Name: Multiplex PCR-test voor het typen van Staphylococcus Cassette Chromosome Mec Types I tot en met V in Methicilline-resistente Staphylococcus aureus (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 3 s
Description: Leer een multiplex PCR-test voor SCCmec-typering van MRSA-isolaten. Deze methode gebruikt DNA-isolatie via warmtebehandeling en gel-elektroforese voor snelle, betrouwbare identificatie van Staphylococcus aureus-stammen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We danken T. Ito, K. Hiramatsu, R. Daum, H. de Lencastre en D. Coleman voor de vriendelijke gift van enkele referentiestammen die in dit onderzoek zijn gebruikt. Dit werk werd gedeeltelijk financieel ondersteund door het Centre for Antimicrobial Resistance (CAR), Alberta Health Services-Calgary/Calgary Laboratory Services/University of Calgary.

Deze procedures moeten worden uitgevoerd in een gecertificeerde bioveiligheidsniveau 2 laboratorium. Geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen zoals handschoenen en witte jassen moeten worden gebruikt op alle tijden. 1. Monstervoorbereiding <ol><li> Verse overnight plaat culturen van MRSA zijn vereist. Op de dag voor PCR gedaan moet worden, selecteert u een enkele kolonie van MRSA met een steriele cultuur stok en bereiden een zware streep van de bacteri

