Name: Voorbereiding van de primaire neuronen voor het visualiseren neurites in een bevroren gehydrateerd Staat Met behulp van Cryo-electron tomography (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-02-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 59 s
Description: Leer hoe u primaire ratneuronen voorbereidt voor cryo-elektronentomografie om neurieten in bevroren gehydrateerde toestand te visualiseren. Deze methode behoudt ultrastructuur zonder chemische fixatie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit onderzoek is ondersteund door de NIH subsidies (PN2EY016525 en P41GM103832). SHS werd ondersteund door een beurs van de Nanobiology Interdisciplinair Graduate Training Program van de WM Keck Centrum voor Interdisciplinaire Bioscience Training van de Gulf Coast Consortia (NIH Grant No T32EB009379). SHS ontleed, groeide en verglaasd DRG en hippocampuscellen; verzameld cryo-EM en cryo-ET gegevens van DRG en hippocampus axonen, gereconstrueerd en kleur-geannoteerde de tilt-serie. MRG ontleed en voorzien hippocampuscellen in MNR het lab. SC bijgestaan ​​in tilt serie annotatie. SHS werd opgeleid door CW over hoe om te ontleden en te groeien neuronen. SHS, WCM en WC bedacht de experimenten. SHS bereid het manuscript met de input van andere auteurs. Deze video is gefilmd bij het Centrum voor Cellulaire Beeldvorming en NanoAnalytics (C-CINA) van de Biozentrum van thij universiteit van Basel. C-CINA is geïntegreerd in het Departement for Biosystems Science and Engineering (D-BSSE) van de ETH Zürich, gevestigd in Bazel, Zwitserland.

