Name: Profilering de triacylglyceride Inhoud in Bat Integumentary Lipids door preparatieve Dunnelaagchromatografie en MALDI-TOF massaspectrometrie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 18 s
Description: Leer triacylglyceriden isoleren uit vleermuizen met dunne-laagchromatografie en MALDI-TOF massaspectrometrie. Deze methode analyseert lipidenprofielen voor chemische signalering in ecologische interacties.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Hulp werd geboden door Scott Treece, Katelyn Arter, Jeremy Ragsdell, Tony LaMark James, Amy Fischer, Hannah Blair, en Cheyenne Gerdes tijdens de ontwikkeling van laboratoriumtechnieken. Wij willen de Medina-Bolivar Laboratory (Luis H. Nopo-Olazabal; Arkansas Biosciences Institute) bedanken voor hulp bij TLC scanning densitometrie. MALDI-TOF MS gebruikt voor dit project werd verstrekt door de NSF EPSCoR, RII: Arkansas ASSET Initiatief P3 Center (EPS-0701890) in de Arkansas Biosciences Institute. De financiering werd verstrekt door een Amerikaanse Fisheries and Wildlife Service / Arkansas State Wildlife Grant, de Nationale Speleologische Society, en het Centrum voor Noord-Amerikaanse Bat Research and Conservation aan de Indiana State University.

LET OP: Haal vooraf alle nodige staats-en federale vergunningen voor het hanteren, transporteren en opslaan van vleermuizen. Goedkeuringen moeten ook worden verkregen bij uw institutionele Animal Care en gebruik Comite, evenals van uw institutionele bioveiligheid commissie. Als levende vleermuizen (of zenuwstelsel weefsel) moeten worden behandeld, moeten dierverzorgers worden gevaccineerd tegen hondsdolheid. Vleermuizen die in de huidige studie werden verzameld uit de Ozark St. Francis National Forest, AR, tijdens de zomer van 2010 volgens standaard werkwijzen (Arkansas State University Institutional bioveiligheid Comite goedkeuring # 135349-1) 28. 1. Tissue Behandeling en vetextractie <ol><li> Reinig alle instrumenten met methanol voor en tussen weefsel verzameling van verschillende individuen. Haar te trimmen (ongeveer 1,0 g) van de huid met een schaar en plaats in een 125 ml erlenmeyer. Monster talg uit vleugeloppervlak door schrobben huid met 4-6 watten bevochtigd met chloroform: Methanol oplosmiddel (C: M; 03:02 v / v), en plaats deze in een aparte kolf. </li><li> Extraheer weefsel met 10 ml C: M (02:01 v / v) dat 0,5% gebutyleerd hydroxytolueen (BHT) om oxidatie 29 te voorkomen. Gebruik alleen HPLC kwaliteit oplosmiddelen. </li><li> Na 2 uur, voeg ongeveer 0,5 g watervrij sulfaat aan elke kolf, meng kort en laat het oplosmiddel door filtreren door filtreerpapier. </li><li> Herhaal de stappen 1.2 en 1.3 twee keer. Eenmaal met 1:1 C: M en sequentieel met 1:02 C: M. Pool filtraten samen. </li><li> Damp de samengevoegde filtraten onder een stroom N2, bepalen droog gewicht, en los het residu op in lipide 03:02 C: M (met 0,5% BHT) tot een concentratie van 10 mg / ml. Store monster in glazen flesjes bij -20 ° C. Het is over het algemeen het beste om te analyseren binnen een maand na de monsterneming en vries-dooi cycli te minimaliseren. </li></ol> 2. Lipide Scheiden door preparatieve dunnelaagchromatografie <ol><li> Bereiden op voorhand-oplosmiddel gewassen 1,5 ml microcentrifuge buizen door het vullen met 3:02 C: M, spoelen met aceton en drogen aan de lucht. Dit wordt gedaan om weekmakers die kunnen interfereren met latere massaspectrometrie verwijderen. Slaan monster buizen in een stofvrije container en omgaan met deze buisjes alleen met handschoenen om besmetting te voorkomen van de huid oliën. </li><li> Activeer de TLC-plaat door eerst pre-ontwikkeling van het met 3:02 C: M. Voeg genoeg oplosmiddel om het TLC, tot een hoogte van 1 cm, plaats dan plaat in de kamer (dicht met glazen deksel) en laat het oplosmiddel helemaal rennen naar de bovenkant van de plaat. Dit duurt ongeveer 45 minuten. </li><li> Verwijder de plaat en droog in een zuurkast tot oplosmiddel verdampt (ongeveer 15 minuten), daarna in een oven gedurende ten minste 10 minuten bij 120 ° C. Plaats een potloodteken bovenaan de plaat positie te houden wanneer bemonsteringen. Plaats een rechte lijn potlood, 1,5 cm van de onderkant van de plaat naar de basislijn waar het monster en standaard wordt geplaatst markeren. </li><li> Bereid TLC kamer door het snijden van eenstuk filterpapier groot genoeg om de twee korte muren voeren en een lange muur. Breng het filter liner in de kamer. Het zal volledig nat als oplosmiddel wordt toegevoegd aan de kamer. </li><li> Bereiding van 100 ml van de mobiele fase oplosmiddel, hetgeen hexaan: diethyl ether: azijnzuur (H: E:; 80:20:2 v / v / v). Giet oplosmiddel in de kamer tot een diepte van ongeveer 1 cm geven. Bedek met de glazen deksel, met een siliconenvet afdichting aan de bovenkant van de kamer. Laat de kamer &#39;s nachts in evenwicht voor gebruik. </li><li> Handmatig Breng het monster op de geprepareerde plaat met een capillair pipet of als een continue strook van ongeveer 1,5 cm van de rand tot 1,5 cm aan de andere rand. Een geautomatiseerde monsterdrager wordt de voorkeur omdat het monster in een homogenere reeks wordt geladen. Gebruik de buitenste rijstroken van TLC-plaat te spotten ongeveer 20 ui