<ol><li>IWG-SCC. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Classification+of+staphylococcal+cassette+chromosome+mec+%28SCCmec%29%3A+guidelines+for+reporting+novel+SCCmec+elements%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrobial+Agents+and+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Classification of staphylococcal cassette chromosome mec (SCCmec): guidelines for reporting novel SCCmec elements.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 53 (12), 4961-4967 (2009).</li>
<li>Ito, T., Hiramatsu, K., Tomasz, A., de Lencastre, H., Perreten, V., Holden, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidelines+for+Reporting+Novel+mecA+Gene+Homologues%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrobial+Agents+and+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Guidelines for Reporting Novel mecA Gene Homologues.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 56 (10), 4997-4999 (2012).</li>
<li>Okuma, K., Iwakawa, K., Turnidge, J. D., Grubb, W. B., Bell, J. M., O'Brien, F. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissemination+of+new+methicillin-resistant+Staphylococcus+aureus+clones+in+the+community%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Dissemination of new methicillin-resistant Staphylococcus aureus clones in the community.</a> Journal of Clinical Microbiology. 40 (11), 4289-4294 (2002).</li>
<li>Kondo, Y., Ito, T., Ma, X. X., Watanabe, S., Kreiswirth, B. N., Etienne, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combination+of+multiplex+PCRs+for+staphylococcal+cassette+chromosome+mec+type+assignment%3A+rapid+identification+system+for+mec%2C+ccr%2C+and+major+differences+in+junkyard+regions%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrobial+Agents+and+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Combination of multiplex PCRs for staphylococcal cassette chromosome mec type assignment: rapid identification system for mec, ccr, and major differences in junkyard regions.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 51 (1), 264-274 (2007).</li>
<li>Oliveira, D. C., de Lencastre, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+PCR+strategy+for+rapid+identification+of+structural+types+and+variants+of+the+mec+element+in+methicillin-resistant+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrobial+Agents+and+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Multiplex PCR strategy for rapid identification of structural types and variants of the mec element in methicillin-resistant Staphylococcus aureus.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 46 (7), 2155-2161 (2002).</li>
<li>Milheirico, C., Oliveira, D. C., de Lencastre, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Update+to+the+multiplex+PCR+strategy+for+assignment+of+mec+element+types+in+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrobial+Agents+and+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Update to the multiplex PCR strategy for assignment of mec element types in Staphylococcus aureus.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 51 (9), 3374-3377 (2007).</li>
<li>Milheirico, C., Oliveira, D. C., de Lencastre, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+PCR+strategy+for+subtyping+the+staphylococcal+cassette+chromosome+mec+type+IV+in+methicillin-resistant+Staphylococcus+aureus%3A+%27SCCmec+IV+multiplex%27%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Antimicrobial+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Multiplex PCR strategy for subtyping the staphylococcal cassette chromosome mec type IV in methicillin-resistant Staphylococcus aureus: 'SCCmec IV multiplex'.</a> Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 60 (1), 42-48 (2007).</li>
<li>Zhang, K., McClure, J. A., Elsayed, S., Louie, T., Conly, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+multiplex+PCR+assay+for+characterization+and+concomitant+subtyping+of+staphylococcal+cassette+chromosome+mec+types+I+to+V+in+methicillin-resistant+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Novel multiplex PCR assay for characterization and concomitant subtyping of staphylococcal cassette chromosome mec types I to V in methicillin-resistant Staphylococcus aureus.</a> Journal of Clinical Microbiology. 43 (10), 5026-5033 (2005).</li>
<li>Zhang, K., McClure, J. A., Conly, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+multiplex+PCR+assay+for+typing+of+staphylococcal+cassette+chromosome+mec+types+I+to+V+in+methicillin-resistant+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Probes%22%5BJournal%5D)">Enhanced multiplex PCR assay for typing of staphylococcal cassette chromosome mec types I to V in methicillin-resistant Staphylococcus aureus.</a> Molecular and Cellular Probes. 26 (5), 218-221 (2012).</li>
<li>de Lamballerie, X., Zandotti, C., Vignoli, C., Bollet, C., de Micco, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+one-step+microbial+DNA+extraction+method+using+%22Chelex+100%22+suitable+for+gene+amplification%5BTitle%5D)+AND+%22Research+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">A one-step microbial DNA extraction method using "Chelex 100" suitable for gene amplification.</a> Research in Microbiology. 143 (8), 785-790 (1992).</li>
<li>Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agarose+gel+electrophoresis+for+the+separation+of+DNA+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments.</a> J. Vis. Exp. (62), e3923(2012).</li>
<li>McClure, J. A., Conly, J. M., Elsayed, S., Zhang, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+PCR+assay+to+facilitate+identification+of+the+recently+described+Staphylococcal+cassette+chromosome+mec+type+VIII%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Probes%22%5BJournal%5D)">Multiplex PCR assay to facilitate identification of the recently described Staphylococcal cassette chromosome mec type VIII.</a> Molecular and Cellular Probes. 24 (4), 229-232 (2010).</li>
<li>Zhang, K., McClure, J. A., Elsayed, S., Conly, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+staphylococcal+cassette+chromosome+mec+type%2C+tentatively+designated+type+VIII%2C+harboring+class+A+mec+and+type+4+ccr+gene+complexes+in+a+Canadian+epidemic+strain+of+methicillin-resistant+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrobial+Agents+and+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Novel staphylococcal cassette chromosome mec type, tentatively designated type VIII, harboring class A mec and type 4 ccr gene complexes in a Canadian epidemic strain of methicillin-resistant Staphylococcus aureus.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 53 (2), 531-540 (2009).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

De hier beschreven multiplex PCR-assay biedt een eenvoudige, betrouwbare methode voor het classificeren van typen en belangrijke subtypes van SCCmec I-V in Staphylococci, met gelijktijdige onderscheiding van MRSA van MSSA. De assay is robuust, gemakkelijk uit te voeren in een enkele PCR-reactie en de resultaten zijn eenvoudig te interpreteren. De assay heeft wel beperkingen, omdat hij zich richt op individuele loci binnen elk SCCmec-type, maar biedt geen uitgebreide ccr- en mec-complex...

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/video/50779/multiplex-pcr-assay-for-typing-staphylococcal-cassette-chromosome-mec">Multiplex PCR Assay for Typing of Staphylococcal Cassette Chromosome Mec Types I to V in Methicillin-resistant Staphylococcus aureus</a>.&#160; There was a&#160;typo&#160;in Table 1.
In Table 1, the Oligonucleotide sequence for Type III-F5 was updated from:
TTCTCATTGATGCTGAAGCC
To:
GAAACTAGTTATTTCCAACGG

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/video/50779/multiplex-pcr-assay-for-typing-staphylococcal-cassette-chromosome-mec">Multiplex PCR Assay for Typing of Staphylococcal Cassette Chromosome Mec Types I to V in Methicillin-resistant Staphylococcus aureus</a>.&#160; There was a&#160;typo&#160;in Table 1.

