Name: MicroRNA In situ Hybridisatie voor formaline gefixeerde nierweefsel (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-30T19:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 21 s
Description: Leer microRNA in situ hybridisatie voor nierweefsel met kleurmetrische detectie. Deze methode lokaliseert en kwantificeert microRNA-expressie in formaline-gefixeerde niersecties voor nierbiologie-onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door de US National Institutes of Health verleent HL082798 en HL111580.

1. Nierweefsel Secties <ol><li> Met formaline gefixeerde (10%) in paraffine ingebedde niersecties gesneden op microscoopglaasjes bij 5 mm dik met een Microm HM 355 S. De objectglaasjes kunnen worden opgeslagen voor meerdere maanden vóór de analyse. </li></ol> 2. Oplossing Voorbereiding <ol><li> Bereid 1 liter 1x PBS in DDH 2 O in een autoclaaf schroefdop fles. Vul een andere fles met 1 L van DDH 2 O. Voeg 1 ml DEPC om elke fles, deksel en schud krachtig. Laat de oplossingen zitten overnacht bij kamertemperatuur te RNAses vernietigen en vervolgens autoclaaf. Voeg 400 ml Tween-20 en 1 l 1X PBS PBS-T maken. </li><li> Bereid proteïnase K-buffer (50 mMTris-HCl, pH 8,0 en 1 mM CaCl2 in DEPC behandeld water). </li><li> Bereid een oplossing van 0,2% glycine in PBS-T. </li></ol> 3. Tissue Voorbereiding <ol><li> Bereid een groot volume hybridisatiebuffer (50-100 ml) bestaande uit 50% formamide, 5x SSC, 0,1% Tween, 9,2mM citroenzuur om een pH van 6, 50 ug / ml heparine en 500 ug / ml gist-RNA DEPC behandeld DDH 2 O. Verdeel het deeg in 1 ml porties en bewaar bij -80 º C. </li><li> Verwijder de paraffine uit het weefsel door 3x wassen in vers xyleen gedurende 5 minuten elk. </li><li> Hydrateren de weefselcoupes door 5 minuten incubaties afnemende concentraties ethanol (100%, 75%, 50% en 25%) in DDH 2 O. </li><li> Behandel de dia&#39;s met voldoende DEPC volledig te bedekken de weefselcoupes (ongeveer 0,4-0,5 ml) gedurende 1 minuut. Zorg ervoor dat de weefsels niet uitdrogen. </li><li> Spoel de glaasjes in DEPC behandeld PBS-T tweemaal gedurende 5 min, het verzamelen van de DEPC met afval voor de juiste afvoer. Alle reagentia moeten worden DEPC behandeld om RNAses elimineren vanaf dit punt. </li><li> Voorverwarmen Proteinase K-buffer en voeg proteinase K om een ​​eindconcentratie van 10 ug / ml. Bedek weefselsecties met proteinase K oplossing en incubeer bij 37 ° C gedurende 5 minuten. </li><li> Snel te verwijderen van de proteinase K oplossing en voeg 0,2% glycine in PBS-T gedurende 30 sec. </li><li> Spoel de objectglaasjes in DEPC behandeld PBS-T tweemaal gedurende 30 seconden elk. </li><li> Fix secties in vers 4% paraformaldehyde gedurende 10 minuten. </li></ol> 4. Hybridisatie <ol><li> Voeg 50 ul hybridisatiebuffer (50% formamide, 5x SSC, 0,1% Tween, 9,2 mM citroenzuur om een ​​pH van 6, 50 ug / ml heparine, 500 ug / ml