Name: Multiplex PCR-test voor het typen van Staphylococcus Cassette Chromosome Mec Types I tot en met V in Methicilline-resistente Staphylococcus aureus (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 3 s
Description: Leer een multiplex PCR-test voor SCCmec-typering van MRSA-isolaten. Deze methode gebruikt DNA-isolatie via warmtebehandeling en gel-elektroforese voor snelle, betrouwbare identificatie van Staphylococcus aureus-stammen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We danken T. Ito, K. Hiramatsu, R. Daum, H. de Lencastre en D. Coleman voor de vriendelijke gift van enkele referentiestammen die in dit onderzoek zijn gebruikt. Dit werk werd gedeeltelijk financieel ondersteund door het Centre for Antimicrobial Resistance (CAR), Alberta Health Services-Calgary/Calgary Laboratory Services/University of Calgary.

Deze procedures moeten worden uitgevoerd in een gecertificeerde bioveiligheidsniveau 2 laboratorium. Geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen zoals handschoenen en witte jassen moeten worden gebruikt op alle tijden. 1. Monstervoorbereiding <ol><li> Verse overnight plaat culturen van MRSA zijn vereist. Op de dag voor PCR gedaan moet worden, selecteert u een enkele kolonie van MRSA met een steriele cultuur stok en bereiden een zware streep van de bacteri

