Name: Isolatie en Th17 Differentiatie van naïeve CD4 T-lymfocyten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-26T21:15:00.000+00:00
Duration: 12 min 59 s
Description: Leer Th17-differentiatie van naïeve CD4+ T-lymfocyten voor immunologisch onderzoek met C57BL/6 muizen. Deze methode helpt bij het bestuderen van auto-immuunziekten en inflammatoire responsen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk wordt mede ondersteund door de NIH / NCATS klinisch en translationeel Science Awards aan de Universiteit van Florida TL1 TR000066 en UL1 TR000064, een diversiteit supplement van Parent Grant R01AI056152 van het National Institute of Health, een BD Biosciences reagens subsidie, en de Universiteit van Florida.

Alle dierlijke gebruik werd uitgevoerd in overeenstemming met protocollen door de Institutional Animal Care en gebruik Comite. 1. Voorbereiding van mengsels en Media <ol><li> Steriele PBS pH: 7,3 (1 L) 0,23 g NaH 2PO 4 1,15 g Na 2 HPO 4 9,0 g NaCl Nemen volume met DI water. Steriliseren met autoclaaf. </li><li> Celkweek media (100 ml) 89 ml RPMI 10 ml 10% FBS 1 ml Antibiotica Anti-schimmel (ABAM) 100 ug 50 mM 2-mercapto-ethanol (3,5 pg voorraad 2-mercapto-ethanol in 96.5 ug PBS) </li><li> FACS buffer (TL Activating Cell Sorting) (Te gebruiken tijdens flowcytometrie) 2% FBS in steriele PBS </li><li> iTh17 Mix (Gebaseerd op aantal monsters, bepalen de benodigde volume voor alle mengsels en media) 1,5 ug / ml anti-CD28 20 ng / ml IL-6 5 ng / mlTGF-β </li></ol> 2. Cellen worden in drievoud uitgeplaat onder de volgende voorwaarden <ol><li> Plaat gebonden anti-CD3, anti-CD28 (dit is de bedieningseenheid mix). </li><li> iTH17: plaat gebonden anti-CD3, anti-CD28, IL-6, TGF-β. </li></ol> 3. -Plaat gebonden anti-CD3 (10 ug / ml) Aanbevolen wordt de bereiding van plaat gebonden anti-CD3 platen geschiedt ten minste 4 uur voorafgaand aan het tijdstip cellen worden toegevoegd aan de platen. <ol><li> Voeg 30 pi anti-CD3 putjes (anti-CD3 wordt verdund in steriele PBS) van een nieuwe met 96 U bodem Microtest weefselkweekplaat en zijdelings op de plaat uniforme dekking van de putjes waarborgen. Incubeer bij 37 ° C gedurende 4 uur en koel dan tot het tijd is om het mixen en cellen aan de plaat. </li></ol> 4. Muis Dissection <ol><li> Dit protocol is gebaseerd op het gebruik van C57BL / 6 mice, 3-8 maanden oud, en gekocht van The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME). </li><li> Sacrifice muis met behulp van CO 2 stikken, en bevestig de dood met aansluitend cervicale dislocatie. </li><li> Steriliseren muizen dissectie-instrumenten en incisie met 70% ethanol en beginnen dissectie. </li><li> Van de ventrale uitzicht, pak de huid die is juist voor de urethra opening en gaan knippen met een schaar van de ventrale middellijn tot aan de kin. Neem voorzorgsmaatregelen niet scheurt of gesneden in de voering van de peritoneale muur. </li><li> Trek de huid en vastpinnen op comfortabele toegang naar de lymfeklieren mogelijk te maken tijdens het verwijderen. </li><li> De lymfklieren en milten verzameld alle verwijderd met een pincet en geplaatst in een steriele petrischaal met 5 ml AutoMACS loopbuffer gekocht bij Miltenyi Biotec (zie figuren 2 en 3 voor lymfeklier en milt verwijdering diagrammen). <ol><li> Verwijder de oksellymfeknopen diegevonden in de buurt van de oksel (oksel) achter de borstspieren van elke muis. </li><li> Verwijder de brachialis lymfeklieren die zich bevinden in het bindweefsel in de buurt van elke oksel. </li><li> Verwijder de oppervlakkige cervicale lymfeknopen in de hals van elke muis. </li><li> Verwijder de inguinale lymfeknopen die zich in de heup gebied bij de verbinding van de 3 bloedvaten. </li><li> Voor toegang tot de lymfklieren, dwars door de peritoneale bekleding van de ventrale middellijn. Mesenteriale lymfeklieren in het