1. Het voorbereiden Gerechten met EM Hekwerk voor Plating primaire neuronen <ol><li> Onderzoek de integriteit van essen koolstof op de gouden EM roosters met behulp van een lichtmicroscoop bij vergroting van ten minste 25X. Zorg ervoor dat carbon gaten zijn&gt; 98% intact. </li><li> Voor plating primaire neuronen, gebruik dan een bunsenbrander aan vlammen steriliseren de EM roosters en tegelijkertijd ze hydrofiel te maken. Gebruik een pincet te halen de EM-net bij de rand, niet de centrale gerasterde oppervlak. LET OP: Laat nooit een brandende bunsenbrander zonder toezicht, en geen handschoenen of een pincet gebruiken met plastic onderdelen tijdens het uitvoeren van deze stappen: <ol><li> Alvorens de bunsenbrander, zet de lucht en gas aanpassingen aan een minimaal open positie. </li><li> Steek de bunsenbrander met een spits vuursteen of butaan lichter. </li><li> Wijzig de lucht en gas aanpassingen aan een kleine, blauwe innerlijke vlam binnen een groter, lichter blauw / violette vlam te bereiken. De tip van de innerlijke vlam is het heetste deel van de vlam. De knop onderneath de brander regelt de hoeveelheid gas die in de branderbuis, terwijl de loop van de brander kan worden gedraaid om de hoeveelheid lucht die de brander passen. Door de lucht afstelling rechtsom verlaagt de lucht (resulterend in een paarse vlam) en tegen de klok in verhoogt de lucht (resulterend in een gele vlam). </li><li> Met behulp van metalen pincet (geen plastic onderdelen) aan de EM rooster te houden, snel haal hem door de vlam twee keer, tegenover koolstof-kant naar boven. De koolstof kant zal meer matte (minder glimmend) verschijnen en met meer van een grijsachtige tint dan de andere kant. </li><li> Onmiddellijk overdracht van de rooster (koolstof-kant naar boven) in het midden van de glazen bodem schaal geplaatst binnen 10 cm van de bunsenbrander. Gebruik een EM rooster per schaal (figuur 1). Gebruik alleen glazen bodem gerechten die worden vooraf gesteriliseerd, dat wil zeggen via gammastraling. </li></ol></li><li> Gebruik een lichtmicroscoop aan het net integriteit (carbon gaten intact) controleren terwijl nog het houden van de EM rooster in het glas-bottOM schotel (om besmetting te voorkomen). Bij toepassing van een stof op het rooster of iets dat in contact met de neuronen komen, steriel procedure en steriele pipet tips. </li><li> In een weefselkweek kap met steriele procedure, van toepassing 250 ul van de juiste coating stof langzaam en voorzichtig naar de centrale glazen gedeelte van de petrischaal. Zorg ervoor dat de juiste coating stof bestrijkt het hele EM rooster. <ol><li> Voor hippocampale neuronen gebruikt poly-L-lysine (PLL, 1 mg / ml) als bekledingsstof, bereid zoals eerder beschreven 19. Merk op dat 250 ul nodig per EM rooster, per gerecht, dus houd daar rekening schaal van de partij. Voor dorsale wortel ganglion (DRG) neuronen, gebruik dan een geleiachtige eiwitmengsel uitgescheiden door Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) muis sarcoom cellen (zie tabel van materialen en reagentia) als de coating stof, bereid als volgt. Merk op dat 250 ul nodig per EM rooster, per gerecht, dus houd daar rekening schaal van de partij. <ol><li> Ontdooi een voorraad flesvan de geleiachtige eiwit mengsel afgescheiden door Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) muis sarcoom cellen overnacht bij 4 ° C. </li><li> Houd koude de geleiachtige eiwit mengsel afgescheiden door Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) muis sarcoom cellen, en alle onderdelen die worden gebruikt om de oplossing te maken, namelijk door ze op ijs. </li><li> Terwijl op ijs, verdund dit gelatineachtige proteïne mengsel Neurobasal medium een verdunning 1:20 opleveren (bijvoorbeeld verdun 500 gl van het gelatineuze proteïne mengsel in 10 ml Neurobasal). </li><li> Verdeel verdunde proteïne gelatineuze mengsel in 1 ml porties en onmiddellijk extra porties bewaard bij -20 ° C. </li><li> Solliciteer 250 ul per EM rooster, per gerecht, zoals beschreven in paragraaf 1.4. </li></ol></li></ol></li><li> Dek de petrischaal met zijn top en incubeer (hetzij PLL voor hippocampus specimens, of met de gelatineachtige proteïne mengsel DRG specimens) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur in de weefselkweek kap. </li><li> Aspiwaardeert alle PLL (voor hippocampus monsters) of de gelatineuze eiwitmengsel (voor DRG specimens) van de gerechten. Om dit te doen, gebruik maken van het vacuüm-systeem in de weefselkweek kap. Gebruik een steriele pipet aan de vacuümbuis. Vermijd direct contact met de EM rooster. </li><li> Gebruik een regelbare displacement pipet 250 pi steriel PBS (fosfaatgebufferde zoutoplossing) voorzichtig toepassing op de EM raster in het centrale glasoppervlak van elke petrischaal, zodat de EM rooster volledig onder PBS. Vervolgens zuig het PBS van elke schaal. Herhaal 3x. </li><li> Laat de gerechten met EM roosters te drogen onder de weefselkweek kap gedurende 15 minuten. Zorg ervoor dat ze volledig droog zijn door het controleren onder de lichtmicroscoop in de weefselkweek kamer. Zorg ervoor dat er geen luchtbellen van vocht in het raster. Dan zorgvuldig aspireren naast de EM net deze extra vocht te elimineren. De gecoate rooster moet onmiddellijk worden gebruikt voor plating de neuronen. </li></ol> 2. Voorbereiden en Plating primaire neuronen over EM Grids <ol><li> Primaire neuronen, eerste ontleden, trypsinize (met 2,5% trypsine) en vermaal plaat naar de hippocampus (of dorsale wortel ganglion van 18 dagen oude embryo rat) dissociëren in individuele cellen zoals eerder beschreven 19. <ol><li> Vermaal is een veel voorkomende term die gebruikt wordt door neurobiologen om te distantiëren groepjes van cellen te beschrijven in individuele cellen, met name door het gebruik van een glazen pipet met een brand-gepolijst tip. Het resultaat wordt bereikt door het zorgvuldig en langzaam het trekken en loslaten van de cellen op en neer, verschillende malen (~ 30) door de pipet. </li></ol></li><li> Volg de procedures zoals eerder beschreven voor DRG dissectie en celisolatie 24, nemend tot 0,25% trypsine (in HBSS) om de rat DRG neuronen te isoleren, in plaats van de enzymen voorgesteld (papaïne, collagenase / dispase) die meer geschikt zijn voor muis DRG neuronen. </li><li> Bereken het aantal geïsoleerde neuronen (dat wil zeggen met behulp van een hemocytometer)en deze waarde om de juiste hoeveelheid cellen berekenen toepassing op elke schotel een concentratie van 50.000 cellen / ml per schaal