Name: Hitte-geïnduceerde antigeentraughering: een effectieve methode om stamcellentypen te detecteren en identificeren tijdens neurogenese van de hippocampus bij volwassenen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-08-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 38 s
Description: Leer hitte-geïnduceerde antigeentraughering om stamcellen in de hippocampus te detecteren. Deze methode verbetert de visualisatie van voorlopercellen tijdens volwassen neurogenese.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De methodologie werd oorspronkelijk ontwikkeld in het laboratorium van Dr. Hongjun Song aan het Institute for Cell Engineering, Department of Neurology, Johns Hopkins School of Medicine. Dit werk werd gefinancierd door NIMH (R00MH090115), NARSAD, de Fraternal Order of Eagles' Mayo Cancer Research Fund en een startpakket van Mayo Foundation toegekend aan M.H.J. en Basic Science Research Program via de National Research Foundation of Korea (NRF) gefinancierd door het Ministry of Education, Science and Technology (A3014385) toegekend aan W.R.K.

1. Pre-immunohistochemistry: Perfusie en Histologie
<ol>
	<li>Perfuse muizen volgens een algemeen transcardiaal protocol aangepast voor muizen en verwijder de hersenen in 4% paraformaldehyde (PFA)9.</li>
	<li>Laat de hersenen overnacht in PFA bij 4 °C (bijv. een 10 ml conische buis gevuld met PFA). Houd in PFA gedurende minimaal 12-24 uur, niet meer dan 36 uur voor volledige fixatie. Na overnachte fixatie, giet de PFA uit de conische buis maar laat de hersenen erin. Giet 30% sucrose in de buis en was de hersenen gedurende 5 seconden om eventueel overgebleven PFA te verwijderen. Vul tenslotte de buis met hersenen opnieuw met 30% sucrose. Bewaar de hersenen in sucrose bij 4 °C tot de hersenen op de bodem van de buis zinken.</li>
	<li>Snijd 40 μm hersensecties op een microtoom. Raadpleeg een muizenhersenatlas om te beginnen met het verzamelen van secties vanaf het begin van de dentate gyrus tot het einde. Bewaar de secties in antivriesoplossing (een eenvoudig recept is 300 g sucrose in 500 ml 0,1 M PBS en 300 ml ethyleenglycol) totdat ze klaar zijn voor immunohistologie.</li>
	<li>Montage het gesneden weefsel op microscoopglazen die specifiek ontworpen zijn om sterk aan weefsel te hechten. Deze glazen zorgen voor een sterke hechting aan het weefsel tijdens de kookfase. Laat het glas na montage van het weefsel 10 min drogen of tot het volledig droog is. Het drogen kan worden versneld als het glas tegen een verticale oppervlakte wordt geplaatst met de onderkant van het glas op een papieren handdoek. Als er meer dan één glas wordt gemonteerd, kunnen de andere glazen gedurende die tijd droog worden gelaten (1-2 uur is oké) totdat klaar om door te gaan naar de volgende stap.</li>
	<li>Zodra het glas droog is, was het driemaal gedurende 5 min met PBS en droog het opnieuw (PBS-buffer = 0,137 M NaCl, 0,0027 M KCl, 0,0119 M Na2PO4). Dit zorgt ervoor dat eventuele eerdere chemicaliën (zoals glycerol uit de antivriesopslagoplossing) voldoende worden verwijderd en de hechting van het weefsel aan het glas niet kunnen beïnvloeden.</li>
</ol>
2. Voorbereiding van Reagentia en Kleine Apparatuur
<ol>
	<li>Bereid Oplossing A (0,1 M of 19,21 g/l citroenzuur) en Oplossing B (0,1 M of 24,9 g/l tris-natriumcitraat) voor waarin weefselsecties gekookt zullen worden.</li>
	<li>Combineer in een geschikte cilinder 9 ml van Oplossing A en 41 ml van Oplossing B. Voeg 450 ml ddH2O toe aan dit mengsel.</li>
	<li>Plaats dit mengsel in een lege container (bijv. een lege doos met pipettips) die magnetronbestendig is.</li>
</ol>
3. Warmte-geïnduceerde Antigeenretrieval
<ol>
	<li>Kook de oplossing gemaakt in stap 2 gedurende 5 min op standaardinstellingen in een standaard magnetron. De oplossing zal beginnen te koken bij of boven de 100 °C.</li>
	<li>Zodra het koken voltooid is, verwijder voorzichtig de container uit de magnetron en plaats de gedroogd glazen erin, zorg ervoor dat het glasoppervlak met hippocampale secties naar beneden gericht is en volledig blootgesteld aan de vloeistof. Plaats indien mogelijk de glazen schuin tegen de wanden van de doos en stapelt andere glazen eromheen. Zorg ervoor dat hun "pasvorm" in de doos goed zit, zodat de glazen geen ruimte hebben om boven elkaar te bewegen.</li>
	<li>Kook dit mengsel met glazen gedurende 7 min op standaardinstellingen in de magnetron. De oplossing zal gedurende deze tijd koken bij of boven de 100 °C.</li>
	<li>Tijdens deze kookfase, vul twee ijsemmers voor de helft met ijs.</li>
	<li>Zodra het koken in stap 3.3 voltooid is, verwijder de container uit de magnetron en plaats deze in een van de ijsemmers. Giet het resterende ijs uit de andere emmer om de container heen en bedek deze volledig. Laat het 1 uur staan.</li>
</ol>
4. Primaire en Secundaire Antilichaamkleuring
<ol>
	<li>Aan het einde van de 1 uur wachttijd, verwijder de glazen uit de container en was ze driemaal gedurende 5 min met TBS-T buffer. Elke apparaat kan worden gebruikt om deze basiswassingen uit te voeren. (Buffer TBS = 50 mM Tris HCl, 150 mM NaCl, TBS-T = 0,05% Triton X-100 TBS-buffer, TBS-TT = 4% ezelsserum TBS-T-buffer).</li>
	<li>Na het wassen, laat de glazen drogen in een donkere plaats (bijv. in een laboratoriumlade, plaats een papieren handdoek in de lade en laat het glas er tegenaan leunen) gedurende 5-10 min of tot het glas volledig droog is. Bereid gedurende deze periode een kamer voor voor overnachtelijke primaire antilichaamkleuring. Een eenvoudige kleuringskamer kan een container met een groot oppervlak gevuld met ddH2O en een podium binnenin de container omvatten, waarop het glas boven het ddH2O kan rusten.</li>
	<li>Zodra het glas droog is, teken een omtrek rond de weefselsecties met een waterafstotende pen. Tijdens stap 4.5 dient deze omtrek als een barrière die voorkomt dat het antilichaammenggewas overstroomt.</li>
	<li>Bereid het primaire antilichaammenggewas in TBS-TT. Er is minimaal 500 μl nodig om één volledig glas te bedekken (bijv. als het antilichaam-voorraad bij een concentratie van 1:500 is, voeg dan 1 μl van een specifiek antilichaam toe aan 500 μl van TBS-TT). Gebruik primaire antilichamen zoals vermeld in de reagentiatabel.</li