bindweefsel dat de darmen elkaar houdt. Ze zijn meestal te vinden in een reeks van 4-8 knopen, en kan verschijnen als een &quot;parelsnoer&quot;. Zorg ervoor te trekken uit de hele string. </li><li> De milt is gelegen in de buikstreek, achter de maag en darmen. Verwijderen door te trekken en los te maken uit de alvleesklier. </li></ol></li><li> Grind organen onder een steriele kap met behulp van 2 mat microscoop dia&#39;s. Plaats lymfeknopen of milt opde matte kant van een microscoop dia, en wrijf met een matte kant van de tweede dia tot uiteengevallen. Herhaal dit tot alle lymfeknopen en milt werden gemalen. </li></ol> Opmerking: Het wordt aanbevolen te beginnen met de lymfeklieren en eindig met de milt, terwijl het bloed zal het moeilijk maken om de resterende lymfeklieren in de AutoMACS buffer zien. <ol start="9"><li> Om gemalen organen filtreer in een enkele celsuspensie te beginnen door het vouwen van een vel 40 urn nylon materiaal meerdere malen, en het in de top van een 15 ml centrifugebuis. De nylon materiaal dient ongeveer 3 x 3 inch </li><li> Gebruik een 5 ml spuit en 21 G naald om de 5 ml AutoMACS Running buffer en gemalen organen zuigen. Breng langzaam in de gevouwen nylon materiaal. Let er op dat aanprikken van het materiaal met de naald. </li></ol> Opmerking: Wanneer enkele celsuspensie wordt bereikt, moet de oplossing weergegeven als een lichte, consistente oplossing zonder ZICHTBle stukjes vast weefsel. Indien vaste stoffen blijven opnieuw aspireren en afzien door een nieuwe opgevouwen nylon in een nieuwe 15 ml centrifugebuis. <ol start="11"><li> Altijd cellen op ijs wanneer niet in gebruik. </li></ol> 5. Cell Separation <ol><li> Voor een optimaal resultaat te verkrijgen ten minste een 80% zuivere CD4 + CD25-celpopulatie door AutoMACS Pro Cell Separator met de MACS CD4 + CD25 + regulatoire T-cel isolatie kit, muis. Het protocol voor de negatieve behoud van de CD4 + CD25-celpopulatie wordt verkregen door Miltenyi Biotec. </li></ol> 6. Th17 Differentiatie <ol><li> Verzamel de CD4 + CD25-celpopulatie na scheiding met de AutoMACS Pro Cell Separator. </li><li> Tellen cellen verdund in een verhouding 1:1000 met trypaanblauw behulp van een hemocytometer. </li><li> Na concentratie werd bepaald uit celtellingen Verdun celsuspensie tot 1 x 10 6 cellen / ml in celkweekmedium. </li><li> Neem platen met 96 putjes met plaat gebonden anti-CD3 na 4 uur. </li><li> Was anti-CD3-beklede putjes met 200 ui PBS. Herhaal 2 keer. <ol><li> Te wassen voeg 200 ul van steriele PBS om anti-CD3-beklede putjes en verwijder PBS in een afvalcontainer. </li></ol></li><li> Voeg 100 ul van het mengsel of iTh17 bedieningseenheid mengsel (zie punt nr. 2) aan de putjes in drievoud. </li><li> Voeg 100 ul van cellen aan elk putje waarbij ofwel de Th17 mengsel of de bedieningseenheid mengsel is geplaatst. </li><li> Incubeer cellen voor ten minste 72 uur of tot 5 dagen (Th17 differentiatie kan worden verkregen na 72 uur of na 5 dagen.) </li><li> Th17 differentiatie kan worden beoordeeld door intracellulaire kleuring en flowcytometrische analyse, ELISA of qPCR </li></ol> 7. Cel activering (alleen nodig voor intracellulaire kleuring) <ol><li> Verwijder 96 putjes van broedmachines eind ofwel 72 uur of 5 dagen <ol><li> Bedenk dat Th17 differentiation kan worden bereikt na ofwel 72 uur of 5 dagen. </li></ol></li><li> Voor elke aandoening (bv. activering controle of iTh17), transfer cellen die in drievoud in een putje van een 24 wells celkweekplaat. De cellen van een voorwaarde zijn nu samengevoegd in een putje van de 24 putjes plaat, in tegenstelling tot zijn in drievoud in 96 well U bodem petrischaal. </li><li> Het totale volume van elk putje in de 24 goed celkweekplaat is nu 600 pi. Verhoog het volume van elk putje om met de celkweek media 1 ml. </li><li> Voeg PMA (forbolmyristaatacetaat) (50 