mengsel van sterolen, FFAs, labels en sterolester normen (gebruik bij 10 mg / ml; premade mengsels kan worden verkregen). </li><li> Plaats de geladen TLC plaat inde geëquilibreerde kamer, dicht bij het deksel, en ontwikkel de plaat totdat het oplosmiddel loopt tot de bovenrand. Dit duurt ongeveer 45 minuten met de mobiele fase beschreven. Verwijder de plaat uit de kamer en laat het overtollige drogen eerst aan de plaat in een zuurkast voor ongeveer 1 minuut. </li><li> Spray met 0,05% rhodamine 6G in 95% ethanol. Visualiseer lipide banden onder een lange golflengte ultraviolet lamp. Markeer met een potlood de Rf positie voor de fluorescerende banden opgelost in de steekproef en normen. Een fotografisch record kan worden genomen op dit punt. </li><li> Identificeer de band die overeenkomt met de TAG standaard en verwijder deze uit de plaat door het afschrapen van de silica met een spatel op een groot stuk van pergamijn wegen papier. Breng silica 1,5 ml oplosmiddel gewassen microcentrifugebuis. </li><li> Voeg 1,0 ml van 03:02 C: M oplosmiddel om het monsterbuisje ultrasone trillingen gedurende 1 min, pellet het silica door centrifugatie en vervolgens over het oplosmiddel in een nieuwe vooraf gewogen buizen. Herhaal the vorige stap, bundelen de filtraten en damp het oplosmiddel onder een stroom N2. </li><li> Bewaar de gedroogde residu bevattende links onder N2 in het donker bij 4 ° C onder andere weefselmonsters worden gescheiden door TLC. Rhodamine 6G aanwezig in monsters, maar is onoplosbaar in hexaan en gedurende monster oplossen onmiddellijk voor MS analyse verwijderd. </li></ol> 3. TAG Analyse met MALDI-TOF MS <ol><li> Bereid een nieuwe α-cyaan-4-hydroxy-kaneelzuur (CHCA) matrix oplossing door het oplossen van 10 mg CHCA in 1 ml oplosmiddel (49,5% ethanol, 49,5% acetonitril en 1% waterige 0,1% TFA). </li><li> Bereid adrenocarticotropic hormoon (ACTH, 18-39 clip, 2465,1989 Da) toegezonden instrument gevoeligheidstesten door mengen van 1 pl van ACTH (1 mg / ml) met 39,5 gl 0,1% trifluorazijnzuur (TFA) tot een 10 pmol / ul vinden stamoplossing. Dit kan worden opgeslagen bij -20 ° C voor toekomstig gebruik. </li><li> Bereid een verse werkende ACTH solution (1 pmol / pl) door middel van 1 pi van 10 pmol / pl voorraadoplossing, mengen met 9 pl 0,1% TFA, en vervolgens mengen (01:01) met 10 ul van de matrix CHCA oplossing in een 500 fmol vinden / pl concentratie. </li><li> Bereid TAG normen bij 10 mg / ml in 03:02 C: M voor MALDI kalibratie (bijv. tricaprine [470,361 Da], tricapryline [554,455 Da], trilaurine [638,549 Da], tripalmitine [722,642 Da], tripalmitolein [800,689 Da] , trimyristine [806,736 Da], trioleïne [884,783 Da], tri-11-eicosenoin [968,877 Da], en trierucin [1052,971 Da]). </li><li> Bereid trioleïne bij 10 mg / ml in 03:02 C: M voor een externe lock mass ijking TAG standaard. </li><li> Los de opgeslagen TAG monsters in hexaan om 10 mg / ml oplossing. </li><li> Bereid een 0,5 M (77,06 mg/1.0 ml) stock oplossing van 2,5-dihydroxybenzoëzuur (DHB) met 90% methanol voor gebruik als monster en de standaard matrix. Eveneens een 1,0 M (2,0 g/50.0 ml) oplossing van NaOH. Bedek de buis met DHB oplossing met behulp van aluminium foi<html> l ter bescherming tegen licht. </li><li> Mix (in voorgewassen buizen) 10,0 ul DHB matrix, 10,0 ul monster of standaard, en 5,0 pi 1,0 M NaOH. Mix en kort centrifugeren de buis mengsel naar de bodem te brengen. </li><li> Spot 1.0 pl standaard, monster, of ACTH op een MALDI roestvrijstalen doel bord en plaats in een exsiccator tot het droog is. Plaats de doelgroep plaat in het instrument voor data-acquisitie. </li><li> Voer MALDI-TOF MS-analyses in positieve reflectron modus. Tune en het instrument kalibreren, zoals beschreven door de fabrikant van het instrument met behulp van de ACTH en TAG standaardoplossingen. </li><li> Verwerven spectra voor elk monster gespot op het richtmerk (consistent met instrument specificaties; parameters voor dit werk waren 5 Hz laser vuursnelheid, ~ 100 schoten per spot met een gemiddelde spectrum te verkrijgen). Na het glad maken en het aftrekken van de achtergrond van MALDI spectra, proces ion pieken handmatig met de online zoekmachine LIPID KAARTEN (/ Tools / ms / glycerolipids_batch &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; www.lipidmaps.org / tools / ms / glycerolipids_batch). </li><li> Kopieer en plak de lijst spectra in de lijst van precursorionen en intensiteit doos. Beperken tot acylsamenstelling gewenst. Identificeer TAGs met de massa / lading (m / z) verhouding van ionen in het spectrum voor elk monster. Als vetzure methylester (FAME) percentages zijn verkrijgbaar bij afzonderlijke GC / MS analyse, moeten deze gegevens aan waarschijnlijkheid van aanwezige TAGs vinden. </li></ol> INSTRUMENT: De massaspectrometer gebruikt in deze studie een Waters MALDI Micro MX (uitgerust met een 337 nm 20 Hz N2 laser). Elke fabrikant MALDI instrument met positieve reflectron modus capaciteit kan worden gebruikt. Algemene instellingen gebruikt zijn impulsspanning, 2000 V; reflectron, 5200 V; bron, 15000 V, met data-acquisitie met behulp MassLynx software (versie 4.0). Deze operationele voorwaarden te scheppen massa resolutie van meer dan 12.000.

