Name: Een snelle protocol voor de integratie Extrachromosomaal Arrays Met High Transmission Rate in de C. elegans Genome (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-09T20:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 33 s
Description: Leer een snel protocol voor de integratie van transgene extrachromosomale arrays in het Caenorhabditis elegans genoom met UV-bestraling. Deze methode optimaliseert de overdrachtssnelheid en minimaliseert materiaalgebruik.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs willen Claire Lecroisey en Laurent Ségalat bedanken voor het genereren van niet-geïntegreerde Pdyc-1::dyc-1::gfp; Pmyo-2::dsRed en Pmyo-3::gfp transgene stammen. We danken Andy Fire voor het geschenk van het Pmyo-2::dsRed plasmid en Pamela Hoppe voor het geschenk van het Pmyo-3::gfp plasmid. Dit werk werd mogelijk gemaakt door het Franse Nationaal Centrum voor Wetenschappelijk Onderzoek (CNRS) en de Claude Bernard Universiteit van Lyon.

1. Culturing Transgenic Nematodes Prior to Integration
Transgene lijningen kunnen worden gegenereerd zoals beschreven in1. Deze lijningen bevatten meestal een co-injectie marker plasmide dat leidt tot de expressie van een fluorescente eiwit of tot een specifiek gedrags- of morfologisch fenotype in een bepaalde ontwikkelingsfase1,3. Dit integratieprotocol kan worden toegepast op stammen die fluorescente of niet-fluorescente co-injectie markers tot expressie brengen. In het voorbeeld dat volgt, werd een stam met een fluorescente co-injectie marker gebruikt.
<ol>
	<li>Bereid kweekplaten voor:
		<ol>
			<li>Bereid ongeveer 500 grote 60 mm Petri-schalen voor, die asseptisch zijn gevuld met elk 10 ml Nematode Growth Medium (NGM)6,7.</li>
			<li>Bewaar elke plaat met 0,3 ml van een verzadigde Escherichia coli OP50 cultuur volgens standaardprocedure6,7.</li>
		</ol>
	</li>
	<li>Evalueer de transmissie snelheid van de te integreren transgene lijn:
		<ol>
			<li>Voor elke transgene lijn, pluk tien fluorescente gravide volwassenen op tien afzonderlijke kweekplaten onder een fluorescente stereoscoop met behulp van een worm pick zoals beschreven in7.</li>
			<li>Kweek de dieren in een worm incubator bij 15-25 °C (afhankelijk van de genetische achtergrond) om de wormen te laten reproduceren.</li>
			<li>Observeer de nakomelingen elke dag om te evalueren op welk ontwikkelingsstadium de co-injectie marker wordt tot expressie gebracht en het best kan worden waargenomen. De expressie van de meeste momenteel gebruikte co-injectie markers wordt waargenomen in het L4 larvenstadium of op volwassen leeftijd.</li>
			<li>Evalueer de transmissie snelheid van de nakomelingen door het percentage van fluorescente nakomelingen te bepalen door observatie onder een fluorescente stereoscoop.</li>
		</ol>
	</li>
	<li>Kies een transgene lijn voor transgen integratie:
		<ol>
			<li>Selecteer de transgene lijn met de hoogst mogelijke transmissie snelheid (idealiter ≥80%).</li>
		</ol>
	</li>
	<li>Verkrijg een populatie van transgene dieren gesynchroniseerd in het L4 larvenstadium voor integratie:
	<ol>