<ol><li>Ming, G. L., Song, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+neurogenesis+in+the+mammalian+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Reviews+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Adult neurogenesis in the mammalian central nervous system.</a> Annual Reviews of Neuroscience. 28, 223-250 (2005).</li>
<li>Santarelli, L., Saxe, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Requirement+of+hippocampal+neurogenesis+for+the+behavioral+effects+of+antidepressants%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Requirement of hippocampal neurogenesis for the behavioral effects of antidepressants.</a> Science. 301 (5634), 805-809 (2003).</li>
<li>Sahay, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increasing+adult+hippocampal+neurogenesis+is+sufficient+to+improve+pattern+separation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Increasing adult hippocampal neurogenesis is sufficient to improve pattern separation.</a> Nature. 472 (7344), 466-4670 (2011).</li>
<li>Clelland, C. D., Choi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+functional+role+for+adult+hippocampal+neurogenesis+in+spatial+pattern+separation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A functional role for adult hippocampal neurogenesis in spatial pattern separation.</a> Science. 325 (5937), 210-213 (2009).</li>
<li>Wang, J. W., David, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+fluoxetine+stimulates+maturation+and+synaptic+plasticity+of+adult-born+hippocampal+granule+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Chronic fluoxetine stimulates maturation and synaptic plasticity of adult-born hippocampal granule cells.</a> Journal of Neuroscience. 28 (6), 1374-1384 (2008).</li>
<li>D'Amico, F., Skarmoutsou, E., Stivala, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((State+of+the+art+in+antigen+retrieval+for+immunohistochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">State of the art in antigen retrieval for immunohistochemistry.</a> Journal of Immunological Methods. 341 (1-2), 1-18 (2009).</li>
<li>Daneshtalab, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Troubleshooting+tissue+specificity+and+antibody+selection%3A+Procedures+in+immunohistochemical+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmacological+and+Toxicological+Methods%22%5BJournal%5D)">Troubleshooting tissue specificity and antibody selection: Procedures in immunohistochemical studies.</a> Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 61 (2), 127-135 (2010).</li>
<li>Jang, M. H., Bonaguidi, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Secreted+frizzled-related+protein+3+regulates+activity-dependent+adult+hippocampal+neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Secreted frizzled-related protein 3 regulates activity-dependent adult hippocampal neurogenesis.</a> Cell Stem Cell. 12 (2), 215-223 (2013).</li>
<li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+Animal+Perfusion+Fixation+for+Rodents%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents.</a> J. Vis. Exp. (65), e3564(2012).</li>
<li>Porcelli, M., Cacciapuoti, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-thermal+effects+of+microwaves+on+proteins%3A+Thermophilic+enzymes+as+model+system%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">Non-thermal effects of microwaves on proteins: Thermophilic enzymes as model system.</a> FEBS Letters. 402 (2-3), 102-106 (1997).</li>
<li>Stone, J. R., Walker, S. A., Povlishock, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+visualization+of+a+new+class+of+traumatically+injured+axons+through+the+use+of+a+modified+method+of+microwave+antigen+retrieval%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathologica%22%5BJournal%5D)">The visualization of a new class of traumatically injured axons through the use of a modified method of microwave antigen retrieval.</a> Acta Neuropathologica. 97 (4), 335-346 (1999).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.