<ol><li>IWG-SCC. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Classification+of+staphylococcal+cassette+chromosome+mec+%28SCCmec%29%3A+guidelines+for+reporting+novel+SCCmec+elements%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrobial+Agents+and+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Classification of staphylococcal cassette chromosome mec (SCCmec): guidelines for reporting novel SCCmec elements.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 53 (12), 4961-4967 (2009).</li>
<li>Ito, T., Hiramatsu, K., Tomasz, A., de Lencastre, H., Perreten, V., Holden, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidelines+for+Reporting+Novel+mecA+Gene+Homologues%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrobial+Agents+and+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Guidelines for Reporting Novel mecA Gene Homologues.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 56 (10), 4997-4999 (2012).</li>
<li>Okuma, K., Iwakawa, K., Turnidge, J. D., Grubb, W. B., Bell, J. M., O'Brien, F. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissemination+of+new+methicillin-resistant+Staphylococcus+aureus+clones+in+the+community%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Dissemination of new methicillin-resistant Staphylococcus aureus clones in the community.</a> Journal of Clinical Microbiology. 40 (11), 4289-4294 (2002).</li>
<li>Kondo, Y., Ito, T., Ma, X. X., Watanabe, S., Kreiswirth, B. N., Etienne, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combination+of+multiplex+PCRs+for+staphylococcal+cassette+chromosome+mec+type+assignment%3A+rapid+identification+system+for+mec%2C+ccr%2C+and+major+differences+in+junkyard+regions%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrobial+Agents+and+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Combination of multiplex PCRs for staphylococcal cassette chromosome mec type assignment: rapid identification system for mec, ccr, and major differences in junkyard regions.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 51 (1), 264-274 (2007).</li>
<li>Oliveira, D. C., de Lencastre, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+PCR+strategy+for+rapid+identification+of+structural+types+and+variants+of+the+mec+element+in+methicillin-resistant+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrobial+Agents+and+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Multiplex PCR strategy for rapid identification of structural types and variants of the mec element in methicillin-resistant Staphylococcus aureus.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 46 (7), 2155-2161 (2002).</li>
<li>Milheirico, C., Oliveira, D. C., de Lencastre, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Update+to+the+multiplex+PCR+strategy+for+assignment+of+mec+element+types+in+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrobial+Agents+and+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Update to the multiplex PCR strategy for assignment of mec element types in Staphylococcus aureus.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 51 (9), 3374-3377 (2007).</li>
<li>Milheirico, C., Oliveira, D. C., de Lencastre, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+PCR+strategy+for+subtyping+the+staphylococcal+cassette+chromosome+mec+type+IV+in+methicillin-resistant+Staphylococcus+aureus%3A+%27SCCmec+IV+multiplex%27%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Antimicrobial+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Multiplex PCR strategy for subtyping the staphylococcal cassette chromosome mec type IV in methicillin-resistant Staphylococcus aureus: 'SCCmec IV multiplex'.</a> Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 60 (1), 42-48 (2007).</li>
