Procedure voor de ontwikkeling van multi-diepte Circulaire Cross-sectionele endotheel Microkanalen-on-a-chip
October 21st, 2013
Een microchannels-on-a-chip platform werd ontwikkeld door de combinatie van fotolithografische reflowable fotolak techniek, zachte lithografie, en microfluidics. Het endotheel microkanalen platform bootst de driedimensionale (3D) geometrie van in vivo micro-vaatjes, loopt onder gecontroleerde continue perfusie stroom, zorgt voor hoge kwaliteit en real-time beeldvorming en kan worden toegepast voor microvasculaire onderzoek.
Het algemene doel van deze procedure is om een multi-diepte circulair dwarsdoorsnede endotheel microkanalen op een chip te ontwikkelen, die de 3D-geometrie van in vivo, microvaten nabootst en onder gecontroleerde continue overvloeiingsstroom loopt. Dit wordt bereikt door eerst een mastermal met een halfcirkelvormige dwarsdoorsnede microkanaalnetwerk te fabriceren met behulp van fotolithografische positieve herstroombare fotoweerstand. De tweede stap is om de mastermal te gebruiken om twee poly dimethyl soane microkanalen te repliceren, ze uit te lijnen en ze te verbinden om een cilindrisch microkanaalnetwerk te creëren.
Vervolgens worden de primaire humane navelstrengvene-endotheelcellen geplaatst in het microkanaalnetwerk voordat de cellen worden gekweekt onder gecontroleerde continue mediumperfusievoorwaarden gedurende een periode van vier dagen tot twee weken. Uiteindelijk ontwikkelt zich een confluente celmonolaag aan de binnenoppervlakte van het microkanaalnetwerk, wat aangegeven wordt door het membraan dat onder de microscoop staat. Berekening van functionele microvaten waarin een platform kan worden geboden voor de studie van complexe vasculaire fenomenen. Echter, conventionele individuele microvaten-assays zoals anso-celmigratie-assays, enSo twee vorming-assays, en de rechter en mos tic ring-assays zijn beperkt om individuele microvaten te herscheppen met betrekking tot driedimensionale geometrie en continue stromingscontrole.
Het belangrijkste voordeel van onze technieken, onze bestaande microfabricagemethode, is dat het conventioneel een multi-diepte microfluïdisch kanaalnetwerk kan fabriceren dat de complexe 3D-geometrieën van in vivo microvaten met afgeronde dwarsdoorsneden nabootst. Het maakt ook mogelijk om microvasculaire biomagnetische systemen te ontwerpen, die ongeveer meer langzaam gehoorzamen en de vloeistofstroom op een vereist niveau houden, zodat de algehele kanaalweerstand laag is en het verlies van stroom uniformer is door het netwerk heen. De procedure zal worden uitgevoerd door een afgestudeerde student uit mijn laboratorium. Deze procedure begint met de fabricage van een fotoweerstand mastermal die bestaat uit microkanalen met diameters tussen de 30 micrometer en 60 micrometer, zoals beschreven in het tekstprotocol. Overbreng kort de herstroombare fotoweerstand van de koelkast op vier graden Celsius naar de schone ruimte 24 uur voor gebruik en laat het opwarmen tot kamertemperatuur.
Begin met het spincoaten van de positieve herstroombare fotoweerstandlaag op een vooraf gereinigde siliciumsubstraat volgens de procedure in het tekstprotocol. Stel vervolgens de fotoweerstand bloot aan UV-licht door een gepatternd masker voordat de gepatternde microkanalen worden ontwikkeld. Maak tenslotte, na herstroom, een halfcirkelvormige dwarsdoorsnede microkanaalnetwerk.
Zodra de mastermal klaar is, bereid polymethyl soane of PDMS-oplossing voor bij een gewichtsverhouding van 10 tot 1 basis tot het uithardingsmiddel en meng het grondig met behulp van een planetaire centrifugaalmixer. Giet de PDMS-oplossing op de herstroomde fotoweerstand mastermal. Plaats de gegoten PDMS in een droogkast gedurende 15 minuten om te degasseren.