		<li>Pluk 30 fluorescente gravide volwassenen op vijf kweekplaten (zes dieren per plaat).</li>
		<li>Laat de wormen 3-4 uur eieren leggen bij 15 °C.</li>
		<li>Verwijder de volwassenen van de platen na controle op de aanwezigheid van minimaal 30 eieren per plaat.</li>
		<li>Kweek de dieren in een worm incubator bij 15-25 °C tot de nakomelingen het L4 larvenstadium bereiken (96 uur bij 15 °C of 36 uur bij 25 °C).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. UV Irradiatie en Herstel van Transgene Wormen
<ol>
	<li>Worm irradiëren:
		<ol>
			<li>Pluk 30-100 fluorescente transgene L4 dieren op afzonderlijke kweekplaten (15-20 dieren per plaat).</li>
			<li>Plaats de platen, met de deksels verwijderd, in een UV cross-linker. Irradieer de wormen bij 0,012 J/cm2. Merk op dat stammen meer of minder gevoelig zijn voor UV en dat resultaten kunnen variëren afhankelijk van de gebruikte UV irradiator. Een dosisbereik tussen 0,010-0,015 J/cm2 kan worden getest.</li>
		</ol>
	</li>
	<li>Worm herstel na bestraling:
	<ol>
		<li>Plaats platen met bestraalde wormen een nacht bij 15 °C voor herstel.</li>
		<li>Controleer het aantal dieren dat in leven is. In onze ervaring is een overlevingspercentage van ongeveer 80-90% geschikt voor een efficiënte bestraling.</li>
		<li>Kweek de bestraalde dieren bij 15-25 °C tot de nakomelingen het ontwikkelingsstadium hebben bereikt dat toelaat om de expressie van de co-injectie marker waar te nemen, zoals vastgesteld in stap 1.2.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Isolatie van Geïntegreerde Transgene Lijnen
<ol>
	<li>Selectie van F1 dieren:
		<ol>
			<li>Pluk één 150-200 fluorescente F1 dieren op afzonderlijke kweekplaten. Voor lijnen met een hoge transmissie (≥80%), zijn 100 F1 dieren voldoende.</li>
			<li>Bewaar deze F1 platen bij 15-25 °C tot de nakomelingen een geschikt stadium bereiken voor de observatie van fluorescente F2 dieren.</li>
			<li>Verwerp alle F1 platen die i) geen nakomelingen vertonen, wat aangeeft dat het F1 dier steriël was of is gestorven, of ii) geen of slechts enkele fluorescente F2 dieren, wat aangeeft dat het F1 dier het transgeen niet heeft overgedragen met de verwachte snelheid. Deze stap is snel en vertegenwoordigt een reëel voordeel in vergelijking met het standaardprotocol dat een schatting van het percentage van fluorescente F2 wormen vereist om F1 platen te selecteren met ≥75% fluorescente nakomelingen (Tabel 1).</li>
		</ol>
	</li>
	<li>Selectie van F2 dieren:
		<ol>
			<li>Pluk vier fluorescente transgene F2 dieren van elke geselecteerde F1 plaat. Bij gebruik van fluorescente transgenen (bijvoorbeeld mCherry8, gfp9, of dsRed10), pluk F2 wormen met een hoog niveau van fluorescentie, aangezien dit kan aangeven dat deze dieren homozygoot zijn voor de geïntegreerde array. Merk op dat bij het plukken van F2 dieren het kritisch is om geen eieren of larven mee te nemen, om valse negatieven in de volgende stap te voorkomen.</li>
			<li>Kweek F2 dieren bij 15-25 °C.</li>
		</ol>
	</li>
	<li>Isolatie en validatie van geïntegreerde transgene stammen:
		<ol>
			<li>Screen F2 platen