<li>Zhang, K., McClure, J. A., Elsayed, S., Louie, T., Conly, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+multiplex+PCR+assay+for+characterization+and+concomitant+subtyping+of+staphylococcal+cassette+chromosome+mec+types+I+to+V+in+methicillin-resistant+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Novel multiplex PCR assay for characterization and concomitant subtyping of staphylococcal cassette chromosome mec types I to V in methicillin-resistant Staphylococcus aureus.</a> Journal of Clinical Microbiology. 43 (10), 5026-5033 (2005).</li>
<li>Zhang, K., McClure, J. A., Conly, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+multiplex+PCR+assay+for+typing+of+staphylococcal+cassette+chromosome+mec+types+I+to+V+in+methicillin-resistant+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Probes%22%5BJournal%5D)">Enhanced multiplex PCR assay for typing of staphylococcal cassette chromosome mec types I to V in methicillin-resistant Staphylococcus aureus.</a> Molecular and Cellular Probes. 26 (5), 218-221 (2012).</li>
<li>de Lamballerie, X., Zandotti, C., Vignoli, C., Bollet, C., de Micco, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+one-step+microbial+DNA+extraction+method+using+%22Chelex+100%22+suitable+for+gene+amplification%5BTitle%5D)+AND+%22Research+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">A one-step microbial DNA extraction method using "Chelex 100" suitable for gene amplification.</a> Research in Microbiology. 143 (8), 785-790 (1992).</li>
<li>Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agarose+gel+electrophoresis+for+the+separation+of+DNA+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments.</a> J. Vis. Exp. (62), e3923(2012).</li>
<li>McClure, J. A., Conly, J. M., Elsayed, S., Zhang, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+PCR+assay+to+facilitate+identification+of+the+recently+described+Staphylococcal+cassette+chromosome+mec+type+VIII%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Probes%22%5BJournal%5D)">Multiplex PCR assay to facilitate identification of the recently described Staphylococcal cassette chromosome mec type VIII.</a> Molecular and Cellular Probes. 24 (4), 229-232 (2010).</li>
<li>Zhang, K., McClure, J. A., Elsayed, S., Conly, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+staphylococcal+cassette+chromosome+mec+type%2C+tentatively+designated+type+VIII%2C+harboring+class+A+mec+and+type+4+ccr+gene+complexes+in+a+Canadian+epidemic+strain+of+methicillin-resistant+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrobial+Agents+and+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Novel staphylococcal cassette chromosome mec type, tentatively designated type VIII, harboring class A mec and type 4 ccr gene complexes in a Canadian epidemic strain of methicillin-resistant Staphylococcus aureus.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 53 (2), 531-540 (2009).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

De hier beschreven multiplex PCR-assay biedt een eenvoudige, betrouwbare methode voor het classificeren van typen en belangrijke subtypes van SCCmec I-V in Staphylococci, met gelijktijdige onderscheiding van MRSA van MSSA. De assay is robuust, gemakkelijk uit te voeren in een enkele PCR-reactie en de resultaten zijn eenvoudig te interpreteren. De assay heeft wel beperkingen, omdat hij zich richt op individuele loci binnen elk SCCmec-type, maar biedt geen uitgebreide ccr- en mec-complex...