Gebruik stikstofgas om eventuele resterende bellen te verwijderen indien nodig. Bak de PDMS in een oven bij een temperatuur van 60 graden Celsius gedurende drie uur om het uit te laten harden. Verwijder vervolgens de uitgeharde PDMS-laag van de mastermal.
Gebruik een scherpe pons om inlaat- en uitlaatgaten te maken door gaten in het kanaalnetwerk te ponsen. Reinig het oppervlak van de PDMS met behulp van stikstofgas. Behandel twee PDMS-lagen met zuurstofplasma gedurende 30 seconden in een plasmareiniger bij een werkdruk van 45 milato en een zuurstofstroomsnelheid van 3,5 kubieke voet per minuut.
Lign de oppervlakken van de PDMS handmatig onder een optische microscoop. Gebruik indien nodig een druppel water voor een betere controle van de uitlijning. Bak tenslotte het apparaat in een oven bij 60 graden Celsius gedurende 30 minuten om een permanente bindingscultuur te bereiken.
Primary humane navelstrengvene-endotheelcellen of VE in kweekmedium met L-glutamine gesupplementeerd met 10% foetaal bovien serum. Behandel het apparaat gedurende vijf minuten met zuurstofplasma bij een werkdruk van 45 milit en een zuurstofstroomsnelheid van 3,5 kubieke voet per minuut. Laad vervolgens het apparaat met gedeïoniseerd water en behandel met UV-licht gedurende acht uur in een laminare bioveiligheidskast voor sterilisatie.
Een dag voordat de cellen klaar zijn, spoel het apparaat met één x fosfaat gebufferd zout oplossing of PBS en bedek vervolgens met fibronectine. Incubeer in de koelkast bij vier graden Celsius overnacht. Zodra de cellen confluëren, oogst ze door de cellen eerst te spoelen met heaps gebufferd zoutoplossing en vervolgens de cellen te behandelen met trypsine EDTA na toevoeging van trypsine.
Incubeer de cellen gedurende twee tot zes minuten bij 37 graden Celsius. Na de trypsinisatie is voltooid, neutraliseer de tripsin EDTA met tripsin neutralisatieoplossing. Tel de cellen, centrifugeer ze vervolgens voor resus.
Suspenderen in kweekmedium met 8%dextrine dextrine wordt gebruikt om de mediumviscositeit te verhogen om betere celzitting en hechting te bevorderen na de FI enc ENC coating. Spoel het apparaat met één XPBS en laad vervolgens het apparaat met kweekmedium voordat het wordt geïncubeerd bij een temperatuur van 37 graden Celsius gedurende 15 minuten. Vervolgens worden cellen in 8% Dextrin kweekmedium met een concentratie van drie tot vier miljoen cellen per milliliter geladen in het apparaat.
Plaats een druppel van 20 microliter cellen op één inlaat van het apparaat en kantel het om de cellen in het microfluïdische kanaal te introduceren. Na 15 tot 20 minuten zullen de cellen beginnen zich aan de zijwanden van de kanalen te hechten. Draai het apparaat elke 15 minuten om een meer uniforme verdeling van cellen te creëren.
Indien nodig kan extra belading worden uitgevoerd. Na vijf tot zes uur statische cultuur zullen de aangehechte cellen zich volledig beginnen te verspreiden. Stel een langdurige
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Deze studie presenteert een microchannels-on-a-chip platform dat de 3D-geometrie van in vivo microvaten nabootst. Het platform maakt gecontroleerde continue perfusiestroming en hoogwaardige real-time beeldvorming mogelijk, waardoor het geschikt is voor microvasculair onderzoek.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Microfluidica
- Vasculaire biologie
- Celcultuurtechnieken
Achtergrond
- Microvasculair onderzoek is essentieel voor het begrijpen van complexe vasculaire fenomenen.
- Conventionele tests falen vaak in het repliceren van de 3D-geometrie en continue stroming van microvaten.
- Endotheelcellen spelen een cruciale rol in vasculaire functie en gezondheid.
- Microfabricatietechnieken kunnen de studie van vasculaire systemen verbeteren.
Doel van het onderzoek
- Om een microfluïdisch platform te ontwikkelen dat in vivo microvaten nauwkeurig nabootst.