<ol><li>Berkowitz, L. A., Knight, A. L., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+stable+transgenic+C.+elegans+using+microinjection%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Generation of stable transgenic C. elegans using microinjection.</a> J. Vis. Exp. (18), e833(2008).</li>
<li>Mello, C., Kramer, J. M., Stinchlomb, D., Ambros, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+gene+transfer+in+C.elegans%3A+extrachromosomal+maintenance+and+integration+of+transforming+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Efficient gene transfer in C.elegans: extrachromosomal maintenance and integration of transforming sequences.</a> EMBO J. 10 (12), 3959-3970 (1991).</li>
<li>Transformation and microinjection. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22WormBook%22">WormBook</a>. Evans, T. C. , The C. elegans Research Community, WormBook. (2006).</li>
<li>Hobert, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PCR+Fusion-Based+Approach+to+Create+Reporter+Gene+Constructs+for+Expression+Analysis+in+Transgenic+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">PCR Fusion-Based Approach to Create Reporter Gene Constructs for Expression Analysis in Transgenic C. elegans.</a> BioTechniques. 32, 728-730 (2002).</li>
<li>Stinchcomb, D. T., Shaw, J. E., Carr, S. H., Hirsh, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extrachromosomal+DNA+transformation+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Extrachromosomal DNA transformation of Caenorhabditis elegans.</a> Mol. Cell. Biol. 5, 3484-3496 (1985).</li>
<li>Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetics+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">The genetics of Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 77, 71-94 (1974).</li>
<li>Chaudhuri, J., Parihar, M., Pires-daSilva, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Introduction+to+Worm+Lab%3A+from+Culturing+Worms+to+Mutagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">An Introduction to Worm Lab: from Culturing Worms to Mutagenesis.</a> J. Vis. Exp. (47), e2293(2011).</li>
<li>Merritt, C., Rasoloson, D., Gallo, C., Voronina, E., Ko, D., Seydoux, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modular+vector+kit+for+transgenesis+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22International+Worm+Meeting%22%5BJournal%5D)">A modular vector kit for transgenesis in C. elegans.</a> International Worm Meeting. , (2007).</li>
<li>Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W., Green Prasher, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+protein+as+a+marker+for+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Fluorescent protein as a marker for gene expression.</a> Science. 263, 802-805 (1994).</li>
<li>Fleenor, J., Fire, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discosoma+sp.+Red+Fluorescent+Protein+%28dsRED%29+as+a+reporter+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Worm+Breeder%27s+Gazette%22%5BJournal%5D)">Discosoma sp. Red Fluorescent Protein (dsRED) as a reporter in C. elegans.</a> Worm Breeder's Gazette. 16 (3), 16(2000).</li>
<li>Lecroisey, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ZYX-1%2C+the+unique+zyxin+protein+of+Caenorhabditis+elegans%2C+is+involved+in+dystrophin-dependent+muscle+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">ZYX-1, the unique zyxin protein of Caenorhabditis elegans, is involved in dystrophin-dependent muscle degeneration.</a> Mol. Biol. Cell. , (2013).</li>
<li>Praitis, V., Casey, E., Collar, D., Austin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Creation+of+low-copy+integrated+transgenic+lines+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Creation of low-copy integrated transgenic lines in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 157 (3), 1217-1226 (2001).</li>
<li>Frøkjaer-Jensen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-copy+insertion+of+transgenes+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">Single-copy insertion of transgenes in Caenorhabditis elegans.</a> Nat. Genet. 40 (11), 1375-1383 (2008).</li>
<li>Dickinson, D. J., Ward, J. D., Reiner, D. J., Goldstein, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+the+Caenorhabditis+elegans+genome+using+Cas9-triggered+homologous+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Engineering the Caenorhabditis elegans genome using Cas9-triggered homologous recombination.</a> Nat. Methods. 10 (10), 1028-1034 (2013).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.

Het hier beschreven protocol biedt een efficiënte methode om extrachromosomale transgene arrays te integreren in het genoom van C. elegans. Met behulp van verschillende niet-geïntegreerde lijnen, die hetzelfde transgen Pdyc-1::dyc-1::gfp (pKG45) met verschillende snelheden overdragen (10-15%, 50-60% en >80%), toonden we aan dat het aantal geïntegreerde stammen dat na UV-bestraling wordt teruggevonden, afhankelijk is van het oorspronkelijke transmissieniveau van de niet-geïntegreerde lijn (Tabel ...