De meest kritische stappen voor succesvolle antigeen-retrieval en kleuring van progenitorceltypen zijn: 1) het gebruik van goed geperfundeerd en gefixeerd weefsel van de optimale coronale dikte; 2) voldoende tijd toestaan voor koken en daaropvolgende afkoeling tijdens antigeenretrieval; 3) handmatig vakmanschap bij het monteren van gefixeerde coronale secties en het voorkomen van schade hierbij.
Het is cruciaal bij IHC om geperfundeerd weefsel te gebruiken dat voldoende fixatie heeft ondergaan...

Neurogenese, de vorming van nieuwe neuronen uit neurale stamcellen, is nu bekend dat het constant plaatsvindt tot in de volwassenheid in twee gespecialiseerde gebieden in de hersenen. Deze omvatten de subventriculaire zone (SVZ) van de olfactorische bol en de subgranulaire zone (SGZ) van de dentate gyrus in de hippocampus. In het afgelopen decennium heeft het veld van de neurogenese van de volwassen hippocampus aanzienlijk werk gezien. Het gebied heeft veel belangstelling gewekt omdat pasgeboren neuronen in de SGZ bijdragen aan verbeterde neurale plasticiteit die specifieke hersenfuncties kan ondersteunen1-5. Volwassen hippocampale neurogenese is betrokken gebleken bij het spelen van belangrijke rollen in stemmingsregulatie, regeneratie, en leren en geheugen. Daarom is er een gezamenlijke inspanning geweest om de ontwikkeling en regulatie van neuronen te begrijpen in deze rijke neurogene niche.
Een onvermijdelijk en belangrijk aspect van het bestuderen van de neurogenese van de volwassen hippocampus is de identificatie van afzonderlijke stadia waardoor een geactiveerde neurale stamcel gaat op weg naar een volledig functionele neuron. In dit proces wordt de rustige neurale stamcel geactiveerd en gaat door een reeks vroege actieve en late actieve voorlopercellentypen (Figuur 1). Deze verschillende populaties van neurale voorlopers kunnen worden geïdentificeerd door morfologie en hun expressie van moleculaire markers zoals MCM2, nestin, Tbr2 en Doublecortin (DCX) en NeuN die de omzetting van RGL's in hun respectieve voorlopercellentypen begeleiden. Nestin is een intermediaire filament-eiwit dat wordt tot expressie gebracht in de radiale gliacellen en sommige vroege voorlopercellentypen. Een andere marker is Tbr2 dat specifiek wordt tot expressie gebracht in de versterkende voorlopercellen. De Tbr2-transgenexpressie wordt aanvankelijk uitgeschakeld in de Type-1 cellen (radial-glia-achtig), ingeschakeld over de Type-2a, Type-2ab en Type-2b voorlopers en uitgeschakeld onder de meer gedifferentieerde Type-3 en onvolwassen neuronen (Figuur 1). DCX is een marker voor neuronale migratie die wordt tot expressie gebracht in de Type-2ab, Type-2b en Type-3 neurale voorlopers. Door deze combinatie van drie markers te gebruiken, kunnen we verschillende subtypen van neurale voorlopers labelen. Deze omvatten de Type-1 (MCM2+nestin+Tbr2-), Type-2a (MCM2+nestin+Tbr2+), Type-2ab (gedeeltelijke MCM2+nestin-Tbr2+ en gedeeltelijke MCM2+Tbr2+DCX-), Type-2b (MCM2+Tbr2+DCX+) en Type-3 (MCM2+Tbr2-DCX+). Post-mitotische cellen zoals de onvolwassen en functioneel geïntegreerde neuronen kunnen worden geïdentificeerd door DCX en de rijpe neuronale marker, NeuN te gebruiken.
Traditionele methoden van IHC gebruiken antilichamen om antigenen te identificeren voor specifieke celtypen op basis van hun genexpressie. Vervolgvisualisatie door hoge resolutie beeldvormingstechnieken zoals confocale microscopie kan worden gebruikt voor hun identificatie. Er zijn echter momenteel problemen met deze methoden die geen efficiënte identificatie van de radiale glia-achtige cellen en vroege voorlopercellentypen toestaan. Het is moeilijk om deze specifieke celtypen te identificeren omdat het toegepaste antilichaam niet in staat is om de nestineiwit te penetreren en efficiënt te binden. Nestin is het intermediaire filament-eiwit dat de radiale processen bevat die worden geproduceerd door de radiale glia-achtige cel. Het inefficiënte binden van een antilichaam aan het antigeen kan het gevolg zijn van vele factoren, waaronder fixatietijd, temperatuur en gebruikte techniek6-7. Om dergelijke problemen te helpen oplossen, hebben we een antigeenherstel- of 'koken'-methode ontwikkeld. Naast nestin verbetert deze methode van antigeenherstel ook de kleuring voor andere markers zoals Ki67, BrdU, gliale fibrillaire zure eiwitten (GFAP), Tbr2 en MCM2. Onze methode combineert chemische en fysische benaderingen. Het omvat chemische fixatie van het weefsel in paraformaldehyde en vervolgens hoogtemperatuur koken van dunne coronale hippocampale secties in een buffer van een denaturant en chaotropisch behandeling. Dit verbetert de toegankelijkheid van het antigeen voor het antilichaam, verbetert de antilichaamspecificiteit en staat verbeterde identificatie van voorlopercellentypen toe. Onze aanpak is eenvoudig te gebruiken en vereist meestal al beschikbare gereedschappen en reagentia in het laboratorium. We hebben het uitgebreid gebruikt om de ontwikkeling van neurale stamcellen en hun regulatie via intrinsieke genetische of extrinsieke omgevingsfactoren te bestuderen8.

<table><tbody><tr><td>SuperFrost Plus Slide</td><td>Fisherbrand</td><td>12-550-15</td><td>Biedt sterke hechting aan hippocampal weefsel tijdens koken</td></tr><tr><td>PVA/DABCO Mounting Media</td><td>Sigma Aldrich</td><td>10981-100 ml</td><td> </td></tr><tr><td>Nestin (chicken) </td><td>Aves Lab</td><td>NES</td><td>Neurale stamcel marker</td></tr><tr><td>GFAP (rabbit)</td><td>Dako North America</td><td>Z033401-2</td><td>Astrocyte en neurale stamcel marker</td></tr><tr><td>MCM2 (mouse)</td><td>BD Transduction Laboratory</td><td>610701</td><td>Proliferatie marker</td></tr><tr><td>DCX (goat)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>SC8066</td><td>Onrijpe neuron marker</td></tr><tr><td>Tbr2 (rabbit)</td><td>Abcam</td><td>Ab23345</td><td>Amplificerende progenitor marker</td></tr><tr><td>NeuN (mouse)</td><td>Millipore</td><td>MAB377</td><td>Mature neuron marker</td></tr><tr><td>Cy2 (anti-rabbit)</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>111-226-047</td><td> </td></tr><tr><td>Cy2 (anti-chicken)</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>303-165-006</td><td> </td></tr><tr><td>Cy5 (anti-mouse)</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>315-175-047</td><td> </td></tr><tr><td>Cy5 (anti-goat)</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>305-165-047</td><td> </td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Life Technologies Corporation</td><td>D1306</td><td> </td></tr><tr><td>Dako Pen</td><td>S2002</td><td>Dako</td><td>Waterafstotende pen</td></tr></tbody></table>

hitte-geïnduceerde antigeentraughering: een effectieve methode om stamcellentypen te detecteren en identificeren tijdens neurogenese van de hippocampus bij volwassenen