<ol><li>Pappas, A., Anthonavage, M., Gordon, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+fate+and+selective+utilization+of+major+FAs+in+human+sebaceous+gland%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Investigative+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Metabolic fate and selective utilization of major FAs in human sebaceous gland.</a> Journal of Investigative Dermatology. 118 (1), 164-171 (2002).</li>
<li>Nicolaides, N., Hwei, H. C., Rice, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+skin+surface+lipids+of+man+compared+with+those+of+eighteen+species+of+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Investigative+Dermatology%22%5BJournal%5D)">The skin surface lipids of man compared with those of eighteen species of animals.</a> Journal of Investigative Dermatology. 51 (2), 83-89 (1968).</li>
<li>Desbois, A. P., Smith, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibacterial+free+fatty+acids%3A+activities%2C+mechanisms+of+action+and+biotechnological+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Microbiology+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Antibacterial free fatty acids: activities, mechanisms of action and biotechnological potential.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 85 (6), 1629-1642 (2010).</li>
<li>Munoz-Garcia, A., Williams, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cutaneous+water+loss+and+lipids+of+the+stratum+corneum+in+Dusky+Antbirds%2C+a+lowland+tropical+bird%5BTitle%5D)+AND+%22Condor%22%5BJournal%5D)">Cutaneous water loss and lipids of the stratum corneum in Dusky Antbirds, a lowland tropical bird.</a> Condor. 109 (1), 59-66 (2007).</li>
<li>Catala, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+function+of+very+long+chain+polyunsaturated+fatty+acids+in+the+pineal+gland%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">The function of very long chain polyunsaturated fatty acids in the pineal gland.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1801, 95-99 (2010).</li>
<li>Stahl, J., Niedorf, F., Kietzmann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+epidermal+lipid+composition+and+skin+morphology+of+animal+skin+ex+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Characterization of epidermal lipid composition and skin morphology of animal skin ex vivo.</a> European Journal of Pharmacology. 72 (2), 310-316 (2009).</li>
<li>Picardo, M., Ottaviani, M., Camera, E., Mastrofrancesco, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sebaceous+gland+lipids%5BTitle%5D)+AND+%22Dermato-Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Sebaceous gland lipids.</a> Dermato-Endocrinology. 1 (2), 68-71 (2009).</li>
<li>Ro, B. I., Dawson, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+sebaceous+gland+activity+and+scalp+microfloral+metabolism+in+the+etiology+of+seborrheic+dermatitis+and+dandruff%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Investigative+Dermatology%22%5BJournal%5D)">The role of sebaceous gland activity and scalp microfloral metabolism in the etiology of seborrheic dermatitis and dandruff.</a> Journal of Investigative Dermatology. 10, 194-197 (2005).</li>
<li>Davoudi, S. M., Sadr, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+study+of+skin+sebum+and+elasticity+level+in+patients+with+sulfur+mustard-induced+dermatitis+and+healthy+controls%5BTitle%5D)+AND+%22Skin+Research+and+Technology%22%5BJournal%5D)">Comparative study of skin sebum and elasticity level in patients with sulfur mustard-induced dermatitis and healthy controls.</a> Skin Research and Technology. 16 (2), 237-242 (2010).</li>
<li>Zampeli, V. A., Makrantonaki, E., Tzellos, T., Zouboulis, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+pharmaceutical+concepts+for+sebaceous+gland+diseases%3A+implementing+today%27s+pre-clinical+data+into+tomorrow%27s+daily+clinical+practice%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Pharmaceutical+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">New pharmaceutical concepts for sebaceous gland diseases: implementing today's pre-clinical data into tomorrow's daily clinical practice.</a> Current Pharmaceutical Biotechnology. 13 (10), 1898-1913 (2012).</li>
<li>Horton, H. R., Moran, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHorton%2C+HR+%22Principles+of+Biochemistry%22">Principles of Biochemistry</a>. , Prentice Hall. Englewood Cliffs, NJ. (1993).</li>
<li>Fahy, E., Subramaniam, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comprehensive+classification+system+for+lipids%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Lipid+Science+and+Technology%22%5BJournal%5D)">A comprehensive classification system for lipids.</a> European Journal of Lipid Science and Technology. 107 (5), 337-364 (2005).</li>
<li>Fahy, E., Subramaniam, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Update+of+the+LIPID+MAPS+comprehensive+classification+system+for+lipids%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Lipid+Research%22%5BJournal%5D)">Update of the LIPID MAPS comprehensive classification system for lipids.</a> Journal of Lipid Research. 50 (5), S9-S14 (2009).</li>
<li>Fuchs, B., Süß, R., Nimptsch, A., Schiller, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MALDI-TOF-MS+directly+combined+with+TLC%3A+A+review+of+the+current+state%5BTitle%5D)+AND+%22Chromotagraphia%22%5BJournal%5D)">MALDI-TOF-MS directly combined with TLC: A review of the current state.</a> Chromotagraphia. 69, S95-S105 (2009).</li>
<li>Savary, B. J., Vasu, P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSavary%2C+BJ+%22Recombinant+Gene+Expression%2C+Reviews+and+Protocols%22">Recombinant Gene Expression, Reviews and Protocols</a>. Lorence, A. , 3rd, Humana Press. New York, NY. (2011).</li>
<li>Gidden, J., Liyanage, R., Durham, B., Lay, J. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reducing+fragmentation+observed+in+the+matrix-assisted+laser+desorption%2Fionization+time-of-flight+mass+spectrometric+analysis+of+triacylglycerols+in+vegetable+oils%5BTitle%5D)+AND+%22Rapid+Communications+in+Mass+Spectrometry%22%5BJournal%5D)">Reducing fragmentation observed in the matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometric analysis of triacylglycerols in vegetable oils.</a> Rapid Communications in Mass Spectrometry. 21, 1951-1957 (2007).</li>
<li>Fuchs, B., Schiller, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+MALDI-TOF+mass+spectrometry+in+lipidomics%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Lipid+Science+and+Technology%22%5BJournal%5D)">Application of MALDI-TOF mass spectrometry in lipidomics.</a> European Journal of Lipid Science and Technology. 111 (1), 83-98 (2009).</li>
<li>Fuchs, B., Sϋβ, R., Schiller, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+update+of+MALDI-TOF+mass+spectrometry+in+lipid+research%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Lipid+Research%22%5BJournal%5D)">An update of MALDI-TOF mass spectrometry in lipid research.</a> Progress in Lipid Research. 49 (4), 450-475 (2010).</li>
<li>Karas, M., Bachmann, D., Hillenkamp, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+the+wavelength+in+high-irradiance+ultraviolet+laser+desorption+mass+spectrometry+of+organic+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Influence of the wavelength in high-irradiance ultraviolet laser desorption mass spectrometry of organic molecules.</a> Analytical Chemistry. 57 (14), 2935-2939 (1985).</li>
<li>Hillenkamp, F., Karas, M., Holtkamp, D., Klusener, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Energy+deposition+in+ultraviolet+laser+desorption+mass+spectrometry+of+biomolecules%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Mass+Spectrometry+and+Ion+Processes%22%5BJournal%5D)">Energy deposition in ultraviolet laser desorption mass spectrometry of biomolecules.</a> International Journal of Mass Spectrometry and Ion Processes. 69 (3), 265-276 (1986).</li>
<li>Knochenmuss, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKnochenmuss%2C+R+%22Electrospray+and+MALDI+Mass+Spectrometry%3A+Fundamentals%2C+Instrumentation%2C+Practicalities%2C+and+Biological+Applications%22">Electrospray and MALDI Mass Spectrometry: Fundamentals, Instrumentation, Practicalities, and Biological Applications</a>. Cole, R. B. , 2nd, John Wiley and Sons. NJ. 149-262 (2010).</li>
<li>Pannkuk, E. L., Gilmore, D., Savary, B. J., Risch, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Triacylglyceride+%28TAG%29+profiles+of+integumentary+lipids+isolated+from+three+bat+species+determined+by+matrix-assisted+laser+desorption+-+ionization+time-of-flight+mass+spectrometry+%28MALDI+-+TOF+MS%29%5BTitle%5D)+AND+%22Canadian+Journal+of+Zoology%22%5BJournal%5D)">Triacylglyceride (TAG) profiles of integumentary lipids isolated from three bat species determined by matrix-assisted laser desorption - ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI - TOF MS).</a> Canadian Journal of Zoology. 90 (9), 1117-1127 (2012).</li>
<li>Blehert, D., Hicks, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bat+white-nose+syndrome%3A+An+emerging+fungal+pathogen%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Bat white-nose syndrome: An emerging fungal pathogen.</a> Science. 323 (5911), 227-228 (2009).</li>
<li>Gargas, A., Trest, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Geomyces+destructans+sp.+nov.+associated+with+bat+white-nose+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Mycotaxon%22%5BJournal%5D)">Geomyces destructans sp. nov. associated with bat white-nose syndrome.</a> Mycotaxon. 108, 147-154 (2009).</li>
<li>Lorch, J. M., Meteyer, C. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+infection+of+bats+with+Geomyces+destructans+causes+white-nose+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Experimental infection of bats with Geomyces destructans causes white-nose syndrome.</a> Nature. 480 (7377), 376-378 (2011).</li>
<li>Frick, W. F., Pollock, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+emerging+disease+causes+regional+population+collapse+of+a+common+North+American+bat+species%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">An emerging disease causes regional population collapse of a common North American bat species.</a> Science. 329 (5992), 679-682 (2010).</li>
<li>Boyles, J. G., Cryan, P. M., McCracken, G. F., Kunz, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+economic+importance+of+bats+in+agriculture%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The economic importance of bats in agriculture.</a> Science. 332 (6025), 41-42 (2011).</li>
<li>Sikes, R. S., Gannon, W. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidelines+of+the+American+Society+of+Mammalogists+on+the+use+of+wild+mammals+in+research%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Mammalogy%22%5BJournal%5D)">Guidelines of the American Society of Mammalogists on the use of wild mammals in research.</a> Journal of Mammalogy. 92 (1), 235-253 (2011).</li>
<li>Law, S., Wertz, P. W., Swartzendruber, D. C., Squier, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regional+variation+in+content%2C+composition%2C+and+organization+of+porcine+epithelial+barrier+lipids+revealed+by+thin+layer+chromatography+and+transmission+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Oral+Biology%22%5BJournal%5D)">Regional variation in content, composition, and organization of porcine epithelial barrier lipids revealed by thin layer chromatography and transmission electron microscopy.</a> Archives of Oral Biology. 40 (12), 1085-1091 (1995).</li>
<li>Folch, J., Lees, M., Sloane Stanley, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+the+isolation+and+purification+of+total+lipids+from+animal+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A simple method for the isolation and purification of total lipids from animal tissues.</a> Journal of Biological Chemistry. 226 (1), 497-509 (1957).</li>
<li>Nicolaides, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skin+lipids%3A+Their+biochemical+uniqueness%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Skin lipids: Their biochemical uniqueness.</a> Science. 186 (4158), 19-24 (1974).</li>
<li>Camera, E., Ludovici, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+analysis+of+the+major+lipid+classes+in+sebum+by+rapid+resolution+high-performance+liquid+chromatography+and+electrospray+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Lipid+Research%22%5BJournal%5D)">Comprehensive analysis of the major lipid classes in sebum by rapid resolution high-performance liquid chromatography and electrospray mass spectrometry.</a> Journal of Lipid Research. 51, 3377-3388 (2011).</li>
<li>Fuchs, B., Süß, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+analysis+by+thin-layer+chromatography-+A+review+of+the+current+state%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chromatography+A%22%5BJournal%5D)">Lipid analysis by thin-layer chromatography- A review of the current state.</a> Journal of Chromatography A. 1218 (19), 2754-2774 (2011).</li>
</ol>