bereiken. Het maximale volume van toepassing is 250 pl. Merk op dat dit alleen de centrale glasoppervlak, niet het gehele gerecht vult. </li><li> Incubeer de schotels voor 30 min in een CO2 incubator bij 37 ° C. Laat cellen om te herstellen en zich te houden. </li><li> Voeg langzaam 1,5 ml verwarmd medium bij elk gerecht, het verzorgen van de EM rooster niet te verstoren. Het type media is afhankelijk van het celtype (hippocampus of DRG). <ol><li> Bereid de juiste media voor zowel hippocampale neuronen 19 of dorsale wortel ganglion neuronen 24, die wordt verwarmd in een 37 ° C waterbad voor gebruik. Incubeer de gerechten &#39;s nachts in de CO 2 incubator. </li><li> Voor hippocampusneuronen, veranderen de media de volgende dag. Wijzig de helft van het medium elke twee dagen verder gedurende 14 dagen. Verwarm de media in een 37 ° C waterbad voor gebruik. </li&gt; <li> Voor DRG neuronen, de dag na dissectie / plating, stelt een nieuwe voorraad van media met een anti-mitotisch middel (Uridine en 5&#39;-fluor-2&#39;-deoxyuridine) levert een 10 mM voorraadoplossing van elk afzonderlijk, gebruik een definitieve concentratie van 10 uM voor elk. Verwijder de helft van de DRG medium (875 pl) en voeg 875 ul vers medium met anti-mitotische middel. <ol><li> Voor DRG neuronen, elke twee dagen de eerste week, afwisselende veranderende informatie tussen anti-mitotische media en standaard DRG media. Voor de tweede week, veranderen standaard DRG media om de twee dagen. </li></ol></li></ol></li></ol> 3. Vitrifying Neuronen op EM Grids <ol><li> Bereid apparatuur en alle materialen voor het invriezen en bewaren in het EM roosters bij cryogene temperatuur: een verglazing apparaat met een vochtige kamer 17, puntig gespecialiseerde pincet voor de verglazing machine, lange vlakke punt pincet, dewar (s) van vloeibare stikstof (LN 2), coolant container, EM rooster opbergdoos, calcium-vrije filterpapier. </li><li> Start de verglazing apparaat. Stel de vochtigheid van 100% en de temperatuur tot 32 ° C. In de sectie &quot;Console&quot;, stelt de vlek tijd op nul seconden. Dit kan met de hand te deppen door de zijruit van vochtkamer de verglazing machine. </li><li> Behandel de calciumvrij filtreerpapier met handschoenen, gelaagdheid hen zodanig dat drie papers worden gestapeld. Snijd de stapel in 0,5 cm brede stroken die ~ 2 cm lang. Buigen bij een 90 ° hoek zodat een zijde van het papier een 0,5 cm x 0,5 cm vlak (figuur 2). Met een pincet, verwijder het midden papier en leg het op een andere calciumvrij filtreerpapier tot gebruik. </li><li> Zet de storage-knop in de houder knop binnen de verglazing kamer. Vul de binnenkamer van de koelvloeistof container met vloeibare stikstof en wacht tot volledige verdamping. Vul de buitenste kamer van the koelvloeistof container met vloeibare stikstof totdat het op stabiele temperatuur voor u verder gaat met de volgende stap. Vul het binnenste kamer met een hoge zuiverheidsgraad gasvormig ethaan dat zal condenseren tot een vloeibare toestand in de gekoelde ruimte. </li><li> Verplaats de schotel (es) van de incubator een grote 100 mm polystyreen gerecht voor transport naar de verglazing kamer, zo niet in de onmiddellijke nabijheid. Gebruik de gespecialiseerde verglazing pincet om zorgvuldig kiezen van de EM rooster uit de schotel. Let op welke kant de neuronen groeien op de EM rooster, de positie van belang voor de volgende stap. Gebruik de zwarte schuiven slot op de pincet om veilig vast de pincet op de EM rooster. </li><li> Plaats de pincet in de verglazing machine zoals die kant van de EM raster waarop de neuronen gehecht vlakken naar links, weg van de zij-opening gat van de verglazing machine. Trek de gespecialiseerde pincet in de verglazing machine. </li><li> Plaats de koelvloeistof container in de juiste houdervan de verglazing machine. Het moet worden gevuld met voldoende LN 2 en vloeibare ethaan. Met de juiste scherm bevel van de verglazing machine, verhogen de koelvloeistof kamer naar boven totdat het gespoeld met de onderkant van de vochtige kamer. </li><li> Met de vlakke punt pincet, grijpen een rand van het filterpapier, zodat de korte kant (het 0,5 cm x 0,5 cm gezicht) loodrecht op de pincet. Dit gezicht zal in direct contact met de EM rooster komen voor blotting (Figuur 2B). Plaats de filter papier voorzichtig in de side-gat van vochtkamer de verglazing machine (Figuur 2A). Stabiel houden het papier tegen de EM rooster (de afgekeerde zijde van het monster) gedurende 10 sec. Gooi het papier daarna meteen duik-vries het model in de vloeibare ethaan met behulp van automatisering van de verglazing machine. </li><li> Overdragen diepvriesproducten gehydrateerd EM rooster voorzichtig een van de sleuven in een van denetwerk storage knoppen. Herhaal dit proces voor extra EM roosters in de gerechten. De EM netwerk storage-knoppen gebruikt in deze experimenten kunnen meerdere bevroren gehydrateerd EM grids slaan. </li></ol> 4. Afbeelding verzameling, verwerking, en annotatie <ol><li> Ga verder met 2-D electronenmicroscoop en / of 3D tilt reeks 5 van de neurieten met een cryo-elektronenmicroscoop onder een lage dosis toestand verzamelen. De 2-D beelden waren bedoeld om de kwaliteit van het netwerk beoordelen op ijsdikte en mogelijke gebieden nuttig voor 3-D tilt series zijn. <ol><li> In dit geval werden alle beelden verzameld met een 4k x 4k CCD camera aan een 200 kV elektronenmicroscoop uitgerust met een tilt vloeibare stikstof cryo overdracht houder op 20k microscoop vergroting op een doel underfocus van 7 urn en bemonstering van 4,4 Å / pixel. </li><li> Om een ​​3D tomogram van het monster te verkrijgen, neem een ​​reeks van projectie beelden terwijl stapsgewijs het kantelen van de sample along een as van de transmissie-elektronenmicroscoop (TEM). Gezien de hellingshoeken en andere experimentele instellingen, zijn er verschillende software beschikbaar om dit te verhelpen serie 5 automatisch verzamelen. De 3-D tilt series hier verzameld op dezelfde microscoop met semi-automatische tilt series acquisitiesoftware 26 over een bereik van -60 ° tot 60 ° in stappen van 5 ° met een cumulatieve dosis van 60 ~ e / A 2. </li></ol></li><li> Reconstrueren de tilt-serie van het neurites gebruik van image processing software 21 als eerder beschreven voor andere monsters 5,29. </li><li> Color-annoteren de 3-D eigenschappen van de neurieten door eerst het segmenteren tomogram en het creëren van een oppervlak model met een 3-D beeldverwerkingssoftware zoals eerder beschreven 5. </li></ol>