gist-RNA) per weefselsectie en bedek met RNAse vrij HybriSlips cut net groter dan het weefsel secties. </li><li> Prehybridize secties vochtigheid hybridisatie oven gedurende 2 uur bij hybridisatietemperatuur bepaald voor de 3 &#39;digoxigenine gemerkte probe (gewoonlijk DNA Tm van de probe -21 ° C, (bijvoorbeeld 54 ° C voor miR-382, DNA probe Tm = 75 ° C ), met behulp van weefsel lab doekjes gedrenkt in 50% formamide/50% 5x SSC om de kamer te houden bevochtigd. </li><li> Verdun de miRNA sonde, positieve controle (U6, kleine nucleaire RNA) en negatieve controle (roereisequentie) tot 40 nM in hybridisatiebuffer (75 pl buffer is nodig per sectie). </li><li> Verwarm de sonde in hybridisatiebuffer bij 65 ° C gedurende 5 minuten. </li><li> Verwijder dia&#39;s van hybridisatie oven en verwijder de dekglaasjes en overtollige hybridisatie buffer van prehybridisatie. </li><li> Voeg 75 ul van probe die buffer per weefsel sectie, rechtstreeks aan weefsel. Bedek weefsel met HybriSlips net groot genoeg om het weefsel secties omvatten. </li><li> Keeping diahouder niveau, terug naar hybridisatie oven gedurende incubatie overnacht bij een temperatuur van stap 4.2 (ongeveer 16 uur). </li></ol> 5. Wassing <ol><li> Voeg 200 ul 2x SSC, verwarmd tot de hybridisatie-temperatuur net onder een rand van de dekglaasjes om vrij het dekglaasje van het weefsel. Verwijder het dekglaasje door het kantelen van de dia. </li><li> Was de glaasjes in 200 pi 50% formamide, 50% 2x SSC bij hybridisatietemperatuur 3x 30 min. elk. </li><li> Spoelende dia 5x in PBS-T bij kamertemperatuur gedurende 5 min. elk op rondschudapparaat op lage snelheid. </li></ol> 6. Opsporing <ol><li> Incubeer dia in blokkerende buffer (2% geit of paardenserum, 2 mg / ml BSA in PBS-T) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur op rondschudapparaat op lage snelheid. </li><li> Verdun anti-DIG-AP Fab-fragmenten in het blokkeren van buffer bij 1:100. Voeg 100 ul per sectie weefsel en bedek met HybriSlips gesneden net groot genoeg om de sectie te dekken. </li><li> Incubeer antilichaam in een vochtige kamer bij 4 ° C gedurende de nacht (ongeveer 16 uur). </li><li> Was de dia&#39;s in PBS-T 7x, gedurende 5 minuten elk op orbitale schudder bij lage snelheid. </li><li> Was de dia&#39;s in AP-buffer (100 mM Tris-HCl pH 9,5, 50 mM MgCl2, 100 mM NaCl, 0,1% Tween 20) 3x, gedurende 5 minuten elk. </li><li> Voeg NBT / BCIP oplossing voor AP-buffer (200 μl/10 ml buffer) </li><li> Voeg 400-500 ml verdund NBT / BCIP oplossing voor elke dia volledig te bedekken alle coupes. Ontwikkelen in een donkere, niveau, Humidified kamer voor 4-5 uur. </li></ol> 7. Montage Slides <ol><li> Dehydrateer secties in toenemende concentraties ethanol (25%, 50%, 75%, 100%) gedurende 5 minuten elk. </li><li> Incubeer in xyleen 5x om secties wissen. </li><li> Mount schuift Permount montage medium en &#39;s nachts droog. </li></ol>

