Hitte-geïnduceerde antigeentraughering: een effectieve methode om stamcellentypen te detecteren en identificeren tijdens neurogenese van de hippocampus bij volwassenen

Het algemene doel van deze procedure is het uitvoeren van antigeenherstel op hippocampaal hersenweefsel om de progenitorceltypen die nieuwe neuronen voortbrengen beter te kunnen visualiseren. Dit wordt bereikt door eerst de geperfuseerde hersenen van de muis te oogsten, dunne coronale coupes te snijden en deze coupes te monteren op een glazen objectglas dat specifiek is ontworpen om sterk aan het weefsel te hechten. De tweede stap is het koken van de objectglazen met weefsel en de bijbehorende behandeling, gevolgd door voldoende tijd voor afkoeling.

Kleur vervolgens het weefsel gedurende de nacht met primaire antilichamen. De laatste stap is het uitvoeren van de secundaire antilichaamkleuring van het weefsel de volgende dag gedurende ten minste twee uur. Visualiseer tot slot de verschillende pro-genderceltypen in de diverse ontwikkelingsstadia tijdens de volwassen neurogenese van het hippocampale weefsel met time-lapse- of confocale microscopie.

Hoi, mijn naam is Hun Jo, postdoc en lid van het laboratorium van Dr. Ian John bij de Mayo Clinic. De belangrijkste focus in het laboratorium van John is het onderzoeken van het proces van neurogenese bij neurologische en psychiatrische aandoeningen. Ons einddoel is om deze kennis succesvol te vertalen naar therapeutische toepassingen; ik zal onze procedure voor antigeen-retrieval demonstreren, samen met Quam Hui en hi John uit ons laboratorium.

Het belangrijkste voordeel van onze techniek ten opzichte van bestaande methoden voor immunohistochemie is dat het effectieve visualisatie mogelijk maakt van verschillende celtypen tijdens de neurogenese in de hippocampus van volwassenen. Deze celtypen, waaronder de precursor neurale stamcellen die anders moeilijk te detecteren zijn, kunnen efficiënt worden gelabeld en gevisualiseerd met behulp van onze methode voor antigeenherstel. Deze methode zal inzicht bieden in de ontwikkeling en regulatie van nieuw gevormde neuronen tijdens de neurogenese in de hippocampus van volwassenen.

Voor onderzoekers die geïnteresseerd zijn in de studie van psychische stoornissen en farmacologische behandeling, zal onze antigeenherstelmethode nuttig blijken bij het onderzoeken van de rol van neuronale ontwikkeling tijdens de pathogenese van deze ziekte. Begin de procedure door de hersenen van een geperfuseerde muis in 4%paraformaldehyde te plaatsen in een conische buis van 10 milliliter, gedurende de nacht bij vier graden Celsius, of gedurende ten minste 12 tot 24 uur, maar niet langer dan 36 uur voor volledige fixatie. Verwijder na de nachtelijke fixatie de PFA en laat de hersenen in de conische buis.

Spoel de hersenen vervolgens met 30% sucrose om eventuele resten PFA te verwijderen en gooi de sucrose weg. Vul de buis daarna opnieuw met 30% sucrose en bewaar deze bij vier graden Celsius totdat de hersenen naar de bodem van de buis zinken. Snijd vervolgens de hippocampus met een microtoom in hersensecties van 40 micrometer.

Bewaar de secties in de antivriesoplossing totdat ze klaar zijn voor immunohistochemie. Monteer de coupes vervolgens op microscoopglaasjes die specifiek zijn ontworpen om het weefsel sterk te binden. Laat de glaasjes na het monteren van het weefsel ongeveer 10 minuten drogen.

Het drogen kan worden versneld door de objectglazen tegen een verticaal oppervlak op een papieren handdoek te plaatsen om volledige verwijdering van eerdere chemicaliën te waarborgen. Zodra de objectglazen droog zijn, wast u ze 3 keer met PBS gedurende telkens vijf minuten. Laat ze vervolgens opnieuw drogen.

Bereid bij deze procedure de oplossing voor het koken van weefsel volgens de beschrijving in het bijbehorende manuscript. Kook de oplossing vervolgens vijf minuten in een standaard magnetron op de standaardinstelling. Zodra het koken is voltooid, wordt de container voorzichtig uit de magnetron verwijderd.

Breng daarna de gedroogde objectglazen over naar de oplossing. Zorg ervoor dat de zijde met de hippocampussecties volledig is blootgesteld aan de oplossing. Plaats de objectglazen indien mogelijk onder een hoek tegen de wanden van de houder en stapel andere objectglazen eromheen.