<ol><li>Al-Amoudi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-electron+microscopy+of+vitreous+sections%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Cryo-electron microscopy of vitreous sections.</a> EMBO J. 23, 3583-3588 (2004).</li>
<li>Benzing, W. C., Mufson, E. J., Armstrong, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alzheimer%27s+disease-like+dystrophic+neurites+characteristically+associated+with+senile+plaques+are+not+found+within+other+neurodegenerative+diseases+unless+amyloid+beta-protein+deposition+is+present%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Alzheimer's disease-like dystrophic neurites characteristically associated with senile plaques are not found within other neurodegenerative diseases unless amyloid beta-protein deposition is present.</a> Brain Res. 606, 10-18 (1993).</li>
<li>Binks, B. P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBinks%2C+BP+%22Modern+characterization+methods+of+surfactant+systems%22">Modern characterization methods of surfactant systems</a>. , Marcel Dekker. New York, New York, USA. (1999).</li>
<li>Briggman, K. L., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+neural+circuit+reconstruction+with+volume+electron+microscopy+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Towards neural circuit reconstruction with volume electron microscopy techniques.</a> Curr. Opin. Neurobiol. 16, 562-570 (2006).</li>
<li>Chen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+cryotomography+of+bacterial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Electron cryotomography of bacterial cells.</a> J. Vis. Exp. (39), e1943(2010).</li>
<li>DiFiglia, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aggregation+of+huntingtin+in+neuronal+intranuclear+inclusions+and+dystrophic+neurites+in+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Aggregation of huntingtin in neuronal intranuclear inclusions and dystrophic neurites in brain.</a> Science. 277, 1990-1993 (1997).</li>
<li>Dubochet, J., Chang, J. J., Freeman, R., Lepault, J., McDowall, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Frozen+aqueous+suspensions%5BTitle%5D)+AND+%22Ultramicroscopy%22%5BJournal%5D)">Frozen aqueous suspensions.</a> Ultramicroscopy. 10, 55-61 (1982).</li>
<li>Fernández-Busnadiego, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+into+the+molecular+organization+of+the+neuron+by+cryo-electron+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Electron+Microsc%22%5BJournal%5D)">Insights into the molecular organization of the neuron by cryo-electron tomography.</a> J. Electron Microsc. 60, 137-148 (2011).</li>
<li>Frey, T. G., Perkins, G. A., Ellisman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+tomography+of+membrane-bound+cellular+organelles%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biophys.+Biomol.+Struct%22%5BJournal%5D)">Electron tomography of membrane-bound cellular organelles.</a> Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 35, 199-224 (2006).</li>
<li>Garvalov, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Luminal+particles+within+cellular+microtubules%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Luminal particles within cellular microtubules.</a> J. Cell. Biol. 174, 759-765 (2006).</li>
<li>Grünewald, K., Cyrklaff, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+complex+viruses+and+virus-infected+cells+by+electron+cryo+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Structure of complex viruses and virus-infected cells by electron cryo tomography.</a> Curr. Opin. Microbiol. 9, 437-442 (2006).</li>
<li>Gu, J., Bourne, P. E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGu%2C+J+%22Structural+bioinformatics%22">Structural bioinformatics</a>. , Wiley-Blackwell. Hoboken, New Jersey, USA. (2009).</li>
<li>De Hoop, M. J., Meyn, L., Dotti, C. G. Culturing hippocampal neurons and astrocytes from fetal rodent brain. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDe+Hoop%2C+MJ+%22Cell+Biology%3A+A+Laboratory+Handbook%22">Cell Biology: A Laboratory Handbook</a>. 1, W.H. Freeman. New York, New York, USA. (1998).</li>
<li>Denk, W., Horstmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serial+Block-Face+Scanning+Electron+Microscopy+to+Reconstruct+Three-Dimensional+Tissue+Nanostructure%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy to Reconstruct Three-Dimensional Tissue Nanostructure.</a> PLoS Biol. 2, e329(2004).</li>
<li>Fink, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+regulation+of+neurite+extension+and+synapse+formation+by+the+beta+but+not+the+alpha+isoform+of+CaMKII%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Selective regulation of neurite extension and synapse formation by the beta but not the alpha isoform of CaMKII.</a> Neuron. 39, 283-297 (2003).</li>
<li>Jacob, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+matrix+granules%3A+their+behavior+during+changing+metabolic+situations+and+their+relationship+to+contact+sites+between+inner+and+outer+mitochondrial+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Microsc.+Res.+Tech%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial matrix granules: their behavior during changing metabolic situations and their relationship to contact sites between inner and outer mitochondrial membranes.</a> Microsc. Res. Tech. 27, 307-318 (1994).</li>
<li>Jensen, G. J., Briegel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+electron+cryotomography+is+opening+a+new+window+onto+prokaryotic+ultrastructure%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">How electron cryotomography is opening a new window onto prokaryotic ultrastructure.</a> Curr. Opin. Struct. Biol. 17, 260-267 (2007).</li>
<li>Ibiricu, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo+Electron+Tomography+of+Herpes+Simplex+Virus+during+Axonal+Transport+and+Secondary+Envelopment+in+Primary+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Cryo Electron Tomography of Herpes Simplex Virus during Axonal Transport and Secondary Envelopment in Primary Neurons.</a> PLoS Pathog. 7, e1002406(2011).</li>
<li>Kaech, S., Banker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culturing+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Culturing hippocampal neurons.</a> Nat. Protoc. 1, 2406-2415 (2006).</li>
<li>Koning, R. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo+electron+tomography+of+vitrified+fibroblasts%3A+microtubule+plus+ends+in+situ%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Cryo electron tomography of vitrified fibroblasts: microtubule plus ends in situ.</a> J. Struct. Biol. 161, 459-468 (2008).</li>
<li>Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computer+visualization+of+three-dimensional+image+data+using+IMOD%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD.</a> J. Struct. Biol. 116, 71-76 (1996).</li>
<li>Lotharius, J., Brundin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenesis+of+Parkinson%27s+disease%3A+dopamine%2C+vesicles+and+alpha-synuclein%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Pathogenesis of Parkinson's disease: dopamine, vesicles and alpha-synuclein.</a> Nat. Rev. Neurosci. 3, 932-942 (2002).</li>
<li>Lucić, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiscale+imaging+of+neurons+grown+in+culture%3A+from+light+microscopy+to+cryo-electron+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Multiscale imaging of neurons grown in culture: from light microscopy to cryo-electron tomography.</a> J. Struct. Biol. 160, 146(2007).</li>
<li>Malin, S. A., Davis, B. M., Molliver, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+dissociated+sensory+neuron+cultures+and+considerations+for+their+use+in+studying+neuronal+function+and%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Production of dissociated sensory neuron cultures and considerations for their use in studying neuronal function and.</a> 2, 152-160 (2007).</li>
<li>Marsh, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lessons+from+tomographic+studies+of+the+mammalian+Golgi%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Lessons from tomographic studies of the mammalian Golgi.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1744, 273-292 (2005).</li>
<li>Mastronarde, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+electron+microscope+tomography+using+robust+prediction+of+specimen+movements%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements.</a> J. Struct. Biol. 152, 36-51 (2005).</li>
<li>Medalia, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organization+of+actin+networks+in+intact+filopodia%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Organization of actin networks in intact filopodia.</a> Curr. Biol. 17, 79-84 (2007).</li>
<li>Medalia, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macromolecular+architecture+in+eukaryotic+cells+visualized+by+cryoelectron+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Macromolecular architecture in eukaryotic cells visualized by cryoelectron tomography.</a> Science. 298, 1209-1213 (2002).</li>
<li>Meyerson, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+molecular+structures+of+HIV+envelope+glycoproteins+using+cryo-electron+tomography+and+automated+sub-tomogram+averaging%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Determination of molecular structures of HIV envelope glycoproteins using cryo-electron tomography and automated sub-tomogram averaging.</a> J. Vis. Exp. (58), e2770(2011).</li>
<li>Nakatomi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+of+Hippocampal+Pyramidal+Neurons+after+Ischemic+Brain+Injury+by+Recruitment+of+Endogenous+Neural+Progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Regeneration of Hippocampal Pyramidal Neurons after Ischemic Brain Injury by Recruitment of Endogenous Neural Progenitors.</a> Cell. 110, 429-441 (2002).</li>
<li>Peachey, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+Microscopic+Observations+on+the+Accumulation+of+Divalent+Cations+in+Intramitochondrial+Granules%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Electron Microscopic Observations on the Accumulation of Divalent Cations in Intramitochondrial Granules.</a> J. Cell. Biol. 20, 95-111 (1964).</li>
<li>Raza, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aging+is+associated+with+elevated+intracellular+calcium+levels+and+altered+calcium+homeostatic+mechanisms+in+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci.+Lett%22%5BJournal%5D)">Aging is associated with elevated intracellular calcium levels and altered calcium homeostatic mechanisms in hippocampal neurons.</a> Neurosci. Lett. 418, 77-81 (2007).</li>
<li>Scroggs, R. S., Fox, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+current+variation+between+acutely+isolated+adult+rat+dorsal+root+ganglion+neurons+of+different+size%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Calcium current variation between acutely isolated adult rat dorsal root ganglion neurons of different size.</a> J. Physiol. 445, 639-658 (1992).</li>
<li>Squire, L. R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSquire%2C+LR+%22Fundamental+neuroscience%22">Fundamental neuroscience</a>. , Academic Press. Amsterdam; Boston. (2003).</li>
<li>Sulzer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+hit+hypotheses+for+dopamine+neuron+loss+in+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Multiple hit hypotheses for dopamine neuron loss in Parkinson's disease.</a> Trends Neurosci. 30, 244-250 (2007).</li>
<li>Tapia, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+expression+of+glycine+and+GABA%28A%29+receptors+in+developing+spinal+cord+neurons.+Effects+on+neurite+outgrowth%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Early expression of glycine and GABA(A) receptors in developing spinal cord neurons. Effects on neurite outgrowth.</a> Neuroscience. 108, 493-506 (2001).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen.

