Name: Sex Stratified neuronale kweken om ischemische Cell Death Pathways Studie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-09T19:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 44 s
Description: Leer hoe je geslachtsgestratificeerde primaire dissociërende neuronale kweken bereidt uit embryonaal hippocampusweefsel. Deze methode maakt onderzoek naar geslachtsspecifieke signalering bij ischemische celdood mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Werk ondersteund gedeeltelijk door de Walter S. en Lucienne Driskill Foundation en NIH R01NS058792.

Alle procedures in dit protocol werden uitgevoerd volgens de richtlijnen van het National Institute of Health voor de ethische behandeling en zorg voor dieren, en volgens een goedgekeurd IACUC-protocol voor diergebruik.
1. Voorbereiding van weefselkweekschotels, kweekmedia en dissectie-instrumenten die ten minste een dag voor de dissectie moeten worden uitgevoerd
<ol>
	<li>Bereid 1 L boraatbuffer: 3,1 g/L boorzuur en 4,75 g/L Borax in dubbel gedestilleerd H2O. Pas pH aan tot 8,4. Filter-steriliseer en bewaar bij 4 °C tot gebruik.</li>
	<li>Verdun poly-D-lysine tot 0,1 mg/ml.
	<ol>
		<li>Plaats onder een laminaire-flow weefselkweekkap voldoende verdunde poly-D-lysine om de bodem van elke put van een multi-well, gekweekte, steriele weefselkweekplaat royaal te bedekken. (Indien gewenst, kunnen voorgereinigde, steriele glas-dekkingen worden toegevoegd aan de bodem van elke put vóór de toevoeging van poly-D-lysine. Dekkingen kunnen zweven na de toevoeging van poly-D-lysine, dus ze moeten worden geduwd met steriele pincetten indien nodig.)</li>
		<li>Incubeer de platen een nacht in de incubator bij 37 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Bereid 1 L dissectiebuffer: 350 mg/L NaHCO3, 2,38 g/L HEPES, 1,44 g/L MgSO4 en 300 mg/L BSA in 1x Hanks Balanced Salt Solution zonder Ca, Mg, natriumpyruvaat of fenolrood. Pas pH aan tot 7,3. Filter-steriliseer en bewaar bij 4 °C tot gebruik.</li>
	<li>Bereid 500 ml plateermedium: 10% foetaal bovien serum, 100 eenheden/ml van elk penicilline en streptomycine, en 2,5 mM glutamine in MEM zonder fenolrood. Filter-steriliseer. Bewaar bij 4 °C tot gebruik. Gooi ongebruikt medium na 1 maand weg.</li>
	<li>Bereid 500 ml voedingsmedium: 2% B-27-supplement, 100 eenheden/ml van elk penicilline en streptomycine, en 2,0 mM GlutaMAX (niet glutamine) in Neurobasal zonder fenolrood. Filter-steriliseer. Bewaar bij 4 °C tot gebruik. Gooi resterend voedingsmedium na 1 maand weg.</li>
	<li>Bereid 10 ml van 100 mM CaCl2, 500 mM EDTA en 1 M NaOH naar behoefte volgens standaardmethoden.</li>
	<li>Autoclaveer de chirurgische/dissectie-instrumenten en bewaar onder steriele omstandigheden tot gebruik. Deze procedure vereist twee scherpe extra-fijne puntige gebogen pincetten, een fijn puntige gebogen pincet, een gekartelde gebogen pincet, een kleine rat-getande pincet, een paar microchirurgische schaar, een paar fijne, smalpuntige chirurgische schaar, een paar mediumpuntige schaar en een stomp eindig dissectie-sonde. Aanvullende steriele instrumenten kunnen worden toegevoegd volgens persoonlijke voorkeur.</li>
</ol>
2. Voorbereiding van weefselkweekschotels, kweekmedia, dissectie-instrumenten en dissectiegebied uit te voeren op de dag van dissectie
<ol>
	<li>Was de poly-D-lysine gecoate weefselkweekplaten. Aspergeer de poly-D-lysine onder de laminaire stroom bioveiligheidskast met een vacuümlijn of pipetteer, voeg water toe aan elke put en incubeer bij kamertemperatuur gedurende ~5 min. Aspergeer het water en vervang het door schoon, sterieel water. Herhaal 3x.
	<ol>
		<li>Laat de platen volledig drogen bij kamertemperatuur.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Bereid het dissectiegebied voor door de toonbank en dissectiescoop af te vegen met 70% ethanol.
	<ol>
		<li>Verzadig een grote Kimwipe met 70% ethanol, en leg de geautoclaveerde dissectiegereedschappen neer. Bedek met een andere Kimwipe.</li>
		<li>Vul een grote, platte schaal met ijs. Label en vul een geschikt aantal 60 mm kweekschotels met koude dissectieoplossing. Bereid genoeg schalen voor om de mannelijke en vrouwelijke hoofden, hersenen en hippocampi gescheiden te houden (indien van toepassing).</li>
		<li>Vul twee grotere 100 mm kweekschotels met koude dissectiebuffer.</li>
		<li>Zet een aparte 100 mm schaal zonder buffer opzij (droog).</li>
		<li>Stel een gebied in voor biogevaar afval en een ander voor dierlijk weefsel (om na de dissectie te worden weggegooid, volgens institutionele normen).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Verwarm 30 ml plateermedium in een 37 °C waterbad. Deze warme oplossing wordt gebruikt in de celdissociatie fase van het protocol.</li>
	<li>Plaats 1 ml plateermedium in elke put van 24-well, poly-D-lysine gecoate, weefselkweekplaat. Gebruik een kleiner volume indien kleinere platen worden gebruikt. Plaats de afgedekte plaat in een 37 °C incubator bij 5% CO2 om op te warmen en te gelijkstellen aan de CO2 tijdens de dissectie.</li>
	<li>Bereid de papaïneoplossing voor.
	<ol>
		<li>Label twee 15 ml steriele conische buisjes, een als "mannelijk" en de andere als "vrouwelijk".</li>
		<li>Voeg aan elke buis het volgende toe: 10 ml dissectiebuffer, 150 μl 100 mM CaCl2, 10 μl 500 mM EDTA, 10μl 1 M NaOH en 150 U papaïne.</li>
		<li>Meng voorzichtig door de buis drie keer om te keren, verwarm vervolgens in een 37 °C waterbad. Opmerking: Elke flacon papaïne zal een andere eenheid van activiteit per mg papaïne hebben, dus het volume papaïne dat aan de oplossing wordt toegevoegd, zal van flacon tot flacon verschillen. De papaïne zal aanvankelijk troebel zijn, maar de oplossing zal opklaren naarmate de papaïne volle