Kook vervolgens het mengsel met de objectglazen zeven minuten in de magnetron op de standaardinstellingen. Vul ondertussen twee ijsemmers voor de helft met ijs. Zodra het koken is voltooid, haal je de houder uit de magnetron en plaats je deze in een van de ijsemmers.

Giet de rest van het ijs uit de andere emmer rondom de container en bedek deze volledig. Laat het geheel daarna één uur staan. Verwijder de objectglazen vervolgens uit de container.

Was deze drie keer met TBST-buffer gedurende vijf minuten per keer. Droog de objectglazen vervolgens in het donker gedurende vijf tot 10 minuten of totdat het objectglas volledig droog is. Bereid ondertussen een kamer met DDH₂O voor voor de overnight-incubatie met het primaire antilichaam.

Zodra de glaasjes zijn opgedroogd, tekent u met een waterafstotende pen een omtrek rond de weefselcoupes. Deze omtrek dient als barrière om te voorkomen dat het antilichamenmengsel overstroomt. Bereid vervolgens het primaire antilichamenmengsel voor in T-B-S-T-T.

Plaats de gedroogde preparaten op de objecttafel in de kleurkamer. Voeg langzaam 500 µL van het primaire antilichaam toe om het gehele oppervlak te bedekken. Sluit vervolgens de kleurkamer om extern licht te blokkeren en bewaar deze een nacht bij kamertemperatuur; was de preparaten de volgende dag drie keer gedurende vijf minuten per keer met TBST-buffer.

Droog ze daarna in het donker. Bereid nu het mengsel van secundaire antilichamen in T-B-S-T-T voor. Plaats vervolgens de droge objectglazen in de kleinkamer.

Voeg 500 µL van het secundaire antilichaam toe. Dek de kleurkamer langzaam af en bewaar deze uit direct licht gedurende ten minste twee uur bij kamertemperatuur na voltooiing van de secundaire kleuring; was de coupes vervolgens drie keer gedurende vijf minuten per keer met TBST-buffer en droog de coupes in het donker. Voeg monteervloeistof toe aan de coupes.

Dek ze voorzichtig af met dekglasplaatjes om de vorming van luchtbellen te voorkomen. Bewaar de objectglazen vervolgens minstens twee uur in het donker vóór de daaropvolgende analyse en het uitvoeren van time-lapse- of confocal-analyse op het gekleurde weefsel. De neurogenese in de hippocampus van volwassenen wordt weergegeven over de subgranulaire zone van de gyrus dentatus.

Een geactiveerde radiale glia-achtige type one stamcel doorloopt verschillende fasen terwijl deze differentieert, rijpt en zich met een complexe morfologie functioneel integreert in het neurale circuit. Elke fase en de respectievelijke celtypen kunnen worden geïdentificeerd op basis van hun expressie van een combinatie van markers. MCM two is een proliferatiemarker die tot expressie komt in alle mitotische progenitorceltypen, terwijl nestin tot expressie komt in radiale en niet-radiale glia-achtige stamcellen.

Wanneer de type twee A-progenitoren differentiëren, wordt de expressie van nestine als eerste uitgeschakeld. De expressie van Anti TBR twee neemt toe in de post-mitotische progenitor, de expressie van MCM twee gaat verloren, terwijl de expressie van DCX en NEWAN de migratie en rijping tot een functioneel neuron bepalen. Dit is een representatieve confocale afbeelding van paarse MCM twee, groene nestine en rode dappy kleuring.

De vergrote afbeeldingen in de kaders tonen een radiale GL-achtige progenitor die neston MCM twee en dpi tot expressie brengt. Hier is een representatieve confocale afbeelding van blauw MCM twee, rood TBR twee, groen DCX en grijs dpi. De kenmerkende kleuring van een Type twee B progenitorceltype, die MCM twee, TBR 2D, c, X en dpi tot expressie brengt, wordt getoond in de vergrote afbeeldingen in de kaders.

Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om drie zaken in gedachten te houden. Ten eerste: gebruik goed geperfuseerd en gefixeerd weefsel met de juiste coronale dikte. Ten tweede: het weefsel vlak op de glaasjes monteren en daarbij elke vorm van beschadiging voorkomen.

En ten slotte, drie, waardoor er voldoende tijd is voor het koken en het daaropvolgende afkoelen tijdens het antigeenherstel. Na deze procedure kunnen andere methoden, zoals confocale weefsreconstructie en gedragsexperimenten, worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden over hoe pasgeboren neuronen zich kunnen integreren in de hippocampale circuits en bijdragen aan de cognitieve functie. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u antigeenherstel uitvoert op uw hippocampale weefsel om effectiever de representatieve celtypen te visualiseren die aan de basis liggen van nieuwe neuronen tijdens andere hippocampale neurogenese.