<ol><li>Nagalakshmi, V. K., Ren, Q., Pugh, M. M., Valerius, M. T., McMahon, A. P., Yu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dicer+regulates+thedevelopment+of+nephrogenic+and+ureteric+compartments+in+the+mammalian+kidney%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+Int%22%5BJournal%5D)">Dicer regulates thedevelopment of nephrogenic and ureteric compartments in the mammalian kidney.</a> Kidney Int. 79 (3), 317-330 (2011).</li>
<li>Ho, J., Pandey, P., Schatton, T., Sims-Lucas, S., Khalid, M., Frank, M. H., Hartwig, S., Kreidberg, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pro-apoptotic+protein+Bim+is+a+MicroRNA+target+in+kidney+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Soc.+Neph%22%5BJournal%5D)">The pro-apoptotic protein Bim is a MicroRNA target in kidney progenitors.</a> J. Am. Soc. Neph. 22 (6), 1053-1063 (2011).</li>
<li>Tian, Z., Greene, A. S., Pietrusz, J. L., Matus, I. R., Liang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA-target+pairs+in+the+rat+kidney+identified+by+microRNA+microarray%2C+proteomic%2C+and+bioinformaticanalysis%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">MicroRNA-target pairs in the rat kidney identified by microRNA microarray, proteomic, and bioinformaticanalysis.</a> Genome Res. 18 (3), 404-411 (2008).</li>
<li>Mladinov, D., Liu, Y., Mattson, D. L., Liang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs+contribute+to+the+maintenance+of+cell-type-specific+physiological+characteristics%3A+miR-192+targets+Na%2B%2FK%2B-ATPase+%CE%B21%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs contribute to the maintenance of cell-type-specific physiological characteristics: miR-192 targets Na+/K+-ATPase β1.</a> Nucleic Acids Res. 41 (2), 1273-1283 (2013).</li>
<li>Liu, Y., Taylor, N. E., Lu, L., Usa, K., Cowley, A. W., Ferreri, N. R., Yeo, N. C., Liang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Renal+medullary+microRNAs+in+Dahl+salt-sensitive+rats%3A+miR-29b+regulates+several+collagens+and+related+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Hypertension%22%5BJournal%5D)">Renal medullary microRNAs in Dahl salt-sensitive rats: miR-29b regulates several collagens and related genes.</a> Hypertension. 55 (4), 974-982 (2010).</li>
<li>Kato, M., Zhang, J., Wang, M., Lanting, L., Yuan, H., Rossi, J. J., Natarajan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA-192+in+diabetic+kidney+glomeruliand+its+function+in+TGF-b-induced+collagen+expression+via+inhibition+of+E-box+repressors%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">MicroRNA-192 in diabetic kidney glomeruliand its function in TGF-b-induced collagen expression via inhibition of E-box repressors.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104 (4), 3432-3437 (2007).</li>
<li>Krupa, A., Jenkins, R., Luo, D. D., Lewis, A., Phillips, A., Fraser, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+microRNA-192+promotes+fibrogenesis+in+diabetic+nephropathy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Soc.+Neph%22%5BJournal%5D)">Loss of microRNA-192 promotes fibrogenesis in diabetic nephropathy.</a> J. Am. Soc. Neph. 21 (3), 438-447 (2010).</li>
<li>Wang, B., Herman-Edelstein, M., Koh, P., Burns, W., Jandeleit-Dahm, K., Watson, A., Saleem, M., Goodall, G. J., Twigg, S. M., Cooper, M. E., Kantharidis, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((E-cadherin+expression+is+regulated+by+miR-192%2F215+by+a+mechanism+that+is+independent+of+the+profibrotic+effects+of+transforming+growth+factor-%CE%B2%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">E-cadherin expression is regulated by miR-192/215 by a mechanism that is independent of the profibrotic effects of transforming growth factor-β.</a> Diabetes. 59 (7), 1794-1802 (2010).</li>