Transgenen worden veelvuldig gebruikt in C. elegans voor een groot scala aan toepassingen. Transgene stammen worden meestal gegenereerd door DNA-injectie in de syncitiële hermafrodiet gonaad1,2. Het DNA dat het transgene van belang draagt, wordt meegeïnjecteerd met plasmiden die coderen voor co-injectiemarkers1,3,4. Co-injectiemarkers zijn gevestigde transgenen die leiden tot de expressie van een fluorescerende eiwit of tot een specifiek gedrags- of morfologisch fenotype. De geïnjecteerde DNA's herschikken zich om multi-copy extrachromosomale arrays te vormen; dus worden het transgene van belang en de co-injectiemarker samen overgedragen5,4. Transgene lijnen worden geselecteerd in de F2-generatie van geïnjecteerde dieren door het volgen van het fenotype geïnduceerd door de expressie van de co-injectiemarker (fluorescentie of specifiek fenotype)1. Transgene lijnen vertonen gedeeltelijke en variabele transmissiepercentages van de extrachromosomale arrays naar de volgende generatie. Afhankelijk van de stam erft 10-100% (100% is een zeldzaam voorval) van de dieren extrachromosomale arrays. Bovendien zijn transgene dieren mozaïek en drukken het transgene uit in een variabel aantal cellen. Dit mozaïcisme is waarschijnlijk gecorreleerd met de transmissiepercentage naar de volgende generatie. Inderdaad, zowel in de geslachtslijn als in somatische cellen hangt de transmissiepercentage af van de segregatie van de extrachromosomale arrays tijdens celdelingen. Een manier om dit probleem te vermijden is om het transgene in het genoom te integreren. Klassiek gezien vertrouwt de integratie van een transgene in een chromosoom op bestraling (ultraviolet of gamma) van transgene wormen die extrachromosomale arrays dragen3. In het kort worden 50-100 hermafrodiet dieren bestraald in het L4-larvestadium. In de F1-generatie worden 200-800 transgene dieren geselecteerd en individueel gekweekt op platen. Volgens Mendeliaanse segregatie zouden transgene F1-dieren die een heterozygote integratie van het transgene in het genoom dragen, 1/2 van transgene nakomelingen produceren die heterozygoot zijn voor de geïntegreerde array, 1/4 van transgene nakomelingen zijn homozygoot voor de geïntegreerde array en 1/4 van nakomelingen die de array niet hebben geïntegreerd (Figuur 1). Dus worden platen met de F2-generatie visueel gescreend op ≥75% transgene dieren zoals waargenomen door de expressie van de co-injectiemarker. Ongeveer 1/3 van de F2-dieren die zijn geselecteerd als integratiekandidaten wordt verondersteld homozygoot te zijn voor de geïntegreerde array en 100% van homozygote F3-dieren te produceren. Dus, van elke geselecteerde plaat worden drie tot acht transgene F2-dieren individueel gekweekt en platen met 100% transgene nakomelingen worden geselecteerd. Vervolgens worden acht F3-dieren individueel gekweekt om de 100% overerving van het transgene te bevestigen.
De belangrijkste nadelen van deze methode zijn dat
<ol type="i">
	<li>het een visuele screening van enkele honderden F1-platen voor ≥75% transgene F2-nakomelingen vereist, wat tijdrovend is vanwege het variabele en onvoorspelbare percentage van transmissie van niet-geïntegreerde extrachromosomale arrays. Als alternatief, om de screening van F1-platen te vermijden, kunnen na bestraling van P0-dieren verschillende opeenvolgende hongerstaps worden uitgevoerd; gevolgd door het plukken van 100 transgene dieren en screenen voor 100% transgene nakomelingen3.</li>
	<li>het niet geschikt is voor stammen met een percentage transmissie van extrachromosomale arrays hoger dan 60% aangezien dit percentage moeilijk te onderscheiden is van 75%.</li>
	<li>aangezien alleen stammen met een relatief lage transmissiepercentage kunnen worden gebruikt, is een hoog aantal bestraalde transgene P0-dieren noodzakelijk evenals de observatie van talrijke F1- en F2-dieren, wat zeer tijdrovend is en een aanzienlijk aantal platen vereist.</li>
</ol>
De bestraling van wormen induceert vermoedelijk dubbelstrengsbreuken in het DNA en integratie van extrachromosomale arrays in chromosomen vindt plaats tijdens DNA-herstel. Dus is het waarschijnlijk dat de kansen om succesvolle bestraling-gemedieerde integratie te verkrijgen direct evenredig zijn aan het aantal geslachtslijncellen dat een extrachromosomale array draagt. Stammen met een hoge transmissiepercentage kunnen meer transgene DNA-arrays bevatten dan stammen met een laag transmissiepercentage zoals gesuggereerd in2, en een hoger aantal geslachtslijncellen vertonen die extrachromosomale arrays dragen. Dus redeneerden we dat in lijnen met een hoge transmissie, transgenen gemakkelijker te integreren kunnen zijn dan in lijnen met een laag transmissiepercentage. Echter, het standaardprotocol sluit de mogelijkheid uit om transgenen met hoog transmissiefrequentie te integreren aangezien het percentage van transgene dieren met een niet-geïntegreerde extrachromosomale array nauwelijks kan worden onderscheiden van dat van de nakomelingen van een F1-dier dat een heterozygote integratie van het transgene in het genoom draagt (Figuur 1).
Hier laten we zien dat voor een bepaald transgene, het aantal geïntegreerde lijnen dat wordt teruggevonden na bestraling met ultraviolet (UV) licht afhankelijk is van het initiële percentage transmissie van de niet-geïntegreerde array. We presenteren een verbeterd protocol voor UV-bestraling-gemedieerde transgene-integratie dat bijzonder relevant is voor lijnen die een hoog percentage transmissie van transgene array vertonen.

