Procedure voor de ontwikkeling van multi-diepte Circulaire Cross-sectionele endotheel Microkanalen-on-a-chip
21 oktober 2013
Een microchannels-on-a-chip platform werd ontwikkeld door de combinatie van fotolithografische reflowable fotolak techniek, zachte lithografie, en microfluidics. Het endotheel microkanalen platform bootst de driedimensionale (3D) geometrie van in vivo micro-vaatjes, loopt onder gecontroleerde continue perfusie stroom, zorgt voor hoge kwaliteit en real-time beeldvorming en kan worden toegepast voor microvasculaire onderzoek.
Het algemene doel van deze procedure is om een multi-diepte circulair dwarsdoorsnede endotheel microkanalen op een chip te ontwikkelen, die de 3D-geometrie van in vivo, microvaten nabootst en onder gecontroleerde continue overvloeiingsstroom loopt. Dit wordt bereikt door eerst een mastermal met een halfcirkelvormige dwarsdoorsnede microkanaalnetwerk te fabriceren met behulp van fotolithografische positieve herstroombare fotoweerstand. De tweede stap is om de mastermal te gebruiken om twee poly dimethyl soane microkanalen te repliceren, ze uit te lijnen en ze te verbinden om een cilindrisch microkanaalnetwerk te creëren.
Vervolgens worden de primaire humane navelstrengvene-endotheelcellen geplaatst in het microkanaalnetwerk voordat de cellen worden gekweekt onder gecontroleerde continue mediumperfusievoorwaarden gedurende een periode van vier dagen tot twee weken. Uiteindelijk ontwikkelt zich een confluente celmonolaag aan de binnenoppervlakte van het microkanaalnetwerk, wat aangegeven wordt door het membraan dat onder de microscoop staat. Berekening van functionele microvaten waarin een platform kan worden geboden voor de studie van complexe vasculaire fenomenen. Echter, conventionele individuele microvaten-assays zoals anso-celmigratie-assays, enSo twee vorming-assays, en de rechter en mos tic ring-assays zijn beperkt om individuele microvaten te herscheppen met betrekking tot driedimensionale geometrie en continue stromingscontrole.
Het belangrijkste voordeel van onze technieken, onze bestaande microfabricagemethode, is dat het conventioneel een multi-diepte microfluïdisch kanaalnetwerk kan fabriceren dat de complexe 3D-geometrieën van in vivo microvaten met afgeronde dwarsdoorsneden nabootst. Het maakt ook mogelijk om microvasculaire biomagnetische systemen te ontwerpen, die ongeveer meer langzaam gehoorzamen en de vloeistofstroom op een vereist niveau houden, zodat de algehele kanaalweerstand laag is en het verlies van stroom uniformer is door het netwerk heen. De procedure zal worden uitgevoerd door een afgestudeerde student uit mijn laboratorium. Deze procedure begint met de fabricage van een fotoweerstand mastermal die bestaat uit microkanalen met diameters tussen de 30 micrometer en 60 micrometer, zoals beschreven in het tekstprotocol. Overbreng kort de herstroombare fotoweerstand van de koelkast op vier graden Celsius naar de schone ruimte 24 uur voor gebruik en laat het opwarmen tot kamertemperatuur.
Begin met het spincoaten van de positieve herstroombare fotoweerstandlaag op een vooraf gereinigde siliciumsubstraat volgens de procedure in het tekstprotocol. Stel vervolgens de fotoweerstand bloot aan UV-licht door een gepatternd masker voordat de gepatternde microkanalen worden ontwikkeld. Maak tenslotte, na herstroom, een halfcirkelvormige dwarsdoorsnede microkanaalnetwerk.
Zodra de mastermal klaar is, bereid polymethyl soane of PDMS-oplossing voor bij een gewichtsverhouding van 10 tot 1 basis tot het uithardingsmiddel en meng het grondig met behulp van een planetaire centrifugaalmixer. Giet de PDMS-oplossing op de herstroomde fotoweerstand mastermal. Plaats de gegoten PDMS in een droogkast gedurende 15 minuten om te degasseren.
Gebruik stikstofgas om eventuele resterende bellen te verwijderen indien nodig. Bak de PDMS in een oven bij een temperatuur van 60 graden Celsius gedurende drie uur om het uit te laten harden. Verwijder vervolgens de uitgeharde PDMS-laag van de mastermal.
Gebruik een scherpe pons om inlaat- en uitlaatgaten te maken door gaten in het kanaalnetwerk te ponsen. Reinig het oppervlak van de PDMS met behulp van stikstofgas. Behandel twee PDMS-lagen met zuurstofplasma gedurende 30 seconden in een plasmareiniger bij een werkdruk van 45 milato en een zuurstofstroomsnelheid van 3,5 kubieke voet per minuut.