Heat-Induced Antigen Retrieval: An Effective Method to Detect and Identify Progenitor Cell Types during Adult Hippocampal Neurogenesis

Traditionele methoden van immunohistochemie (IHC) na weefselfixatie maken de visualisatie van verschillende celtypen mogelijk. Deze gaan doorgaans gepaard met het aanbrengen van antilichamen om antigenen te binden en cellen te identificeren met kenmerken die een functie zijn van de inherente biologie en ontwikkeling. Neurogenese in de hippocampus bij volwassenen is een sequentieel proces waarin een rustige neurale stamcel geactiveerd kan worden en door stadia van proliferatie, differentiatie, maturatie en functionele integratie kan gaan. elke fase is uniek met een karakteristieke morfologie en opregulatie van genen. Identificatie van deze fasen is belangrijk om de regulerende mechanismen die aan het werk zijn te begrijpen en eventuele veranderingen in dit proces die de pathofysiologie van invaliderende aandoeningen onderliggen. Onze door hitte geïnduceerde antigenretrieval-aanpak verbetert de intensiteit van het signaal dat wordt gedetecteerd en maakt correcte identificatie van het progenitorceltype mogelijk. Zoals besproken in dit artikel, stelt het ons vooral in staat om huidige problemen bij de detectie van bepaalde progenitorceltypen te omzeilen.

Neurogenese in de hippocampus van volwassenen is een sequentieel proces waarbij het representatieve progenitorceltype in elke fase kan worden geïdentificeerd met een combinatie van markers. Zorgvuldige chemische fixatie en antigeen-retrieval verbeteren de effectiviteit en toegankelijkheid van markers die anders moeilijk te detecteren zijn. Een van deze markers is nestin, dat tot expressie komt in radiale glia-achtige neurale stamcellen en sommige vroege actieve progenitorceltypes. Nestin kan een sleutelprotein zijn bij h...

Tijdens neurogenese van de hippocampus bij volwassenen wordt een specifieke set genetische markers tot expressie gebracht wanneer een inactieve neurale stamcel sequentieel progresseert en zich ontwikkelt tot een functioneel geïntegreerde neuron in de circuit. Met behulp van warmte-geïnduceerde antigeenretrieval worden progenitorceltypen die anders moeilijk te detecteren zijn, met verbeterde effectiviteit geïdentificeerd.

Hitte-geïnduceerde antigeentraughering: een effectieve methode om stamcellentypen te detecteren en identificeren tijdens neurogenese van de hippocampus bij volwassenen

Traditional  methods of immunohistochemistry (IHC) following tissue fixation allow visualization  of various cell types. These typically proceed with the ...