<table><tbody><tr><td>Agar</td><td>Prolabo</td><td>20768.292</td><td>voor NGM (nematode groeimedium) voorbereiding (6,7)</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Chimie-Plus</td><td>40045</td><td>voor NGM voorbereiding</td></tr><tr><td>Bacto-peptone</td><td>BD</td><td>211820</td><td>voor NGM voorbereiding</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Roth</td><td>3904-1</td><td>voor NGM voorbereiding</td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Prolabo</td><td>26930.293</td><td>voor NGM voorbereiding</td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Roth</td><td>P027.2</td><td>voor NGM voorbereiding</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Prolabo</td><td>22317.297</td><td>voor NGM voorbereiding</td></tr><tr><td>Cholesterol</td><td>Rectapur</td><td></td><td>voor NGM voorbereiding</td></tr><tr><td>LB-broth</td><td>Sigma</td><td>L3022</td><td>voor kweek van OP50 bacteriën</td></tr><tr><td>EQUIPMENT</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>U.V. cross-linker</td><td>Fischer Scientific</td><td></td><td>Golflengte 254 nm</td></tr><tr><td>Microscope SteREO Discovery V8</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Petri schotels, 60 mm</td><td>CML</td><td>BPS55E6</td><td></td></tr><tr><td>Platinium draad 0.25 mm</td><td>Alfa Aesar</td><td>7440-06-4</td><td>Om een pick voor wormen te maken (7)</td></tr></tbody></table>

een snelle protocol voor de integratie extrachromosomaal arrays met high transmission rate in de<em&gt; c. elegans</em&gt; genome

A Rapid Protocol for Integrating Extrachromosomal Arrays With High Transmission Rate into the C. elegans Genome

