Identificatie van specifieke Sensory Neuron Populaties voor Studie van Uitgedrukt Ion Channels

Het algemene doel van deze procedure is om afferente neuronen te identificeren door retrograde kleurstoflabeling en om de ionkanalen in deze neuronen te bestuderen met behulp van patch clamp elektrofysiologie en immunochemie. Dit wordt bereikt door eerst DAI in het doelweefsel te injecteren om de innerverende afferente neuronen te labelen. De tweede stap is het isoleren van afferente neuronen uit dorsale wortelganglia.

Vervolgens worden de gelabelde neuronen met patch clamp vastgeklemd om de gated ionkanalen op te nemen, de laatste stap is het identificeren van geëxprimeerde ionkanalen in de gelabelde neuronen met behulp van immunochemie. Uiteindelijk, door een combinatie van patch, clamp en immunochemie, zijn we in staat om het expressiepatroon evenals de functionele eigenschappen van de ionkanalen in afferente neuronen te identificeren. Het belangrijkste voordeel van deze methode boven andere bestaande methoden is dat het een niet-invasieve methode is en de DAI die we gebruiken, DAI I, staat bekend om zijn snelle opname door de neuronale terminalen.

Gebrek aan overdracht tussen neuronen en langetermijnretentie binnen de neuronen die we injecteren. Het demonstreren van de procedure zal ik zijn en Stephanie, onderzoekstechnicus van ons lab voor kleurstofinjectie. Eerst scheer je het haar boven de kuit op beide benen van de geanesthetiseerde rat met een elektrische scheermachine.

Vervolgens vul je een een CC steriele spuit met 200 microliter van een 1,5% Dai-oplossing. Breng de naald langzaam in parallel met de lange as van elke gastro-spier in en injecteer 100 microliter van dai in de spier voordat je de naald uit de spier trekt. Trek terug op de zuiger van de spuit om ervoor te zorgen dat de kleurstof niet langer uit de punt stroomt.

Wacht 10 seconden en trek vervolgens de naald uit de spier. Vier tot vijf dagen zijn nodig voor de verdeling van de kleurstof om zich voor te bereiden op de dissectie. Plaats een beker met 10 milliliter HBSS, een 35 millimeter Petrischaal en een 100 millimeter Petrischaal op ijs.

Vervolgens weeg je zeven milligram collageenase af, één milligram DNA en 10 milligram trypsine, verwarm een schuddende waterbad tot 37 graden Celsius en verwarm een 15 milliliter centrifugebuis met 10 milliliter EBSS in het bad op. Nadat de rat is geëuthanaseerd voorafgaand aan de dissectie, snij je snel de huid op de rug van het dier open. Verwijder vervolgens het bind- en spierweefsel langs de wervelkolom voor een betere blootstelling.

Vervolgens verwijder je het lumbale deel van de wervelkolom. Plaats vervolgens de geïsoleerde wervelkolom in de 100 millimeter Petrischaal. Breng gekoelde HBSS-oplossing aan met behulp van een steriele weidepipet om de voorbereiding vochtig en koud te houden.

Snijd de spieren van de zijden van de wervelkolom. Voer een dorsale laminectomie uit door rongeurs of schaar te gebruiken om voorzichtig het bot te verwijderen en de recessen die de dorsale wortelganglia bevatten te sluiten. Herhaal dit. Breng tijdens deze procedure ijskoud HBSS aan.

Onder de microscoop isoleer je de DRG door de perifere en centrale zenuwen te snijden, waarbij één tot twee millimeter zenuw wordt achtergelaten om de handling van de ganglia te vergemakkelijken. Plaats vervolgens de geïsoleerde DRG in de 35 millimeter Petrischaal met ijskoud HBSS-buffer. Herhaal de procedures totdat alle L vier en L vijf DRG zijn geïsoleerd.

Verwijder overtollige zenuwen en bloedvaten met behulp van microschaar en pincetten. Snijd de DRG open voor een betere blootstelling aan de enzymen, maar ontdoe de DRG niet van de mantel voor DRG-neurondissociatie. Voeg de enzymen toe aan het warme EBSS-medium, schudden vervolgens om op te lossen en sterieel te filteren.

Plaats vervolgens alle DRG in de enzymoplossing met een steriele weidepipet. Bubble de flacon met 95% zuurstof en 5% CO2 gedurende 60 seconden voordat je de flacon stevig afdekt. Incubeer vervolgens de flacon in het schuddende waterbad van 37 graden Celsius gedurende 60 minuten bij 240 RPM.

Aan het einde van de incubatie krachtig. Schud de flacon 50 keer om de DRG onder steriele omstandigheden te dissociëren. Voeg vijf milliliter MEM plus toe aan de flacon om de enzymatische activiteiten te stoppen.

Breng de inhoud van de flacon over in een steriele 15 milliliter centrifugebuis en centrifugeer gedurende zes minuten bij 16 keer G. Verwijder vervolgens en gooi de supernatant weg. Voeg vijf milliliter MEM plus toe aan het monster, tritreer voorzichtig met de pipet.

Om de pellet te breken, herhaal de centrifugeerstap, verwijder en gooi de supernatant weg en voeg 500 microliter MEM plus toe, tritreer voorzichtig met de ene milliliter pipettetip op een pipet om een celsuspensie te maken. Plaats vervolgens een met polylysine gecoate glazen dekglas in een lege, steriele 35 millimeter schaal. Voeg vervolgens een druppel van de celsuspensie toe aan het midden van het dekglas.

Herhaal deze procedure totdat de celoplossing is uitgeput. Plaats de 35 millimeter schalen in een incubator van 37 graden Celsius en 5% CO2 gedurende een uur om de neuronen toe te laten hechten aan de dekglasjes na een uur. Voeg een extra twee milliliter medium toe aan elke schaal en breng ze terug naar de incubator om patch clamp opnamen uit te voeren.

Identificeer eerst de kleurstofgelabelde DRG-neuronen met behulp van een microscoop met epi-fluorescentie. Vul vervolgens de glazen elektrode met interne oplossing. Tik voorzichtig om eventuele vastzittende luchtbellen te verwijderen.

Plaats vervolgens de elektrode in de elektrodehouder. Laat de elektrode zakken naar de cel met behulp van een micromanipulator. Zodra de elektrode de cel raakt, breng je zachte zuiging aan via de zuigbuis totdat een strakke afdichting is gevormd.

Klamp vervolgens het membraanpotentiaal op het gewenste holdingpotentiaal. Verkrijg de gehele cel patch clamp configuratie door sterkere zuiging toe te passen. Om het membraanpatch aan de punt van de elektrode te verwijderen, start u