Name: Procedure voor de ontwikkeling van multi-diepte Circulaire Cross-sectionele endotheel Microkanalen-on-a-chip (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-10-21T19:45:00.000+00:00
Duration: 10 min 55 s
Description: Ontdek een microfluidisch platform voor microvasculair onderzoek met 3D-geometrie en continue perfusie. Deze methode cultiveert endotheelcellen in cilindrische microkanalen voor real-time beeldvorming.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit onderzoek werd gedeeltelijk ondersteund door de National Science Foundation (NSF 1227359), WVU EPSCoR programma gefinancierd door de National Science Foundation (EPS-1003907), WVU ADVANCE kantoor gesponsord door de National Science Foundation (1007978), en WVU PSCoR, respectievelijk. De microfabrication werk werd gedaan in WVU Shared Research Facilities (cleanroom-faciliteiten) en Microfluïdische Integratieve Cellular Research on Chip Laboratory (microchip Lab) bij Universiteit van West Virginia. De confocale beeldvorming werd gedaan bij WVU Microscope Imaging Facility.

1. Fotolithografie Fabrication van Photoresist Master Mold Het volgende protocol toont het proces om de microkanalen fabriceren met een diameter tussen 30-60 um. Een microkanaal komen met een kleinere diameter (kleiner dan 30 urn), een spin-coating fotoresist nodig. <ol><li> Breng de reflow fotolak van de koelkast bij 4 ° C tot de cleanroom 24 uur voor gebruik en laat het opwarmen tot kamertemperatuur. </li><li> Schoon een silicium wafer en bak het gedurende een uur bij 150 ° C om deze te dehydrateren. De uitdroging wordt de fotoresist voorkomen kan het siliciumsubstraat. </li><li> Spin-laag de eerste laag fotolak met het volgende recept: </li></ol><table border="1"><tbody><tr><td> Stap </td><td> Tijd (seconden) </td><td> Toerental (tpm) </td><td> Versnelling </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 2 &lt;/ Td&gt; <td> 300 </td><td> hoogst </td></tr><tr><td> 2 </td><td> 10 </td><td> 0 </td><td></td></tr><tr><td> 3 </td><td> 3 </td><td> 300 </td><td> hoogst </td></tr><tr><td> 4 </td><td> 60 </td><td> 600 </td><td> hoogst </td></tr><tr><td> 5 </td><td> 10 </td><td> 500 </td><td> hoogst </td></tr><tr><td> 6 </td><td> 10 </td><td> 600 </td><td> hoogst </td></tr></tbody></table><ol start="4"><li> Bak dan de wafel op een verwarmingsplaat met een temperatuur van 110 ° C gedurende 90 sec. Na het zacht bakken de dikte van de fotoresist wordt 20-30 urn. </li><li> Spin laag een tweede laag fotolak volgens dezelfde receptuur voor de eerste laag. </li><li> Zachte bak de wafer opnieuw door het op een verwarmingsplaat met een temperatuur van 110 ° C gedurende 90 sec. Hierna soft bake de dikte van de fotoresist wordt 40-60 urn. </li><li> Genereren van positieve meester patronen door het blootstellen van de photoresist aan UV-licht met een bestralingsdosis van 14.500 mJ / cm 2 door middel van een film masker. </li><li> Verdun de ontwikkelaar met gedeïoniseerd (DI) water (1:2 (v / v)). Herhaaldelijk spoelen de wafer in de oplossing totdat het patroon volledig is ontwikkeld. Was daarna de wafer met DI-water en droog het met behulp van stikstofgas. </li><li> Opnieuw: Plaats de wafer op een verwarmingsplaat met een temperatuur van 120 ° C gedurende 4 min en deksel met een glazen petrischaal om oplosmiddelverdamping te voorkomen. Verwijder de wafer uit een verwarmingsplaat en laat afkoelen tot kamertemperatuur. De fotoresist dikte na reflow is gewoonlijk 50-60 micrometer. </li></ol> 2. Zachte Lithografie Fabrication van PDMS Microchannel Network <ol><li> Bereid polydimethylsiloxaan (PDMS) oplossing in de gewichtsverhouding van 10:01 (basis: verharder) en meng het grondig met een centrifugale planetaire menger. </li><li> Wierp de PDMS oplossing op de opnieuw geplaatste fotolak meester mal. Plaats de gegoten PDMS in een exsiccator gedurende 15 minuten te ontgassen. Gebruik stikstofgas om alle resterende luchtbellen indien nodig te verwijderen. </li><li> Bak de PDMS in een oven bij een temperatuur van 60 ° C gedurende 3 uur om deze te genezen. Verwijder vervolgens de uitgeharde PDMS laag van de meester mal. </li><li> Gebruik een scherp puncher met inlaat / uitlaat gaten te creëren