<ol><li>Andreano, J. M., Cahill, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sex+influences+on+the+neurobiology+of+learning+and+memory%5BTitle%5D)+AND+%22Learn+Mem%22%5BJournal%5D)">Sex influences on the neurobiology of learning and memory.</a> Learn Mem. 16, 248-266 (2009).</li>
<li>Arnold, A. P., Burgoyne, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Are+XX+and+XY+brain+cells+intrinsically+different%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Endocrinol.+Metab%22%5BJournal%5D)">Are XX and XY brain cells intrinsically different.</a> Trends Endocrinol. Metab. 15, 6-11 (2004).</li>
<li>Cahill, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Why+sex+matters+for+neuroscience%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Why sex matters for neuroscience.</a> Nat. Rev. Neurosci. 7, 477-484 (2006).</li>
<li>Jazin, E., Cahill, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sex+differences+in+molecular+neuroscience%3A+from+fruit+flies+to+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Sex differences in molecular neuroscience: from fruit flies to humans.</a> Nat. Rev. Neurosci. 11, 9-17 (2010).</li>
<li>Morris, J. A., Jordan, C. L., Breedlove, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sexual+differentiation+of+the+vertebrate+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Sexual differentiation of the vertebrate nervous system.</a> Nat. Neurosci. 7, 1034-1039 (2004).</li>
<li>Lang, J. T., McCullough, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathways+to+ischemic+neuronal+cell+death%3A+are+sex+differences+relevant%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Transl.+Med%22%5BJournal%5D)">Pathways to ischemic neuronal cell death: are sex differences relevant.</a> J. Transl. Med. 6, 33(2008).</li>
<li>Van Den Eeden, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incidence+of+Parkinson%27s+disease%3A+variation+by+age%2C+gender%2C+and+race%2Fethnicity%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Epidemiol%22%5BJournal%5D)">Incidence of Parkinson's disease: variation by age, gender, and race/ethnicity.</a> Am. J. Epidemiol. 157, 1015-1022 (2003).</li>
<li>Abel, K. M., Drake, R., Goldstein, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sex+differences+in+schizophrenia%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+Rev.+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Sex differences in schizophrenia.</a> Int. Rev. Psychiatry. 22, 417-428 (2010).</li>
<li>Vest, R. S., Pike, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gender%2C+sex+steroid+hormones%2C+and+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Horm.+Behav%22%5BJournal%5D)">Gender, sex steroid hormones, and Alzheimer's disease.</a> Horm. Behav. 63, 301-307 (2013).</li>
<li>Fernandez-Guasti, A., Fiedler, J. L., Herrera, L., Handa, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sex%2C+stress%2C+and+mood+disorders%3A+at+the+intersection+of+adrenal+and+gonadal+hormones%5BTitle%5D)+AND+%22Horm.+Metab.+Res%22%5BJournal%5D)">Sex, stress, and mood disorders: at the intersection of adrenal and gonadal hormones.</a> Horm. Metab. Res. 44, 607-618 (2012).</li>
<li>Hall, E. D., Pazara, K. E., Linseman, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sex+differences+in+postischemic+neuronal+necrosis+in+gerbils%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cereb.+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">Sex differences in postischemic neuronal necrosis in gerbils.</a> J. Cereb. Blood Flow Metab. 11, 292-298 (1991).</li>
<li>Hawk, T., Zhang, Y. Q., Rajakumar, G., Day, A. L., Simpkins, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Testosterone+increases+and+estradiol+decreases+middle+cerebral+artery+occlusion+lesion+size+in+male+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Testosterone increases and estradiol decreases middle cerebral artery occlusion lesion size in male rats.</a> Brain Res. 796, 296-298 (1998).</li>
<li>Nakano, T., Hurn, P. D., Herson, P. S., Traystman, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Testosterone+exacerbates+neuronal+damage+following+cardiac+arrest+and+cardiopulmonary+resuscitation+in+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Testosterone exacerbates neuronal damage following cardiac arrest and cardiopulmonary resuscitation in mouse.</a> Brain Res. 1357, 124-130 (2010).</li>
<li>Pan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+testosterone+on+functional+recovery+in+a+castrate+male+rat+stroke+model%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Effect of testosterone on functional recovery in a castrate male rat stroke model.</a> Brain Res. 1043, 195-204 (2005).</li>
<li>Siegel, C., Turtzo, C., McCullough, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sex+differences+in+cerebral+ischemia%3A+possible+molecular+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Res%22%5BJournal%5D)">Sex differences in cerebral ischemia: possible molecular mechanisms.</a> J. Neurosci. Res. 88, 2765-2774 (2010).</li>