Erratum: Multiplex PCR Assay for Typing of Staphylococcal Cassette Chromosome Mec Types I to V in Methicillin-resistant Staphylococcus aureus

Methicilline-resistente Staphylococcus aureus (MRSA) is overgenomen en ge

<table><tbody><tr><td>Tryptic Soy Agar</td><td>Fisher (BD)</td><td>CA90002-700 (236920)</td><td></td></tr><tr><td>Sterieel gedistilleerd water</td><td>Life Technologies</td><td>10977-015</td><td></td></tr><tr><td>Platinum Taq: inclusief 10x PCR buffer en 50 mM MgCl2</td><td>Life Technologies</td><td>10966-034</td><td></td></tr><tr><td>100 mM dNTP</td><td>Life Technologies</td><td>10297-018</td><td></td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6066</td><td></td></tr><tr><td>Boorzuur</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B7901</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Life Technologies</td><td>15576-028</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Life Technologies</td><td>16500-500</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Life Technologies</td><td>15514-011</td><td></td></tr><tr><td>Broomfenolblauw</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B8026</td><td></td></tr><tr><td>1Kb+ DNA ladder</td><td>Life Technologies</td><td>10787-026</td><td></td></tr><tr><td>Ethidiumbromide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7637</td><td></td></tr><tr><td>1,5 ml microcentrifugebuisjes </td><td>VWR (Axygen Scientific)</td><td>10011-700</td><td></td></tr><tr><td>Cultuurstokjes</td><td>VWR</td><td>CA10805-018</td><td></td></tr><tr><td>PCR buisjes</td><td>Diamed</td><td>AD0210-FCN (nieuw nummer: DIATEC420-1250)</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5417c</td><td></td></tr><tr><td>Heat block</td><td>VWR</td><td>13259-030 / 13259-286</td><td></td></tr><tr><td>Thermische cycler</td><td>Applied Biosystems (2720)</td><td>4359659</td><td></td></tr><tr><td>Horizontaal, dompelbaar gelelektroforese systeem met gelvorm</td><td>BioRad</td><td>170-4469</td><td></td></tr><tr><td>Voeding</td><td>BioRad</td><td>164-5050</td><td></td></tr><tr><td>Roterende schudler</td><td>VWR</td><td>40000-300</td><td></td></tr><tr><td>Moleculair beeldvormingsgel Doc systeem</td><td>BioRad</td><td>1708170</td><td></td></tr></tbody></table>

multiplex pcr-test voor het typen van staphylococcus cassette chromosome mec types i tot en met v in methicilline-resistente<em&gt; staphylococcus aureus</em

Multiplex PCR Assay for Typing of Staphylococcal Cassette Chromosome Mec Types I to V in Methicillin-resistant Staphylococcus aureus

Staphylococcen Cassette Chromosome mec (SCC mec) typen is een zeer belangrijke moleculaire tool voor het begrijpen van de epidemiologie en klonale stam verwantschap van methicilline-resistente Staphylococcus aureus (MRSA), met name de opkomende uitbraken van de gemeenschap-geassocieerde MRSA (CA-MRSA) die zich op een wereldwijde basis. Traditionele PCR typering&#39;s classificeren SCC mec door targeting en identificeerbaar is mec en ccr gen complexe vormen, maar vereisen het gebruik van veel primer sets en meerdere afzonderlijke PCR experimenten. We ontwierpen en publiceerde een eenvoudige multiplex PCR-test voor het snel-screening van grote SCC mec types en subtypes I tot V, en later bijgewerkt als beschikbaar werd nieuwe sequentie-informatie. Deze eenvoudige test richt zich op individuele SCC mec types in een enkele reactie, is het gemakkelijk te interpreteren en is uitgebreid wereldwijd gebruikt. Vanwege de verfijnde nature van de test en het grote aantal primers in de reactie, is de kans op problemen tijdens de aanpassing van deze assay aan elk laboratorium. Om het proces van de oprichting van een MRSA SCC mec test te vergemakkelijken, hier laten we zien hoe het opzetten van onze multiplex PCR-test, en bespreken een aantal van de essenti