Het algemene doel van deze procedure is het uitvoeren van antigeenherstel op hippocampaal hersenweefsel om de progenitorceltypen die nieuwe neuronen voortbrengen beter te kunnen visualiseren. Dit wordt bereikt door eerst de geperfuseerde hersenen van de muis te oogsten, dunne coronale coupes te snijden en deze coupes te monteren op een glazen objectglas dat specifiek is ontworpen om sterk aan het weefsel te hechten. De tweede stap is het koken van de objectglazen met weefsel en de bijbehorende behandeling, gevolgd door voldoende tijd voor afkoeling.Kleur vervolgens het weefsel gedurende de nacht met primaire antilichamen. De laatste stap is het uitvoeren van de secundaire antilichaamkleuring van het weefsel de volgende dag gedurende ten minste twee uur. Visualiseer tot slot de verschillende pro-genderceltypen in de diverse ontwikkelingsstadia tijdens de volwassen neurogenese van het hippocampale weefsel met time-lapse- of confocale microscopie.Hoi, mijn naam is Hun Jo, postdoc en lid van het laboratorium van Dr. Ian John bij de Mayo Clinic. De belangrijkste focus in het laboratorium van John is het onderzoeken van het proces van neurogenese bij neurologische en psychiatrische aandoeningen. Ons einddoel is om deze kennis succesvol te vertalen naar therapeutische toepassingen; ik zal onze procedure voor antigeen-retrieval demonstreren, samen met Quam Hui en hi John uit ons laboratorium.Het belangrijkste voordeel van onze techniek ten opzichte van bestaande methoden voor immunohistochemie is dat het effectieve visualisatie mogelijk maakt van verschillende celtypen tijdens de neurogenese in de hippocampus van volwassenen. Deze celtypen, waaronder de precursor neurale stamcellen die anders moeilijk te detecteren zijn, kunnen efficiënt worden gelabeld en gevisualiseerd met behulp van onze methode voor antigeenherstel. Deze methode zal inzicht bieden in de ontwikkeling en regulatie van nieuw gevormde neuronen tijdens de neurogenese in de hippocampus van volwassenen.Voor onderzoekers die geïnteresseerd zijn in de studie van psychische stoornissen en farmacologische behandeling, zal onze antigeenherstelmethode nuttig blijken bij het onderzoeken van de rol van neuronale ontwikkeling tijdens de pathogenese van deze ziekte. Begin de procedure door de hersenen van een geperfuseerde muis in 4%paraformaldehyde te plaatsen in een conische buis van 10 milliliter, gedurende de nacht bij vier graden Celsius, of gedurende ten minste 12 tot 24 uur, maar niet langer dan 36 uur voor volledige fixatie. Verwijder na de nachtelijke fixatie de PFA en laat de hersenen in de conische buis.Spoel de hersenen vervolgens met 30% sucrose om eventuele resten PFA te verwijderen en gooi de sucrose weg. Vul de buis daarna opnieuw met 30% sucrose en bewaar deze bij vier graden Celsius totdat de hersenen naar de bodem van de buis zinken. Snijd vervolgens de hippocampus met een microtoom in hersensecties van 40 micrometer.Bewaar de secties in de antivriesoplossing totdat ze klaar zijn voor immunohistochemie. Monteer de coupes vervolgens op microscoopglaasjes die specifiek zijn ontworpen om het weefsel sterk te binden. Laat de glaasjes na het monteren van het weefsel ongeveer 10 minuten drogen.Het drogen kan worden versneld door de objectglazen tegen een verticaal oppervlak op een papieren handdoek te plaatsen om volledige verwijdering van eerdere chemicaliën te waarborgen. Zodra de objectglazen droog zijn, wast u ze 3 keer met PBS gedurende telkens vijf minuten. Laat ze vervolgens opnieuw drogen.Bereid bij deze procedure de oplossing voor het koken van weefsel volgens de beschrijving in het bijbehorende manuscript. Kook de oplossing vervolgens vijf minuten in een standaard magnetron op de standaardinstelling. Zodra het koken is voltooid, wordt de container voorzichtig uit de magnetron verwijderd.Breng daarna de gedroogde objectglazen over naar de oplossing. Zorg ervoor dat de zijde met de hippocampussecties volledig is blootgesteld aan de oplossing. Plaats de objectglazen indien mogelijk onder een hoek tegen de wanden van de houder en stapel andere objectglazen eromheen.Kook vervolgens het mengsel met de objectglazen zeven minuten in de magnetron op de standaardinstellingen. Vul ondertussen twee ijsemmers voor de helft met ijs. Zodra het koken is voltooid, haal je de houder uit de