<li>Uchida, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dose-dependent+effects+of+androgens+on+outcome+after+focal+cerebral+ischemia+in+adult+male+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cereb.+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">Dose-dependent effects of androgens on outcome after focal cerebral ischemia in adult male mice.</a> J. Cereb. Blood Flow Metab. 29, 1454-1462 (2009).</li>
<li>Yang, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Testosterone+increases+neurotoxicity+of+glutamate+in+vitro+and+ischemia-reperfusion+injury+in+an+animal+model%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Testosterone increases neurotoxicity of glutamate in vitro and ischemia-reperfusion injury in an animal model.</a> J. Appl. Physiol. 92, 195-201 (2002).</li>
<li>Cheng, J., Alkayed, N. J., Hurn, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deleterious+effects+of+dihydrotestosterone+on+cerebral+ischemic+injury%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cereb.+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">Deleterious effects of dihydrotestosterone on cerebral ischemic injury.</a> J. Cereb. Blood Flow Metab. 27, 1553-1562 (2007).</li>
<li>Nunez, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sex+and+steroid+hormones+in+early+brain+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Rev.+Endocr.+Metab.+Disord%22%5BJournal%5D)">Sex and steroid hormones in early brain injury.</a> Rev. Endocr. Metab. Disord. 13, 173-186 (2012).</li>
<li>Renolleau, S., Fau, S., Charriaut-Marlangue, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gender-related+differences+in+apoptotic+pathways+after+neonatal+cerebral+ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscientist%22%5BJournal%5D)">Gender-related differences in apoptotic pathways after neonatal cerebral ischemia.</a> Neuroscientist. 14, 46-52 (2008).</li>
<li>McCarthy, M. M., Konkle, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((When+is+a+sex+difference+not+a+sex+difference%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neuroendocrinol%22%5BJournal%5D)">When is a sex difference not a sex difference.</a> Front Neuroendocrinol. 26, 85-102 (2005).</li>
<li>Aarts, M. M., Tymianski, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRPMs+and+neuronal+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Arch%22%5BJournal%5D)">TRPMs and neuronal cell death.</a> Pflugers Arch. 451, 243-249 (2005).</li>
<li>Jiang, L. -H., Yang, W., Zou, J., Beech, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRPM2+channel+properties%2C+functions+and+therapeutic+potentials%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opin.+Ther.+Targets%22%5BJournal%5D)">TRPM2 channel properties, functions and therapeutic potentials.</a> Expert Opin. Ther. Targets. 14, 973-988 (2010).</li>
<li>Jia, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sex+differences+in+neuroprotection+provided+by+inhibition+of+TRPM2+channels+following+experimental+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cereb.+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">Sex differences in neuroprotection provided by inhibition of TRPM2 channels following experimental stroke.</a> J. Cereb. Blood Flow Metab. 31, 2160-2168 (2011).</li>
<li>Fairbanks, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+the+sex+difference+in+neuronal+ischemic+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Mechanism of the sex difference in neuronal ischemic cell death.</a> Neuroscience. 219, 183-191 (2012).</li>
<li>Verma, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRPM2+channel+activation+following+in+vitro+ischemia+contributes+to+male+hippocampal+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci.+Lett%22%5BJournal%5D)">TRPM2 channel activation following in vitro ischemia contributes to male hippocampal cell death.</a> Neurosci. Lett. 530, 41-46 (2012).</li>
<li>Bai, P., Canto, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+PARP-1+and+PARP-2+enzymes+in+metabolic+regulation+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">The role of PARP-1 and PARP-2 enzymes in metabolic regulation and disease.</a> Cell Metab. 16, 290-295 (2012).</li>
<li>Blenn, C., Wyrsch, P., Bader, J., Bollhalder, M., Althaus, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Poly%28ADP-ribose%29glycohydrolase+is+an+upstream+regulator+of+Ca2%2B+fluxes+in+oxidative+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol.+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Poly(ADP-ribose)glycohydrolase is an upstream regulator of Ca2+ fluxes in oxidative cell death.</a> Cell Mol. Life Sci. 68, 1455-1466 (2011).</li>
<li>Buelow, B., Song, Y., Scharenberg, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Poly%28ADP-ribose%29+polymerase+PARP-1+is+required+for+oxidative+stress-induced+TRPM2+activation+in+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">The Poly(ADP-ribose) polymerase PARP-1 is required for oxidative stress-induced TRPM2 activation in lymphocytes.</a> J. Biol. Chem. 283, 24571-24583 (2008).</li>
<li>Fonfria, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRPM2+channel+opening+in+response+to+oxidative+stress+is+dependent+on+activation+of+poly%28ADP-ribose%29+polymerase%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">TRPM2 channel opening in response to oxidative stress is dependent on activation of poly(ADP-ribose) polymerase.</a> Br. J. Pharmacol. 143, 186-192 (2004).</li>