ng / ml), ionomycine (1 uM) en BFA (Brefeldine-A) (10 ug / ml) aan elk putje in 24 putjes celkweek plaat bij de vermelde concentraties. </li><li> Incubeer bij 37 ° C gedurende 4 uur. </li></ol> 8. Intracellulaire kleuring <ol><li> Stain cellen met de gewenste extracellulaire en intracellulaire merkers voor flowcytometrische analyse. Om de aanwezigheid o detecterenf IL-17 is intracellulaire kleuring uitgevoerd met anti-IL-17A antilichamen. Aanbevolen extracellulaire oppervlak merkers omvatten CD4, CD8 en CD25. <ol><li> Gebruik de intracellulaire cytokine kleuring Starter Kit-Muis uit BD Bioscience voor IL-17 intracellulaire kleuring. </li><li> Voor elk monster pellet cellen verwijderen supernatant en resuspendeer celpellet in 200 ui FACS buffer (2% FBS in PBS). </li><li> Transfer geresuspendeerd cellen tot 96 cel flowcytometrie plaat. </li><li> Spin cellen naar beneden gedurende 5 min bij 1200 rpm en gooi supernatant. </li><li> Voeg 200 ul PBS FACS buffer, gecentrifugeerd gedurende 5 minuten bij 1200 rpm en gooi supernatant. </li><li> Resuspendeer cellen in 100 ul FACS buffer en 100 gl extracellulaire antilichaam (Ab) mengsel (extracellulair Ab mengsel in FACS buffer) toegepast. Incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur, bedekt met folie. </li><li> Herhaal stap 8.1.4. </li><li> Herhaal stap 8.1.5 2x. </li><li> Resuspendeer cellen in 100 ul BD Cytofix / Cytoperm Buffer. Incubat gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur, bedekt met folie. </li><li> Voeg 100 ul van 1 x BD Perm / Wash buffer, centrifugeer 5 min bij 1200 rpm en gooi supernatant. Herhalen. </li><li> Voeg 50 ul van intracellulair Ab mengsel. (Intracellulaire Ab mengsel in 1x BD Perm / Wash) Incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur, bedekt met folie. </li><li> Herhaal stap 8.1.10. </li><li> Resuspendeer cellen in 200 ul BD vlekken buffer. </li><li> Plaats geresuspendeerd cellen in flowcytometrie buisjes die 200 ul BD vlekken buffer (eindvolume is 400 pi). </li><li> Bewaren bij 4 ° C tot monsters zijn klaar om te worden gelezen. </li></ol></li></ol> 9. Flowcytometrische Analyse <ol><li> Gate levende cellen bevolking. </li><li> Van de levende cellen bevolking, poort op CD4 + CD8-bevolking. </li><li> Van de CD4 + CD8-bevolking, poort op IL-17A + populatie. <ol><li> Op basis van onze eerdere experimentele resultaten, wordt 100% van de IL-17A + populatie CD25 + zijn. </li></ol></li></ol> * Totaal absolute cel-tellingen werden verkregen na het bundelen van het monster triplicaten ** Absolute aantal CD4 + CD25 + IL-17A +-cellen werd bepaald door het totale aantal cellen vermenigvuldigen met de levende poort percentage en het percentage van cellen die de lijn-specifieke merkers, CD4, CD25 en IL-17A, zoals bepaald door flow cytometrie. 10. qPCR en ELISA <ol><li> Plaats cellen niet gebruikt voor flowcytometrische analyse in een 1,5 ml eppendorfbuisje en gecentrifugeerd bij 13.000 rpm gedurende 5-10 minuten. De cellen in de celpellet na centrifugeren wordt gebruikt voor qPCR analyse. qPCR analyse werd uitgevoerd met behulp van PTC-200 Peltier PCR-apparaat (Biorad). </li><li> Verzamel supernatant van het gecentrifugeerde buizen voor ELISA. IL-17A ELISA&#39;s werden uitgevoerd met behulp van antilichaam paar TC11-18h10 (capture, catalogusnummer 555068) en TC11-8H4 biotine (opsporing, catalogusnummer 555067) gekocht van BD Biosciences. IL-17A ELISA standards werden verkregen van eBioscience (catalogusnummer 14-8171-80). </li><li> Na verwijdering van het supernatant, resuspendeer de resterende cellen worden gebruikt voor qPCR in 175 pl RNA lysisbuffer (onmiddellijk gebruikt voor RNA-extractie, cDNA-synthese en qPCR of bewaar bij -80 ° C voor later gebruik). <ol><li> Zie Tabel II voor primer sequenties voor IL-17A en actine (house-keeping gen) </li></ol></li></ol>