Lign de oppervlakken van de PDMS handmatig onder een optische microscoop. Gebruik indien nodig een druppel water voor een betere controle van de uitlijning. Bak tenslotte het apparaat in een oven bij 60 graden Celsius gedurende 30 minuten om een permanente bindingscultuur te bereiken.
Primary humane navelstrengvene-endotheelcellen of VE in kweekmedium met L-glutamine gesupplementeerd met 10% foetaal bovien serum. Behandel het apparaat gedurende vijf minuten met zuurstofplasma bij een werkdruk van 45 milit en een zuurstofstroomsnelheid van 3,5 kubieke voet per minuut. Laad vervolgens het apparaat met gedeïoniseerd water en behandel met UV-licht gedurende acht uur in een laminare bioveiligheidskast voor sterilisatie.
Een dag voordat de cellen klaar zijn, spoel het apparaat met één x fosfaat gebufferd zout oplossing of PBS en bedek vervolgens met fibronectine. Incubeer in de koelkast bij vier graden Celsius overnacht. Zodra de cellen confluëren, oogst ze door de cellen eerst te spoelen met heaps gebufferd zoutoplossing en vervolgens de cellen te behandelen met trypsine EDTA na toevoeging van trypsine.
Incubeer de cellen gedurende twee tot zes minuten bij 37 graden Celsius. Na de trypsinisatie is voltooid, neutraliseer de tripsin EDTA met tripsin neutralisatieoplossing. Tel de cellen, centrifugeer ze vervolgens voor resus.
Suspenderen in kweekmedium met 8%dextrine dextrine wordt gebruikt om de mediumviscositeit te verhogen om betere celzitting en hechting te bevorderen na de FI enc ENC coating. Spoel het apparaat met één XPBS en laad vervolgens het apparaat met kweekmedium voordat het wordt geïncubeerd bij een temperatuur van 37 graden Celsius gedurende 15 minuten. Vervolgens worden cellen in 8% Dextrin kweekmedium met een concentratie van drie tot vier miljoen cellen per milliliter geladen in het apparaat.
Plaats een druppel van 20 microliter cellen op één inlaat van het apparaat en kantel het om de cellen in het microfluïdische kanaal te introduceren. Na 15 tot 20 minuten zullen de cellen beginnen zich aan de zijwanden van de kanalen te hechten. Draai het apparaat elke 15 minuten om een meer uniforme verdeling van cellen te creëren.
Indien nodig kan extra belading worden uitgevoerd. Na vijf tot zes uur statische cultuur zullen de aangehechte cellen zich volledig beginnen te verspreiden. Stel een langdurige
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie presenteert een microkanalen-op-een-chip platform dat de 3D-geometrie van in vivo microvaten nabootst. Het platform maakt gecontroleerde continue perfusieflow en hoogwaardige real-time beeldvorming mogelijk, waardoor het geschikt is voor microvasculair onderzoek.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschappelijk vakgebied
- Microfluïdica
- Vasculaire biologie
- Celkweektechnieken
Achtergrond
- Microvasculair onderzoek is essentieel voor het begrijpen van complexe vasculaire fenomenen.
- Conventionele assays slagen er vaak niet in om de 3D-geometrie en de continue doorstroming van microvaten na te bootsen.
- Endotheelcellen spelen een cruciale rol bij de vasculaire functie en gezondheid.
- Microfabricatietechnieken kunnen de studie van vasculaire systemen verbeteren.
Doel van de studie
- Het ontwikkelen van een microfluïdisch platform dat in vivo microvaten nauwkeurig nabootst.
- Het mogelijk maken van real-time beeldvorming en gecontroleerde perfusie voor vasculaire studies.
- Het bieden van een betrouwbare methode voor het kweken van endotheelcellen in een 3D-omgeving.
Gebruikte methoden
- Fotolithografische fabricage van een mastermatrijs voor microkanalen.
- Replicatie van de matrijs met behulp van PDMS om het microkanaalnetwerk te creëren.
- Uitzaaien van primaire humane endotheelcellen uit de navelstrengvene in de kanalen.
- Continue perfusie van medium om de celcultuurcondities te handhaven.
Belangrijkste resultaten
- Een confluente monolaag van endotheelcellen werd ontwikkeld binnen de microkanalen.
- Het platform bootste met succes de 3D-structuur van microvaten na.
- Real-time imaging demonstreerde de functionaliteit van de endotheelcellen.
- Het systeem maakt het mogelijk om complexe vasculaire fenomenen onder gecontroleerde omstandigheden te bestuderen.
Conclusies
- Het microkanalen-op-een-chip-platform is een waardevol instrument voor vasculair onderzoek.
- Deze methode vergroot het begrip van het gedrag van endotheelcellen in een 3D-context.