<li>Miller, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+TRPM2+function+by+PARP+inhibitors+protects+cells+from+oxidative+stress-induced+death%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Inhibition of TRPM2 function by PARP inhibitors protects cells from oxidative stress-induced death.</a> Br. J. Pharmacol. 143, 515-516 (2004).</li>
<li>Vagnerova, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Poly+%28ADP-ribose%29+polymerase-1+initiated+neuronal+cell+death+pathway--do+androgens+matter%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Poly (ADP-ribose) polymerase-1 initiated neuronal cell death pathway--do androgens matter.</a> Neuroscience. , 166-476 (2010).</li>
<li>Yuan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sex+differences+in+the+response+to+activation+of+the+poly+%28ADP-ribose%29+polymerase+pathway+after+experimental+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Sex differences in the response to activation of the poly (ADP-ribose) polymerase pathway after experimental stroke.</a> Exp. Neurol. 217, 210-218 (2009).</li>
<li>Berthois, Y., Katzenellenbogen, J. A., Katzenellenbogen, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenol+red+in+tissue+culture+media+is+a+weak+estrogen%3A+implications+concerning+the+study+of+estrogen-responsive+cells+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Phenol red in tissue culture media is a weak estrogen: implications concerning the study of estrogen-responsive cells in culture.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83, 2496-2500 (1986).</li>
<li>Dumesic, D. A., Renk, M., Kamel, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estrogenic+effects+of+phenol+red+on+rat+pituitary+cell+responsiveness+to+gonadotropin-releasing+hormone%5BTitle%5D)+AND+%22Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Estrogenic effects of phenol red on rat pituitary cell responsiveness to gonadotropin-releasing hormone.</a> Life Sci. 44, 397-406 (1989).</li>
<li>Ernst, M., Schmid, C., Froesch, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenol+red+mimics+biological+actions+of+estradiol%3A+enhancement+of+osteoblast+proliferation+in+vitro+and+of+type+I+collagen+gene+expression+in+bone+and+uterus+of+rats+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Steroid+Biochem%22%5BJournal%5D)">Phenol red mimics biological actions of estradiol: enhancement of osteoblast proliferation in vitro and of type I collagen gene expression in bone and uterus of rats in vivo.</a> J. Steroid Biochem. 33, 907-914 (1989).</li>
<li>Hubert, J. F., Vincent, A., Labrie, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estrogenic+activity+of+phenol+red+in+rat+anterior+pituitary+cells+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">Estrogenic activity of phenol red in rat anterior pituitary cells in culture.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 141, 885-891 (1986).</li>
<li>Ortmann, O., Sturm, R., Knuppen, R., Emons, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Weak+estrogenic+activity+of+phenol+red+in+the+pituitary+gonadotroph%3A+re-evaluation+of+estrogen+and+antiestrogen+effects%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Steroid+Biochem%22%5BJournal%5D)">Weak estrogenic activity of phenol red in the pituitary gonadotroph: re-evaluation of estrogen and antiestrogen effects.</a> J. Steroid Biochem. 35, 17-22 (1990).</li>
<li>Rajendran, K. G., Lopez, T., Parikh, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estrogenic+effect+of+phenol+red+in+MCF-7+cells+is+achieved+through+activation+of+estrogen+receptor+by+interacting+with+a+site+distinct+from+the+steroid+binding+site%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">Estrogenic effect of phenol red in MCF-7 cells is achieved through activation of estrogen receptor by interacting with a site distinct from the steroid binding site.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 142, 724-731 (1987).</li>
<li>Welshons, W. V., Wolf, M. F., Murphy, C. S., Jordan, V. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estrogenic+activity+of+phenol+red%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Estrogenic activity of phenol red.</a> Mol. Cell Endocrinol. 57, 169-178 (1988).</li>
<li>Moreno-Cuevas, J. E., Sirbasku, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estrogen+mitogenic+action.+III.+is+phenol+red+a+%22red+herring%22%3F%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro+Cell+Dev.+Biol.+Anim%22%5BJournal%5D)">Estrogen mitogenic action. III. is phenol red a "red herring"?</a> In Vitro Cell Dev. Biol. Anim. 36, 447-464 (2000).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Primaire gescheiden hippocampale neuronale culturen, gestratificeerd naar geslacht, waarbij mannelijke en vrouwelijke hippocampi worden gedisseceerd, gescheiden en afzonderlijk gekweekt, vormen een nuttig hulpmiddel voor het onderzoeken van geslachtsspecifieke celsignalering bij neuronceldood. Hoewel neurowetenschappers gewoonlijk primaire neuronale culturen gebruiken, variëren de protocollen tussen laboratoria afhankelijk van hun specifieke experimentele doelen en interesses. Veel onderzoekers kiezen ervoor om neuronen ...