We zien dat rat embryonale neuronen (dorsale wortel ganglion en hippocampus) kunnen worden gekweekt op goud elektronenmicroscopie (EM) roosters en glasachtige ijs dun genoeg zijn neurieten worden afgebeeld met behulp van 2-D cryo-EM en 3-D cryo-ingevroren ET. Terwijl hippocampus neurites eerder zijn afgebeeld met behulp van cryo-ET 8,10,18,23, een protocol gedetailleerd genoeg voor een succesvolle replicatie met behulp van commercieel beschikbare apparaten heeft ontbroken. Bovendien, terwijl hun onderzoek het...

Neuronen stellen de complexe schakelingen essentieel zijn voor de functie van het centrale en perifere zenuwstelsel door de uitwerking dendrieten en axonen informatie, vaak nogal lang, communiceren downstream neuronen ontvangen. Neuriet uitgroei speelt een fundamentele rol tijdens embryonale ontwikkeling en neuronale differentiatie en onderhoud van neurieten ondersteunt de kritische functie van het zenuwstelsel. Neuritische processen hebben ook kritisch in neuronale schade en herstel, evenals aandoeningen van het zenuwstelsel. De studie van neuronale architectuur is cruciaal voor zowel de normale en zieke hersenen te begrijpen. Gelukkig, fysiologisch relevante neuronale celkweek systemen bestaan ​​die kunnen complexe en heterogene cellulaire structuren recapituleren. Gebaseerd op de opheldering van vaste experimentele platforms, effectieve visualisatie strategieën die kwalitatieve en kwantitatieve analyses van neuronale morfologie mogelijk nodig. Vooral nuttig zouzijn een gedetailleerde methodologie die een consistent platform voor het visualiseren neurites, zowel axonen en dendrieten op de nanometer schaal biedt. Traditionele elektronenmicroscopie vereist het gebruik van organische oplosmiddelen bij uitdroging en hars inbedding, die verstoringen kunnen veroorzaken in de monsters uit hun ware staat. Tot op heden zijn de meeste structurele karakteriseringen op nanometerschaal op basis van grotere cellen of weefsels die worden blootgesteld aan zulke agressieve chemicaliën - en dus de interpretatie van de bevindingen 4,9,25 beperken. Bovendien, voor elektronenbundel penetratie, snijden is vereist voor organismen of cellulaire uitsteeksels vertonen een dikte van meer dan 1 urn 12. Tenslotte doorsnede of gemalen weefsel leidt verzameling van discrete slice-specifieke datasets, waardoor omslachtige de definitie van de langwerpige kenmerk van neurieten. Zelfs voor cryo-EM, waarbij snijden diepvriesbewaarruimte gehydrateerde monster mogelijk is, stelt de werkwijze compressie artifhandelingen 1. In de afgelopen jaren hebben onderzoekers geleerd hoe hippocampusneuronen direct groeien op EM roosters en-flits bevriezen ze in vloeibare ethaan om vervolgens neurites visualiseren met behulp van cryo-ET 8,10,18,23. Echter, deze studies gebruik maken van een hulpmiddel naar maat 10,23, of het ontbreken details over de blotting stap voor het genereren dun genoeg glasvocht ijs voor routinematige visualisatie 8,18. Bijvoorbeeld, een studie adviseert het gebruik van 30-40 seconden voor blotting de EM rooster 10, maar wordt deze waarde niet geoptimaliseerd voor algemeen gebruik, maar is specifiek voor die custom-made-duik bevriezing apparaat. Met behulp van een op maat gemaakte inrichting in plaats van een commercieel verkrijgbaar een 17 voor het behoud van vocht voorafgaand aan een duik-bevriezing van het monster kan een hindernis voor grootschalige reproduceerbaarheid opleveren. Hoewel deze studies zijn baanbrekend visualiseren neurieten door cryo-ET, hebben we een stap verder naar de ap verkennentoepasselijkheid van cryo-ET van verschillende neuronale specimens (hippocampus en dorsale wortel ganglion neuronen). Daarnaast bespreken we zowel optimale en suboptimale resultaten, alsook de mogelijke artefacten die men zou kunnen optreden bij het gebruik cryo-ET voor dergelijke specimens. Het definiëren van een gedetailleerde techniek voor het behoud en het visualiseren hele neurites op de nanometer schaal in een near-native staat zou de mogelijkheid voor meer onderzoekers om ultrastructurele studies uit te voeren verbeteren. Daartoe doeltreffende en gedetailleerd protocol beschrijven we de handel verkrijgbare apparatuur losgemaakt, onbesmet neuronen bereiden neurieten visualiseren. Dit is een belangrijke eerste stap in de richting waarin de ultrastructuur van gezonde neurites en de basis te leggen voor het begrijpen van wat structurele verschillen aanwezig in het zenuwstelsel ziekte modellen. Sinds cryo-ET niet vastgelegde, onbesmet neuriet functies op nanometerschaal kan oplossen in 3-D, zal de methode maakt het mogelijk als nooitvoorgrond neuritische architectuur 12 definiëren.