door het ponsen van gaten in het kanaal netwerk. Reinig het oppervlak van de PDMS met stikstofgas. </li><li> Behandel twee PDMS lagen met zuurstofplasma gedurende 30 seconden in een plasma cleaner bij een werkdruk van 4,5 x 10 -2 Torr en een zuurstof stroomsnelheid van 3,5 m 3 / min. Breng daarna de oppervlakken van de PDMS handmatig onder een optische microscoop. Gebruik een druppel water eventueel een betere controle van de uitlijning. </li><li> Bak de inrichting in een oven bij 60 ° C gedurende 30 min tot permanente verbinding te verkrijgen. </li></ol> 3. HUVEC Cultuur en zaaien in de Chip <ol><li> Cultuur de HUVEC door kweekmedium met L-glutamine, aangevuld met 10% foetaal bovine serum (FBS). Voor the experiment doorgangen tussen 2 en 5 werden gebruikt. </li><li> Zodra de HUVEC confluent zijn, tellen de cellen en oogst ze door eerst spoelen van de cellen met HEPES gebufferde zoutoplossing (HEPES-BSS), en vervolgens behandelen van de cellen met trypsine / EDTA en incubeer gedurende 2-6 minuten bij 37 ° C. Na de behandeling met trypsine is voltooid, neutraliseren de trypsine / EDTA met trypsine neutraliserende oplossing. Centrifugeer en schorten de cellen in kweekmedium met 8% dextran om ze te verzamelen. Dextran werd gebruikt om het medium viscositeit te verhogen om te helpen bij hogere cellulaire zaaien en bevestiging. </li><li> Behandel het apparaat met zuurstofplasma gedurende 5 min bij een werkdruk van 4,5 x 10 -2 Torr en een zuurstof stroomsnelheid van 3,5 m 3 / min. Vervolgens laadt het apparaat met DI-water en behandelen met UV-licht voor 8 uur in een laminaire bioveiligheid kap voor sterilisatie. </li><li> Een dag voor de cellen klaar zijn, was het apparaat met 1x fosfaat gebufferde zoutoplossing (1x PBS) dan jas met fibronectine (100 ug / ml, diluted met 1x PBS) en incubeer in de koelkast bij 4 ° C overnacht. </li><li> Na de fibronectine coating, wast het apparaat met 1x PBS vervolgens te vullen met kweekmedium. Incubeer de inrichting bij een temperatuur van 37 ° C gedurende 15 minuten. </li><li> Plaats de HUVEC cellen in 8% dextran kweekmedium met een celconcentratie van 3-4 x 10 6 cellen / ml. Plaats een 20 ul druppel cellen bij een inlaat van het toestel en kantelen om de cellen te introduceren in de microfluïdische kanaal. Na 15-20 min de cellen beginnen te hechten aan de zijwanden van de kanalen. Draai het apparaat elke 15 minuten tot een gelijkmatige verdeling van de cellen te creëren. Indien nodig kan extra lading worden uitgevoerd. </li></ol> 4. Langdurige perfusie Setup Na 5-6 uur van statische cultuur, zal de bijgevoegde HUVECs beginnen om volledig uit te strekken. Opzetten perfusie met behulp van een op afstand bestuurbare spuit pompsysteem met een gestage stroom van 10 pl / uur. Perfusie kan worden aangepast fof een hoger debiet, en kan duren voor een periode van 4 dagen tot 2 weken. 5. Cel kleuring en Microscoop karakterisering <ol><li> Wanneer de cellen te bereiken samenvloeiing in het apparaat, ten eerste, was het apparaat met 1x PBS om grondig te verwijderen het medium. Vervolgens laadt het apparaat met rode kleurstof verdund met verdunner (4 pl-1 ml). Laad de kleurstof vergelijkbaar met de cel laadproces. Incubeer het apparaat in het donker gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur en daarna wassen het apparaat kweekmedium kleuring stoppen. Lange incubatie van de kleurstof kan cellulaire toxiciteit en disadhesion veroorzaken. </li><li> Laad het apparaat met blauwe kleurstof verdund met 1x PBS (2 druppels per ml). Incubeer in het donker gedurende 5 min bij kamertemperatuur geroerd en daarna grondig het apparaat met 1x PBS. </li><li> Onderzoek de cel kleuring onder een omgekeerde optische microscoop. Als de kleuring was goed, laadt de microkanalen met vaststelling medium (3,5% paraformaldehyde verdund met 1x PBS), vervolgens onderdompelenhet apparaat bij de vaststelling van middelgrote en volledig bedekken met aluminiumfolie. Bewaar het toestel in de koelkast bij een temperatuur van 4 ° C zodat het apparaat niet uitdroogt en fotobleken. De vaste inrichting is nu klaar voor confocale beeldvorming, die kan worden uitgevoerd door een laser scanning confocale microscoop. </li></ol>