Zoogdieren zijn seksueel dimorf, waarbij mannetjes en vrouwtjes verschillende kenmerken en eigenschappen vertonen. Geslachtsverschillen reiken zelfs tot in de hersenen en zijn duidelijk in de vatbaarheid van neuronen voor letsel en ziekte (besproken in1-5). Bijvoorbeeld, het hersenen van het mannetje is vatbaarder voor ischemische neuronale schade door een beroerte of hartstilstand gevolgd door reanimatie (besproken in6). De ziekte van Parkinson (besproken in7) en schizofrenie (besproken in8) komen vaker voor bij mensen van het mannelijke geslacht dan bij vrouwen, terwijl de menselijke vrouwelijke hersenen vatbaarder lijken te zijn voor de ziekte van Alzheimer (besproken in9) en stemmingsstoornissen zoals depressie (besproken in10). Ondanks waarneembare verschillen tussen geslachten in de vatbaarheid voor neuronaal letsel en ziekte, falen de meeste huidige behandelingsparadigma's om rekening te houden met geslacht en zijn ze vergelijkbaar bij zowel mannen als vrouwen. Meer succes zou kunnen worden bereikt als er rekening werd gehouden met en begrip werd gekregen voor geslachtsverschillen.
In vivo diermodellen van neuronale schade en ziekte vertonen seksueel dimorfisme vergelijkbaar met mensen en zijn van cruciaal belang voor het verbeteren van ons begrip van geslachtsverschillen en hoe die verschillen bijdragen aan neuronale overleving en functie. Bewijs heeft bijvoorbeeld aangetoond dat mannelijke knaagdieren vatbaarder zijn dan vrouwtjes voor ischemische neuronale schade11-15. Deze verschil wordt geacht ten minste gedeeltelijk afhankelijk te zijn van de moleculaire signalering van testosteron, het primaire mannelijke geslachtshormoon, en oestrogeen, het primaire vrouwelijke geslachtshormoon. Studies met gecastreerde mannelijke en vrouwelijke knaagdieren onthullen dat testosteron en de testosteronmetaboliet, dihydrotestosteron (DHT) neuronale schade na cerebrale ischemie verergeren en oestrogeen vermindert12-14,16-18. Geslachtsverschillen in cerebrale ischemie zijn echter aanwezig bij zowel neonaten als volwassen dieren19,20. Neonaten ervaren pieken in oestrogeen of testosteron in utero tijdens de ontwikkeling, maar hebben relatief lage hormoonniveaus na de geboorte tot de puberteit (besproken in21). Dus, de aanwezigheid of afwezigheid van het primaire geslachtshormoon is niet de enige bepalende factor voor geslachtsbeïnvloede neuronale vatbaarheid voor letsel. Inderdaad, het is waarschijnlijk dat seksuele dimorfismen tijdens de ontwikkeling worden vastgesteld die resulteren in verschillen in celsignalering en reactie op ischemie, zelfs wanneer hormoonniveaus laag zijn.
Ongeacht of geslachtsverschillen afhankelijk zijn van de aanwezigheid van geslachtshormoon of dat ze te wijten zijn aan dimorfismen die tijdens de ontwikkeling zijn vastgesteld, wordt bij verder onderzoek duidelijk dat er verschillen zijn in celsignalering tussen mannen en vrouwen in de hersenen. In het Herson Lab aan de University of Colorado School of Medicine hebben we een dergelijk verschil geïdentificeerd. We hebben gevonden dat het calcium-, natrium- en kaliumdoorlatende ionkanaal, TRPM2 (besproken in22,23), neuronale celdood induceert na ischemische insult in vivo bij het mannetje maar niet bij het vrouwtje muis24. We tonen aan dat farmacologische remming of genetische knockdown van TRPM2 beschermend is bij het mannetje maar niet bij het vrouwtje muis in ons in vivo midden carotidale arteriële occlusie (MCAO) model van beroerte24.