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/video/50779/multiplex-pcr-assay-for-typing-staphylococcal-cassette-chromosome-mec">Multiplex PCR Assay for Typing of Staphylococcal Cassette Chromosome Mec Types I to V in Methicillin-resistant Staphylococcus aureus</a>.&#160; There was a&#160;typo&#160;in Table 1.
In Table 1, the Oligonucleotide sequence for Type III-F5 was updated from:
TTCTCATTGATGCTGAAGCC
To:
GAAACTAGTTATTTCCAACGG

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/video/50779/multiplex-pcr-assay-for-typing-staphylococcal-cassette-chromosome-mec">Multiplex PCR Assay for Typing of Staphylococcal Cassette Chromosome Mec Types I to V in Methicillin-resistant Staphylococcus aureus</a>.&#160; There was a&#160;typo&#160;in Table 1.

Erratum: Multiplex PCR Assay for Typing of Staphylococcal Cassette Chromosome Mec Types I to V in Methicillin-resistant Staphylococcus aureus

Methicilline-resistente Staphylococcus aureus (MRSA) is overgenomen en ge

<table><tbody><tr><td>Tryptic Soy Agar</td><td>Fisher (BD)</td><td>CA90002-700 (236920)</td><td></td></tr><tr><td>Sterieel gedistilleerd water</td><td>Life Technologies</td><td>10977-015</td><td></td></tr><tr><td>Platinum Taq: inclusief 10x PCR buffer en 50 mM MgCl2</td><td>Life Technologies</td><td>10966-034</td><td></td></tr><tr><td>100 mM dNTP</td><td>Life Technologies</td><td>10297-018</td><td></td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6066</td><td></td></tr><tr><td>Boorzuur</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B7901</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Life Technologies</td><td>15576-028</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Life Technologies</td><td>16500-500</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Life Technologies</td><td>15514-011</td><td></td></tr><tr><td>Broomfenolblauw</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B8026</td><td></td></tr><tr><td>1Kb+ DNA ladder</td><td>Life Technologies</td><td>10787-026</td><td></td></tr><tr><td>Ethidiumbromide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7637</td><td></td></tr><tr><td>1,5 ml microcentrifugebuisjes </td><td>VWR (Axygen Scientific)</td><td>10011-700</td><td></td></tr><tr><td>Cultuurstokjes</td><td>VWR</td><td>CA10805-018</td><td></td></tr><tr><td>PCR buisjes</td><td>Diamed</td><td>AD0210-FCN (nieuw nummer: DIATEC420-1250)</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5417c</td><td></td></tr><tr><td>Heat block</td><td>VWR</td><td>13259-030 / 13259-286</td><td></td></tr><tr><td>Thermische cycler</td><td>Applied Biosystems (2720)</td><td>4359659</td><td></td></tr><tr><td>Horizontaal, dompelbaar gelelektroforese systeem met gelvorm</td><td>BioRad</td><td>170-4469</td><td></td></tr><tr><td>Voeding</td><td>BioRad</td><td>164-5050</td><td></td></tr><tr><td>Roterende schudler</td><td>VWR</td><td>40000-300</td><td></td></tr><tr><td>Moleculair beeldvormingsgel Doc systeem</td><td>BioRad</td><td>1708170</td><td></td></tr></tbody></table>

multiplex pcr-test voor het typen van staphylococcus cassette chromosome mec types i tot en met v in methicilline-resistente<em&gt; staphylococcus aureus</em

Multiplex PCR Assay for Typing of Staphylococcal Cassette Chromosome Mec Types I to V in Methicillin-resistant Staphylococcus aureus

Staphylococcen Cassette Chromosome mec (SCC mec) typen is een zeer belangrijke moleculaire tool voor het begrijpen van de epidemiologie en klonale stam verwantschap van methicilline-resistente Staphylococcus aureus (MRSA), met name de opkomende uitbraken van de gemeenschap-geassocieerde MRSA (CA-MRSA) die zich op een wereldwijde basis. Traditionele PCR typering&#39;s classificeren SCC mec door targeting en identificeerbaar is mec en ccr gen complexe vormen, maar vereisen het gebruik van veel primer sets en meerdere afzonderlijke PCR experimenten. We ontwierpen en publiceerde een eenvoudige multiplex PCR-test voor het snel-screening van grote SCC mec types en subtypes I tot V, en later bijgewerkt als beschikbaar werd nieuwe sequentie-informatie. Deze eenvoudige test richt zich op individuele SCC mec types in een enkele reactie, is het gemakkelijk te interpreteren en is uitgebreid wereldwijd gebruikt. Vanwege de verfijnde nature van de test en het grote aantal primers in de reactie, is de kans op problemen tijdens de aanpassing van deze assay aan elk laboratorium. Om het proces van de oprichting van een MRSA SCC mec test te vergemakkelijken, hier laten we zien hoe het opzetten van onze multiplex PCR-test, en bespreken een aantal van de essenti