- Om real-time beeldvorming en gecontroleerde perfusie mogelijk te maken voor vasculair onderzoek.
- Om een betrouwbare methode te bieden voor het kweken van endotheelcellen in een 3D-omgeving.
Gebruikte methoden
- Fotolithografische fabricage van een mastermal voor microkanalen.
- Replicatie van de mal met behulp van PDMS om het microkanaalnetwerk te creëren.
- Zaaien van primaire humane navelstrengvene-endotheelcellen in de kanalen.
- Continue mediumperfusie om celcultuurcondities te handhaven.
Belangrijkste resultaten
- Er werd een confluent monolaag van endotheelcellen ontwikkeld binnen de microkanalen.
- Het platform nabootste met succes de 3D-structuur van microvaten.
- Real-time beeldvorming demonstreerde de functionaliteit van de endotheelcellen.
- Het systeem maakt de studie van complexe vasculaire fenomenen onder gecontroleerde omstandigheden mogelijk.
Conclusies
- Het microchannels-on-a-chip platform is een waardevol hulpmiddel voor vasculair onderzoek.
- Deze methode verbetert het begrip van endotheelcelgedrag in een 3D-context.
- Toekomstige studies kunnen dit platform gebruiken om verschillende aspecten van microvasculaire biologie te verkennen.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Reproducible in vitro microvascular models are critical for early-stage drug discovery, enabling mechanistic de-risking and predictive confidence in vascular biology studies. This multi-depth circular cross-sectional endothelialized microchannels-on-a-chip platform addresses the limitations of conventional assays by replicating in vivo-like 3D geometry and supporting continuous perfusion. The system enhances translational continuity and supports robust target validation for vascular-focused portfolios.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of vascular biology hypotheses in a physiologically relevant 3D microenvironment.
- Supports functional target validation by maintaining endothelial cell monolayers under controlled flow.
- Facilitates mechanistic de-risking by allowing direct observation of endothelial responses to experimental variables.
- Improves predictive confidence for vascular targets by mimicking in vivo microvessel architecture.
Screening & Assay Development
- Provides a standardized, reproducible platform for quantitative assessment of endothelial cell behavior.
- Supports assay development with continuous perfusion and real-time imaging capabilities.
- Enables preparation of validated microvascular systems for downstream compound screening.
- Facilitates scalability and platform reuse across multiple experimental conditions.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant vascular models for translational biomarker studies.
- Maintains continuity from early discovery through preclinical validation by supporting long-term perfusion culture.
- Reduces translational risk by providing physiologically relevant data on microvascular function.
- Supports risk-adjusted advancement decisions for vascular-targeted therapeutics.
Pipeline & Workflow Integration
This microfluidic platform integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling hypothesis testing, quantitative readouts, and translational modeling of microvascular systems.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification and biological de-risking through controlled variable manipulation and real-time observation.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative outputs for compound evaluation in a 3D endothelialized context.
- Analytics: Provides high-resolution imaging and quantitative measurement of endothelial monolayer formation and function.
- Translational Research: Bridges in vitro findings to preclinical models by replicating in vivo-like microvascular geometry and flow.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable, adaptable platform for diverse vascular research and screening applications.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in vascular target studies.
- Operational Value: Standardizes microvascular modeling with reproducible fabrication and culture protocols.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and capital-efficient portfolio management for vascular programs.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of vascular-targeted assets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microfabrication, microfluidics, and endothelial cell culture.
- Needs access to photolithography, soft lithography, and confocal imaging infrastructure.
- Demands cross-team standardization for reproducible device fabrication and cell seeding.
- Adaptable to various endothelial cell sources and experimental conditions.
- Limited by the need for precise alignment and bonding of PDMS microchannels.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
3:10
Soft Lithography Fabrication of PDMS Microchannel Network
4:34
HUVEC Culture and Seeding in the Chip
7:03
Cell Staining and Microscope Characterization
8:10
Results: Multi-depth Microchannel Networks Mimic the Complex 3D Geometries of In vivo Microvessel
9:35
Conclusion
2:22
Photolithography Fabrication of Photoresist Master Mold