<li>Kato, M., Arce, L., Wang, M., Putta, S., Lanting, L., Natarajan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microRNA+circuit+mediates+transforming+growth+factor-%CE%B21+autoregulation+in+renal+glomerular+mesangial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+Int%22%5BJournal%5D)">A microRNA circuit mediates transforming growth factor-β1 autoregulation in renal glomerular mesangial cells.</a> Kidney Int. 80 (4), 358-368 (2011).</li>
<li>Gottardo, F., Liu, C. G., Ferracin, M., Calin, G. A., Fassan, M., Bassi, P., Sevignani, C., Byrne, D., Negrini, M., Pagano, F., Gomella, L. G., Croce, C. M., Baffa, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micro-RNA+profiling+in+kidney+and+bladder+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Urol.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Micro-RNA profiling in kidney and bladder cancers.</a> Urol. Oncol. 25 (5), 387-392 (2007).</li>
<li>Juan, D., Alexe, G., Antes, T., Liu, H., Madabhushi, A., Delisi, C., Ganesan, S., Bhanot, G., Liou, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+microRNA+panel+for+clear-cell+kidney+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Urol%22%5BJournal%5D)">Identification of a microRNA panel for clear-cell kidney cancer.</a> Urol. 75 (4), 835-841 (2010).</li>
<li>Xu, X., Kriegel, A. J., Liu, Y., Usa, K., Mladinov, D., Liu, H., Fang, Y., Ding, X., Liang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delayed+ischemic+preconditioning+contributes+to+renal+protection+by+upregulation+of+miR-21%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+Int%22%5BJournal%5D)">Delayed ischemic preconditioning contributes to renal protection by upregulation of miR-21.</a> Kidney Int. 82 (11), 1167-1175 (2012).</li>
<li>Kriegel, A. J., Mladinov, D., Liang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translational+study+of+microRNAs+and+its+application+in+kidney+disease+and+hypertension%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Translational study of microRNAs and its application in kidney disease and hypertension.</a> 122 (10), 439-447 (2012).</li>
<li>Kloosterman, W. P., Wienholds, E., de Bruijn, E., Kauppinen, S., Plasterk, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+detection+of+miRNAs+in+animal+embryos+using+LNA-moidified+oligonucleotide+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">In situ detection of miRNAs in animal embryos using LNA-moidified oligonucleotide probes.</a> Nat. Methods. 3 (1), 27-29 (2006).</li>
<li>Nelson, P. T., Baldwin, D. A., Kloosterman, W. P., Kauppinen, S., Plasterk, R. H., Mourelatos, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RAKE+and+LNA-ISH+reveal+microRNA+expression+and+localization+in+archival+human+brain+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">RAKE and LNA-ISH reveal microRNA expression and localization in archival human brain tissue.</a> RNA. 12 (2), 187-191 (2006).</li>
<li>Obernosterer, G., Martinez, J., Alenius, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Locked+nucleic+acid-based+in+situ+detection+of+microRNAs+in+mouse+tissue+sections%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protocols%22%5BJournal%5D)">Locked nucleic acid-based in situ detection of microRNAs in mouse tissue sections.</a> Nat. Protocols. 2 (6), 1508-1514 (2007).</li>
<li>Kriegel, A. J., Liu, Y., Cohen, B., Usa, K., Liu, Y., Liang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MiR-382+targeting+of+kallikrein+5+contributes+to+renal+inner+medullary+interstitial+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Genomics%22%5BJournal%5D)">MiR-382 targeting of kallikrein 5 contributes to renal inner medullary interstitial fibrosis.</a> Physiol. Genomics. 44 (4), 259-267 (2012).</li>
</ol>