Het micro-injecteren van DNA in het cytoplasma van de syncitiële gonade van Caenorhabditis elegans is de belangrijkste techniek die wordt gebruikt om transgene lijnen te vestigen die gedeeltelijke en variabele transmissiepercentages van extrachromosomale arrays naar de volgende generatie vertonen. Bovendien zijn transgene dieren mozaïek en drukken het transgen uit in een variabel aantal cellen. Extrachromosomale arrays kunnen in het C. elegans genoom worden geïntegreerd met behulp van UV-bestraling om niet-mozaïsche transgene stammen met 100% transmissiepercentage van het transgen te vestigen. In dit opzicht worden F1-nakomelingen van UV-bestraalde transgene dieren gescreend op dieren die een heterozygote integratie van het transgen dragen, wat leidt tot een Mendeliaanse transmissiepercentage van 75% naar de F2-nakomelingen. Een van de uitdagingen van deze methode is om onderscheid te maken tussen het percentage transgen-transmissie in een populatie voor (X% transgene dieren) en na integratie (≥75% transgene F2-dieren). Daarom vereist deze methode het kiezen van een niet-geïntegreerde transgene lijn met een percentage transgene dieren dat significant lager is dan de Mendeliaanse segregatie van 75%. Bijgevolg worden niet-geïntegreerde transgene lijnen met een transmissiepercentage van extrachromosomale arrays naar de volgende generatie ≤60% meestal geprefereerd voor integratie, en transgen-integratie in sterk overdragende stammen is moeilijk. Hier laten we zien dat de efficiëntie van integratie van extrachromosomale arrays in het genoom toeneemt wanneer hoog overdragende transgene lijnen worden gebruikt (≥80%). Het beschreven protocol maakt eenvoudige selectie mogelijk van verschillende onafhankelijke lijnen met homozygote transgen-integratie in het genoom na UV-bestraling van transgene wormen die een hoge transmissie van extrachromosomale arrays vertonen. Bovendien is deze methode vrij snel en vereist weinig materiaal. De mogelijkheid om snel verschillende lijnen te genereren die een bepaald geïntegreerd transgen tot expressie brengen, is van groot belang voor studies gericht op genexpressiepatroon en -regulatie, eiwitlokalisatie en -overexpressie, evenals voor de ontwikkeling van subcellulaire markers.

Integraties van transgenen in twee verschillende lijnen die extrachromosomale arrays overdragen met ongeveer dezelfde frequentie (50-60%) werden uitgevoerd met behulp van de standaard- en de verbeterde protocollen (Tabel 1). Het standaardprotocol maakte de recoverie mogelijk van drie onafhankelijke geïntegreerde lijnen na UV-bestraling van 91 transgene L4-dieren, terwijl het verbeterde protocol de recoverie mogelijk maakte van één geïntegreerde lijn na UV-bestraling van 30 transgene L4-dieren. Dit sugger...

Dit protocol beschrijft een snelle en materiaalbesparende procedure voor de integratie van transgene extrachromosomale arrays in het Caenorhabditis elegans genoom met behulp van ultraviolette (UV) bestraling. Bovendien is dit protocol bijzonder geschikt voor transgene lijnen die extrachromosomale arrays met een hoge snelheid overdragen.

Een snelle protocol voor de integratie Extrachromosomaal Arrays Met High Transmission Rate in de<em&gt; C. elegans</em&gt; Genome

Microinjecting DNA into the cytoplasm of the syncytial gonad of Caenorhabditis elegans is the main technique used to establish transgenic lines that ...