Deze bijgewerkte M-PCR is in staat om SCCmec-typen I-V te bepalen (classificeren), evenals de belangrijkste subtypen van SCCmec IV. De assay richt zich op unieke en specifieke loci van SCCmec I, II, III, IVa, IVb, IVc, IVd, IVE en V, met gelijktijdige detectie van het mecA-gen. Voorlopige identificatie van SCCmec VI en VIII is ook mogelijk, maar zou verdere testen vereisen ter bevestiging. Figuur 3 illustreert representatieve SCCmec I-VI en VIII en de...

We demonstreren een eenvoudige multiplex PCR-test voor snel screenen en typeren van Staphylococcal Cassette Chromosome mec (SCCmec) typen I-V voor methicilline-resistente Staphylococcus aureus, en bieden enkele van de essentiële stappen en procedurele nuances die het succesvol maken om deze test aan te passen aan individuele laboratoria.

Multiplex PCR-test voor het typen van Staphylococcus Cassette Chromosome Mec Types I tot en met V in Methicilline-resistente<em&gt; Staphylococcus aureus</em

Staphylococcal Cassette Chromosome mec (SCCmec) typing  is a very important molecular tool for understanding the epidemiology and  clonal strain ...

Het algemene doel van deze procedure is om het SCC MEC-type van methicilline-resistente Staphylococcus aureus of MRSA-isolaten te bepalen met behulp van een multiplex PCR-assay. Dit wordt bereikt door eerst DNA uit de stammen te isoleren met een snelle en eenvoudige extractietechniek waarbij de bacteriële cellen in water worden verhit. De tweede stap is het uitvoeren van een multiplex PCR-assay om targets te amplificeren die specifiek zijn voor elk van de SEC ME-typen.Vervolgens worden de PCR-producten gescheiden via AROS-gelelektroforese. De laatste stap is het kleuren van de gel voor de visualisatie van het DNA en de data-analyse. Uiteindelijk wordt de unieke combinatie van specifieke PCR-producten die met deze multiplex PCR-assay is verkregen, gebruikt om de SE cmec-typen van de MRS A-isolaten te bepalen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals traditionele S CEC-typeringsschema's die zich richten op individuele CCR- en MEC-gencomplexen en meerdere individuele PCR-buisjes vereisen, is dat dit proces de werklast aanzienlijk vereenvoudigt en in een enkel PCR-buisje kan worden uitgevoerd.Deze procedures moeten worden uitgevoerd in een

multiplex-pcr-assay-for-typing-staphylococcal-cassette-chromosome-mec

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Een goedkope, high throughput methode voor gelijktijdige detectie van maximaal 43 moleculaire doelwitten wordt beschreven. Toepassingen van mPCR / RLB onder andere micro-organismen te typen en de detectie van meerdere pathogenen uit klinische monsters.

Multiplex PCR en Reverse Line Blot hybridisatie assay (mPCR / RLB)

Beschrijven we een multiplex-PCR voor de snelle detectie van Salmonella enterica serovars Enteritidis, Hadar, Heidelberg, en Typhimurium. Specifieke Salmonella serovars kunnen worden geïdentificeerd door zich te richten een multiplex PCR om genen en sequenties die uniek zijn voor het O-antigen biosynthese cluster en flagelline van een bepaalde serovar. Serovar wordt vervolgens toegewezen aan een Salmonella isoleren op basis van het optreden van de specifieke, grootte amplicons (PCR-product) die...