magnetron en plaats je deze in een van de ijsemmers.Giet de rest van het ijs uit de andere emmer rondom de container en bedek deze volledig. Laat het geheel daarna één uur staan. Verwijder de objectglazen vervolgens uit de container.Was deze drie keer met TBST-buffer gedurende vijf minuten per keer. Droog de objectglazen vervolgens in het donker gedurende vijf tot 10 minuten of totdat het objectglas volledig droog is. Bereid ondertussen een kamer met DDH₂O voor voor de overnight-incubatie met het primaire antilichaam.Zodra de glaasjes zijn opgedroogd, tekent u met een waterafstotende pen een omtrek rond de weefselcoupes. Deze omtrek dient als barrière om te voorkomen dat het antilichamenmengsel overstroomt. Bereid vervolgens het primaire antilichamenmengsel voor in T-B-S-T-T.Plaats de gedroogde preparaten op de objecttafel in de kleurkamer. Voeg langzaam 500 µL van het primaire antilichaam toe om het gehele oppervlak te bedekken. Sluit vervolgens de kleurkamer om extern licht te blokkeren en bewaar deze een nacht bij kamertemperatuur; was de preparaten de volgende dag drie keer gedurende vijf minuten per keer met TBST-buffer.Droog ze daarna in het donker. Bereid nu het mengsel van secundaire antilichamen in T-B-S-T-T voor. Plaats vervolgens de droge objectglazen in de kleinkamer.Voeg 500 µL van het secundaire antilichaam toe. Dek de kleurkamer langzaam af en bewaar deze uit direct licht gedurende ten minste twee uur bij kamertemperatuur na voltooiing van de secundaire kleuring; was de coupes vervolgens drie keer gedurende vijf minuten per keer met TBST-buffer en droog de coupes in het donker. Voeg monteervloeistof toe aan de coupes.Dek ze voorzichtig af met dekglasplaatjes om de vorming van luchtbellen te voorkomen. Bewaar de objectglazen vervolgens minstens twee uur in het donker vóór de daaropvolgende analyse en het uitvoeren van time-lapse- of confocal-analyse op het gekleurde weefsel. De neurogenese in de hippocampus van volwassenen wordt weergegeven over de subgranulaire zone van de gyrus dentatus.Een geactiveerde radiale glia-achtige type one stamcel doorloopt verschillende fasen terwijl deze differentieert, rijpt en zich met een complexe morfologie functioneel integreert in het neurale circuit. Elke fase en de respectievelijke celtypen kunnen worden geïdentificeerd op basis van hun expressie van een combinatie van markers. MCM two is een proliferatiemarker die tot expressie komt in alle mitotische progenitorceltypen, terwijl nestin tot expressie komt in radiale en niet-radiale glia-achtige stamcellen.Wanneer de type twee A-progenitoren differentiëren, wordt de expressie van nestine als eerste uitgeschakeld. De expressie van Anti TBR twee neemt toe in de post-mitotische progenitor, de expressie van MCM twee gaat verloren, terwijl de expressie van DCX en NEWAN de migratie en rijping tot een functioneel neuron bepalen. Dit is een representatieve confocale afbeelding van paarse MCM twee, groene nestine en rode dappy kleuring.De vergrote afbeeldingen in de kaders tonen een radiale GL-achtige progenitor die neston MCM twee en dpi tot expressie brengt. Hier is een representatieve confocale afbeelding van blauw MCM twee, rood TBR twee, groen DCX en grijs dpi. De kenmerkende kleuring van een Type twee B progenitorceltype, die MCM twee, TBR 2D, c, X en dpi tot expressie brengt, wordt getoond in de vergrote afbeeldingen in de kaders.Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om drie zaken in gedachten te houden. Ten eerste: gebruik goed geperfuseerd en gefixeerd weefsel met de juiste coronale dikte. Ten tweede: het weefsel vlak op de glaasjes monteren en daarbij elke vorm van beschadiging voorkomen.En ten slotte, drie, waardoor er voldoende tijd is voor het koken en het daaropvolgende afkoelen tijdens het antigeenherstel. Na deze procedure kunnen andere methoden, zoals confocale weefsreconstructie en gedragsexperimenten, worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden over hoe pasgeboren neuronen zich kunnen integreren in de hippocampale circuits en bijdragen aan de cognitieve functie. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u antigeenherstel uitvoert op uw hippocampale weefsel om effectiever de representatieve celtypen te visualiseren die aan de basis liggen van nieuwe neuronen tijdens andere hippocampale neurogenese.