Er is niets te onthullen.

Het doel van dit artikel was om een protocol voor miRNA in situ hybridisatie die goed werkt in formaline gefixeerde nierweefsel beschrijven. Tijdens het werken uit dit protocol een aantal belangrijke bronnen van kleuring artefact zijn geïdentificeerd. Zorgvuldige aandacht voor deze punten kan helpen voorkomen vlekken artefact en de kans op een succesvolle ISH run. Een van de meest vermijdbare oorzaken van vlekken artefact kan optreden wanneer weefselsecties worden gedroogd tijdens l...

MicroRNA zijn klein (ongeveer 22 nucleotiden lang) niet-coderende RNA&#39;s die endogeen wordt geproduceerd. Zij over het algemeen functioneren van eiwit expressie te onderdrukken door middel van translationeel repressie of mRNA degradatie. miRNAs binden aan mRNA doelen met onvolledige complementariteit, waardoor het mogelijk is voor een enkele miRNA aan verschillende doelen te onderdrukken. Begrijpen welke celtypen en structuren te uiten miRNA&#39;s is een belangrijk onderdeel van het begrijpen van de mechanismen waardoor veranderingen in miRNA expressie invloed cellen en weefsels fenotypes. Hoewel methoden zoals miRNA sequencing, qPCR en Northern blotting kan worden gebruikt voor de detectie van miRNAs geheel weefsels staat deze benadering niet mogelijk maken om te bepalen welke specifieke celtype ze uit in een gegeven weefsel. Dissectie van cellulaire en structurele componenten voorafgaand aan de analyse met behulp van deze methoden kan heel moeilijk zijn en het nodig is om een ​​adequate isolatie bereiken omstandigheden kunnen leiden tot alterations in genexpressie of afbraak van RNA&#39;s. microRNA in situ hybridisatie is een methode die wordt gebruikt om microRNA locatie en expressie niveaus visualiseren in weefsels. Deze techniek is bijzonder waardevol in weefsels bestaande uit heterogene structuren, zoals de nieren. MicroRNAs is aangetoond dat een regulerende rol in de ontwikkeling nier 2,3 en fysiologie 4 spelen. microRNA expressie veranderingen hebben ook aangetoond te worden betrokken met nier pathologie zoals fibrose 5-10, diabetische nefropathie 7, niercarcinoom 11,12, en acute nierschade 13. In ons onderzoek hebben wij gevonden dat het optimaliseren van microRNA in situ hybridisatie voor nierweefsel was waardevol voor het bepalen van de exacte locaties van structurele miRNA expressie in zowel gezondheid en ziekte 14. Bepaling van de buisvormige en cellulaire expressie van verschillende microRNAs is belangrijk omdat de regulering van targets kan afhankelijk cellulaire functies zijn. In zieke toestanden is het ook belangrijk om te bepalen hoe veranderingen in miRNA expressie kan beïnvloeden functie. Het doel van de hier beschreven methode was om voort te bouwen op bestaande ISH methodieken ontwikkeld door Kloosterman et al.. 15, andere onderzoekers 16,17, en die voorgesteld door Exiqon 1 en optimaliseren van de methode voor het formaline gefixeerde nierweefsel. We hebben met succes gebruik gemaakt van deze methode om duidelijke regionale verschillen in de renale microRNA miR-382 expressie met eenzijdige ureterobstructie 18 identificeren. Deze benadering kan worden gebruikt met andere weefsels ook, met extra optimalisatie.

<table><tbody><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>70011044</td><td></td></tr><tr><td>Diethyl Pyrocarbonate</td><td>Sigma</td><td>D5758</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>Xylenes</td><td>Sigma</td><td>534056</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Ultra Pure</td><td>200CSPTP</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Life Technologies</td><td>15506-017</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma</td><td>C2536</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>J.T. Baker</td><td>4059-00</td><td></td></tr><tr><td>Citric Acid</td><td>Sigma</td><td>C2404</td><td></td></tr><tr><td>Formamide</td><td>Sigma</td><td>F9037</td><td></td></tr><tr><td>20x SSC Buffer</td><td>Life Technologies</td><td>15557-044</td><td></td></tr><tr><td>Heparin</td><td>SAGENT</td><td>25021-400-30</td><td></td></tr><tr><td>Yeast RNA</td><td>Life Technologies</td><td>AM7118</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma</td><td>M8266-1004</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>J.T. Baker</td><td>4058-01</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Fermentas</td><td>EO0491</td><td></td></tr><tr><td>3&rsquo; DIG- miRNA probe</td><td>Exiqon</td><td>miR dependent-05</td><td></td></tr><tr><td>3&rsquo; DIG- Scrambled miR probe</td><td>Exiqon</td><td>99004-05</td><td></td></tr><tr><td>3&rsquo; DIG- U6 miR probe</td><td>Exiqon</td><td>99002-05</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Digoxigenin-Ab Fab</td><td>Roche</td><td>11093274910</td><td></td></tr><tr><td>NBT/BCIP</td><td>Roche</td><td>11681451001</td><td></td></tr><tr><td>Permount</td><td>Fisher</td><td>SP15-500</td><td></td></tr><tr><td>Coverslips</td><td>Fisher</td><td>Fit to tissue size</td><td></td></tr><tr><td>Microtom HM 355 S</td><td>Thermo Scientific</td><td>23-900-672</td><td></td></tr><tr><td>In-slide Out Hybridization Oven</td><td>Boekel</td><td>241000</td><td></td></tr><tr><td>Aluminum Tray Assembly</td><td>Boekel</td><td>C2403973</td><td></td></tr><tr><td>Stainless Steel Rack Insert</td><td>Boekel</td><td>C2403754</td><td></td></tr></tbody></table>

microrna<em&gt; in situ</em&gt; hybridisatie voor formaline gefixeerde nierweefsel

