Een snelle protocol voor de integratie Extrachromosomaal Arrays Met High Transmission Rate in de C. elegans Genome

Het algemene doel van deze procedure is om transgene extra chromosomale arrays te integreren in het serratus elegance genoom met behulp van ultraviolette bestraling. Selecteer eerst de transgene lijn met de hoogst mogelijke overdrachtssnelheid, idealiter groter dan 80%. Bestraal vervolgens de geselecteerde transgene L vier larven. Selecteer uit elke geselecteerde F1 plaat vier van de fluorescerende transgene F twee dieren. Vervolgens screen de F twee platen op 100%fluorescerende transgene.

F drie wormen. Uiteindelijk kan het kiezen van fluorescerende dieren van de F drie generatie de 100%overerving van het transgeen aantonen. Deze experimentele aanpak is goed geschikt voor transgene lijnen die extra chromosoomarrays met een hoge snelheid overdragen.

Het demonstreren van de procedure zal worden gedaan door Stephanie Belman, een technicus uit ons laboratorium. Begin met 500 grote Petri-schalen met nematodengroei. Mediozaai elke plaat met 0,3 milliliter verzadigde isia coli.

OP 50 cultuur. Evalueer de overdrachtssnelheid van de te integreren transgene lijn voor elke transgene lijn. Kies 10 fluorescerende volwassenen op 10 aparte kweekplaten onder een fluorescerende stereomicroscoop.

Plaats de dieren in een wormincubator ingesteld op een temperatuur die de voortplanting van de genetische achtergrond toelaat. Bewaak de nakomelingen elke dag om te evalueren in welk ontwikkelingsstadium de co-injectiemarker wordt uitgedrukt en het beste kan worden waargenomen met behulp van fluorescoscopie. Evalueer de overdrachtssnelheid van de nakomelingen door het percentage van fluorescerende nakomelingen te bepalen.

Voor de integratie van het transgeen, selecteer de transgene lijn met de hoogste overdrachtssnelheid. Verkrijg een populatie van transgene dieren gesynchroniseerd in het L vier larvale stadium. Voor integratie, kies 30 fluorescerende GRA-volwassenen op vijf kweekplaten.

Nadat de wormen drie tot vier uur eieren hebben gelegd bij 15 graden Celsius, controleer op de aanwezigheid van minimaal 30 eieren per plaat en verwijder vervolgens de volwassenen van de platen. Kweek de dieren in een wormincubator tot de nakomelingen het L vier larvale stadium hebben bereikt. Plaats elke plaat met 15 tot 20 fluorescerende transgene L vier dieren in een UV crosslinker met de deksels verwijderd, bestraal de wormen voor herstel. Incubeer de bestraalde wormen een nacht bij 15 graden Celsius.

Controleer het aantal dieren dat in onze handen leeft. Een overlevingspercentage van ongeveer 80 tot 90% is aangepast voor een efficiënte bestraling. Kweek de bestraalde dieren bij 15 tot 25 graden Celsius tot de nakomelingen de ontwikkelingsfase hebben bereikt, waardoor de expressie van de co-injectiemarker kan worden waargenomen.

Breng enkele fluorescerende F1 dieren over naar afzonderlijke kweekplaten. Houd deze F1 platen bij 15 tot 25 graden Celsius tot de nakomelingen een geschikt stadium bereiken voor de observatie van fluorescerende F twee dieren, afhankelijk van de gebruikte co-marker. In dit specifieke geval observeerden we de wormen als volwassenen. Gooi alle F1 platen weg die geen nakomelingen vertonen, wat aangeeft dat het F1-dier steriel was of stierf, of twee geen, of slechts een paar fluorescerende F twee dieren, wat aangeeft dat het F1-dier het transgeen niet met de verwachte snelheid heeft overgedragen.

Selecteer vier fluorescerende transgene F twee dieren uit elke geselecteerde F1-plaat. Wanneer u fluorescerende transgenen gebruikt, kies F twee wormen met een hoog niveau van fluorescentie, omdat dit kan aangeven dat deze dieren homozygoot zijn voor de geïntegreerde array. Merk op dat het erg belangrijk is om geen eieren of larven mee te nemen bij het kiezen van F twee dieren, om valse negatieven in de volgende stap te voorkomen.

Na het kweken van de F twee dieren screen de F twee platen op 100%fluorescerende transgene F drie wormen. Het screen is vrij snel, omdat de aanwezigheid van een enkele niet-fluorescerende worm aangeeft dat de plaat moet worden weggegooid. Selecteer acht fluorescerende F drie dieren uit geselecteerde platen om de 100%overerving van het transgeen te bevestigen. Bewaar indien mogelijk verschillende onafhankelijke geïntegreerde transgene stammen.

Integraties van transgenen in twee verschillende lijnen, die extra chromosomale arrays met ongeveer dezelfde frequentie overdragen, werden uitgevoerd. Met behulp van de standaard- en de verbeterde protocollen, worden de tijd en het aantal platen dat nodig is per geïntegreerde lijn geoptimaliseerd in het verbeterde protocol. Vervolgens hebben we de hypothese getest dat een hogere overdrachtssnelheid van transgenen in een niet-geïntegreerde lijn de integratie van het transgeen in het genoom eenvoudiger maakt.

Eén specifiek transgeen werd geïntegreerd in lijnen die met verschillende snelheden overdragen, met behulp van het verbeterde protocol voor de lijn met de hoogste overdracht. Drie geïntegreerde lijnen werden teruggevonden uit slechts 90 geselecteerde F1-dieren, terwijl voor de transgene lijn die met 50 tot 60% overdraagt, één geïntegreerde lijn werd teruggevonden uit 110 geselecteerde F1-dieren. Door deze procedure te volgen, kunnen verschillende methoden worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals het bepalen van genexpressie, patroon en regulatie, eiwitlokalisatie en eiwitoverexpressie, of de ontwikkeling van subcellulaire markers.