Ondanks hun nuttigheid, kunnen in vivo diermodellen van ischemische neuronale schade, soms, beperkt zijn voor moleculaire studies van neuronale dood, vanwege de moeilijkheid of onmogelijkheid om specifiek neuronen voor onderzoek te targeten. Om deze reden gebruikt ons lab primaire gedissocieerde corticale of hippocampale neuronen in vitro om ons in vivo werk aan te vullen. Primaire gedissocieerde neuronculturen bieden een nuttig hulpmiddel om de celsignaleringspaden die betrokken zijn bij neuronale schade en ziekte te onderzoeken. Neuronen in cultuur kunnen worden gehandhaafd in een nauwkeurig gecontroleerde omgeving, met of zonder gliale input. In afwezigheid van gliale cellen zijn alle waargenomen reacties in cultuur neuronaal. Farmacologische middelen kunnen aan de cultuur worden toegediend zonder zorgen over absorptie door de bloed-hersenbarrière, wat de remming of activering van specifieke componenten van een gegeven signaaltransductieroute mogelijk maakt. Moleculaire biologie kan worden gebruikt om verschillende eiwitten van belang te overexpresseren of te knockdownen, en elektrofysiologische metingen kunnen worden uitgevoerd op individuele cellen, iets wat niet mogelijk zou zijn in een in vivo modelsysteem.
Het Herson Lab breidt de bruikbaarheid van primaire gedissocieerde neuronale culturen uit door eerst de geslachtsverdeling van de embryo's te bepalen die worden gebruikt om de culturen voor te bereiden. Mannelijke en vrouwelijke geslachtsgestratificeerde neuronculturen tonen duidelijk aan dat mannelijke neuronen vatbaarder zijn dan vrouwelijke neuronen voor neuronale celdood na zuurstof- en glucosedeprivatie25. Zuurstof- en glucosedeprivatie is een geaccepteerd in vitro model van neuronale ischemie aangezien ischemie de zuurstof- en glucosebeschikbaarheid voor de hersenen vermindert. Verder hebben we met elektrofysiologische experimenten in gedissocieerde, geslachtsgestratificeerde neuronen aangetoond dat TRPM2 wordt geactiveerd in mannelijke maar niet in vrouwelijke neuronen24,26. We onderzoeken momenteel de moleculaire geslachtsspecifieke regulatoren van TRPM2-activiteit24,26. Hier delen en bespreken we ons protocol voor het vaststellen van geslachtsgestratificeerde primaire embryonale gedissocieerde hippocampale neuronculturen en presenteren we representatieve gegevens met behulp van deze methode die suggereren dat het DNA-reparatie-enzym

```html
<table><tbody><tr><td>B27 Supplement</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Borax</td><td>Sigma</td><td>71997</td><td></td></tr><tr><td>Boriumzuur</td><td>Sigma</td><td>B6768</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumine</td><td>Sigma</td><td>A4503</td><td></td></tr><tr><td>Foetaal bovien serum</td><td>Invitrogen</td><td>26140-079</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Invitrogen</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>Glutamine</td><td>Invitrogen</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>HBSS, geen calcium, geen magnesium, geen fenolrood</td><td>Invitrogen</td><td>14175-095</td><td></td></tr><tr><td>MEM, geen glutamine, geen fenolrood</td><td>Invitrogen</td><td>51200-038</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal, geen glutamine, geen fenolrood</td><td>Invitrogen</td><td>12348-017</td><td></td></tr><tr><td>Penicilline/Streptomycine</td><td>Invitrogen</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>Poly-D-lysine, MW 70.000-150.000</td><td>Sigma</td><td>P0899</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blauw 0,4%</td><td>Invitrogen</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>UITRUSTING</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5/45 Hoekstang</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-35</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #7 &ndash; Fijne Gebogen Tang</td><td>Fine Science Tools</td><td>11274-20</td><td></td></tr><tr><td>Gekartelde (London) Tang</td><td>Fine Science Tools</td><td>11080-02</td><td></td></tr><tr><td>Extra Fijn Graefe Tang 1 x 2 tanden</td><td>Fine Science Tools</td><td>11153-10</td><td></td></tr><tr><td>Moria Veerschaar</td><td>Fine Science Tools</td><td>15396-00</td><td></td></tr><tr><td>Middelgrote Operatieschaar</td><td>Roboz Surgical</td><td>RS-6812</td><td></td></tr><tr><td>Extra Fijne Microdissectieschaar</td><td>Roboz Surgical</td><td>RS-5880</td><td></td></tr><tr><td>24-wells Tissue Cultuur Platen</td><td>Fisher</td><td>87721</td><td></td></tr><tr><td>Celzeef, 40 &micro;M Nylon Mesh</td><td>BD Biosciences</td><td>352340</td><td></td></tr></tbody></table>
```