MicroRNA In situ Hybridization for Formalin Fixed Kidney Tissues

In dit artikel wordt een methode voor de colorimetrische detectie van miRNA in de nier beschrijven we door in situ hybridisatie met digoxigenine gelabeld microRNA probes. Dit protocol, oorspronkelijk ontwikkeld door Kloosterman en collega&#39;s voor een breed gebruik met Exiqon miRNA sondes 1, is aangepast om de uitdagingen die inherent zijn miRNA analyse in nierweefsel overwinnen. Deze omvatten zaken als identificatie structuur en moeilijk om de resterende sonde en antilichaam te verwijderen. Het gebruik van relatief dunne, 5 mm, weefselcoupes toegestaan ​​duidelijke visualisatie van structuren nieren, terwijl een sterke testsignaal werd behouden in cellen. Bovendien werden probeconcentratie en incubatie-omstandigheden geoptimaliseerd om visualisatie van microRNA expressie met lage achtergrond en niet-specifieke signaal te vergemakkelijken. Hier wordt de geoptimaliseerde protocol beschreven voor een eerste weefsel en bereidingsmethodes door de montage van dia aan het einde van de procedure. De basis componegen van dit protocol kan worden aangepast voor toepassing op andere weefsels en celcultuur modellen.

De gebieden van een weefselsectie die uitdrogen tijdens de hybridisaties, incubaties en wasstappen algemeen uiteindelijk donkerder kleuring tijdens de NBT / BCIP ontwikkeling. Figuur 1 toont een gedeelte van een nier doorsnede, waarbij de HybriSlip afgegleden van de rand van het weefsel, waardoor het gedeeltelijk uitgedroogd. Ondanks rehydratie en dekking in de resterende stappen, het signaal in de gedehydrateerde deel is kunstmatig hoog. Het belang van het controleren van h...

Dit artikel beschrijft een in situ hybridisatie protocol geoptimaliseerd voor colorimetrische detectie van microRNA expressie in formaline gefixeerde niersecties.

MicroRNA<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisatie voor formaline gefixeerde nierweefsel

In this article we describe a method for colorimetric detection of miRNA in the kidney through in situ hybridization with digoxigenin tagged microRNA ...