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen.

<html> 1. Meester schimmel fabricage Een van de ontwerpen en de leidende beginselen voor vasculaire morphometry staat bekend als Murray&#39;s wet 16, waarin staat dat de verdeling van het schip diameters in het gehele netwerk wordt beheerst door minimale energie overweging. Het bepaalt ook dat de kubus van de diameters van een ouder schip op een vertakking is gelijk aan de som van de kubussen van de diameters van de dochter schepen ( <img alt="Vergelijking 1" fo:content-width="0.9in" ...

Microvaatjes als onderdeel van het circulatiesysteem, bewerkstelligen de interactie tussen bloed en weefsels, ondersteunen metabolische activiteiten definiëren weefsel micro en spelen een belangrijke rol in vele gezondheids en pathologische omstandigheden. Recapitulatie van functionele microvaatjes in vitro kan een platform voor de studie van complexe vasculaire fenomenen. Echter, conventionele in vitro assays microvaatje, zoals endotheliale celmigratie testen buisvorming endotheliale assays en ratten en muizen aortaring assays, in staat zijn de opnieuw in vivo microvaatjes met betrekking tot driedimensionale (3D) geometrie als continu control 1-8. Studies microvaatjes met dierlijke modellen en in vivo assays, zoals corneale angiogenese assay, kuiken chorioallantoïsmembraan angiogenese assay en Matrigel plug assay, zijn tijdrovend, in hoge kosten, uitdaging met betrekking tot waarneming en kwantificering enethische kwesties 1, 9-13. Vooruitgang in micromanufacturing en microfluïdische chip technologieën hebben verschillende inzichten mogelijk in biomedische wetenschappen terwijl vermindering de experimentele hoge kosten en complexiteit van de dieren in vivo studies 14, zoals gewoon strak gecontroleerde biologische omstandigheden en dynamische vloeibare milieus, die niet zou mogelijk met conventionele technieken macroschaal. Hier presenteren we een aanpak om een endotheel construeren microchannels-on-a-chip, die de 3D-geometrie van de in vivo micro-vaatjes nabootst en draait onder gecontroleerde continue perfusie stroom door gebruik te maken van de combinatie van fotolithografische reflowable fotolak techniek, zachte lithografie, en microfluidics.