sex stratified neuronale kweken om ischemische cell death pathways studie

Sex Stratified Neuronal Cultures to Study Ischemic Cell Death Pathways

Sekseverschillen in neuronale vatbaarheid voor ischemische schade en neurodegeneratieve ziekten worden al lang waargenomen, maar de signaalmechanismen die verantwoordelijk zijn voor die verschillen blijven onduidelijk. Primaire gedissocieerde embryonale neuronale kweek biedt een vereenvoudigd experimenteel model waarmee de neuronale celsignalering die betrokken is bij celdood als gevolg van ischemie of ziekte kan worden onderzocht; echter, de meeste neuronale culturen die tegenwoordig in onderzoek worden gebruikt, zijn van gemengd geslacht. Onderzoekers kunnen en doen de effecten van behandeling met geslachtssteroïden testen in neuronale culturen van gemengd geslacht in modellen van neuronale schade en ziekte, maar de ophoping van bewijs suggereert dat de vrouwelijke hersenen anders reageren op androgenen, oestrogenen en progesteron dan de mannelijke hersenen. Bovendien reageren neonatale mannelijke en vrouwelijke knaagdieren anders op ischemische schade, waarbij mannetjes meer schade ervaren na cerebrale ischemie dan vrouwtjes. Dus gemengde sekse neuronale culturen kunnen de experimentele resultaten verdoezelen en verwarren; belangrijke informatie kan worden gemist. Om deze reden bereidt het Herson Lab aan de University of Colorado School of Medicine routinematig sekse-gestratificeerde primaire gedissocieerde embryonale neuronale culturen voor van zowel de hippocampus als de cortex. Embryo's worden geslacht voordat hersenweefsel wordt geoogst en mannelijk en vrouwelijk weefsel worden apart gedissocieerd, apart geplaatst en apart onderhouden. Met behulp van deze methode heeft het Herson Lab een mannelijk-specifieke rol voor het ionenkanaal TRPM2 in ischemische celdood aangetoond. In dit manuscript delen en bespreken we ons protocol voor het geslacht bepalen van embryonale muizen en het voorbereiden van sekse-gestratificeerde hippocampale primaire gedissocieerde neuronculturen. Deze methode kan worden aangepast om sekse-gestratificeerde corticale culturen te bereiden en de methode voor het geslacht bepalen van embryo's kan worden gebruikt in combinatie met andere protocollen voor elk onderzoek waarbij geslacht wordt beschouwd als een belangrijk determinant van het resultaat.

Het correct bepalen van het geslacht van embryonale muizen is een cruciale stap bij de preparatie van geslachtsgestratificeerde primaire neuronenculturen. Om te waarborgen dat de hippocampi van mannetjes en vrouwtjes apart werden gekweekt vanuit correct gesexeerde pups, werden de embryo's op basis van geslacht gescheiden en werden hun cortex en hippocampus geoogst. Genomisch DNA werd geïsoleerd uit het geoogste weefsel van elk embryo volgens standaardprocedures, waarbij zorgvuldig werd toegezien op de scheiding van de ge...

Primaire gedissocieerde embryonale hippocampale neuronale culturen zijn nuttig voor het onderzoeken van de signaalmechanismen die betrokken zijn bij neurondood. Het bepalen van het geslacht van de embryo's vóór de isolatie en dissociatie van de hippocampus maakt de voorbereiding van afzonderlijke mannelijke en vrouwelijke culturen mogelijk, waardoor de onderzoeker geslachtsspecifieke celsignalering kan identificeren en onderzoeken.

Sex Stratified neuronale kweken om ischemische Cell Death Pathways Studie

Sex differences in neuronal susceptibility to ischemic injury and neurodegenerative disease have long been observed, but the signaling mechanisms ...

Het algemene doel van deze procedure is het prepareren van naar geslacht gestratificeerde, primaire gedissocieerde neuronenculturen uit de hippocampus. De eerste stap van de procedure is het bepalen van het geslacht en het dissekeren van embryo's op embryonale dag 18, om naar geslacht gestratificeerde primaire neuronenculturen te verkrijgen. De volgende stap is het prepareren van gedissocieerde neuronen uit het neuronale weefsel.De laatste stap is het uitplaten van de neuronen met de juiste dichtheid en het laten groeien ervan voor experimentele doeleinden. Uiteindelijk kan deze methode, in combinatie met andere protocollen, worden gebruikt voor elke studie waarin geslacht wordt beschouwd als een belangrijke determinant voor de uitkomst. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen het genderonderzoek, zoals de vraag of mannelijke en vrouwelijke knaagdieren verschillend reageren op neuronale ischemie. Van de verschillende vereiste preparaten waren er enkele die een herhaling waard waren, zoals de weefselkweekplaten.Bereid een verdunning van poly-D-lysine tot 0,1 mg/mL. Bedek vervolgens, onder een laminaire flow-kap voor weefselkweek, de bodem van elke put van

sex-stratified-neuronal-cultures-to-study-ischemic-cell-death-pathways

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

This video demonstrates the technique of assessing neuronal death in rhinal cortex-hippocampus organotypic slices. Neuronal death occurs via evolving epileptic seizures — resembling in vivo epilepsy — and is detected through dual-staining of the dead cells using propidium iodide and immunofluorescence.