<table><tbody><tr><td>Dumont #7 Tweezers</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>72803-01</td><td>Voor het hanteren van EM roosters</td></tr><tr><td>Glass bottom dishes</td><td>MatTek Corp.</td><td>P35G-1.5-10C</td><td>Voor het kweken van monsters</td></tr><tr><td>Electron microscopy grids</td><td>Quantifoil</td><td>Holey Carbon, Au 200, R 2/2</td><td>Voor het kweken van monsters</td></tr><tr><td>Calcium-free filter paper</td><td>Whatman</td><td>1541-055</td><td>Voor het blotten van monsters</td></tr><tr><td>Large flat point long tweezers</td><td>Excelta Corporation</td><td>E003-000590, 25-SA</td><td>Voor het blotten van monsters</td></tr><tr><td>Vitrification device and tweezers</td><td>FEI</td><td>Vitrobot Mark III</td><td>Voor het invriezen van monsters</td></tr><tr><td>Minigrid storage boxes</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>160-40</td><td>Voor het opslaan van EM roosters</td></tr><tr><td>Cryo transfer holder</td><td>Gatan</td><td>626 Single Tilt Liquid Nitrogen Cryo Transfer Holder</td><td>Voor het beeldvormen van monsters</td></tr><tr><td>Semiautomated tilt series acquisition software</td><td>SerialEM</td><td>http://bio3d.colorado.edu/SerialEM/</td><td>Voor het beeldvormen van monsters</td></tr><tr><td>Image processing software</td><td>IMOD eTomo</td><td>http://bio3d.colorado.edu/imod/</td><td>Voor beeldverwerking</td></tr><tr><td>Transmission electron microscope for cryoEM</td><td>JEOL, Tokyo</td><td>200-kV JEM2100 LaB6 elektronenmicroscoop</td><td>Voor het beeldvormen van monsters</td></tr><tr><td>4k x 4k CCD camera</td><td>Gatan</td><td>N/A</td><td>Voor het beeldvormen van monsters</td></tr><tr><td>3-D annotation software</td><td>Visage Imaging GmbH</td><td>Amira/Avizo</td><td>Voor het verwerken van 3-D gegevens</td></tr><tr><td>Software voor het digitaal samenvoegen van 2-D beelden</td><td>Adobe</td><td>Adobe Photoshop</td><td>Voor het verwerken van 2-D gegevens</td></tr><tr><td>DMEM, Hoge Glucose</td><td>Invitrogen</td><td>11965-118</td><td>Voor hippocampale cultuur</td></tr><tr><td>Boorzuur</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B-0252</td><td>Voor hippocampale cultuur</td></tr><tr><td>Natriumtetraboraat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B-9876</td><td>Voor hippocampale cultuur</td></tr><tr><td>Poly-L-lysine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P2636-500MG</td><td>Voor hippocampale cultuur</td></tr><tr><td>Filtersysteem</td><td>Corning</td><td>430758</td><td>Voor hippocampale cultuur</td></tr><tr><td>Neurobasal medium</td><td>Invitrogen</td><td>21103-049</td><td>Voor DRG-cultuur</td></tr><tr><td>B-27 supplement</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td>Voor DRG-cultuur</td></tr><tr><td>Penicilline/Streptomycine</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td>Voor DRG-cultuur</td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Invitrogen</td><td>35050-061</td><td>Voor DRG-cultuur</td></tr><tr><td>Recombinant rat b-NGF</td><td>R&amp;D Systems</td><td>556-NG</td><td>Voor DRG-cultuur</td></tr><tr><td>Uridine</td><td>Sigma</td><td>U3003-5G</td><td>Voor DRG-cultuur</td></tr><tr><td>5'-Fluoro-2'-deoxyuridine</td><td>Sigma</td><td>F0503-100MG</td><td>Voor DRG-cultuur</td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>BD Biosciences</td><td>356234</td><td>Voor DRG-cultuur</td></tr></tbody></table>

voorbereiding van de primaire neuronen voor het visualiseren neurites in een bevroren gehydrateerd staat met behulp van cryo-electron tomography

Preparation of Primary Neurons for Visualizing Neurites in a Frozen-hydrated State Using Cryo-Electron Tomography

Neurieten, zowel dendrieten en axonen, zijn neuronale cellulaire processen die de geleiding van elektrische impulsen tussen neuronen mogelijk. Het definiëren van de structuur van neurites is cruciaal om te begrijpen hoe deze processen te verplaatsen materialen en signalen die synaptische communicatie ondersteunen. Elektronenmicroscopie (EM) is van oudsher gebruikt om de ultrastructurele functies binnen neurites beoordelen, maar kan de blootstelling aan organische oplosmiddelen tijdens uitdroging en hars inbedding structuren verstoren. Een belangrijke onvervulde doel is het formuleren van procedures die het mogelijk maken voor structurele evaluaties niet beïnvloed door dergelijke artefacten. Hier hebben wij een gedetailleerde en reproduceerbare protocol voor het kweken en Snelkoelen geheel neurieten van verschillende primaire neuronen van elektronenmicroscopie netten gevolgd door de behandeling met cryo-electron tomografie (cryo-ET) vastgesteld. Deze techniek maakt 3-D visualisering van bevroren gehydrateerd neurieten op nanometer resolutie vergemakkelijken assessment van hun morfologische verschillen. Ons protocol levert een ongekend uitzicht op dorsale wortel ganglion (DRG) neurites, en een visualisatie van de hippocampus neuronen in hun buurt-inheemse staat. Als zodanig zijn deze werkwijzen maakt een basis voor toekomstige studies neurieten van zowel normale neuronen en die beïnvloed door neurologische stoornissen.

Voorafgaand aan het invriezen en beeldvorming via cryo-ET dient lichtmicroscoop beelden worden gemaakt van de EM raster waarop de neuronen groeien. Neurieten moet duidelijk zichtbaar zonder aanzienlijke overlapping met elkaar. Een gekleurde doos in figuur 3A vertegenwoordigt een gebied dat wordt ingezoomd om een hogere vergroting in figuur 3B, waarbij neurieten uitstrekken over het rooster van het rooster tonen. Elk raster vierkante bestaat uit een essen koolstof film die de neuronen en...

Neuronale processen bewaren voor ultrastructurele analyse beschrijven we een protocol voor beplating van primaire neuronen van elektronenmicroscopie netten gevolgd door flash-bevriezen, waardoor monsters gesuspendeerd in een laag van glasachtige ijs. Deze monsters kunnen worden onderzocht met een cryo-elektronenmicroscoop om structuren te visualiseren op de nanometer schaal.

Voorbereiding van de primaire neuronen voor het visualiseren neurites in een bevroren gehydrateerd Staat Met behulp van Cryo-electron tomography

Neurites, both dendrites and axons, are neuronal cellular processes that enable the conduction of electrical impulses between neurons. Defining the ...