Een Allelotyping PCR voor het vaststellen van Salmonella enterica Serovars Enteritidis, Hadar, Heidelberg, en Typhimurium

We beschrijven een multiplex methode voor de detectie van micro-organismen in een monster met behulp van oligonucleotide-coupled fluorescerende kralen. Amplicon van alle organismen in een monster is gehybridiseerd met een panel van probe-gekoppelde kralen. Een Luminex of Bio-Plex instrument wordt gebruikt om elke kraal voor kraal type en hybridisatie-signaal zoekopdracht.

Multiplex detectie van bacteriën in complexe klinische en Milieu monsters met behulp van oligonucleotide-coupled Fluorescent Microsferen

Lytische faag biosensoren en antilichaam kralen zijn in staat onderscheid te maken tussen methicilline resistente (MRSA) en gevoelige stafylokok bacteriën. De fagen werden geïmmobiliseerd door een Langmuir-Blodgett methode op een oppervlak van een kwartskristal microbalans sensor en werkte als breed staphylococcus probes. Antilichaam kralen herkennen MRSA.

Biosensor voor de detectie van antibiotica resistente Staphylococcus bacteriën

Een amplificatie microarray combineert asymmetrische PCR-amplificatie en microarray hybridisatie in een enkele kamer, die aanzienlijk stroomlijnt microarray workflow voor de eindgebruiker. Vereenvoudiging microarray workflow is een noodzakelijke eerste stap voor het maken van microarray-gebaseerde diagnostiek die routinematig kan worden gebruikt in een lagere-resource-omgevingen.

Aantonen van een multiresistente<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em&gt; Versterking Microarray

Dit protocol beschrijft de detectie van klasse 1 integrons en hun bijbehorende gencassettes in levensmiddelen.

Screening Levensmiddelen voor klasse 1 integrons en Gene Cassettes

Hier wordt ribosomale spacer PCR (RS-PCR) gebruikt samen met een geminiaturiseerd elektroforesesysteem als een snelle en hoge resolutie methode voor genotypering van S. aureus tegen matige kosten waardoor een hoge doorvoer mogelijk is.

genotypering van<em&gt; Staphylococcus aureus</em&gt; Door Ribosomaal Spacer PCR (RS-PCR)

We presenteren twee op sondes gebaseerde in-house eenstaps RT-qPCR-kits voor veel voorkomende respiratoire virussen. De eerste test is voor SARS-CoV-2 (N), Influenza A (H1N1 en H3N2) en Influenza B. De tweede is voor SARS-Cov-2 (N) en MERS (UpE en ORF1a). Deze testen kunnen met succes worden geïmplementeerd in elk gespecialiseerd laboratorium.

Ontwikkeling van multiplex real-time RT-qPCR-assays voor de detectie van SARS-CoV-2, influenza A/B en MERS-CoV

Protocollen voor het gebruik van open systeem stroom biofilms met drip stroom reactoren en roterende schijf reactoren worden in detail.

Het gebruik van Drip Flow en roterende schijf reactoren voor Staphylococcus aureus Biofilm Analyse

Een muismodel voor huid- en weke deleninfecties wordt gebruikt om de virulentiefunctie van methicilline-resistente Staphylococcus aureus (MRSA) en de immunologische respons van de gastheer te beoordelen. Hier presenteren wij een subcutaan infectiemodel voor huid- en weke deleninfecties.

Subcutane Infectie van Methicilline Resistente Staphylococcus Aureus (MRSA)

Leer een multiplex PCR-test voor SCCmec-typering van MRSA-isolaten. Deze methode gebruikt DNA-isolatie via warmtebehandeling en gel-elektroforese voor snelle, betrouwbare identificatie van Staphylococcus aureus-stammen.

Multiplex PCR-test voor het typen van Staphylococcus Cassette Chromosome Mec Types I tot en met V in Methicilline-resistente Staphylococcus aureus (Video) | JoVE Journal

Multiplex PCR-test voor het typen van Staphylococcus Cassette Chromosome Mec Types I tot en met V in Methicilline-resistente

Meer video's verkennen