<ol><li>Chen, Z., Lin, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Foxp3+and+ROR%CE%B3T%3A+transcriptional+regulation+of+Treg+and+Th17%5BTitle%5D)+AND+%22International+Immunopharmacology%22%5BJournal%5D)">Foxp3 and RORγT: transcriptional regulation of Treg and Th17.</a> International Immunopharmacology. 11, 536-542 (2011).</li>
<li>Cua, D. J., Sherlock, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin-23+rather+than+interleukin-12+is+the+critical+cytokine+for+autoimmune+inflammation+of+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Interleukin-23 rather than interleukin-12 is the critical cytokine for autoimmune inflammation of the brain.</a> Nature. 421, 742-748 (2003).</li>
<li>El-Behi, M., Rostami, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+views+on+the+roles+of+Th17+and+Th17+cells+in+experimental+autoimmune+encephalitis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neuroimmune+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Current views on the roles of Th17 and Th17 cells in experimental autoimmune encephalitis.</a> J. Neuroimmune Pharmacol. 5, 189-197 (2010).</li>
<li>Inaba, K., Kroide, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Properties+of+memory+T+lymphocytes+isolated+from+the+mixed+leukocyte+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Properties of memory T lymphocytes isolated from the mixed leukocyte reaction.</a> Proc Natl Acad Sci. 82, 7686-7690 (1985).</li>
<li>L, I. vanovF. rutosR., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+microbiota+direct+the+differentiation+of+IL-17-producing+T-helper+cells+in+the+mucosa+of+the+small+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">Specific microbiota direct the differentiation of IL-17-producing T-helper cells in the mucosa of the small intestine.</a> Cell Host Microbe. 16, 337-349 (2008).</li>
<li>Jager, L. D., Dabelic, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Kinase+Inhibitory+Region+of+SOCS-1+is+Sufficient+to+Inhibit+T+helper-17+Function+in+Experimental+Allergic+Encephalomyelitis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neuroimmunol%22%5BJournal%5D)">The Kinase Inhibitory Region of SOCS-1 is Sufficient to Inhibit T helper-17 Function in Experimental Allergic Encephalomyelitis.</a> J. Neuroimmunol. 232, 08-18 (2011).</li>
<li>Kimura, A., Kishimoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-6%3A+regulator+of+Treg%2FTh17+balance%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">IL-6: regulator of Treg/Th17 balance.</a> Eur. J. Immunol. 40, 1830-1835 (2010).</li>
<li>Korn, T., Bettelli, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-17+and+Th17+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">IL-17 and Th17 Cells.</a> Annu Rev Immunol. 27, 485-517 (2009).</li>
<li>Kriegel, M. A., Seflk, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Naturally+transmitted+segmented+filamentous+bacteria+segregate+with+diabetes+protection+in+nonobese+diabetic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Naturally transmitted segmented filamentous bacteria segregate with diabetes protection in nonobese diabetic mice.</a> PNAS. 108, 11548-11553 (2011).</li>
<li>Langrish, C. L., Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-23+drives+a+pathogenic+T+cell+population+that+induces+autoimmune+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">IL-23 drives a pathogenic T cell population that induces autoimmune inflammation.</a> J. Exp. Med. 201, 233-240 (2005).</li>
<li>Lau, K., Benitez, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+type+1+diabetes+by+a+Lactobacillus+johnsonii+mediated+Th17+bias%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Inhibition of type 1 diabetes by a Lactobacillus johnsonii mediated Th17 bias.</a> J. Immunol. 186, 3538-3546 (2011).</li>
<li>Lee, Y., Awasthi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+and+molecular+signature+of+pathogenic+TH17+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Induction and molecular signature of pathogenic TH17 cells.</a> Nat Immunol. 13, 991-999 (2012).</li>
<li>Litmann, D. R., Rudensky, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Th17+and+regulatory+T+cells+in+mediating+and+restraining+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Th17 and regulatory T cells in mediating and restraining inflammation.</a> Cell. 140, 845-858 (2010).</li>
<li>O'Connor, W. Jr, Kamanaka, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protective+function+for+interleukin+17A+in+T+cell-mediated+intestinal+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">A protective function for interleukin 17A in T cell-mediated intestinal inflammation.</a> Nat Immunol. 10, 603-609 (2009).</li>
<li>Picca, C. C., Larkin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+TCR+specificity+in+CD4%2BCD25%2B+regulatory+T+cell+selection%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Rev%22%5BJournal%5D)">Role of TCR specificity in CD4+CD25+ regulatory T cell selection.</a> Immunol Rev. 212, 74-85 (2006).</li>
<li>Shah, K., Lee, W. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disregulated+balance+of+Th17+and+Th1+cells+in+systemic+lupus+erythematosus%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+Research+%26+Therapy%22%5BJournal%5D)">Disregulated balance of Th17 and Th1 cells in systemic lupus erythematosus.</a> Arthritis Research & Therapy. 12, R53(2010).</li>
<li>Sospedra, M., Martin, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunology+of+Multiple+Sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Immunology of Multiple Sclerosis.</a> Annu. Rev. Immunol. 23, 683-747 (2005).</li>
<li>Stockringer, B., Veldhoen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+and+function+of+Th17+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Differentiation and function of Th17 T cells.</a> Current Opinion in Immunology. 19, 281-286 (2007).</li>
<li>Veldhoen, M., Hocking, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGF%CE%B2+in+the+context+of+an+inflammatory+cytokine+milieu+supports+de+novo+differentiation+of+IL-17-producing+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">TGFβ in the context of an inflammatory cytokine milieu supports de novo differentiation of IL-17-producing T cells.</a> Immunity. 24, 179-189 (2006).</li>
<li>Zou, Y., Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strain-dependent+production+of+interleukin-17%2Finterferon-%CE%B3+and+matrix+remodeling-associated+genes+in+experimental+Candida+albicans+keratitis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Vis%22%5BJournal%5D)">Strain-dependent production of interleukin-17/interferon-γ and matrix remodeling-associated genes in experimental Candida albicans keratitis.</a> Mol Vis. 18, 1215-1225 (2012).</li>
</ol>