heat-induced-antigen-retrieval-an-effective-method-to-detect-identify

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Hitte-geïnduceerde antigeenretrieval: een effectieve methode om stamcellentypen te detecteren en identificeren tijdens neurogenese in de hippocampus van volwassenen

The video illustrates an immunofluorescence staining method used to examine neurogenesis in the adult hippocampus. Initially, a mouse brain section undergoes treatment with primary antibodies directed at marker proteins associated with neurogenesis in neuronal progenitor cells. Next, it is labeled with secondary antibodies tagged with fluorophores. The brain section is then observed under a confocal microscope to distinguish various subtypes of progenitor cells, based on the expression patterns...

An Immunofluorescence Staining Technique to Detect Adult Hippocampal Neurogenesis

This video demonstrates the procedure for staining newly proliferated neural stem cells in brain tissue sections using EdU incorporation, followed by immunofluorescence to visualize specific proteins, enhancing the understanding of cell dynamics and proliferation.

Immunofluorescence Staining for Visualizing Proliferated Neural Stem Cells in Mouse Brain Sections

Deze video-artikel illustreert een uitgebreid protocol om alle stadia van neurogenese van de hippocampus bij volwassenen binnen dezelfde weefselsectie te detecteren en te kwantificeren. We hebben een methode ontwikkeld om de beperkingen van indirecte meervoudige immunofluorescentie te overwinnen die zich voordoen wanneer geschikte antilichamen van verschillende gastheersoorten niet beschikbaar zijn.

