Cel-gebaseerde test protocol voor de prognostische Voorspelling van Idiopathische scoliose met behulp van cellulaire diëlektrische spectroscopie

Het algemene doel van het volgende experiment is om de prognose van idiopathische scoliose te voorspellen volgens de functionele groepering van patiënten door hun PBM C'S-respons op GPCR R-activering te screenen met behulp van cellulaire diëlektrische spectroscopie. Dit wordt bereikt door pbmc te kweken in aanwezigheid van fytohemagglutinine of PHA om het aantal cellen te vermenigvuldigen. Celexpansie wordt voltooid in een buis, gehouden in een schuine positie.

Als tweede stap worden de cellen behandeld met OSTEOPONTIN of OPN, wat de GI-eiwitactiviteit verhoogt of vermindert. Afhankelijk van de patiënten na de behandeling, wordt de celsuspensie overgebracht naar de microplaat. Vervolgens worden de cellen gestimuleerd met GI of GS GPCR-agonisten om de resulterende impedantieveranderingen te bepalen.

De resultaten leveren kinetische respons op voor alle putjes en geïntegreerde reacties worden vervolgens gekwantificeerd op basis van impedantieveranderingen. De implicatie van deze techniek gaat veel verder dan alleen diagnose. Dus voor de eerste keer kunnen we in een vroeg stadium symptomatische patiënten detecteren die het risico lopen om scoliose te ontwikkelen, en nu we weten wie scoliose zal ontwikkelen of in welke fase ze zich bevinden, kunnen we nieuwe therapieën aanbieden om hen te behandelen.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden zoals röntgenblootstelling, is dat deze techniek het voorspellen van progno osteopathische scoliose mogelijk maakt zonder dat het nodig is om covid te meten en zonder gezondheidsrisico. Het meest recente, de techniek zal nu onze onderzoeksassistent Nita Franco zijn, Ontdooi een bevroren aliquot van perifere bloedmononucleaire cellen in een waterbad van 37 graden Celsius. Gebruik een steriele pipet om de celsuspensie over te brengen naar een 50 milliliterbuis met 15 milliliter compleet medium en centrifugeer.

De cellen aspireren het supernatant. Breng vervolgens voorzichtig de celpellet in één milliliter PHA-medium, vul het volume aan tot 20 milliliter met hetzelfde medium, sluit de buis losjes af om lucht binnen te laten. Incubeer de buis een nacht bij 37 graden Celsius in een kooldioxide-incubator om rustige lymfocyten te laten transformeren in snel proliferatieve lymfoblasten.

Sluit de doppen volledig en pellet de cellen door centrifugatie. Verwijder het supernatant door aspiratie. Breng voorzichtig de celpellet in één milliliter compleet medium in suspensie.

Vul het volume aan tot 20 milliliter met hetzelfde medium en sluit de buis losjes af. Cultiveer de buis overnacht om de celpopulatie te vermenigvuldigen. Na twee wasbeurten met 10 milliliter RPMI 1640, breng de celpellet voorzichtig opnieuw in suspensie in 600 microliters RPMI 1640. Meet de celconcentratie en levensvatbaarheid met behulp van een geautomatiseerde celteller en levensvatbaarheidsanalysator.

Voeg vervolgens een geschikt volume RPMI 1640 toe om de celconcentratie aan te passen tot 1,5 keer 10 tot de vijfde cellen per 20 microliter. Breng 100 microliter van de suspensie over in twee steriele 1,5 milliliter eend of ph buisjes. Voeg recombinant osteopontin toe aan één buis tot een eindconcentratie van 0,5 microgram per milliliter.

Voeg een gelijk volume PBS toe aan de tweede buis. Meng elke conditie voorzichtig door twee keer te pipetten met een steriele pipet ingesteld op 100 microliter. Voeg vervolgens vijf microliters RPMI 1640 toe aan elk putje van een 96-wellplaat, centrifugeer de plaat gedurende drie minuten bij 200 GS om eventuele luchtbellen te verwijderen en breng de cellen over van buis naar microplaat.

Pipet voorzichtig eenmaal op en neer om een uniforme celsuspensie te garanderen. Zaai 40 microliter celsuspensie per putje in viervoudige duplicaat voor onbehandelde cellen en in duplicaat voor ROPN of PBS-behandelde cellen. Laat de celplaat vijf minuten onder de steriele kap om de cellen te laten rusten en gelijkmatig naar de bodem van de putjes te zinken.

Om het effect van OPN-cultuur te optimaliseren, worden de cellen gedurende 18 uur bij 37 graden Celsius in een kooldioxide-incubator gecultiveerd en worden de culturen gedurende ongeveer 30 minuten bij kamertemperatuur geëquilibreerd. Bereid ondertussen één milliliter van 100 micromolar somatostatine en isoproterenol in RPMI 1640. Vul de verbindingsplaat door 20 microliter in geschikte putjes te doseren.

Bedek de verbindingsplaat met een uithardbare afdichting. Laad de plaat, pipettips en verbindingsplaat in het CDS-gebaseerde systeem. Noem de plaat in de CDS-gebaseerde instrumentsoftware.

Ga naar de protocollijst en selecteer het juiste protocol om het protocol te starten. Klik op starten. Het geïntegreerde vloeistofsysteem voegt gelijktijdig de verbindingen toe aan alle putjes.

Het CDS-gebaseerde systeem verzamelt automatisch de gegevens gedurende 15 minuten na het toevoegen van verbindingen. De cellevensvatbaarheid was vergelijkbaar tussen alle monsters met waarden consistent in het bereik van 86 tot 96%. Daarentegen werden hoge variaties opgemerkt in celgetallen. Van de 32 monsters werden er twee als onvoldoende geclassificeerd en zijn niet geclassificeerd. Dit voorbeeld toont de functionele classificatie volgens de mate van onbalans tussen GI en GI-signalering.

De evaluatie van het OPN-effect in reactie op GI-stimulatie had aangetoond dat OPN de respons verhoogde bij patiënten 353 en 371. Daarentegen was de respons bij meer dan 50% verminderd bij patiënten 345 en 382 en bij minder dan 50% bij patiënt 370 na behandeling met ROPN. Dus volgens onze classificatiecriteria konden we patiënten 353 en 371 categoriseren in FG een patiënten 300 van 45 en 382 in FG twee en patiënt 370 in FG drie.

Parallel werden alle patiënten getest op hun respons op GI-eiwitstimulatie en vergeleken met controlesubjecten. Zoals verwacht, waren alle patiënten minder responsief dan controlesubjecten. Patiënten die in dezelfde functionele groep