Het algemene doel van het volgende experiment is het lokaliseren en kwantificeren van micro-RNA-expressie in nierweefsels. Dit wordt bereikt door eerst een digoxigenine-gelabelde probe te hybridiseren met een specifiek micro-RNA binnen het nierweefsel. Als tweede stap wordt een antilichaam tegen digoxigenine, dat geconjugeerd is met alkalische fosfatase, geïncubeerd met het weefsel.Vervolgens wordt een N-B-T-B-C-I-P-substraat aan het weefsel toegevoegd om de locatie van het micro RNA te visualiseren door de vorming van een blauwgekleurd product op de plaatsen van de gehybridiseerde micro RNA-sondes; de resultaten tonen aan waar microRNA's tot expressie komen in nierregio's en nefronsegmenten op basis van de hybridisatie van complementaire micro RNA-sondes. Voor deze procedure worden formaline-gefixeerde en in paraffine ingebedde niercoupes gebruikt, die met een dikte van 5 µm op microscopische objectglazen zijn aangebracht. Om de niercoupes voor analyse voor te bereiden, wordt de paraffine eerst uit het weefsel verwijderd door drie wasbeurten in verse xyleen van vijf minuten.Rehydrate de weefselsneden vervolgens door incubaties van vijf minuten in afnemende concentraties ethanol in dubbel gedestilleerd water. Behandel de coupes daarna met voldoende dathyl, percarbonaat of desy om de weefselsneden gedurende één minuut volledig te bedekken. Zorg ervoor dat de weefsels niet uitdrogen.Haal de slides uit de desiccator en spoel ze af in PBST; herhaal dit twee keer gedurende vijf minuten. Zorg ervoor dat de desiccator die afval bevat, wordt verzameld voor correcte verwijdering.Vanaf dit punt moeten alle reagentia dsy worden behandeld. Om RNA's te elimineren, wordt proteinase K toegevoegd aan voorverwarmde proteinase K-buffer tot een eindconcentratie van 10 micrograms per milliliter. Bedek de weefselsneden met de proteinase K-oplossing en incubeer gedurende vijf minuten bij 37 degrees Celsius. Verwijder de proteinase K-oplossing snel en voeg 0,2% glycine in PBST toe gedurende 30 seconden.Spoel de objectglazen twee keer gedurende 30 seconden met PBST. Fixeer tot slot de weefselcoupes gedurende 10 minuten in vers bereide 4% paraformaldehyde.Om met deze procedure te beginnen, voegt u 50 µL hybridisatiebuffer per weefselcoupe toe en bedekt u deze met RNase-vrije hybridisatieslipjes die net iets groter zijn dan de weefselcoupes. Plaats de objectglaasjes in een kamer die bevochtigd is met laboratoriumdoekjes gedrenkt in 50% formamide en 50% 5X SSC. Pre-hybridiseer de weefselcoupes door de bevochtigte kamer gedurende twee uur in een oven te plaatsen bij de hybridisatietemperatuur die is bepaald voor de 3'-digoxigenine gelabelde probe. De hybridisatietemperatuur voor de probe is gewoonlijk de DNA-smelttemperatuur of TM van de probe minus 21 °C.Bijvoorbeeld, de hybridisatietemperatuur voor de mere 3 82-probe is 54 °C omdat de TM 75 °C is. Bereid de micro RNA-probe en de positieve en negatieve controles voor door elk te verdunnen tot 40 nM in hybridisatiebuffer. De positieve controle is het U6 kleine nucleaire RNA en de negatieve controle is een scrambled sequentie.Verwarm de probe en de controles vijf minuten lang op 65 °C. Haal de objectglaasjes uit de hybridisatieoven. Verwijder de hybride slips en het overtollige hybridisatiebuffer uit de prehybridisatie-opstelling.Voeg 75 µL van de probe met buffer direct toe aan elke weefselcoupe. Dek deze af met hybrid-slips die, wederom, net groot genoeg zijn om de weefselcoupes te bedekken. Houd de objectglaashouder waterpas.Plaats de objectglazen terug in de hybridisatieoven op de juiste temperatuur. Incubeer deze gedurende de nacht, ongeveer 16 uur. Zodra de hybridisatie is voltooid, worden de objectglazen uit de hybridisatieoven gehaald.Voeg 200 µL 2X SSC, verhit tot de hybridisatietemperatuur, toe net onder één rand van het dekglas om het dekglas los te maken van het weefsel. Verwijder het dekglas door de objectglas te kantelen. Nadat de dekglasjes zijn verwijderd, worden de objectglazen drie keer gedurende 30 minuten gewassen in 200 µL 50% formamide/2X SSC bij de vastgestelde hybridisatietemperatuur.Spoel de objectglazen vijf keer met PBST bij kamertemperatuur gedurende telkens vijf minuten op een orbitale schudkerf bij lage snelheid. Begin deze procedure door de objectglazen één uur bij kamertemperatuur te incuberen in blokkeringsbuffer op een orbitale schudkerf bij lage snelheid. Voeg na één uur 100 µL anti-dig AP FAB-fragmenten toe aan elke weefselsectie en dek deze af met hybride dekglasjes.Snijd het materiaal net groot genoeg af om de sectie te bedekken. Incubeer de coupes in een bevochtigde kamer bij vier graden Celsius overnight of gedurende ongeveer 16 uur de volgende dag. Was de coupes zeven