Het algemene doel van deze procedure is om primaire ratneuronen te kweken op een wijze die geschikt is voor visualisatie middels cryo-elektronenmicroscopie. Dit wordt bereikt door eerst schaaltjes met EM-grids voor te bereiden voor het uitplaten van primaire neuronen. De tweede stap is het prepareren en uitplaten van de primaire neuronen op de EM-grids.Vervolgens wordt de vitrificatie van neuronen op EM-roosters uitgevoerd. De laatste stap is het verzamelen van beelden via cryo-elektronenmicroscopie, gevolgd door nabewerking en annotatie. Uiteindelijk worden cryo-elektronenmicroscopie en tomografie gebruikt om de ultrastructuur van neurieten in een bevroren gehydrateerde staat aan te tonen.Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden is dat deze kan worden gebruikt voor 3D-visualisatie van bevroren gehydrateerde neurieten met nanometerresolutie zonder het gebruik van chemische fixatiemiddelen. Hierdoor wordt de beoordeling van morfologische kenmerken vergemakkelijkt die dichter bij de natuurlijke staat liggen. Begin deze procedure met het controleren van de integriteit van het holy carbon op de gouden EM-roosters.Controleer met een lichtmicroscoop bij een vergroting van ten minste 25 keer of de koolstofgaatjes voor meer dan 98% intact zijn. Gebruik voor het uitplaten van primaire neuronen een bunsenbrander om de EM-grids vlamsteriel te maken en ze gelijktijdig hydrofiel te maken. Breng het grid onmiddellijk met de koolstofzijde naar boven over naar het midden van het glas.Plaats één EM-grid per schaaltje in een schaaltje met glazen bodem en gebruik uitsluitend vooraf gesteriliseerde schaaltjes met glazen bodem. Controleer vervolgens de integriteit van het grid met een lichtmicroscoop, terwijl het EM-grid in het schaaltje met glazen bodem in een weefselkweekkast blijft; breng 250 µL van de juiste coatingstof aan op het centrale glazen gedeelte van de Petrischaal. Zorg er langzaam en zorgvuldig voor dat de betreffende coatingstof het gehele EM-grid bedekt.Dek daarna de Petrischaal af met het deksel en incubeer de specimens gedurende één uur bij kamertemperatuur. Aspireer vervolgens al het polyol-lysine-mengsel uit de schalen met een steriele pipetpunt die is bevestigd aan de vacuümbuis in de zuigkast. Vermijd direct contact met het E EM-rooster.Gebruik vervolgens een instelbare luchtverplaatsingspipet om voorzichtig 250 µL steriele PBS aan te brengen om het EM-grid in het centrale glazen gebied van elke petrischaal volledig te bedekken. Aspireer daarna de PBS uit elke schaal. Herhaal deze procedure vervolgens drie keer.Laat de schaaltjes met EM-roosters 15 minuten drogen in de weefselkweekkap. Controleer dit onder de lichtmicroscoop. Zorg ervoor dat ze volledig droog zijn en dat er geen vochtbellen in het rooster aanwezig zijn.Zuig anders voorzichtig naast het EM-grid om dit extra vocht te verwijderen; het gecoate grid moet onmiddellijk worden gebruikt voor het uitplaten van de neuronen. Bereken bij deze procedure het juiste celvolume per schaaltje om een concentratie van 50.000 cellen per milliliter per schaaltje te bereiken. De maximale applicatiehoeveelheid moet 250 microliters zijn om alleen het centrale glazen gedeelte te vullen, en niet het gehele schaaltje.Incubeer vervolgens de schaaltjes gedurende 30 minuten in een CO2-incubator bij 37 °C om de cellen de kans te geven te herstellen en te hechten. Voeg na 30 minuten langzaam 1,5 mL van het voorverwarmde celmedium toe aan elk schaaltje en vermijd contact met het EM-grid voor hippocampale neuronen. Verschoon het medium de volgende dag en vervang daarna elke twee dagen de helft van het medium gedurende 14 dagen. Bereid bij deze procedure de apparatuur en alle materialen voor het invriezen en opslaan van de gouden EM-grids bij cryogene temperaturen, waartoe behoren een vitrificatieapparaat met een bevochtigingskamer, calciumvrij filterpapier, een pincet met lange platte punten, een gespecialiseerd fijnpuntig pincet voor de vitrificatiemachine, een houder voor vloeibare stikstof, een koelmiddelcontainer en de bewaardoos voor EM-grids.Zet vervolgens het vitrificatieapparaat aan. Stel de luchtvochtigheid in op 100% en de temperatuur op 32 °C. Stel in het optiegedeelte de blokkeringstijd in op nul seconden.Hiermee is handmatig droogdeppen mogelijk via het zijraam van de bevochtigingskamer. Stapel vervolgens drie calciumvrije filterpapieren. Snijd de stapel in stroken van 0,5 centimeter breed en ongeveer twee centimeter lang; buig deze daarna in een hoek van 90 graden, zodat één sectie van het papier 0,5 centimeter bij 0,5 centimeter is.Dit gedeelte wordt gebruikt voor het droogdeppen van het monster. Verwijder het middelste filterpapier en plaats het op een ander calciumvrij filterpapier tot gebruik. Gebruik vervolgens de gespecialiseerde vitrificatiepincet om het EM-rooster voorzichtig uit het schaaltje te pakken.Let op aan welke zijde van het EM-grid de neuronen groeien, aangezien deze positie van belang is voor de volgende stap. Gebruik vervolgens de zwarte schuifsluiting op de pincet om de pincet stevig op het EM-grid te vergrendelen. Plaats de pincet nu in de vitrificatiemachine, zodanig dat de zijde van het EM-grid waarop de neuronen gehecht zijn naar links is gericht en van de cirkelvormige opening aan de zijkant van de vitrificatiemachine af wijst.Trek vervolgens de pincet die het EM-grid vasthoudt terug in de vitrificatiemachine. Plaats daarna de koelmiddelcontainer, gevuld met voldoende LN2 en vloeibaar ethaan, in de juiste houder van de vitrificatiemachine met behulp van het betreffende schermcommando van de vitrificatiemachine. Til de koelkam omhoog met de platte pincet totdat deze gelijkvloers is met de bodem van de bevochtigingskamer.Pak een rand van het filterpapier zodanig vast dat de kortere zijde loodrecht op de pincet staat. Dit vlak komt tijdens het blotten in direct contact met het EM-grid. Voer het filterpapier nu voorzichtig en stabiel in via het zijgat van de bevochtigingskamer. Houd het papier 10 seconden tegen het EM-grid, gooi het papier weg en plunge onmiddellijk.Bevries het monster in vloeibaar ethaan met behulp van de automatisering van de vitrificatiemachine. Breng vervolgens het bevroren gehydrateerde EM-rooster voorzichtig over naar een van de sleuven in de roosteropslag. Dit is een lichtmicroscoopafbeelding van het centrale gebied van een EM-rooster bij een 10-voudige vergroting, waarop primaire neuronen van ratten gedurende twee weken zijn gegroeid.Hier is het ingezoomde beeld van het aqua-gekleurde kader waarin de neuronen en hun neurietuitlopers worden waargenomen. Dit is een elektronenmicrografie van een neuriet die vanuit het neuronlichaam naar buiten steekt bij een vergroting van 4K. Het blauwe kader wordt hier van dichtbij bekeken, waarbij de interne kenmerken van de neurieten duidelijk zichtbaar zijn bij een vergroting van 20 K.Deze video toont een 3D-gereconstrueerde stapel micrografen van een neuriet uit een primaire cultuur van hippocampale neuronen van ratten. Deze is gevisualiseerd met tomografie, gevolgd door de overeenkomstige 3D-kleuraannotatie. Hier is een andere video die een 3D-gereconstrueerde stapel beelden toont van een axon uit een dorsaal wortelganglion van een rat, verzameld met cryo-elektronentomografie, gevolgd door de bijbehorende 3D-kleuraannotatie; tevens wordt hier een montage getoond van vier 2D cryo-EM beelden van een ander axon uit een dorsaal wortelganglion van een rat, genomen bij een vergroting van 20 K.Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u primaire neuronen op elektronenmicroscopierosters prepareert op een wijze die geschikt is voor het visualiseren van deze neuronen in een bevroren gehydrateerde staat met behulp van cryo-elektronentomografie.