De auteurs verklaren geen concurrerende financiële belangen.

Dit document presenteert een eenvoudige en robuuste methode voor het scheiden van brede lipideklassen geïsoleerd van zoogdieren omhulsel door preparatieve TLC en het bepalen van TAG profielen door MALDI-TOF MS, zonder tijdrovende derivatisering van de vetmoleculen. De kritische stappen in het produceren van kwaliteit spectra van TAG&#39;s met MALDI-TOF MS zijn onder andere: 1) Succesvolle extractie van de verbinding met minimale vervuiling of oxidatie, 2) Voldoende scheiding en isolatie door chromatografie, en 3) een hoge resolutie en nauwkeurigheid van massa door MALDI-TOF MS. Deze paper toont de methode door het winnen en het scheiden van de neutrale lipide fractie uit de plagiopatagium van de Oost-rode vleermuis om TAG MS profielen te verkrijgen. Hoewel de huidige studie gebruikte een vleermuis species (Mammalia: Chiroptera) deze werkwijzen kunnen worden uitgebreid tot bedekkinglijk lipiden van elke zoogdiersoort bestuderen. Bat omhulsel wordt gekenmerkt door overwegend cholesterol, met lagere hoeveelheden TAG, FFAs, squaleen, en sterol / wasesters. Talg lipideverhoudingen in knuppels verschillen van mensen, dat squaleen aanwezig in lage bedragen (in plaats van tot 16% bij de mens), terwijl cholesterol komt in grotere verhoudingen (1 - 7% bij mensen maar 26-62% in knuppels) 22 , 31. Menselijke haren bevatten ongeveer 3% TAGs, terwijl verhoudingen tot 28% gevonden in Oost rood bat haar. De extractie van lipide monsters van knuppels is vergelijkbaar voor andere soorten. Terwijl in deze studie watten gedrenkt in oplosmiddel gebruikt talg verwijderen, kan men ook zwenken flesje of monsterbuis met oplosmiddel op het oppervlak van het omhulsel meerdere keren. Gespecialiseerde tape producten bieden ook alternatieve middelen om het oppervlak lipiden halen 32. Een belangrijk onderdeel van een goede lipide extractie is om verontreiniging van de huid olie te minimaliseren. Dit is eenvoudig te realiseren door het houden van een knijpfles met methanol en spuiten van al het glaswerk en bestek, vegen gebruiksvoorwerpen met een weefsel tussen alle monsters en het dragen van onderzoekshandschoenen. Oxidatie of polyonverzadigde acyls wordt voorkomen door de toevoeging van BHT en moet ongeacht de temperatuur monsters opgeslagen worden. Biomolecuul analyse vereist meestal een chromatografische stap om afzonderlijke moleculen van belang tegen verontreinigingen. TLC wordt gebruikt in deze werkwijze, die instrumentatie eisen voor gas-of vloeistofchromatografie vermijdt en vereist minder technische ervaring robuuste en herhaalbare resultaten. Afhankelijk van de lipide klasse plaats kunnen vele mobiele fasen worden opgenomen. Bovendien kan het gebruik van HPTLC platen en scanning densitometrie worden gebruikt om kwantitatieve resultaten te bereiken. Hoewel variaties van TLC methoden zijn te talrijk om hier een aantal gangbare mobiele fasen gebruikt lipide TLC onder chloroform: methanol: water voor scheiding van fosfolipiden en glycolipiden of isooctaan: ethylether voor het scheiden van niet-polaire lipiden 28. In termen van het scheiden van tags uit andere lipide klassen, de H: E: Een zolvent systeem werkt consequent en levert vergelijkbare resultaten. Een ander voordeel voor het gebruik van TLC is dat banden van belang snel kan worden geprofileerd met behulp van MALDI-TOF MS zonder voorafgaande derivatisering van de analyten. In deze studie wordt de silica uit de TLC-plaat en de analyt geëlueerd uit door sonicatie in een oplosmiddel en daaropvolgende centrifugatie aan het adsorptiemiddel en verdamping van het eluerende oplosmiddel te scheiden. Als alternatief matrix kan direct op analyt bands gescheiden op TLC-platen en vervolgens direct geanalyseerd met MALDI-TOF MS 33 toegepast. Succesvolle profilering door MALDI-TOF MS doet beroep op voldoende monstervoorbereiding en vaardigheid van de operator met tuning en kalibreren van het instrument. Het instrument moet dagelijks worden gekalibreerd met normen voor molecuulgewichtbereik geschikt is voor de moleculen van belang. De geschikte gevoeligheid en resolutie (bijv. ≥ 10.000) van de apparatuur moet worden confirmedagelijks d met ACTH. De talgklieren lipide bestanddelen gevonden op het oppervlak van zoogdieren omhulsel kan een rol spelen in de kolonisatie door bacteriën / schimmels. Daarom is kennis van de chemische samenstelling tussen soorten en individuen kan aanwijzingen over processen van mens en dier ziekten. Intraspecifieke verschillen tussen zieke en gezonde mensen kunnen klinische verschijnselen vertegenwoordigen die helpen bij ziekte opsporing en diagnose. Bovendien, als specifieke verbindingen die microbiële groei remmen aanwezig zijn, kunnen deze worden geïdentificeerd voor gebruik in de behandeling van ziekten en preventie.

Zoogdieren integumentary weefsels onder de opperhuid, verhoornde structuren (bv. haar en nagels) en exocriene klieren. Talg type exocriene klieren zijn geassocieerd met haarfollikels, die collectief worden aangeduid als de talgklieruitvoergang 1. Talgklieren laat een olieachtige afscheiding op het huidoppervlak aangeduid als talg. Talg is grotendeels samengesteld uit glycerolipids (bijv. triacylglyceriden [TAG]), vrije vetzuren acyls (FFAs), sterol / wasesters, en squaleen. Talg de chemische samenstelling is soortspecifiek 2. Naast het feit dat een deel van het aangeboren immuunsysteem en het verstrekken van antimicrobiële functie 3, talglipiden beïnvloeden belangrijke fysiologische processen waaronder waterverlies door verdamping via de huid 4, cellulaire integriteit en genregulatie 5, en absorptie 6. Sebaceous lipidesamenstellingen kan ook dienen als ziektemarkers. Veranderde verhoudingen en hoeveelheden talg bweg lipide klassen zijn klinische symptomen van ziekten zoals acne vulgaris 7, 8 roos, seborrheic dermatitis 8, asteatosis 9, onder anderen 10. Epidermale en haar weefsels bevatten variabele profielen met sterolen en derivaten, markeringen, FFAs, ceramiden, fosfolipiden, en andere kleine lipide componenten. Omdat integumentary lipiden kunnen functioneren ziekteprocessen bepalen verschillen in chemische samenstellingen van TAGs tussen gezonde en zieke individuen bruikbaar zijn voor klinische diagnose van ziekte. Lipiden worden in het algemeen gedefinieerd als zijnde niet in water oplosbare organische verbindingen met ofwel niet-polaire of apolaire-polaire substituenten 11. Lipide structuren kunnen lange koolwaterstofketens, geoxygeneerde alkanen (zoals wax esters, FFAs, alcoholen, ketonen en aldehyden), of complexe ringstructuren zoals cholesterol 12. Er zijn acht grote klassen van lipiden basis van de structuur (FFAs, glycerolipids [GL] glycerophospholipids [GP], sfingolipiden [SP], sterol lipiden [ST], prenol lipiden [PR] saccharolipids [SL] en polyketiden [PK]), die een groot aantal chemische eigenschappen vertonen afhankelijk klasse 13. Vanwege de grote variatie in de chemische eigenschappen van lipide klassen, wordt direct profilering zonder voorafgaande derivatisering van vetmoleculen gewenst. Een opkomende werkwijze lipide activiteit is dunnelaagchromatografie (TLC) gecombineerd met matrix-assisted laser desorptie / ionisatie time-of-flight massaspectrometrie (MALDI-TOF MS) 14. MALDI-TOF MS wordt veelvuldig gebruikt in proteomics onderzoek om eiwitten te identificeren en koppelen aan specifieke aminozuursequenties vanwege de zeer nauwkeurige peptide ion mass &quot;fingerprints&quot; gegenereerd door trypsine-gedigereerde eiwitten 15. MALDI-TOF MS kan ook worden gebruikt om andere biomolecuul klassen, waaronder lipiden zoals TAG 16-18 profileren. MALDI vereist het gebruik van een matrix, typtisch een organische verbinding die aromatische en geconjugeerde dubbele binding structuren bevat. De matrix moleculen dienen voorzichtig overdracht van de energie van de laser om de analyten, bevorderen protonenoverdracht en produceren enkelvoudig geladen gasfase ionen 19-21. Ionen worden onderworpen aan een hoge spanning veld onder hoog vacuüm en versneld in een TOF massa-analysator wanneer ionen vervolgens gescheiden door verschillen in snelheden die evenredig is met hun massa-tot-lading verhoudingen. Zelfs zeer grote biomoleculen kunnen worden geïoniseerd met weinig fragmentatie, het produceren van enkelvoudig geladen moleculaire ion soorten vereenvoudigde spectrum analyse. De mogelijkheid om vetmoleculen direct analyseren zonder voorafgaande derivaatvorming heeft bevorderd klaar goedkeuring van MALDI-TOF MS in lipidomic onderzoek 18. Dit document presenteert een routine methode te isoleren en analyseren Integumentair lipiden uit het haar, de talgafscheiding en plagiopatagium van de Oost-rode vleermuis (Lasiurus Borealis). Dit wordt gebruikt om interspecifieke variaties in bat Integumentair lipiden bepalen om het ziekteproces van Wit-Nose Syndrome (WNS) 22 toe te lichten. WNS is een schimmelziekte van knuppels en wordt veroorzaakt door de nieuw beschreven psychrofiele soorten Geomyces destructans 23-25. WNS heeft de dood van meer dan 5 miljoen Noord-Amerikaanse grot vleermuizen veroorzaakt en bedreigt het uitsterven van kwetsbare soorten vleermuizen, met potentiële economische effecten van miljarden dollars aan schade aan de agrarische industrie 26,27. Om de stappen in G. onderzoeken destructans infectie werden lipiden geëxtraheerd uit het haar en vleugel weefsels van Oost rode vleermuizen en gescheiden in brede lipideklassen door TLC aan de TAG fractie voor verdere analyse door MALDI-TOF MS isoleren. Tags bevatten korte acylketens en zijn gemakkelijk gedetecteerd door MALDI-TOF MS met weinig matrix interferentie.