Het algemene doel van deze procedure is om transgene extracromosomale arrays in het genoom van serratus elegance te integreren met behulp van ultraviolette bestraling. Selecteer eerst de transgene lijn met de hoogst mogelijke transmissiegraad, idealiter groter dan 80%. Bestraal vervolgens de geselecteerde transgene L4-larven met UV en selecteer vier van de fluorescente transgene F2-dieren van elke geselecteerde F1-plaat. Screen vervolgens de F2-platen op 100% fluorescente transgenen.F3-wormen. Uiteindelijk kan de selectie van fluorescente dieren uit de F3-generatie de 100% overerving van het transgen aantonen. Deze experimentele aanpak is zeer geschikt voor transgene lijnen die extra chromosoomarrays met een hoge frequentie overdragen.De procedure zal worden gedemonstreerd door Stephanie Belman, een technicus uit ons laboratorium. Begin met 500 grote Petrischalen met nematode-groeimedium. Ent elke plaat met 0,3 milliliters verzadigde isia coli.OP 50-cultuur. Evalueer de transmissiesnelheid van de te integreren transgene lijn voor elke transgene lijn. Selecteer 10 fluorescerende volwassen individuen middels gravitatie en plaats deze op 10 afzonderlijke cultuurplaten onder een fluorescent stereomicroscoop.De dieren bevinden zich in een wormincubator die is ingesteld op een temperatuur die reproductie van de genetische achtergrond toelaat. Controleer de nakomelingen dagelijks om te evalueren in welk ontwikkelingsstadium de co-injectiemarker tot expressie komt en het best kan worden waargenomen met fluorescentiemicroscopie. Evalueer de transmissiesnelheid van de nakomelingen door het percentage fluorescerende nakomelingen te bepalen.Kies voor de integratie van het transgen de transgene lijn met de hoogste transmissiesnelheid. Verkrijg een populatie transgene dieren die gesynchroniseerd zijn in het L4-larvale stadium. Selecteer voor integratie 30 fluorescerende GRA-volwassenen en verdeel deze over vijf kweekplaten.Nadat de wormen drie tot vier uur lang eieren hebben gelegd bij 15 °C, controleert u op de aanwezigheid van ten minste 30 eieren per plaat en verwijdert u vervolgens de volwassen dieren van de platen; kweek de dieren in een wormincubator totdat het nageslacht het L4-larvale stadium bereikt. Plaats elke plaat met 15 tot 20 fluorescente transgene L4-dieren met de deksels verwijderd in een UV-crosslinker, bestraal de wormen en laat ze vervolgens herstellen. Incubeer de bestraalde wormen gedurende de nacht bij 15 °C.Controleer het aantal dieren dat nog in leven is. Een overlevingspercentage van ongeveer 80 tot 90% is optimaal voor een efficiënte bestraling. Kweek de bestraalde dieren bij 15 tot 25 °C totdat de nakomelingen het ontwikkelingsstadium hebben bereikt waarbij de expressie van de co-injectiemarker kan worden waargenomen.Breng individuele fluorescerende F1-dieren over naar afzonderlijke kweekplaten. Bewaar deze F1-platen bij 15 tot 25 graden Celsius totdat de nakomelingen een geschikt stadium hebben bereikt voor de observatie van fluorescerende F2-dieren, afhankelijk van de gebruikte co-marker. In dit specifieke geval observeerden we de wormen als volwassenen; verwijder alle F1-platen die ofwel één, geen nakomelingen vertonen, wat aangeeft dat het F1-dier steriel was of is gestorven, of twee, geen of slechts enkele fluorescerende F2-dieren vertonen, wat aangeeft dat het F1-dier het transgen niet met de verwachte frequentie heeft overgedragen.Selecteer vier fluorescente transgene F2-dieren van elke geselecteerde F1-plaat. Kies bij het gebruik van fluorescente transgenen F2-wormen met een hoog fluorescentieniveau, aangezien dit kan erop wijzen dat deze dieren homozygoot zijn voor het geïntegreerde array. Let erop dat het bij het selecteren van F2-dieren cruciaal is om geen eieren of larven mee te voeren, om fout-negatieven in de volgende stap te voorkomen.Nadat de F2-dieren zijn opgekweekt, worden de F2-platen gescreend op 100% fluorescente transgene F3-wormen. De screening verloopt vrij snel, aangezien de aanwezigheid van een enkele niet-fluorescente worm betekent dat de plaat moet worden weggegooid; selecteer acht fluorescente F3-dieren van de geselecteerde platen om de 100% overerving van het transgen te bevestigen. Houd, indien mogelijk, meerdere onafhankelijke geïntegreerde transgene stammen aan.Er werden integraties van transgenen uitgevoerd in twee verschillende lijnen die extrachromosomale arrays met ongeveer dezelfde frequentie overdroegen. Door gebruik te maken van het standaardprotocol en het verbeterde protocol, zijn de tijd en het aantal benodigde platen per geïntegreerde lijn in het verbeterde protocol geoptimaliseerd. Vervolgens hebben we de hypothese getest dat een hogere transmissiesnelheid van het transgen in een niet-geïntegreerde lijn de integratie van het transgen in het genoom vergemakkelijkt.Eén specifiek transgen werd geïntegreerd in lijnen die met verschillende percentages overgingen, waarbij het verbeterde protocol werd gebruikt voor de lijn met het hoogste overgangspercentage. Drie geïntegreerde lijnen werden teruggewonnen uit slechts 90 geselecteerde F1-dieren, terwijl voor de transgene lijn die met 50 tot 60% overging, één geïntegreerde lijn werd teruggewonnen uit 110 geselecteerde F1-dieren. Na deze procedure kunnen verschillende methoden worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals het bepalen van de genexpressie, het patroon en de regulatie, de eiwitlokalisatie en eiwitoverexpressie, of de ontwikkeling van subcellulaire markers.

a-rapid-protocol-for-integrating-extrachromosomal-arrays-with-high

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

De mogelijkheid om transgenen te produceren...