- Toekomstige studies kunnen dit platform benutten om verschillende aspecten van de microvasculaire biologie te onderzoeken.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de Industrie
Reproduceerbare in vitro microvasculaire modellen zijn cruciaal voor vroege fasen van geneesmiddelenontwikkeling, omdat ze mechanische risicoreductie en predictieve betrouwbaarheid in vasculair biologisch onderzoek mogelijk maken. Dit platform met microkanalen-op-een-chip, voorzien van endotheelcellen in cirkelvormige dwarsdoorsneden van variabele diepte, pakt de beperkingen van conventionele assays aan door in vivo-achtige 3D-geometrie te repliceren en continue perfusie te ondersteunen. Het systeem verbetert de translationele continuïteit en ondersteunt robuuste targetvalidatie voor portfolio's die gericht zijn op het vaatstelsel.
Strategische toepassingen in biopharma R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Maakt het toetsen van hypothesen over vasculaire biologie mogelijk in een fysiologisch relevante 3D-micro-omgeving.
- Ondersteunt functionele targetvalidatie door endotheliale cellagen te behouden onder gecontroleerde flow.
- Faciliteert mechanische risicoreductie door directe observatie van endotheliale responsen op experimentele variabelen mogelijk te maken.
- Verbetert de voorspellende betrouwbaarheid voor vasculaire targets door de architectuur van microvaten in vivo na te bootsen.
Screening & assayontwikkeling
- Biedt een gestandaardiseerd, reproduceerbaar platform voor de kwantitatieve beoordeling van het gedrag van endotheelcellen.
- Ondersteunt assay-ontwikkeling met mogelijkheden voor continue perfusie en real-time imaging.
- Maakt de preparatie van gevalideerde microvasculaire systemen mogelijk voor daaropvolgende screening van verbindingen.
- Faciliteert schaalbaarheid en hergebruik van het platform over meerdere experimentele condities.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Slaat aan bij ziekterelevante vasculaire modellen voor translationele biomarkerstudies.
- Bewaart de continuïteit van vroege ontdekking tot preklinische validatie door ondersteuning van langetermijnperfusiecultuur.
- Vermindert het translationele risico door fysiologisch relevante gegevens over de microvasculaire functie te verschaffen.
- Ondersteunt risico-gecorrigeerde beslissingen over de verdere ontwikkeling van vasculair gerichte therapeutica.
Integratie van Pipeline & Workflow
Dit microfluïdisch platform integreert in het continuüm van ontdekking tot preklinisch onderzoek door hypothesetoetsing, kwantitatieve read-outs en translationele modellering van microvasculaire systemen mogelijk te maken.
- Discovery Biology: Ondersteunt de verduidelijking van signaalpaden en biologische risicoreductie door middel van gecontroleerde variabelemanipulatie en real-time observatie.
- Screening: Levert reproduceerbare, kwantitatieve resultaten voor de evaluatie van verbindingen in een 3D geendothelialiseerde context.
- Analytics: Biedt beelding in hoge resolutie en kwantitatieve meting van de vorming en functie van een endotheelmonolaag.
- Translational Research: Slaat een brug tussen in vitro bevindingen en preklinische modellen door in vivo-achtige microvasculaire geometrie en flow te repliceren.
- Enterprise Reuse: Biedt een herbruikbaar, aanpasbaar platform voor diverse vasculaire onderzoek- en screeningstoepassingen.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen en vermindert mechanistische ambiguïteit in studies naar vasculaire targets.
- Operationele waarde: Standaardiseert microvasculaire modellering met reproduceerbare fabricage- en kweekprotocollen.
- Strategische waarde: Maakt onderbouwde go/no-go beslissingen en kapitaalefficiënt portfoliomanagement voor vasculaire programma's mogelijk.
- Impact op portfolio: Ondersteunt risico-gecorrigeerde prioritering en bevordering van assets gericht op vasculaire targets.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in microfabricage, microfluidica en endotheliale celkweek.
- Vereist toegang tot infrastructuur voor fotolithografie, zachte lithografie en confocale beeldvorming.
- Vereist standaardisatie tussen teams voor reproduceerbare fabricage van apparaten en celzaaien.
- Aanpasbaar aan diverse endotheliale celbronnen en experimentele condities.
- Beperkt door de noodzaak van nauwkeurige uitlijning en hechting van PDMS-microkanalen.
Biopharma Veelgestelde Vragen
Chapters in this video
0:05
Title
3:10
Soft Lithography Fabrication of PDMS Microchannel Network
4:34
HUVEC Culture and Seeding in the Chip
7:03
Cell Staining and Microscope Characterization
8:10
Results: Multi-depth Microchannel Networks Mimic the Complex 3D Geometries of In vivo Microvessel
9:35
Conclusion
2:22
Photolithography Fabrication of Photoresist Master Mold