<table><tbody><tr><td>Butylated Hydroxytoluene</td><td>MP Biomedicals, LLC</td><td>101162</td><td><a href="http://www.mpbio.com" target="_blank">www.mpbio.com</a></td></tr><tr><td>TLC Flexible Plates</td><td>Whatman</td><td>4410-222</td><td><a href="http://www.whatman.com" target="_blank">www.whatman.com</a></td></tr><tr><td>ACTH</td><td>Sigma-Aldrich Chem. Co.</td><td>A8346-5X1VL</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com" target="_blank">www.sigmaaldrich.com</a></td></tr><tr><td>Triolein</td><td>Sigma-Aldrich Chem. Co.</td><td>44895-U</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>TLC Lipid Standard</td><td></td><td>TLC 18-1</td><td><a href="http://www.nu-chekprep.com" target="_blank">www.nu-chekprep.com</a></td></tr><tr><td>MALDI TAG Standard</td><td>Nu-Check Prep., Inc.</td><td>NIH Code 53B</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>MALDI TAG Standard</td><td>Sigma-Aldrich Chem. Co.</td><td>17810-1AMP-S</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Glass Vials with Teflon Cap</td><td>U.S. National Scientific Co.</td><td>B7800-2</td><td><a href="http://www.nationalscientific.com/" target="_blank">www.nationalscientific.com/</a></td></tr><tr><td>DHB</td><td>Sigma-Aldrich Chem. Co.</td><td>50862-1G-F</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>CHCA</td><td>Sigma-Aldrich Chem. Co.</td><td>C8982-10X10 mg</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Sebutape</td><td>CuDerm</td><td>S100</td><td>&nbsp;</td></tr></tbody></table>

profilering de triacylglyceride inhoud in bat integumentary lipids door preparatieve dunnelaagchromatografie en maldi-tof massaspectrometrie

Profiling the Triacylglyceride Contents in Bat Integumentary Lipids by Preparative Thin Layer Chromatography and MALDI-TOF Mass Spectrometry

De zoogdieren integument bevat talgklieren die een olieachtige stof afscheiden op het huidoppervlak. Talgproductie is onderdeel van het aangeboren immuunsysteem dat beschermend tegen pathogene microben. Abnormale talgproductie en chemische samenstelling ook een klinisch symptoom van bepaalde huidziekten. Talg bevat een complex mengsel van lipiden, zoals triacylglyceriden, die soortspecifiek. De brede chemische eigenschappen vertoond door diverse lipideklassen belemmeren de specifieke bepaling van talg samenstelling. Analysetechnieken voor lipiden vergen doorgaans chemische derivatiseringen dat arbeidsintensieve en stijging monstervoorbereiding kosten. Dit document beschrijft hoe om lipiden te extraheren uit zoogdieren integument, aparte brede lipideklassen door dunne-laag chromatografie, en het profiel van de inhoud triacylglyceride behulp van matrix-assisted laser desorptie / ionisatie time-of-flight massaspectrometrie. Deze robuuste methode maakt een directe bepalingvan de triacylglyceride profielen tussen soorten en individuen, en kan gemakkelijk worden toegepast op elke taxonomische groep van zoogdieren.