Immunohistochemie en Multiple Labeling met antilichamen van dezelfde Host te onderzoeken soorten volwassen hippocampus Neurogenese

We beschrijven een immunohistochemie protocol om het profiel van de hippocampus neuron activering studeren na blootstelling aan een ruimtelijke leertaak in een muismodel gekenmerkt door cognitieve tekorten van neurologische oorsprong. Dit protocol kan worden toegepast op zowel genetische of farmacologische muismodellen gekenmerkt door cognitieve tekorten.

Immunohistochemische Visualisatie van hippocampus Neuron activiteit na Ruimtelijke Leren in een muismodel van Neurodevelopmental Disorders

Presenteren we een effectieve en reproduceerbare methode om te isoleren en cultuur van neurale voorlopercellen van embryonale en postnatale hersenweefsel voor chromatine immunoprecipitation (ChIP) van Histon 3 lysine 79 dimethylation (H3K79me2) - een Histon mark gelegen binnen de bolvormige domein van Histon 3.

Isolatie en teelt van neurale progenitoren gevolgd door chromatine-Immunoprecipitation van Histone 3 Lysine 79 Dimethylation Mark

Het doel van dit protocol is om een aanpak te beschrijven voor het analyseren van gedrag van volwassen neurale stam/voorlopercellen in reactie op chemogenetische manipulatie van een specifiek lokaal neuraal circuit.

Asgezegde circuit specifieke regulering van volwassen Hippocampal neurale precursor cellen

Dit artikel presenteert vier van de meest voorkomende technieken voor het visualiseren van BrdU-positieve cellen om volwassen neurogenese bij ratten te meten. Dit werk omvat instructies voor reagenspreparaatatie, thymidine-analoge toediening, transcardiale perfusie, weefselvoorbereiding, peroxidase immunohistochemische reactie, immunofluorescentie, signaalversterking, counterstaining, microscopiebeeldvorming en celanalyse.

Immunohistochemische technieken om cellulaire proliferatie en neurogenese bij ratten te analyseren met behulp van de Thymidine Analog BrdU

Auto-immune encefalitis is een nieuwe categorie van antilichaam-gemedieerde ziekten van het centrale zenuwstelsel. Hippocampusneuronen kunnen worden gebruikt om deze antilichamen te ontdekken en te karakteriseren. Dit artikel biedt een protocol voor primaire celkweek en immunostaining om auto-antilichamen in het serum en cerebrospinale vloeistof van patiënten te bepalen.

Hippocampale neuronale culturen om nieuwe pathogene antilichamen te detecteren en te bestuderen die betrokken zijn bij auto-immune encefalitis

Transplantatie van menselijke pluripotente stamcel-afgeleide GABAerge neuronen gegenereerd door neuronale programmering zou een potentiële behandelingsbenadering kunnen zijn voor neurologische ontwikkelingsstoornissen. Dit protocol beschrijft de generatie en transplantatie van menselijke stamcel-afgeleide GABAerge neuronale voorlopers in de hersenen van neonatale muizen, waardoor langdurig onderzoek van geënte neuronen en evaluatie van hun therapeutisch potentieel mogelijk is.

Transplantatie van menselijke stamcel-afgeleide GABAerge neuronen in de vroege postnatale muis hippocampus om neurologische ontwikkelingsstoornissen te verminderen

Hier wordt een methode gepresenteerd om enkele kernen geïsoleerd uit de gyrus van de muis te sequencen die de meeste neuronen uitsluit door fluorescentie-geactiveerde kernen (FAN) -sortering. Deze aanpak genereert hoogwaardige expressieprofielen en vergemakkelijkt de studie van de meeste andere celtypen die in de niche zijn vertegenwoordigd, inclusief schaarse populaties zoals neurale stamcellen.

Fluorescentie-geactiveerde kernen negatieve sortering van neuronen gecombineerd met single nuclei RNA-sequencing om de hippocampale neurogene niche te bestuderen

Leer hitte-geïnduceerde antigeentraughering om stamcellen in de hippocampus te detecteren. Deze methode verbetert de visualisatie van voorlopercellen tijdens volwassen neurogenese.

Hitte-geïnduceerde antigeentraughering: een effectieve methode om stamcellentypen te detecteren en identificeren tijdens neurogenese van de hippocampus bij volwassenen (Video) | JoVE Journal

Hitte-geïnduceerde antigeentraughering: een effectieve methode om stamcellentypen te detecteren en identificeren tijdens neurogenese van de hippocampus bij volwassenen

Meer video's verkennen