<table><tbody><tr><td>Reagens/Materiaal</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Reflow Photoresist</td><td>AZ Electronic Materials</td><td>AZP4620</td><td></td></tr><tr><td>Ontwikkelaar</td><td>AZ Electronic Materials</td><td>AZ 400K</td><td></td></tr><tr><td>PDMS</td><td>Dow Corning Corporation</td><td>Sylgard 184</td><td></td></tr><tr><td>MCDB 131 Cultuurmedium</td><td>Invitrogen</td><td>10372-019</td><td></td></tr><tr><td>NacBlue Kernkleuring</td><td>Invitrogen</td><td>H1399</td><td></td></tr><tr><td>PKH Red Kleuring</td><td>Sigma</td><td>MINI26 en PKH26GL</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectine</td><td>Gibco</td><td>PHE0023</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>Sigma</td><td>G7513</td><td></td></tr><tr><td>Fosfaat Gebufferde Saline</td><td>Invitrogen</td><td>14040-133</td><td></td></tr><tr><td>HEPES Gebufferde Saline Oplossing</td><td>Lonza</td><td>CC-5024</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine/EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>25300-062</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine Neutralisatie Oplossing</td><td>Lonza</td><td>CC-5002</td><td></td></tr><tr><td>PDMS Uithardingsmiddel</td><td>Dow Corning Corporation</td><td>Sylgard 184</td><td></td></tr><tr><td>Primaire Humane Umbilicale Vaat Endotheel Cellen</td><td>Lonza</td><td>CC-2517</td><td></td></tr><tr><td>Foetaal Rundserum</td><td>Lonza</td><td>14-501F</td><td></td></tr><tr><td>Diluent C</td><td>Sigma</td><td>CGLDIL</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst33342</td><td>Invitrogen, Molecular Probes</td><td>R37605</td><td></td></tr><tr><td>Dextraan</td><td>Sigma</td><td>95771</td><td></td></tr><tr><td>3,5% Paraformaldehyde</td><td>Electron Microscopy Science</td><td>15710-S</td><td></td></tr><tr><td>Apparatuur</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spinner</td><td>Laurell Technologies Corporation</td><td>WS-400BZ-6NPP/LITE</td><td></td></tr><tr><td>Exsiccator</td><td>BelArt Products</td><td>999320237</td><td></td></tr><tr><td>Omgekeerd Microscoop</td><td>Nikon</td><td>Eclipse Ti</td><td></td></tr><tr><td>Spuitpomp Systeem</td><td>Harvard Apparatus</td><td>PHD Ultra</td><td></td></tr><tr><td>Laminaire Bioveiligheids Kap</td><td>Thermo Scientific</td><td>1300 Series A2</td><td></td></tr><tr><td>Planetaire Centrifuge Mixer</td><td>Thinky</td><td>ARE-310</td><td></td></tr><tr><td>Isotemp Oven</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-246-516GAQ</td><td></td></tr><tr><td>Optische Microscoop</td><td>Zeiss</td><td>Invertoskop 40C</td><td></td></tr><tr><td>Plasma Reiniger</td><td>Harrick Plasma</td><td>PDC-32G</td><td></td></tr><tr><td>Hotplate</td><td>Barnstead/Thermolyne Cimarec</td><td>SP131635</td><td></td></tr><tr><td>Laser Scanning Confocal Microscoop</td><td>Zeiss</td><td>LSM 510</td><td></td></tr></tbody></table>

procedure voor de ontwikkeling van multi-diepte circulaire cross-sectionele endotheel microkanalen-on-a-chip

Procedure for the Development of Multi-depth Circular Cross-sectional Endothelialized Microchannels-on-a-chip

Inspanningen gericht op het ontwikkelen van in vitro assays voor de studie van microvaatjes omdat in vivo dierstudies zijn tijdrovend, duur en observatie en kwantificering zijn zeer uitdagend. Echter, conventionele in vitro assays microvaatje hebben beperkingen als die in vivo microvaatjes met betrekking tot driedimensionale (3D) geometrie en een continue vloeistofstroom. Met behulp van een combinatie van fotolithografische reflowable fotolak techniek, zachte lithografie, en microfluidics, hebben we een multi-diepte cirkelvormige dwarsdoorsnede endotheel microkanalen-on-a-chip, die de 3D-geometrie van de in vivo micro-vaatjes nabootst en draait onder gecontroleerde continue perfusie flow. Een positieve herplaatsbaar fotolak werd gebruikt om een ​​meester mal te fabriceren met een halfronde dwarsdoorsnede microchannel netwerk. Door de afstemming en binding van de twee polydimethylsiloxaan (PDMS) microchannels replvoor bestemde van de meester mal, werd een cilindrische microchannel netwerk gecreëerd. De diameters van de microkanalen kan goed worden gecontroleerd. Bovendien primaire humane navelstreng endotheelcellen (HUVEC) gezaaid in de chip bleek dat de cellen gevoerd het binnenoppervlak van de microkanalen in gecontroleerde perfusie die gedurende een tijdsperiode tussen 4 dagen tot 2 weken.