Geen onthullingen te verklaren.

Hier hebben we het protocol om in vitro Th17 differentiatie bereiken beschreven. De studie van Th17 differentiatie is belangrijk, omdat differentiatie van T-lymfocyten in de Th17 deelverzameling is van cruciaal belang voor de effectieve uitbanning van menselijke ziekteverwekkers 13. Omgekeerd is IL17 productie geassocieerd met auto ziekteprogressie 13. Werkwijze Th17 differentiatie is toepasbaar op veel onderzoek instellingen kan worden toegepast op tal van verschillende muismodellen van i...

CD4 + T-lymfocyten (T-cellen) spelen een cruciale rol in het immuunsysteem gemedieerde bescherming tegen infectieuze micro-organismen. Omgekeerd T-cellen zijn ook nauw verbonden met het begin en de progressie van auto-immuunziekten zoals type 1 diabetes, systemische lupus erythematosus en reumatoïde artritis. CD4 + T-lymfocyten geactiveerd worden door een combinatie van T-celreceptor (TCR) interacties met verwant antigeen / transplantatieantigenen II (MHCII) moleculen en CD28 receptor interacties met B7.1/B7.2 liganden 15. Naast het leveren van TCR stimulatie en CD28 co-stimulatie, antigeenpresenterende cellen ook een cytokine omgeving, waarin de differentiatie status van T lymfocyten bepaalt, waardoor de reactie van de T-lymfocyt aan de leiding bepaald antigeen. Verschillende pathogeen / antigeen-presenterende cel interacties maken verschillende cytokine omgeving, die scheef T lymfocyten beneden verschillende paden gericht op het eliling van het initiëren ziekteverwekker. Helaas, T-lymfocyten effector signaalwegen, oorspronkelijk ontworpen om te roeien binnendringende ziekteverwekkers, kunnen worden ten onrechte gericht tegen eigen weefsels-15. Daarom is een beter begrip van differentiatie staat elke afzonderlijke CD4 + T cel subsets is van cruciaal belang voor ons begrip van hoe de balans tussen de eliminatie van ziekteverwekkers en tolerantie om zelf te moduleren. Naast de Th1, Th2 en induceerbare regulatoire T cel differentiatie signaalwegen, kan naïeve T-lymfocyten ook worden aangedreven door cytokinen door het Th17 weg. Dat Th1-cellen bestrijden intracellulaire pathogenen, Th2 cellen te elimineren extracellulaire pathogenen en regulerende T-cellen (Tregs) minimaliseren ontstekingsreacties 1, 16, Th17 cellen een belangrijke rol spelen bij de eliminatie van extracellulaire bacteriën en schimmels. Th17 cellen worden algemeen aangeduid door expressie van het geslacht-specifieke transcriptiefactor RORγT en productie van IL-17A, die de activatie van macrofagen en neutrofielen 1, 7 bevordert. Th17 cellen zijn betrokken bij verschillende auto-immuunziekten en bijbehorende diermodellen. Zo is aangetoond dat IL-23 (die nodig is om de Th17 fenotype sustain), maar niet IL-12, was de centrale schuldige in experimentele autoimmune encefalitis (EAE), het knaagdier ziektemodel voor MS. Het is vervolgens aangetoond dat een verlaging van IL-17 productie samenhangen met EAE preventie 2, 6, 17. Bovendien zijn Th17 cellen geassocieerd met andere auto-immuunziekten zoals artritis en systemische lupus erythematosus (SLE) 10, 16. IL-23 deficiënte p19 - / - muizen bleken zeer lage aantallen Th17 cellen, en zijn bestand tegen de ontwikkeling niet alleen EAE, maar ook collageen-geïnduceerde artritis, een model voor reumatoïde artritis 10, 18. Bovendien muizen behandeld met neutraliserende antilichamen IL-17A after het begin van de collageen-geïnduceerde artritis werden ook gevonden op de resolutie van gewrichtsschade 18 hebben. Opgemerkt zij dat de rol van Th17 cellen in de progressie van auto-immuunziekte nog worden gekarakteriseerd als recent onderzoek heeft ook aangetoond een beschermende rol van Th17 cellen bij type 1 diabetes 9, 11 en darmontsteking 14. Deze studies bevestigen het belang van Th17 differentiatie in auto-immuniteit. In vitro Th17 differentiatie is een noodzakelijke methode in T-cel onderzoek, omdat er ten minste twee verwarrende vragen die nader onderzoek vereisen: 1) Hoe precies doet IL-6 regelen de balans tussen Treg en Th17 differentiatie, en 2) wat zijn de exacte mechanismen achter IL-17-geïnduceerde inflammatoire aandoeningen? Onze methode maakt gebruik van CD4 + CD25-T-cellen van de milt en de lymfeklieren van de C57BL / 6 muis. Het is belangrijk op te merken dat, hoewel het mogelijk is Th17 differentiatie induceren met een onzuiverebevolking, het verwerven van tenminste een 80% zuivere CD4 + CD25-T-cel populatie ontkent enige zorg van verontreiniging en zorgt voor meer succes Th17 differentiatie resultaten. Om een ​​goede Th17 differentiatie bereiken zijn CD4 + CD25-T-cellen geïncubeerd in de aanwezigheid van anti-CD3 en anti-CD28, die activatie signalen, 