Deze bijgewerkte M-PCR is in staat om SCCmec-typen I-V te bepalen (classificeren), evenals de belangrijkste subtypen van SCCmec IV. De assay richt zich op unieke en specifieke loci van SCCmec I, II, III, IVa, IVb, IVc, IVd, IVE en V, met gelijktijdige detectie van het mecA-gen. Voorlopige identificatie van SCCmec VI en VIII is ook mogelijk, maar zou verdere testen vereisen ter bevestiging. Figuur 3 illustreert representatieve SCCmec I-VI en VIII en de...

We demonstreren een eenvoudige multiplex PCR-test voor snel screenen en typeren van Staphylococcal Cassette Chromosome mec (SCCmec) typen I-V voor methicilline-resistente Staphylococcus aureus, en bieden enkele van de essentiële stappen en procedurele nuances die het succesvol maken om deze test aan te passen aan individuele laboratoria.

Multiplex PCR-test voor het typen van Staphylococcus Cassette Chromosome Mec Types I tot en met V in Methicilline-resistente<em&gt; Staphylococcus aureus</em

Staphylococcal Cassette Chromosome mec (SCCmec) typing  is a very important molecular tool for understanding the epidemiology and  clonal strain ...

Het algemene doel van deze procedure is om het SCC MEC-type van methicilline-resistente Staphylococcus aureus of MRSA-isolaten te bepalen met behulp van een multiplex PCR-assay. Dit wordt bereikt door eerst DNA uit de stammen te isoleren met een snelle en eenvoudige extractietechniek waarbij de bacteriële cellen in water worden verhit. De tweede stap is het uitvoeren van een multiplex PCR-assay om targets te amplificeren die specifiek zijn voor elk van de SEC ME-typen.Vervolgens worden de PCR-producten gescheiden via AROS-gelelektroforese. De laatste stap is het kleuren van de gel voor de visualisatie van het DNA en de data-analyse. Uiteindelijk wordt de unieke combinatie van specifieke PCR-producten die met deze multiplex PCR-assay is verkregen, gebruikt om de SE cmec-typen van de MRS A-isolaten te bepalen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals traditionele S CEC-typeringsschema's die zich richten op individuele CCR- en MEC-gencomplexen en meerdere individuele PCR-buisjes vereisen, is dat dit proces de werklast aanzienlijk vereenvoudigt en in een enkel PCR-buisje kan worden uitgevoerd.Deze procedures moeten worden uitgevoerd in een gecertificeerd laboratorium voor biologische veiligheidsniveau twee. Op de dag voordat de PCR wordt uitgevoerd, moet te allen tijde geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen worden gebruikt. Selecteer met een steriel kweekstokje een enkele kolonie MRSA van een verse overnight-plaat en maak een dikke uitstrijk van de bacteriën op een triptiek-soja-agarplaat.Meerdere monsters kunnen op één enkele plaat worden uitgestreken en een nacht worden geïncubeerd bij 37 °C. Voeg 75 µL steriel gedestilleerd water toe aan een 1,5 mL microcentrifugebuis. Gebruik hiervoor een steriele kweekstok.Neem een kleine hoeveelheid bacteriën van de dikke overnight streak. Wervel de bacteriën in het steriele water om een troebele oplossing te bereiden. Herhaal dit proces voor alle monsters.Incubeer de buisjes 10 minuten in een droog warmteblok ingesteld op 95 °C om de bacteriën te lyseren en het DNA vrij te maken. Haal de monsters uit het warmteblok en laat ze vijf minuten afkoelen op kamertemperatuur. Centrifugeer de monsters één minuut bij 13.000 RPM.Het resulterende monster bevat een pellet van cellulair debris en een helder supernatant waarin het DNA zich bevindt. Ter voorbereiding op de PCR worden de PCR-reagentia, waaronder 10 XPCR-buffer, 50 millimolar magnesiumchloride, DTP's en primers, uit de vriezer van minus 20 °C gehaald en bij kamertemperatuur ontdooid op de schone PCR-werkbank waar geen bacteriën of DNA zijn toegestaan. De 0,2 milliliter PCR-buisjes kunnen op dit moment worden klaargemaakt en gelabeld.Zodra de reagentia zijn ontdooid, kortstondig vortexen om alles te mengen en vervolgens combineren volgens de tabel in het tekstprotocol. Het is belangrijk om platinum tech DNA polymerase te gebruiken, aangezien is vastgesteld dat dit de slaagkans van de reactie beïnvloedt. Nadat de mastermix is gevortexd en in de individuele PCR-buisjes is verdeeld, alle PCR-buisjes sluiten en naar de algemene werkbank verplaatsen.Voeg het template toe aan de PCR-buisjes door twee µL van het heldere supernatant van de eerder bereide bacteriële monsters te pipetteren. Ga naar de speciale locatie voor amplificatie voordat u de buisjes in de thermocycler plaatst en de reactie uitvoert zoals beschreven in het tekstprotocol. Werk op een speciale locatie voor gelelektroforese met 2,5 g agarose in 100 