Onze benadering van de multi-diepte microkanaal netwerk vervaardigen bootst de complexe 3D geometrieën van in vivo microvaatjes, waarbij de microkanalen afgeronde doorsneden 15. Bovendien, de diameters van de ouder vertakkende kanalen en dochter kanalen ongeveer gehoorzamen Murray wet handhaven de fluïdumstroom op een vereist niveau, zodat de totale kanaal weerstand laag en stroomsnelheden zijn gelijk voor het gehele netwerk 16-18. De procedure en de resultaten voor de vervaardiging van ee...

Een microchannels-on-a-chip platform werd ontwikkeld door de combinatie van fotolithografische reflowable fotolak techniek, zachte lithografie, en microfluidics. Het endotheel microkanalen platform bootst de driedimensionale (3D) geometrie van in vivo micro-vaatjes, loopt onder gecontroleerde continue perfusie stroom, zorgt voor hoge kwaliteit en real-time beeldvorming en kan worden toegepast voor microvasculaire onderzoek.

Procedure voor de ontwikkeling van multi-diepte Circulaire Cross-sectionele endotheel Microkanalen-on-a-chip

Efforts have been focused on developing in vitro assays for the study of microvessels because in vivo animal studies are more time-consuming, expensive, ...

Het algemene doel van deze procedure is het ontwikkelen van microkanalen op een chip met endotheelcellen en een cirkelvormig dwarsvlak van verschillende dieptes, die de 3D-geometrie van in vivo microvaten nabootst en functioneert onder een gecontroleerde, continue perfusiestroom. Dit wordt bereikt door eerst fotolithografisch een mastermold te vervaardigen met een netwerk van microkanalen met een halfcirkelvormig dwarsvlak, gebruikmakend van een positieve reflowable fotoresist. De tweede stap bestaat uit het gebruik van de mastermold om twee polydimethylsiloxaan microkanalen te repliceren, deze uit te lijnen en aan elkaar te hechten om een cilindrisch microkanaalnetwerk te creëren.Vervolgens worden de primaire menselijke endotheelcellen van de navelstrengvene in het microkanaalnetwerk geplaatst, waarna de cellen gedurende een periode van vier dagen tot twee weken worden gekweekt onder gecontroleerde omstandigheden van continue mediumperfusie. Uiteindelijk ontwikkelt zich langs het binnenoppervlak van het microkanaalnetwerk een samenvloeiende cellaag, wat onder de microscoop zichtbaar is aan de membranen en kernen, waardoor functionele microvaten ontstaan die een platform kunnen bie

procedure-for-development-multi-depth-circular-cross-sectional

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

Beschrijven we een chip-gebaseerde platform voor de drie-dimensionale kweken van cellen in micro-bioreactoren. Een chip kan maximaal huis tot 10 miljoen. cellen die kunnen worden geteeld onder nauwkeurig omschreven voorwaarden met betrekking tot stroming, zuurstofspanning enz. in een steriele, gesloten circulatie lus.

Chip-op basis van drie-dimensionale Cultuur van de Cel in doorbloed Micro-bioreactoren

We presenteren twee processen voor de microfabricage van poreuze polymeer chips voor drie-dimensionale celkweek. De eerste is hot embossing gecombineerd met een damp van oplosmiddelen lasproces. De tweede maakt gebruik van een recent ontwikkelde microthermoforming proces in combinatie met ion-Track technologie leidt tot een aanzienlijke vereenvoudiging van de productie.

