Een snelle protocol voor de integratie Extrachromosomaal Arrays Met High Transmission Rate in de

Het algemene doel van deze procedure is om transgene extracromosomale arrays in het genoom van serratus elegance te integreren met behulp van ultraviolette bestraling. Selecteer eerst de transgene lijn met de hoogst mogelijke transmissiegraad, idealiter groter dan 80%. Bestraal vervolgens de geselecteerde transgene L4-larven met UV en selecteer vier van de fluorescente transgene F2-dieren van elke geselecteerde F1-plaat. Screen vervolgens de F2-platen op 100% fluorescente transgenen.

F3-wormen. Uiteindelijk kan de selectie van fluorescente dieren uit de F3-generatie de 100% overerving van het transgen aantonen. Deze experimentele aanpak is zeer geschikt voor transgene lijnen die extra chromosoomarrays met een hoge frequentie overdragen.

De procedure zal worden gedemonstreerd door Stephanie Belman, een technicus uit ons laboratorium. Begin met 500 grote Petrischalen met nematode-groeimedium. Ent elke plaat met 0,3 milliliters verzadigde isia coli.

OP 50-cultuur. Evalueer de transmissiesnelheid van de te integreren transgene lijn voor elke transgene lijn. Selecteer 10 fluorescerende volwassen individuen middels gravitatie en plaats deze op 10 afzonderlijke cultuurplaten onder een fluorescent stereomicroscoop.

De dieren bevinden zich in een wormincubator die is ingesteld op een temperatuur die reproductie van de genetische achtergrond toelaat. Controleer de nakomelingen dagelijks om te evalueren in welk ontwikkelingsstadium de co-injectiemarker tot expressie komt en het best kan worden waargenomen met fluorescentiemicroscopie. Evalueer de transmissiesnelheid van de nakomelingen door het percentage fluorescerende nakomelingen te bepalen.

Kies voor de integratie van het transgen de transgene lijn met de hoogste transmissiesnelheid. Verkrijg een populatie transgene dieren die gesynchroniseerd zijn in het L4-larvale stadium. Selecteer voor integratie 30 fluorescerende GRA-volwassenen en verdeel deze over vijf kweekplaten.

Nadat de wormen drie tot vier uur lang eieren hebben gelegd bij 15 °C, controleert u op de aanwezigheid van ten minste 30 eieren per plaat en verwijdert u vervolgens de volwassen dieren van de platen; kweek de dieren in een wormincubator totdat het nageslacht het L4-larvale stadium bereikt. Plaats elke plaat met 15 tot 20 fluorescente transgene L4-dieren met de deksels verwijderd in een UV-crosslinker, bestraal de wormen en laat ze vervolgens herstellen. Incubeer de bestraalde wormen gedurende de nacht bij 15 °C.

Controleer het aantal dieren dat nog in leven is. Een overlevingspercentage van ongeveer 80 tot 90% is optimaal voor een efficiënte bestraling. Kweek de bestraalde dieren bij 15 tot 25 °C totdat de nakomelingen het ontwikkelingsstadium hebben bereikt waarbij de expressie van de co-injectiemarker kan worden waargenomen.

Breng individuele fluorescerende F1-dieren over naar afzonderlijke kweekplaten. Bewaar deze F1-platen bij 15 tot 25 graden Celsius totdat de nakomelingen een geschikt stadium hebben bereikt voor de observatie van fluorescerende F2-dieren, afhankelijk van de gebruikte co-marker. In dit specifieke geval observeerden we de wormen als volwassenen; verwijder alle F1-platen die ofwel één, geen nakomelingen vertonen, wat aangeeft dat het F1-dier steriel was of is gestorven, of twee, geen of slechts enkele fluorescerende F2-dieren vertonen, wat aangeeft dat het F1-dier het transgen niet met de verwachte frequentie heeft overgedragen.

Selecteer vier fluorescente transgene F2-dieren van elke geselecteerde F1-plaat. Kies bij het gebruik van fluorescente transgenen F2-wormen met een hoog fluorescentieniveau, aangezien dit kan erop wijzen dat deze dieren homozygoot zijn voor het geïntegreerde array. Let erop dat het bij het selecteren van F2-dieren cruciaal is om geen eieren of larven mee te voeren, om fout-negatieven in de volgende stap te voorkomen.

Nadat de F2-dieren zijn opgekweekt, worden de F2-platen gescreend op 100% fluorescente transgene F3-wormen. De screening verloopt vrij snel, aangezien de aanwezigheid van een enkele niet-fluorescente worm betekent dat de plaat moet worden weggegooid; selecteer acht fluorescente F3-dieren van de geselecteerde platen om de 100% overerving van het transgen te bevestigen. Houd, indien mogelijk, meerdere onafhankelijke geïntegreerde transgene stammen aan.

Er werden integraties van transgenen uitgevoerd in twee verschillende lijnen die extrachromosomale arrays met ongeveer dezelfde frequentie overdroegen. Door gebruik te maken van het standaardprotocol en het verbeterde protocol, zijn de tijd en het aantal benodigde platen per geïntegreerde lijn in het verbeterde protocol geoptimaliseerd. Vervolgens hebben we de hypothese getest dat een hogere transmissiesnelheid van het transgen in een niet-geïntegreerde lijn de integratie van het transgen in het genoom vergemakkelijkt.

Eén specifiek transgen werd geïntegreerd in lijnen die met verschillende percentages overgingen, waarbij het verbeterde protocol werd gebruikt voor de lijn met het hoogste overgangspercentage. Drie geïntegreerde lijnen werden teruggewonnen uit slechts 90 geselecteerde F1-dieren, terwijl voor de transgene lijn die met 50 tot 60% overging, één geïntegreerde lijn werd teruggewonnen uit 110 geselecteerde F1-dieren. Na deze procedure kunnen verschillende methoden worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals het bepalen van de genexpressie, het patroon en de regulatie, de eiwitlokalisatie en eiwitoverexpressie, of de ontwikkeling van subcellulaire markers.