De extractiemethode voor het isoleren van lipiden uit weefselkweek beschreven door Folch 30 is een eenvoudige procedure, die hier geschikt. Na weefsel extractie en verdamping van het oplosmiddel, de lipiden vaak als een gelige film. De gele kleur waarschijnlijk is uit eiwitten verontreinigingen, die kan worden verwijderd door het uitvoeren van een vloeistof-vloeistof extractie. Deze extra monster verwerking is niet noodzakelijk in deze procedure omdat preparatieve TLC scheidt de TAG fractie uit dergelijke verontreinigingen. De toevoeging van verse watervrij natriumsulfaat in alle fasen filtering helpt waterverontreiniging die nauwkeurige vetgewicht bepalingen beïnvloedt. Zoogdieren integumentary lipide-analyses door preparatieve TLC met H: E: als de mobiele fase zal verdwijnen doorgaans vier verschillende banden die overeenkomen met (vanaf oorsprong) sterolen, FFAs, labels en sterolesters / wasesters / squaleen (figuur 1). Af en toe bij het gebruik van analytischecal high performance (HP) TLC met de H: E: Een mobiele fase, de sterolesters, wasachtige esters, en squaleen zal scheiden en verschijnen als drie afzonderlijke banden. Onder de in de onderhavige studie voorwaarden worden de sterol / wasachtige esters niet gescheiden. Als deze banden van belang, kan de mobiele fase worden geschakeld isooctaan: ethylether (95:5 v / v), en HPTLC plaat kan worden geanalyseerd met scanning densitometrie. Andere factoren kunnen een slechte scheiding veroorzaken. Deze worden meestal verwijderd door het plaatsen van het filterpapier in de kamer, het toepassen van vet voor een goede afdichting op het deksel, evenwichtsherstellende de kamer &#39;s nachts, en het houden van schoon TLC kamers, een consistente kwaliteit TLC scheidingen en gegevens te verkrijgen. Vertegenwoordiger MALDI-TOF massa spectra verkregen voor tags geïsoleerd van de Oost-rode vleermuis zijn weergegeven in de figuren 2 en 3. Deze spectra bevatten TAG ionen pieken in het massa bereik van m / z 850-910, die typisch is voor TAG geïsoleerd uit niet-aquatische zoogdiers. De toevoeging van 1,0 M NaOH bevordert enkelvoudig geladen Na + ionen die stabieler dan H + ionen zijn. Daarnaast vormt het ontbreken van H + en K + ionen verhoogt het gemak van spectrumanalyse. Het m / z 850-910 ion pieken corresponderen met 16:00, 18:00, 18:01 en 18:02 FA eenheden mag overheersen acyl bestanddelen in TAGs (tabel 1). Mogelijke FA resten van tags kunnen in eerste instantie worden bepaald door de totale ion m / z aanwezig in MALDI-TOF MS-spectra, en verschillen tussen soorten en individuen afgeleid. Indien de specifieke verhoudingen van acyl inhoud vereist, dan MS / MS of gaschromatografie (GC / MS) worden gebruikt. Meer informatie over acyl verhoudingen kunnen worden afgeleid door het observeren van de pieken in de diacylglycerides gebied van het spectrum (figuur 4). Diacylglycerides worden geproduceerd uit TAG fragmentatie in de MALDI bron en is te vinden in de m / z 590-650 regio. TAG fragmentatie kan worden verhoogdweglaten van de toevoeging van 1,0 M NaOH 16. Oost rode vleermuis vleugel weefsel wordt gekenmerkt door een dominante piek bij m / z 879,7 en haar weefsel met een dominante piek bij m / z 881,8 (figuur 2 en 3 respectievelijk). Pieken bij m / z 907,8, 879,7 en 855,7 (POP, OPE) ongeveer zelfs intensiteit (~ 50%) in het haar weefsel met de piek bij 853,7 wezen ~ 40%. <table border="1"><tbody><tr><td fo:width="2in"> Samenstelling </td><td fo:width="1in"> Elementsamenstelling </td><td fo:width="1in"> Waargenomen Massa </td></tr><tr><td> Na + TAG </td><td></td><td> Na + TAG </td></tr><tr><td> SSO </td><td> C 57 H 108 O 6 </td><td> 911,8 </td></tr><tr><td> OOS, LSS </td><td> C 57 H 106 O 6 </td><td> 909,8 </td></tr><tr><td> OOO, lnss, LSO </td><td> C 57 H104 O 6 </td><td> 907,8 </td></tr><tr><td> LOO, LLS </td><td> C 57 H 102 O 6 </td><td> 905,8 </td></tr><tr><td> LLO, OOLn </td><td> C 57 H 100 O 6 </td><td> 903,7 </td></tr><tr><td> LLL </td><td> C 57 H 98 O 6 </td><td> 901,7 </td></tr><tr><td> LLLn </td><td> C 57 H 96 O 6 </td><td> 899,7 </td></tr><tr><td> LLnLn </td><td> C 57 H 94 O 6 </td><td> 897,7 </td></tr><tr><td> LnLnLn </td><td> C 57 H 92 O 6 </td><td> 895,7 </td></tr><tr><td> OSP </td><td> C 55 H 104 O 6 </td><td> 883,8 </td></tr><tr><td> LSP, OOP, Sopo </td><td> C 55 H 102 O 6 </td><td> 881,8 </td></tr><tr><td> LOP, LnSP, LSPO </td><td> C 55 H 100 O 6 &lt;/ Td&gt; <td> 879,7 </td></tr><tr><td> LLP, LNOP Lopo </td><td> C 55 H 98 O 6 </td><td> 877,7 </td></tr><tr><td> LnLP, LLPo, LnOPo </td><td> C 55 H 96 O 6 </td><td> 875,7 </td></tr><tr><td> LnLnP, LnLPo </td><td> C 55 H 94 O 6 </td><td> 873,7 </td></tr><tr><td> LnLnPo </td><td> C 55 H 92 O 6 </td><td> 871,7 </td></tr><tr><td> PPS </td><td> C 53 H 102 O 6 </td><td> 857,8 </td></tr><tr><td> POP, OEP </td><td> C 53 H 100 O 6 </td><td> 855,7 </td></tr><tr><td> OOM, PPL, Popos, Popo </td><td> C 53 H 98 O 6 </td><td> 853,7 </td></tr><tr><td> PPLN, ppol, Popoo, Myoo </td><td> C 53 H 96 O 6 </td><td> 851,7 </td></tr><tr><td> LLM, LnOM </td><td> C 53 H 94 </sub&gt; O 6 </td><td> 849,7 </td></tr><tr><td> PPP, SSLa </td><td> C 51 H 98 O 6 </td><td> 829,7 </td></tr><tr><td> PPPo, Osla </td><td> C 51 H 96 O 6 </td><td> 827,7 </td></tr><tr><td> PPoPo, PMyO </td><td> C 51 H 94 O 6 </td><td> 825,7 </td></tr><tr><td> LnLnLa </td><td> C 51 H 86 O 6 </td><td> 817,6 </td></tr><tr><td> MMS, tik, PPM </td><td> C 49 H 94 O 6 </td><td> 801,7 </td></tr><tr><td> SLaPo, PPOM, PPMy </td><td> C 49 H 92 O 6 </td><td> 799,7 </td></tr><tr><td> PoPoM, OOCa </td><td> C 49 H 90 O 6 </td><td> 797,7 </td></tr><tr><td> MMP </td><td> C 47 H 90 O 6 </td><td> 773,7 </td></tr><tr><td> MMPo, OCAP </td><td> C 47 H 88 O6 </td><td> 771,7 </td></tr><tr><td> OCaPo </td><td> C 47 H 86 O 6 </td><td> 769,6 </td></tr><tr><td> MMM, PPCA, PMLA </td><td> C 45 H 86 O 6 </td><td> 745,6 </td></tr><tr><td> PoPCa, PoMLa </td><td> C 45 H 84 O 6 </td><td> 743,6 </td></tr><tr><td> Popoca </td><td> C 45 H 82 O 6 </td><td> 741,6 </td></tr><tr><td> Lalap, MMLa, MCAP </td><td> C 43 H 82 O 6 </td><td> 717,6 </td></tr><tr><td> LaLaPo </td><td> C 43 H 80 O 6 </td><td> 715,6 </td></tr><tr><td> OO </td><td> C 39 H 72 O 5 </td><td> 643,5 </td></tr><tr><td> OL </td><td> C 39 H 70 O 5 </td><td> 641,5 </td></tr><tr><td> LL </td><td> C 39 H 68 O 5 </td><td> 639,5 </td></tr><tr><td> SP </td><td> C 37 H 72 O 5 </td><td> 619,5 </td></tr><tr><td> OP </td><td> C 37 H 70 O 5 </td><td> 617,5 </td></tr><tr><td> LP </td><td> C 37 H 68 O 5 </td><td> 615,5 </td></tr></tbody></table> Tabel 1. Vetzuursamenstelling, elementaire samenstelling en isotopische massa sodiated adducten van triacylglyceriden en diacylglycerides. Ln = linoleenzuur (18:03), L = linolzuur (18:02), O = oliezuur (18:01), S = stearinezuur (18:00), P = palmitinezuur (16:00), Po = palmitinezuur (16:01), M = myristinezuur (14:00), My = myristoleinezuur (14:01) La = laurinezuur zuur (12:00), Ca = caprinezuur (10:00). <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/50757/50757fig1.jpg" /> Figuur 1. Dunne-laag chromatogram van brede lipideklasse scheiding door hexaan: diethylether: azijnzuur(80:20:2 v / v / v) als mobiele fase. De band tussen sterol en FFA niet ontdekt standaard maar kan een vetalcohol of was diester zijn. <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/50757/50757fig2.jpg" /> Figuur 2. Uitgebreid TAG regio MALDI-TOF massa spectrum van sodiated tags. (M / z 700-950) uit Oost-rode vleermuis (L. borealis) vleugel weefsel Pieken geïdentificeerd bij m / z 853,7 (OOM, PPL, Popos, Popo) en m / z 879,7 (LOP, LnSP, LSPO). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50757/50757fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken</a> . <img alt="Figuur 3" src="/files/ftp_upload/50757/50757fig3.jpg" /> Figuur 3. Uitgebreid TAG regio MALDI-TOF massa spectrum van sodiated TAG (m / z 700-950) uit Oost-rode vleermuis (L. borealis) haar weefsel.Pieken die bij m / z 905,8 (LOO, LLS) en m / z 907,8 (OOO, lnss, LSO). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50757/50757fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken</a> . <img alt="Figuur 4" src="/files/ftp_upload/50757/50757fig4.jpg" /> Figuur 4. DAG regio van MALDI-TOF massa spectrum van sodiated DAG fragmenten (m / z 530-730). Uit Oost rode vleermuis (L. borealis) vleugel weefsel Pieken geïdentificeerd bij m / z 643,5 (OO) en m / z 615,5 (LP) . <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50757/50757fig4large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken</a> .