1 en 2, respectievelijk, en IL-6, en TGF-β. Hoewel is beschreven dat IL-23 alleen kan worden gebruikt om Th17 differentiatie bereiken, werd later aangetoond dat IL-23 is noodzakelijk voor de stabiliteit van de Th17 celpopulatie, maar IL-6 en TGF-β zijn essentieel voor Th17 differentiatie 3, 18, ​​19. Murine studies hebben aangetoond dat IL-23 receptor tot expressie wordt gebracht op CD4 + T-cellen nadat ze zijn gestimuleerd met IL-6 en TGF-β 13, 18. Ook zal Th17 cellen succesvol ontwikkelen in de aanwezigheid van IL-23-blokkerende antilichamen zolang IL-6 en TGF-β heden 18, 19 zijn. Als zodanig is deze Th17 differentiatie protocol provIdes de juiste voorwaarden om Th17 differentiatie succes induceren. Ontwikkeling van een beter begrip van de mechanismen die ten grondslag liggen Th17 differentiatie en IL-17 productie voor te stellen de mogelijkheid voor de ontwikkeling van betere therapieën die gericht zijn op auto-immuunziekten 13.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Reagens/Materiaal</td></tr><tr><td>Sterile Polyestrene Petri Dish</td><td>Fisher Scientific</td><td>0875713A</td><td>60 mm x 15 mm</td></tr><tr><td>autoMACS Running Buffer</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-221</td><td></td></tr><tr><td>Premium Microscope Slides, Frosted</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-3</td><td>3" x 1"1 mm</td></tr><tr><td>5 ml 21G1 Latex Free Syringe en Naald</td><td>BD Biosciences</td><td>309632</td><td></td></tr><tr><td>Corning 15 ml Centrifuge Tubes</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS430791</td><td></td></tr><tr><td>Nylon 40 microns</td><td>Miami Aquaculture</td><td>Nylon 40/26</td><td></td></tr><tr><td>Microtest weefselkweekplaat 96 well U bodem </td><td>BD Biosciences</td><td>35-3077</td><td></td></tr><tr><td>Corning Costar 24 well celkweekplaten</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CL3524</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Tubes 1,5 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>Gezonde NA/LE Hamster Anti-Mouse CD3e</td><td>BD Biosciences</td><td>553057</td><td></td></tr><tr><td>Gezonde NA/LE Hamster Anti-Mouse CD28</td><td>BD Biosciences</td><td>553294</td><td></td></tr><tr><td>Muis IL-6 Recombinant Eiwit</td><td>eBioscience</td><td>14-8061-62</td><td></td></tr><tr><td>TGFbeta</td><td>R&amp;D Systems</td><td>240-B-002</td><td></td></tr><tr><td>Trypan blauw oplossing 0,4 %</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>66H2364</td><td></td></tr><tr><td>Pac Blue Rat Anti-Mouse CD4</td><td>BD Biosciences</td><td>558107</td><td></td></tr><tr><td>APC Rat Anti-Mouse CD8a</td><td>BD Biosciences</td><td>553035</td><td></td></tr><tr><td>PE Conjugated Anti-muis CD25</td><td>eBioscience</td><td>E01155-516</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 700 Rat Anti-muis IL-17</td><td>BD Biosciences</td><td>560820</td><td></td></tr><tr><td>Intracellulaire Cytokine Kleuring Starter Kit-Muis</td><td>BD Biosciences</td><td>51-2041AK (559311)</td><td></td></tr><tr><td>MACS CD4+CD25+ regulatorische T-cel isolatie kit, muis</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-221</td><td></td></tr><tr><td>ABAM </td><td>Cellgro</td><td>30-004-CI</td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Corning, Cellgro</td><td>10-040-CM</td><td></td></tr><tr><td>B 2-Mercapt&#8211;ethanol</td><td>MP Biomedical</td><td>194834</td><td>Gevaarlijk</td></tr><tr><td>Phorbol 12-Myristaat 13-Acetaat (PMA)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ionomycin Calciumzout</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>13909-1ML</td><td>Gevaarlijk</td></tr><tr><td>Brefeldin A (BFA)</td><td>MP Biomedicals</td><td>159027</td><td></td></tr><tr><td>ELISA IL-17A Capture mAb </td><td>BD Biosciences</td><td>555068</td><td></td></tr><tr><td>ELISA IL-17A Detectie mAb </td><td>BD Biosciences</td><td>555067</td><td></td></tr><tr><td>ELISA IL-17A Standaard</td><td>eBioscience</td><td>14-8171-80</td><td></td></tr><tr><td>IL-2 ELISA Kit</td><td>BD Biosciences</td><td>555148</td><td></td></tr><tr><td>TMB Substraat Reagens Set </td><td>BD Biosciences</td><td>555214</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Apparatuur </td></tr><tr><td>autoMACS Pro Cell Separator</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-545</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall Legend RT+ Centrifuge</td><td>ThermoScientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Napco serie 8000 WJ CO2 Incubator</td><td>ThermoScientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PTC-200 Peltier Thermal Cycler</td><td>Biorad</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