mL 0,5 X TBE-buffer in een glazen erlenmeyer.Dek de kolf af met vershoudfolie en verhit de oplossing in een magnetron tot deze volledig is opgelost. Een gel van 2,5% zal snel overkoken. Stop daarom de magnetron regelmatig en zwenk de oplossing.Koel de agros af tot ze comfortabel aan te raken zijn door ze te zwenken onder koud water of door ze vijf minuten op de werkbank te laten rusten. Giet de agros in de gietbak nadat de buisjes uit de PCR-thermocycler zijn gehaald. Bereid de monsters voor door twee µL zes XDNA-laadkleurstof aan elk monster toe te voegen.Laad vijf tot 10 µL monster per putje op de gel. Een 1 KB plus of 100 base pair DNA-ladder is geschikt voor de verwachte bandgroottes. Ethidiumbromide kan aan de gel worden toegevoegd vóór het gieten, of alternatief kan de gel worden gekleurd in een ethidiumbromide-bad vóór de visualisatie.Plaats de voltooide gel in een oplossing van 0,5 µg/mL atheriumbromide en gedestilleerd water en meng dit voorzichtig op een shaker gedurende 10 minuten. Breng de gel over naar een schoon reservoir en laat deze nog 10 minuten in gedestilleerd water rusten. Hier wordt een representatieve gel getoond die de verwachte PCR-producten demonstreert voor alle representatieve stammen van SEC MEC types één tot en met zes en acht, evenals SEC MEK type vier subtypen A tot en met F. Voor een typische SEC MEK type één stam worden twee banden verwacht.De type één-specifieke band op 613 baseparen evenals de mec, een controleband op 147 baseparen. Drie representatieve SEC MEK twee-stammen worden getoond, waaronder de prototypische type twee-stam N315 en de minder voorkomende type twee A en type twee B. Om een stam als SEC mek twee te classificeren, moeten twee banden aanwezig zijn, waaronder het type twee-locusdoel op 128 baseparen en de Meca-controle. Twee representatieve SEC MEK drie-stammen worden op de gel getoond, waaronder de prototypische SEC MEK drie-stam 852082 en de minder voorkomende type drie A-stam JCSC290. SSC MEC drie wordt geïdentificeerd op basis van de aanwezigheid van twee PCR-producten, waaronder het type drie-specifieke doel op 257 baseparen en het Mecca-controledoel.De dominante SEC MEC drie zal ook positief zijn voor het kwik-target op 280 baseparen, dat op een aangrenzend SEC-element ligt en dient om het te onderscheiden van de minder voorkomende SEC MEC drie A vijf. Representatieve SEC MEC vier-elementen worden getoond, waaronder typen vier A, vier B, vier C, vier D, vier E en vier F. In tegenstelling tot SC MEK één tot drie, is er geen enkel target aanwezig in alle SCC MEK vier-subtypen, afgezien van meck A. De representatieve SCC MEK vier E-stam wordt geïdentificeerd op basis van de aanwezigheid van de Type vier E-band, evenals het CCR AB vier-product, dat aanwezig is op een aangrenzend accessoir element, en het type vier C-product, dat aanwezig is omdat SEC MEK vier E dezelfde J 1-regio deelt als SE Cmk vier C. SCC MEK vier F is vergelijkbaar met SEC MEK vier E in die zin dat het dezelfde J 3-regio deelt en consequent positief is voor het vier E-target, alsook positief voor het CCR AB vier-target vanwege een aangrenzend accessoir element. S Cmk vier F kan echter worden onderscheiden van S CMK vier E doordat het het type vier C-target mist.Een typische SE CMK type vijf zou twee PCR-producten op de gel vertonen: de type vijf-specifieke band op 325 base pairs en de ME a-controle op 147 base pairs. Ten slotte, hoewel het doel van deze assay niet was om een definitieve identificatie van SE CMK type zes of acht te verschaffen, werden voor beide representatieve stammen opgenomen, aangezien een specifiek PCR-patroon suggestief bewijs levert voor de aanwezigheid van deze types.Naast het Meck A-doelwit wordt van het representatieve SEC MEK zes verwacht dat het een positief CR AB vier-product van 106 baseparen produceert, aangezien dit het belangrijkste CCR-complextype is. Het representatieve SEC MEC acht zou ook positief zijn voor MEC A bij 147 baseparen en C-C-R-A-B vier bij 106 baseparen, en zou worden onderscheiden van SEC MEK zes op basis van een positief type twee-specifiek product, dat voortvloeit uit het feit dat het dezelfde J twee-regio heeft als SEC MEK twee. Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat er, vanwege de complexe aard van de assay en het grote aantal primers in de reactie, mogelijkheden zijn voor complicaties.Bij het aanpassen van deze methode aan individuele laboratoria zal het besteden van nauwe aandacht aan bepaalde kernpunten, zoals de preparatie van het DNA-template en het merk van de PCR-reagentia, dit doel aanzienlijk vergemakkelijken.