Zoogdieren omhulsel bevat oplosmiddel-extraheerbare lipiden die chemische samenstelling kenmerkend is voor individuele soorten kan bieden. Dit document presenteert een routinemethode voor het scheiden brede lipideklassen Integumentair geïsoleerd uit weefsels met behulp van dunnelaagchromatografie en waarin de triacylglyceride profiel door matrix-geassisteerde laser desorptie / ionisatie time-of-flight massaspectrometrie.

Profilering de triacylglyceride Inhoud in Bat Integumentary Lipids door preparatieve Dunnelaagchromatografie en MALDI-TOF massaspectrometrie

The mammalian integument includes sebaceous glands that secrete an oily material onto the skin surface. Sebum production is part of the innate immune ...

Het algemene doel van deze procedure is het isoleren en identificeren van de triglyceride-inhoud in talgsecreties van vleermuizen. Extraheer eerst de oppervlakkige lipidenfractie uit integumentaire weefsels onder omstandigheden die contaminatie en oxidatie minimaliseren. Scheid de lipiden vervolgens middels dunlaagchromatografie om de triglyceridefractie te verkrijgen.Verwerk nu de spectrale gegevens met de software van het instrument en analyseer deze met online chemische databases. Uiteindelijk worden preparatieve dunne-laagchromatografie en matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight massaspectrometrie gebruikt om verschillen in triglyceridesamenstellingsprofielen tussen de experimentele en controlegroepen te bepalen. Deze methode kan worden gebruikt om te helpen bij het identificeren van uitgescheiden lipiden die kunnen fungeren als chemische signalen bij interacties tussen gastheer en pathogeen.Hoewel we deze methode gebruiken om de klinische symptomen van het witte-neussyndroom te onderzoeken, kan deze methode worden toegepast op andere zoogdiersystemen, waaronder het bestuderen van seksuele signalering of mogelijk interspecifieke verschillen in de melksamenstelling. Reinig alle instrumenten met methanol vóór en tussen de weefselafname van verschillende individuen. Trim ongeveer één gram haar van de huid en plaats dit in een erlenmeyer van 125 milliliter.Om sebum van de vleugeloppervlakken te bemonsteren. Bevochtig wattenbolletjes met een chloroform-methanol-oplosmiddel. Schuur de huid en plaats deze in een aparte kolf.Extraheer nu het weefsel met 10 milliliters chloroform methanol waarin 0,5% BHT is opgelost om oxidatie te voorkomen, na twee uur met ongeveer 0,5 grams watervrij natriumsulfaat en filter dit door filterpapier om het oplosmiddel op te vangen. Herhaal de extractie opeenvolgend met chloroform methanol in een verhouding van één-op-één en één-op-twee. Voeg vervolgens de filtraten samen en verdampt de gepoolde filtraten onder een stroom stikstof.Bepaal het drooggewicht en los het lipideresidu op tot een concentratie van 10 mg/mL. Bewaar het monster in glazen vials bij -20 °C gedurende maximaal één maand om weekmakers te verwijderen die latere massaspectrometrie-analyse kunnen beïnvloeden. Vul 1,5 mL microcentrifugebuisjes met een mengsel van chloroform en methanol in een verhouding van 3:2.Spoel vervolgens met aceton en laat aan de lucht drogen; bewaar de monsterbuisjes in een stofvrije container en hanteer deze buisjes uitsluitend met handschoenen om contaminatie door huidvetten te voorkomen. Activeer de TLC-plaat door deze eerst voor te ontwikkelen met chloroform methanol in een verhouding van drie op twee.Voeg oplosmiddel toe aan de TLC-kamer tot een hoogte van één centimeter. Plaats vervolgens de plaat in de kamer en laat het oplosmiddel volledig tot aan de bovenkant van de plaat lopen. Neem de plaat uit de kamer en laat deze in een zuurkast drogen tot het oplosmiddel is verdampt.Verhit de plaat vervolgens ten minste 10 minuten bij 120 °C. Markeer de plaat nu met een potloodstreep aan de bovenzijde. Trek een rechte potloodlijn op 1,5 centimeter van de onderrand van de plaat om de basislijn te markeren waarop het monster en de standaarden worden aangebracht.Snijd vervolgens een stuk filterpapier af dat groot genoeg is om de twee korte wanden en één lange wand van de TLC-kamer te bekleden. Plaats de filterpapierbekleding in de kamer. Giet 100 milliliter vers bereid mobiele fase-oplosmiddel in de kamer tot een diepte van ongeveer één centimeter.Breng een siliconenvetafdichting aan langs de bovenrand van de kamer. Dek deze af met het glazen deksel en laat het geheel een nacht equilibreren. Breng het monster handmatig of met een automatische monsterapplicator aan in een continue streep.Gebruik de buitenste banen van de TLC-plaat om ongeveer 20 µL van het standaardmengsel op te brengen. Plaats de geladen TLC-plaat in de geëquilibreerde kamer. Sluit het deksel en laat de plaat ontwikkelen tot het oplosmiddel de bovenrand bereikt.Verwijder de plaat na ongeveer 45 minuten en laat het overtollige oplosmiddel verdampen in een zuurkast. Besproei de plaat met 0,05% rodine six G in 95% ethanol. Visualiseer vervolgens de lipidebanden onder een ultravioletlamp met lange golflengte en markeer deze met een potlood. Markeer de RF-positie voor de gefluoresceerde banden die in het monster en de standaarden zijn gescheiden.Maak een fotografische opname. Identificeer vervolgens de band die overeenkomt met de tagstandaard. Breng deze over op een groot stuk glas en wei-papier, en vervolgens in een met oplosmiddel gewassen microcentrifugebuisje van 1,5 milliliter.Voeg één milliliter chloroform-methanol-oplosmiddel in een verhouding van drie op twee toe aan het monster en sonicize gedurende één minuut. Pelleteer de silica door centrifugatie en breng het oplosmiddel vervolgens over naar een nieuwe, vooraf gewogen buis. Herhaal de extractie met één milliliter, verzamel de filtraten en laat het oplosmiddel vervolgens verdampen onder een stroom stikstof.Bewaar het gedroogde residu met de tags onder stikstof in het donker bij vier graden Celsius terwijl aanvullende weefselmonsters worden gescheiden via TLC Rho Domine. Six G is aanwezig in de monsters, maar is onoplosbaar in hexaan en wordt verwijderd tijdens het oplossen van de monsters. Bereid onmiddellijk voor de MS-analyse de 500 fmol per microliter A CTH werkoplossing en de 10 milligram per milliliter tag-standaarden voor zoals beschreven in het tekstprotocol.Bereid daarnaast de 0,5 molaire stockoplossing van DHB met 90% methanol ter gebruik als monster- en standaardmatrix. Bedek de buis met aluminiumfolie om deze tegen licht te beschermen. Combineer nu 10 µL DHB-matrix, 10 µL monster of standaard en 5 µL van een een molaire natriumhydroxidemix, en centrifugeer de buis kort om het mengsel naar de bodem te brengen.Breng één µL van het standaardmonster of A CTH aan op een MALDI roestvrijstalen targetplaat en plaats deze in een desiccator om te drogen. Plaats vervolgens de targetplaat in het instrument voor data-acquisitie. Voer de MALDI-TOF MS-analyse uit in positieve reflectiemodus.Stel het instrument af en kalibreer het zoals beschreven door de fabrikant van het instrument met behulp van de A CTH- en tag-standaardoplossingen. Verkrijg spectra voor elk monster dat op de doelplaat is geplaatst na het gladstrijken en aftrekken van de achtergrond vanuit Aldi Spectra; verwerk ionpieken handmatig met de online zoekmachine lipid maps, en kopieer en plak de lijst met spectra in het vak voor precursor-ionen en intensiteit. Beperk de zoekopdracht tot de gewenste AAL-samenstelling. Identificeer tags aan de hand van de massa-ladingsverhoudingen van de ionen die in het spectrum van elk monster aanwezig zijn.Indien percentages van vetzuurmethylesters beschikbaar zijn uit een afzonderlijke GCMS-analyse, voeg deze gegevens dan toe om de waarschijnlijkheden van TAG's te bepalen. De analyse van lipiden uit het integument van zoogdieren middels preparatieve TLC met HEA als mobiele fase resulteert gewoonlijk in vier duidelijke banden die overeenkomen met sterolesters, vrije vetzuren (FFA's), TAG's en sterolesters, was-esters, EER's en squaleen. Deze massa-spectra werden verkregen voor TAG's geïsoleerd uit de oosterschelpvleermuis.Typisch voor een preparaat van niet-aquatische zoogdieren. De spectra bevatten ionpieken in het massa-ladingverhoudingsbereik tussen 850 en 910. Vetzuurcomponenten zijn de dominante bestanddelen en tags van de AAL.Verdere informatie over AAL-ratio's kan worden afgeleid door de pieken in de D AAL-glyceridenregio van het spectrum te observeren, die de fragmentatie van tag vertegenwoordigen. Het MALDI-spectrum vertoont drie verschillende tag-regio's waarbij de master charge ratio is gebaseerd op het aantal koolstofatomen. Vleugelweefsel van de oosterse rode vleermuis wordt gekenmerkt door dominante pieken in deze drie regio's bij master charge ratio 8 53 0.7 8, 79 0.7 en 907.8.Houd er rekening mee dat wanneer u werkt met levende of geëuthanaseerde vleermuizen, u alle vereiste vergunningen moet verkrijgen voor het hanteren, opslaan en transporteren van deze dieren. Daarnaast moet u toestemming verkrijgen van de institutionele commissie voor dierenzorg en -gebruik (IACUC) en van de institutionele commissie voor biologische veiligheid. Indien er wordt gewerkt met levende vleermuizen of zenuwweefsel van vleermuizen, dient u erop te letten dat alle personen die hiermee werken zijn gevaccineerd tegen rabiës.Bovendien is voor het werken met bepaalde pathogenen van vleermuizen, zoals geo MiSiS mieren, een laboratorium met biosafety level 2 vereist.