preparation-primary-neurons-for-visualizing-neurites-frozen-hydrated

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Source: Schönherr, S., et. al. Combined Optogenetic and Freeze-fracture Replica Immunolabeling to Examine Input-specific Arrangement of Glutamate Receptors in the Mouse Amygdala. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates the immunolabelling of freeze-fractured replicas of mouse brain tissue for electron microscopy. The fractured and coated replicas are digested to expose receptors. Primary and gold-tagged secondary antibodies are added to label specific neuronal membrane receptors. The replica...

Immunolabeling of Neuronal Membrane Proteins in a Freeze-fractured Specimen of Mouse Brain Tissue

We presenteren een protocol voor het gebruik van Cox Golgi-kleuring werkwijze dikke hersenpreparaten, teneinde neuronen met lange dendritische bomen opgenomen in één weefselmonsters zichtbaar. Twee varianten van dit protocol worden ook getoond dat cresyl violet tegenkleuring, en het bevriezen van onbewerkte hersenen voor langdurige opslag omvatten.

Imaging Neuronen binnen Dik Brain af met de Golgi-Cox Method

Hier geven we een eenvoudige, goedkope en tijdbesparende protocol chemisch fixeren primaten hersenweefsel met acroleïne fixatief, waardoor langdurig bewaren die compatibel zijn met pre-inbedding immunohistochemie voor transmissie elektronenmicroscopie is.

De bereiding van niet-menselijke primaten Brain Tissue voor Pre-embedding immunohistochemie en elektronenmicroscopie

Op basis van in vitro lentivirale engineering van neuronale precursoren, hun co-transplantatie in wild-type hersenen en gepaarde morphometrische evaluatie van "test" en "Control" derivaten, maakt deze methode nauwkeurige modellering van in vivo gencontrole van neocorticale neuron morfologie op een eenvoudige en betaalbare manier.

Intraveneuze triculaire transplantatie van engineered neuronale precursoren voor in vivo Neuroarchitecture studies

Hier wordt een protocol gepresenteerd dat de monstervoorbereiding en gegevensverzamelingsstappen beschrijft die nodig zijn in cryo zachte röntgentomografie (SXT) om de ultrastructuur van hele cryo-geconserveerde cellen in beeld te brengen met een resolutie van 25 nm halve toonhoogte.

Een 3D cartografische beschrijving van de cel door Cryo Soft X-ray Tomography

Met behulp van gefocusseerde ionenbundelfrezen om glasvochtlamellen op het rooster te produceren uit bevroren biologische monsters voor cryo-elektronentomografie.

Lamellen bereiden van glasvochtbiologische monsters met behulp van een dual-beam scanning elektronenmicroscoop voor cryo-elektronentomografie

We presenteren een protocol voor lamellenpreparaat van diepgevroren biologische monsters door cryo-gerichte ionenbundelmicromachining voor structurele studies met hoge resolutie van macromoleculen in situ met cryo-elektronentomografie. Het gepresenteerde protocol biedt richtlijnen voor de bereiding van hoogwaardige lamellen met een hoge reproduceerbaarheid voor structurele karakterisering van macromoleculen in de Saccharomyces cerevisiae.

Bereiding en Cryo-FIB microbewerking van Saccharomyces cerevisiae voor Cryo-Elektronen Tomografie

Het doel van dit protocol is om celadhesie en -groei te richten op gerichte gebieden van rasters voor cryo-elektronenmicroscopie. Dit wordt bereikt door een aangroeiwerende laag aan te brengen die wordt opgeblazen in door de gebruiker gespecificeerde patronen, gevolgd door afzetting van extracellulaire matrixeiwitten in de patroongebieden voorafgaand aan het zaaien van cellen.

Micropatterning Transmissie ElektronenMicroscopie Grids naar Direct Cell Positioning binnen Whole-Cell Cryo-Electron Tomography Workflows

Cryo-STEM-tomografie biedt een middel om organellen van intacte cellen te visualiseren zonder inbedding, sectie of andere invasieve preparaten. De verkregen 3D-resolutie ligt momenteel in het bereik van enkele nanometers, met een gezichtsveld van enkele micrometers en een toegankelijke dikte in de orde van grootte van 1 μm.

Visualisatie van organellen in situ door cryo-STEM tomografie

Dit videoprotocol illustreert hoe scanning-transmissie-elektronenmicroscopietomografie van virologische monsters moet worden uitgevoerd. Voor optimale resultaten worden monsters bereid door vries onder hoge druk en daaropvolgende vriessubstitutie.

Scanning transmissie-elektronenmicroscopietomografie in de virologie: 3D-beeldvorming van onder hoge druk ingevroren, vriesgesubstitueerde monsters

Dit protocol standaardiseert cryo-elektrontomografie (cryo-ET) voor dik weefsel door hogedrukbevriezing (HPF) te integreren met de wafelmethode, cryogene focus ion beam (cryo-FIB) lift-out en dosissymmetrische, parallelle acquisitie, waardoor uniform dunne lamellen en gevitrificeerde monsters worden opgeleverd voor reproduceerbare in situ-analyse in de hippocampus van de muis.

Cryo-elektrontomografie workflow voor dik weefsel aangetoond bij de muishippocampus

Leer hoe u primaire ratneuronen voorbereidt voor cryo-elektronentomografie om neurieten in bevroren gehydrateerde toestand te visualiseren. Deze methode behoudt ultrastructuur zonder chemische fixatie.

Voorbereiding van de primaire neuronen voor het visualiseren neurites in een bevroren gehydrateerd Staat Met behulp van Cryo-electron tomography (Video) | JoVE Journal

Voorbereiding van de primaire neuronen voor het visualiseren neurites in een bevroren gehydrateerd Staat Met behulp van Cryo-electron tomography

Meer video's verkennen