Neuronal Death Assay to Evaluate Cell Death in Ex Vivo Epilepsy Model

This video demonstrates an ex vivo technique to induce brain cell death mediated through cytotoxic CD8+ T cells. Upon obtaining brain slices, activated oligodendrocyte-directed CD8+ T cells are transferred onto the slices to target the myelin sheath and oligodendrocytes. Post-incubation, the damage to myelin and neuronal death can be assessed histologically in the regions of interest.

An Ex Vivo Technique to Induce Neuronal Death via Oligodendrocyte-Specific CD8+ T Cells

Bilaterale carotis occlusie combinatie met systemische hypotensie produceert wereldwijde hersenen ischemie in de rat, met schade aan de hippocampus met reproduceerbare ernst. Proefdieren worden verminderd met voorspelbare patronen van hersenbeschadiging, ze herstellen doelmatig en sterftecijfers zijn relatief laag.

2-Vessel Occlusie / Hypotensie: een rat model van Global Brain Ischemie

We hebben hersenen slice model dat gebruikt kan worden om de moleculaire mechanismen betrokken bij-gemedieerde excitotoxiciteit hersenletsel onderzoeken ontwikkeld. Deze techniek genereert levensvatbare volwassen hersenweefsel en vermindert nummers die nodig zijn voor experimenten dier, met behoud van de neuronale circuits, cellulaire interacties, en postsynaptische compartimenten gedeeltelijk intact.

Excitotoxische Stimulatie van Hersenen Microslices als<em&gt; In vitro</em&gt; Model van een beroerte

Deze studie presenteert een techniek voor de isolatie van neuronen van WT-neonatale muizen. Het vereist de zorgvuldige dissectie van het ruggenmerg van de neonatale muis, gevolgd door de scheiding van neuronen uit het ruggenmergweefsel door mechanische en enzymatische splitsing.

Spinal Cord Neurons Isolatie en Cultuur van Neonatale Muizen

Dit protocol beschrijft een eenvoudige methode om te isoleren en primaire muisknop cerebrale submodule neuronen (CGNs) van 6-7 dag oud pups, efficiënte transductie van CGNs voor verlies en winst van functie studies, kweken en modellering NMDA-geïnduceerde neuronale excitotoxicity, lage-kalium-veroorzaakte celdood, DNA-schade en oxidatieve stress met behulp van de zelfde cultuur-model.

Modelleren van neuronale dood en degeneratie in muis primaire cerebellaire submodule neuronen

Een protocol om vrij zwevende segment culturen van volwassen menselijk brein voor te bereiden wordt gepresenteerd. Het protocol is een variatie van de veelgebruikte segment cultuurmethode met behulp van membraan inserts. Het is eenvoudig, kosteneffectief, en aanbevolen voor het uitvoeren van korte termijn testen gericht op het ontrafelen van mechanismen van neurodegeneratie achter de leeftijd geassocieerde hersenziekten.

Korte-termijn vrij zwevende segment culturen van het volwassen menselijk brein

Organotypische segment culturen zijn een krachtig hulpmiddel om neuroontwikkelingsof degeneratieve/regeneratieve processen te bestuderen. Hier beschrijven we een protocol dat de neuroontwikkelingsdood van Purkinje-cellen in muizen cerebellaire segment culturen modelheeft. Deze methode kan profiteren van onderzoek in neuroprotectieve Drug Discovery.

Purkinje-celoverleving in Organotypische cerebellaire segment culturen

Hier presenteren we een eenvoudige aanpak met behulp van specifieke cultuurmedia die de oprichting van neuron- en astrocytenverrijkte culturen, of neuron-glia culturen uit de embryonale cortex, met hoge opbrengst en reproduceerbaarheid mogelijk maakt.

Een cel cultuur model voor het bestuderen van de rol van Neuron-Glia Interacties in Ischemie

Een krachtige manier om de neuronale lawines, dat wil zeggen schaal-invariant spatio-temporele activiteit uitbarstingen, indicatief van kritieke toestand dynamiek in cortex te bestuderen. Lawines ontstaan ​​spontaan in de ontwikkeling van oppervlakkige lagen van gekweekte hersenschors, die voor de lange termijn metingen van de activiteit mogelijk maakt met vlakke geïntegreerde multi-elektrode arrays (MEA) onder nauwkeurig gecontroleerde omstandigheden.

Multi-electrode array Opnamen van neuronale Lawines in organotypische culturen

Leer hoe je geslachtsgestratificeerde primaire dissociërende neuronale kweken bereidt uit embryonaal hippocampusweefsel. Deze methode maakt onderzoek naar geslachtsspecifieke signalering bij ischemische celdood mogelijk.

Sex Stratified neuronale kweken om ischemische Cell Death Pathways Studie

Meer video's verkennen