profiling-triacylglyceride-contents-bat-integumentary-lipids

Research

JoVE Journal

Chemistry

Scheikunde

Samenstelling van de polaire lipiden extracten en de vetzuursamenstelling van de individuele glycerolipids worden bepaald in een eenvoudige en robuuste lipide profilering experiment. Voor dit doel worden glycerolipids geïsoleerd door dunnelaagchromatografie en onderworpen aan transmethylation van hun acylgroepen. Fatty acyl methylesters worden gekwantificeerd door middel van gas-vloeistofchromatografie.

Arabidopsis thaliana Polar Glycerolipid Profiling door Thin Layer Chromatography (TLC) Samen met de gas-vloeistofchromatografie (GLC)

We stellen robuuste biochemische en microscopische methoden voor het...

Biochemische en High Throughput microscopische beoordeling van Fat Mass in<em&gt; Caenorhabditis Elegans</em

Dithranol (DT, 1,8-dihydroxy-9 ,10-dihydroanthracen-9-on) is eerder gerapporteerd als een MALDI matrix voor weefsel beeldvorming van kleine moleculen, protocollen voor het gebruik van DT voor de MALDI beeldvorming van endogene lipiden op de oppervlak van het weefsel secties door positieve-ion MALDI-MS op een ultrahoge resolutie quadrupool-FTICR instrument worden hier gegeven.

Dithranol als een matrix voor Matrix Assisted Laser desorptie / ionisatie Imaging op een Fourier transform ion cyclotron resonantie spectrometrie

Het vetzuur trofische marker aanpak, dat wil zeggen, de assimilatie van vetzuren als hele molecuul en transfer in consument weefsel met geen of een kleine wijziging, wordt gehinderd door lacunes in de kennis in de vetzuurstofwisseling van kleine bodem-ongewervelde dieren. Isotopologue profilering wordt geleverd als een waardevol instrument te ontwarren trofische interacties.

Profilering van vetzuur 13C Isotopologue geeft inzicht in de trofische Carbon overdracht en lipide metabolisme van ongewervelde consumenten

In reptielen zijn huid lipiden van soortgenoten cruciaal voor seksuele signalering, met potentiële gebruik in beheer van invasieve soorten. Hier beschrijven we protocollen voor het extraheren van huid lipiden uit schuur huid of hele dieren, bepalen en analyseren van de totale lipide-massa en de lipiden met behulp van fractionering via kolom-chromatografie te scheiden.

Chemische isolatie, kwantificering en scheiding van lipiden van de huid van reptielen

Dit protocol is voor de bepaling van lipiden in zeewater en biologische specimens. Lipiden in filtraten worden geëxtraheerd met chloroform of mengsels van chloroform en methanol in het geval van vaste stoffen. Lipideklassen worden gemeten door staaf dunnelaagchromatografie met vlamionisatiedetectie en hun som geeft het totale lipidengehalte.

Bepaling van totale lipide- en lipideklassen in mariene monsters

Shotgun massaspectrometrie-gebaseerde lipidomics levert een gevoelige kwantitatieve momentopname van een breed spectrum van lipidenklassen tegelijkertijd in een enkele meting van verschillende knaagdierweefsels.

Shotgun Lipidomics van Knaagdier weefsels

Het doel van dit protocol is om gedetailleerde richtlijnen te geven over de juiste monstervoorbereiding voor lipide- en metabolietanalyse in kleine weefsels, zoals de Drosophila-hersenen , met behulp van matrixondersteunde laserdesorptie / ionisatie (MALDI) massaspectrometrie beeldvorming.

Monstervoorbereiding voor snelle lipidenanalyse in drosophila-hersenen met behulp van matrixondersteunde laserdesorptie / ionisatie massaspectrometrie beeldvorming

Hier wordt een methode gepresenteerd voor het screenen van lipidestructuren door middel van stabiele isotopenlabeling door gebruik te maken van hun retentietijd, mobiliteit en fragmentatie.

De novo lipiden traceren met behulp van stabiele isotopenetikettering LC-TIMS-TOF MS/MS

Dit protocol beschrijft een uniek klinisch protocol voor het verzamelen van menselijke traanvloeistofmonsters met behulp van fenolrode draden en vloeistofchromatografie-tandem massaspectrometrie (LC-MS/MS)-gebaseerde workflow om het scheurlipidomische profiel te ontdekken. De eenvoudige methyl tert-butylether (MTBE)/methanol biphasische scheidingsmethode maakt snelle traanlipide-extractie mogelijk met hoge opbrengst voor de ontdekking van traanbiomarkers.

Fenolrode draad-gebaseerde bemonsteringsprocedure voor niet-gerichte traanvloeistoflipidomics bij de biomarkerontdekking

Leer triacylglyceriden isoleren uit vleermuizen met dunne-laagchromatografie en MALDI-TOF massaspectrometrie. Deze methode analyseert lipidenprofielen voor chemische signalering in ecologische interacties.

Profilering de triacylglyceride Inhoud in Bat Integumentary Lipids door preparatieve Dunnelaagchromatografie en MALDI-TOF massaspectrometrie (Video) | JoVE Journal

Profilering de triacylglyceride Inhoud in Bat Integumentary Lipids door preparatieve Dunnelaagchromatografie en MALDI-TOF massaspectrometrie

Meer video's verkennen