multiplex-pcr-assay-for-typing-staphylococcal-cassette-chromosome-mec

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Een goedkope, high throughput methode voor gelijktijdige detectie van maximaal 43 moleculaire doelwitten wordt beschreven. Toepassingen van mPCR / RLB onder andere micro-organismen te typen en de detectie van meerdere pathogenen uit klinische monsters.

Multiplex PCR en Reverse Line Blot hybridisatie assay (mPCR / RLB)

Beschrijven we een multiplex-PCR voor de snelle detectie van Salmonella enterica serovars Enteritidis, Hadar, Heidelberg, en Typhimurium. Specifieke Salmonella serovars kunnen worden geïdentificeerd door zich te richten een multiplex PCR om genen en sequenties die uniek zijn voor het O-antigen biosynthese cluster en flagelline van een bepaalde serovar. Serovar wordt vervolgens toegewezen aan een Salmonella isoleren op basis van het optreden van de specifieke, grootte amplicons (PCR-product) die...

Een Allelotyping PCR voor het vaststellen van Salmonella enterica Serovars Enteritidis, Hadar, Heidelberg, en Typhimurium

We beschrijven een multiplex methode voor de detectie van micro-organismen in een monster met behulp van oligonucleotide-coupled fluorescerende kralen. Amplicon van alle organismen in een monster is gehybridiseerd met een panel van probe-gekoppelde kralen. Een Luminex of Bio-Plex instrument wordt gebruikt om elke kraal voor kraal type en hybridisatie-signaal zoekopdracht.

Multiplex detectie van bacteriën in complexe klinische en Milieu monsters met behulp van oligonucleotide-coupled Fluorescent Microsferen

Lytische faag biosensoren en antilichaam kralen zijn in staat onderscheid te maken tussen methicilline resistente (MRSA) en gevoelige stafylokok bacteriën. De fagen werden geïmmobiliseerd door een Langmuir-Blodgett methode op een oppervlak van een kwartskristal microbalans sensor en werkte als breed staphylococcus probes. Antilichaam kralen herkennen MRSA.

Biosensor voor de detectie van antibiotica resistente Staphylococcus bacteriën

Een amplificatie microarray combineert asymmetrische PCR-amplificatie en microarray hybridisatie in een enkele kamer, die aanzienlijk stroomlijnt microarray workflow voor de eindgebruiker. Vereenvoudiging microarray workflow is een noodzakelijke eerste stap voor het maken van microarray-gebaseerde diagnostiek die routinematig kan worden gebruikt in een lagere-resource-omgevingen.

Aantonen van een multiresistente<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em&gt; Versterking Microarray

Dit protocol beschrijft de detectie van klasse 1 integrons en hun bijbehorende gencassettes in levensmiddelen.

Screening Levensmiddelen voor klasse 1 integrons en Gene Cassettes

Hier wordt ribosomale spacer PCR (RS-PCR) gebruikt samen met een geminiaturiseerd elektroforesesysteem als een snelle en hoge resolutie methode voor genotypering van S. aureus tegen matige kosten waardoor een hoge doorvoer mogelijk is.

genotypering van<em&gt; Staphylococcus aureus</em&gt; Door Ribosomaal Spacer PCR (RS-PCR)

We presenteren twee op sondes gebaseerde in-house eenstaps RT-qPCR-kits voor veel voorkomende respiratoire virussen. De eerste test is voor SARS-CoV-2 (N), Influenza A (H1N1 en H3N2) en Influenza B. De tweede is voor SARS-Cov-2 (N) en MERS (UpE en ORF1a). Deze testen kunnen met succes worden geïmplementeerd in elk gespecialiseerd laboratorium.

Ontwikkeling van multiplex real-time RT-qPCR-assays voor de detectie van SARS-CoV-2, influenza A/B en MERS-CoV

Protocollen voor het gebruik van open systeem stroom biofilms met drip stroom reactoren en roterende schijf reactoren worden in detail.

Het gebruik van Drip Flow en roterende schijf reactoren voor Staphylococcus aureus Biofilm Analyse

Een muismodel voor huid- en weke deleninfecties wordt gebruikt om de virulentiefunctie van methicilline-resistente Staphylococcus aureus (MRSA) en de immunologische respons van de gastheer te beoordelen. Hier presenteren wij een subcutaan infectiemodel voor huid- en weke deleninfecties.

Subcutane Infectie van Methicilline Resistente Staphylococcus Aureus (MRSA)

Leer een multiplex PCR-test voor SCCmec-typering van MRSA-isolaten. Deze methode gebruikt DNA-isolatie via warmtebehandeling en gel-elektroforese voor snelle, betrouwbare identificatie van Staphylococcus aureus-stammen.

Multiplex PCR-test voor het typen van Staphylococcus Cassette Chromosome Mec Types I tot en met V in Methicilline-resistente Staphylococcus aureus (Video) | JoVE Journal

Multiplex PCR-test voor het typen van Staphylococcus Cassette Chromosome Mec Types I tot en met V in Methicilline-resistente

Meer video's verkennen