isolatie en th17 differentiatie van naïeve cd4 t-lymfocyten

Isolation and Th17 Differentiation of Na&iuml;ve CD4 T Lymphocytes

Th17 cellen zijn een afzonderlijke subset van T-cellen die zijn gevonden produceren interleukine 17 (IL-17) en verschillen in functie van het andere T-cel subsets zoals Th1, Th2 en regulatoire T-cellen. Th17 cellen hebben zich ontwikkeld tot een centrale boosdoener in overijverige inflammatoire immuunreacties geassocieerd met vele auto-immuunziekten. In deze methode zuiveren we T-lymfocyten uit de milt en lymfeknopen van C57BL / 6 muizen, en onder controle en Th17-inducerende omgevingen stimuleren gezuiverde CD4 + T-cellen. De Th17 inducerende omgeving omvat stimulatie in aanwezigheid van anti-CD3 en anti-CD28 antilichamen, IL-6 en TGF-β. Na incubatie gedurende ten minste 72 uur en tot vijf dagen bij 37 ° C worden de cellen vervolgens geanalyseerd op het vermogen om IL-17 te produceren door middel van flowcytometrie, qPCR en ELISA. Th17 gedifferentieerde CD4 + CD25-T-cellen kunnen worden gebruikt voor de opheldering van de rol die Th17 cellen spelen in het ontstaan ​​en de progressie van auto-immuniteit en de ontvangendefense. Bovendien kan Th17 differentiatie van CD4 + CD25-lymfocyten van verschillende muizen knockout / ziektemodellen tot ons begrip van cellot plasticiteit.

Deze Th17 differentiatie protocol begint met het verwijderen van de milt en de axillaire, brachiale, mesenterische, cervicale en inguinale lymfeknopen. Een weergave van de plaats van elk kan worden in figuren 2 en 3. Figuren 1 en 5 beide een visuele representatie van de in dit protocol beschreven. Deze Th17 protocol gericht op differentiatie van CD4 + CD25-T-lymfocyt populatie. Het is belangrijk om te weten hoe efficiënt de AutoMACS Pro Cell...

Met effector functies te onderscheiden van andere T-cel subsets, zijn Th17 cellen centraal zijn betrokken bij inflammatoire auto-immuniteit. Deze in vitro Th17 differentiatie protocol verschaft een middel om te bepalen of naïeve CD4 + T-lymfocyten kunnen differentiëren in Th17 cellen en hun rol bij auto-immuniteit en gastheerrespons verder te onderzoeken.

Isolatie en Th17 Differentiatie van naïeve CD4 T-lymfocyten

Th17 cells are a distinct subset of T cells that have been found to produce interleukin 17 (IL-17), and differ in function from the other T cell subsets ...

Het algemene doel van deze procedure is om TH17-cellen te differentiëren uit naïeve CD4-positieve T-lymfocyten. Dit wordt bereikt door eerst de lymfeklieren en de milt te oogsten van een volwassen C57BL/6-muis. In de tweede stap worden de weefsels vermalen om een enkelcel-suspensie te verkrijgen.De CD4-positieve CD25-negatieve T-cellen worden vervolgens geïsoleerd en gekweekt onder TH17-inducerende condities of activatiecontrolecondities. Uiteindelijk kunnen qPCR, ELISA en flowcytometrie worden gebruikt om de expressie van IL-17A te evalueren. Deze methode kan dus inzicht bieden in de differentiatie van CD4 T-lymfocyten tot Th17-cellen in C57BL/6-muizen.Het kan ook worden toegepast op andere muismodellen. De demonstratie van deze methode is essentieel, aangezien de lymfeklieren zeer klein zijn, wat de dissectiestappen bemoeilijkt. Zonder directe visualisatie van deze methode: becoat u ten minste vier uur voor het toevoegen van de cellen de wells van een nieuwe 96-well UBO micro test weefselkweekplaat met 30 µL anti-CD3 verdund in steriele PBS; tik tegen de zijkanten van de plaat om een uniforme bedekking van de wells te waarborgen en incubeer de plaat vervolgens bij 37 °C. Koel de

isolation-and-th17-differentiation-of-nave-cd4-t-lymphocytes

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Deze procedure beschrijft de detectie en isolatie van de muis Th17 leukocyten die actief IL-17 afscheiden na stimulatie.