Microfabricage van Chip-en kleinbedrijf Stellingen voor drie-dimensionale celkweek

Een methode om cultuur een endotheelcel monolaag het gehele inwendige oppervlak van een 3D microfluïdische apparaat met microvasculaire grootte kanalen (&lt;30 pm) beschreven.

Endothelialized Microfluidics voor het bestuderen van microvasculaire Interacties in Hematologische ziekten

Microfluïdische stromingskamers geëtst door fotolithografie en vervaardigd uit PDMS worden toegepast op functionele resultaten in verband met EG-dysfunctie en ontsteking te onderzoeken. In een representatief experiment het vermogen van differentiële schuifspanning moduleren monocyte celhechting aan cytokine geactiveerd EC monolagen wordt aangetoond.

On-Chip Endotheliale Inflammatoire Fenotypering

Een kwantitatief spontane migratie van cellen te bestuderen in een eendimensionale beperkte micro beschreven. Deze methode maakt gebruik van microfabricated kanalen en kan worden gebruikt om de migratie van grote aantallen cellen te bestuderen onder verschillende omstandigheden in enkele experimenten.

Studie van cel-migratie in Microfabricated Kanalen

Deze publicatie beschrijft de fabricage van een apparaat van de orgel-on-chip met geïntegreerde elektroden voor directe kwantificering van signaalcomplexen elektrische weerstand (TEER). Voor een validatie, de bloed - hersen barrière werd geïmiteerd binnen dit microfluidic apparaat en zijn functie als barrière werd gecontroleerd. De gepresenteerde methoden voor de integratie van de elektrode en directe kwantificering van de TEER zijn algemeen toepasbaar.

Fabricage en validatie van een orgel-on-chip systeem met geïntegreerde elektroden te kwantificeren direct signaalcomplexen elektrische weerstand

Verschillende methoden zijn beschikbaar voor de fabricage van alle zenders van niet-rechthoekige stukken ingesloten in Polydimethylsiloxaan microfluidic apparaten. De meeste van hen betrekken meerstaps productie en uitgebreide uitlijning. In deze paper is een one-step-aanpak voor het fabriceren van microfluidic kanalen van verschillende geometrische kruissecties gerapporteerd door Polydimethylsiloxaan sequentiële nat etsen.

Één stap aanpak te fabriceren Polydimethylsiloxaan Microfluidic kanalen van verschillende geometrische secties door sequentiële nat etsen processen

Hier presenteren we een protocol dat beschrijft de fabricage van rekbare, dual channel, orgel chip microfluidic cel cultuur apparaten voor Recapitulerend orgel-niveau functionaliteit in vitro.

Schaalbare fabricage van rekbare, Dual Channel, Microfluidic orgel Chips

Hier presenteren we een protocol om een driedimensionaal vereenvoudigd en ongedifferentieerd huidmodel te genereren met behulp van een microgemachineerd microfluïdisch platform. Een parallelle stromingsbenadering maakt de in situ afzetting van een dermale compartiment mogelijk voor het zaaien van epitheelcellen bovenop, allemaal geregeld door spuitpompen.

Generatie van een vereenvoudigd driedimensionaal huid-op-een-chip-model in een microgemachineerd microfluïdisch platform

In dit protocol wordt een biomimetische microfluïde assay, die een fysiologisch relevante microvasculaire omgeving kan reproduceren en de gehele leukocytenadhesie / migratiecascade kan reproduceren, gebruikt om leukocyten-endotheelcelinteracties bij ontstekingsziekten te bestuderen.

Een microfysiologisch systeem om leukocyten-endotheelcelinteractie tijdens ontsteking te bestuderen

Ontdek een microfluidisch platform voor microvasculair onderzoek met 3D-geometrie en continue perfusie. Deze methode cultiveert endotheelcellen in cilindrische microkanalen voor real-time beeldvorming.

Procedure voor de ontwikkeling van multi-diepte Circulaire Cross-sectionele endotheel Microkanalen-on-a-chip

Meer video's verkennen