De productie van C. elegans Transgenen via Recombineering met de GalK Selecteerbare marker

Een procedure voor vloeibare-based kweken en verstrekking...

High-throughput screening &#39;en biosensing met fluorescerende C. elegans Stammen

Microarray analyse werd uitgevoerd om genetische expressie profielen...

Het bepalen van genetische expressie profielen in C. elegans Met behulp van microarray en real-time PCR

Hier beschrijven we een moleculaire uitlezing van langdurige geur...

Een Moleculaire Uitlezen van lange termijn Olfactorische aanpassing in<em&gt; C. elegans</em

Deze video beschrijft een techniek om een enkel nematode snel te screenen op een genetische marker door PCR-screening. In het voorbeeldprotocol screenen we op CRISPR-gebaseerde genoombewerking.

Single Worm PCR: een methode om genomisch DNA te extraheren en te versterken

Micro-invoeging van transgenes resulteert meestal in C. elegans stammen met grote extrachromosomale arrays, wat resulteert in variabele expressie en transmissie van het transgene.  UV-bestraling kan chromosomale integratie van de array en stabielere transgene transmissie induceren.

UV-bestraling: een methode om extrachromosomale arrays te integreren

Hier presenteren we een methode om het genoom van C. elegans ingenieur met behulp van CRISPR-Cas9 ribonucleoproteins en homologie afhankelijke reparatie sjablonen.

Een snelle en Facile pijpleiding voor het genereren van Genomic punt mutanten in C. elegans met behulp van CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

Hier wordt een beschrijving gegeven van de eenvoudige en relatief snelle isolatie van Caenorhabditis elegans genomisch DNA van een of enkele dieren met behulp van een in de handel verkrijgbare weefselkit. Het resulterende gDNA-preparaat is een geschikt sjabloon voor PCR.

Kleinschalige extractie van Caenorhabditis elegans Genomisch DNA

Dit protocol biedt een methode voor het meten van crossover-frequenties en -verdeling tijdens meiose in Caenorhabditis elegans. Genotypering van single-nucleotide polymorfisme met real-time PCR werd gebruikt om de oorsprong van de chromosomen te bepalen. De 4-punts mapping maakte het mogelijk om de crossover-verdelingen van de linkerarm-, midden- en rechterarmregio's van elk chromosoom te bepalen. ...

Frequentie en distributie van cross-overs in Caenorhabditis elegans Meiose door SNP-genotypering met behulp van real-time PCR

Hier presenteren we een snel en eenvoudig ATAC-seq-protocol dat geïmplementeerd kan worden in L4-fase Caenorhabditis elegans whole-worm met slechts 30 μL wormpellet.

Chromatine toegankelijkheidsprofilering bij hele Caenorhabditis elegans L4-larven

Een CRISPR/Cas9 microinjectieworkflow voor endogene fluorescerende tagging in de Caenorhabditis elegans kiemlijn om homozygote knock-in-lijnen te verkrijgen voor in vivo eiwitlokalisatieanalyse.

CRISPR/Cas9-gemedieerde endogene fluorescerende tagging van kiemlijnspecifieke genen in Caenorhabditis elegans

Leer een snel protocol voor de integratie van transgene extrachromosomale arrays in het Caenorhabditis elegans genoom met UV-bestraling. Deze methode optimaliseert de overdrachtssnelheid en minimaliseert materiaalgebruik.

Een snelle protocol voor de integratie Extrachromosomaal Arrays Met High Transmission Rate in de

Meer video's verkennen