Detectie en isolatie van levensvatbare muis IL-17-afscheidende T-cellen

Wij beschrijven een werkwijze voor het regulerende, geheugen naïeve T-cellen van een menselijke bloed donoren. Gepolariseerde Tregs kan worden vergeleken met andere subgroepen in verschillende genetische en functionele toepassingen met genetische homogeniteit, zoals onderdrukking assay ook hier beschreven.

Genereren van Induced regulatoire T-cellen uit primaire menselijke naïef en geheugen T-cellen

Naïve CD4+ T-cellen polariseren naar verschillende subsets, afhankelijk van de omgeving op het moment van activering.  De differentiatie van naïve CD4+ T-cellen naar verschillende effector-subsets kan in vitro worden bereikt door de toevoeging van T-celreceptor-stimuli en specifieke cytokine-signalen.

Muis Naïve CD4<sup&gt; +</sup&gt; T Cell Isolatie en<em&gt; In vitro</em&gt; Differentiatie in T cel subsets

Hier bieden we een geoptimaliseerd protocol voor de isolatie en klonen van de schaarse T-cel entiteit van perifere Vδ1+CD4+ T-cellen die, zoals we onlangs hebben laten zien, een extrathymische αβ T-cel voorloper is. Deze techniek maakt het mogelijk om deze cellen kwantitatief te isoleren, klonen en efficiënt uit te breiden in ex vivo cultuur.

Isolatie en<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Cultuur van Vδ1<sup&gt; +</sup&gt; CD4<sup&gt; +</sup&gt; γδ T-cellen, een Extrathymic αβT-cel Progenitor

Dit protocol beschrijft de differentiatie van naïeve CD4+ T-cellen tot pathogene Th17-cellen in vitro. In combinatie met een op flowcytometrie gebaseerde benadering met meerdere parameters kan met behulp van deze differentiatiemethode een zuiverheid van 90% van pathogene Th17-cellen worden verkregen uit naïeve CD4+ T-cellen.

In vitro differentiatie van naïeve CD4+ T-cellen tot pathogene Th17-cellen in muizen

We presenteren een protocol voor retrovirale transductie van gids-RNA in primaire T-cellen van Cas9 transgene muizen, en bieden een efficiënt alternatief voor genbewerking bij het bestuderen van Th17-differentiatie.

Retrovirale CRISPR/Cas9-gemedieerde gentargeting voor de studie van Th17-differentiatie in vitro

Genereren van T-lymfocyten van geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPS) cellen geeft een alternatieve aanpak van het gebruik van embryonale stamcellen voor T-cel-gebaseerde immunotherapie. De werkwijze blijkt dat door een...

Geregisseerd Differentiatie van geïnduceerde pluripotente stamcellen naar T lymfocyten

Een efficiënte manier om lymfocyten uit muizen genitaal isoleren beschreven. Deze methode maakt gebruik van enzymdigestie en Percoll gradiëntscheiding om efficiënte isolatie. Deze techniek is ook aangepast aan gebruik in andere...

Isolatie van Lymfocyten van Mouse geslachtsorganen Mucosa

Adenovirale genoverdracht in naïeve CD4 T-cellen met transgene expressie van de Coxsackie adenovirus receptor kan de moleculaire analyse van regulatoire T...

Adenovirale transductie van Naïeve CD4 T-cellen aan Treg Differentiatie Studie

Palatinale amandelen zijn een rijke bron van B- en T-lymfocyten. Hier bieden we een eenvoudig, efficiënt en snel protocol om B- en T-lymfocyten te isoleren uit menselijke palatinale amandelen. De beschreven methode is specifiek aangepast voor studies naar de virale etiologie van amandelontsteking, bekend als tonsillitis.

Efficiënte isolatie protocol voor B- en T-lymfocyten van Human Palatine Amandelen

Leer Th17-differentiatie van naïeve CD4+ T-lymfocyten voor immunologisch onderzoek met C57BL/6 muizen. Deze methode helpt bij het bestuderen van auto-immuunziekten en inflammatoire responsen.

Isolatie en Th17 Differentiatie van naïeve CD4 T-lymfocyten

Meer video's verkennen