keer in PBST bij kamertemperatuur, telkens gedurende vijf minuten op een orbital shaker ingesteld op een lage snelheid.Was vervolgens de objectglazen drie keer gedurende vijf minuten per keer in AP-buffer. Bereid de N-B-T-B-C-I-P-ontwikkelingsoplossing voor door 200 µL N-B-T-B-C-I-P-oplossing toe te voegen aan 10 mL AP-buffer. Voeg 400 tot 500 µL van de verdunde N-B-T-B-C-I-P-oplossing toe aan elk objectglas om alle weefselsneden volledig te bedekken.Laat de preparaten vier tot vijf uur bij kamertemperatuur rijpen in een donkere, bevochtigde kamer totdat de cholometrische detectie is voltooid. Dehydrateer de coupes in oplossingen van ethanol met toenemende concentraties gedurende telkens vijf minuten en ontwas de coupes door vijf incubaties in xyleen van telkens vijf minuten. Monteer de coupes tot slot met Permount montagemedium en laat ze een nacht drogen.Het is van cruciaal belang voor het succes van dit in situ hybridisatieprotocol dat de weefselsneden niet uitdrogen. Het linkergedeelte van deze figuur toont een deel van een niersneden waarin de hybrid slip van de rand van het weefsel is afgegleden, waardoor het weefsel gedeeltelijk is uitgedroogd. Ondanks rehydratatie en afdekking in de resterende stappen is het signaal in het uitgedroogde gedeelte kunstmatig hoog in vergelijking met het gedeelte dat bedekt bleef door de hyper slip.De schaalbalk in deze afbeelding vertegenwoordigt 100 micron. Het belang van het optimaliseren van de duur van de N-B-T-B-C-I-P-ontwikkeling wordt in de volgende figuren aangetoond. Paneel A laat zien dat ontwikkelingsperioden van langer dan vier tot vijf uur leiden tot een uitgesproken aspecifieke kleurontwikkeling en verstoorde micro RNA-controlesondes in de weefsels door de gehele nier.Paneel B laat zien dat incubaties langer dan vier tot vijf uur niet leiden tot verdere verbetering van het signaal wanneer nieren worden onderzocht op targets met een hoge abundantie, zoals de U6 small nuclear RNA-controle. Deze figuren, aangepast uit een eerdere studie, bevestigen de toepasbaarheid van deze in situ hybridisatiemethode voor de detectie van micro RNA in nierweefsel. Paneel A toont representatieve beelden van miR-382-expressie verkregen door in situ hybridisatie in niersecties van muizen met of zonder unilaterale ureterobstructie (UUO) en behandeld met ofwel anti-miR-382 of anti-scrambled. UUO induceerde een toename van miR-382-expressie, zoals blijkt uit de donkerdere kleuring in het UUO plus anti-scrambled weefsel vergeleken met het sham plus anti-scrambled weefsel.Deze toename werd geblokkeerd door behandeling met anti-ME 3 82. De grafieken in paneel B tonen de expressie van mere 3 82 bij sham-behandelde muizen plus muizen behandeld met antis scrambled, uitgedrukt als percentage van de gemiddelde geïntegreerde optische dichtheid. Als maat voor de pixelintensiteit is waargenomen dat UUO een significante toename van de mere 3 82-expressie induceert in de buitenste en binnenste medulla, en dat anti-ME 3 82 dit blokkeert.Deze toename kan volledig worden gevisualiseerd en gemeten via micro-RNA in situ hybridisatie. Deze resultaten zijn tevens consistent met resultaten van qPCR die hier niet worden getoond, wat aangeeft dat het gebruik van in situ hybridisatie voor het detecteren van miR-382-expressie in gefixeerde nieren gevoelig genoeg is om kwantificeerbare resultaten te leveren die de op qPCR gebaseerde expressieanalyse weerspiegelen. Bovendien maakt in situ hybridisatie de meting van duidelijke regionale verschillen in micro-RNA-expressie binnen de nier mogelijk.

microrna-in-situ-hybridization-for-formalin-fixed-kidney-tissues

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Hele Mount<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisatie van E8.5 aan E11.5 muis embryo&#39;s

We beschrijven hier een efficiënte high...

Een High Throughput In situ Hybridisatie Methode om mRNA expressie patronen karakteriseren in de Fetal Mouse lagere urogenitale tractus

Hier beschrijven we een vereenvoudigd protocol voor microRNA (miRNA) expressieanalyses in gearchiveerde, formaline-gefixeerde, paraffine-ingeslagen (FFPE) of vers bevroren prostaatkanker (PCa) klinisch weefsel met behulp van kwantitatieve real-time PCR (RT-PCR) en in situ hybridisatie (ISH).

miRNA expressie analyses bij prostaatkanker Klinische Tissues

Hier presenteren we een protocol om miRNA-expressie in monsters van borstkankerpatiënten te detecteren met behulp van miRNA in situ hybridisatie.

Clinicopathologische Analyse van miRNA expressie in Breast Cancer weefsels met behulp van miRNA<em&gt; In Situ</em&gt; hybridisatie

Micro-RNAs (miRNAs) zijn korte en zeer homologe RNA-sequenties, post-transcriptional regulatoren van messenger RNAs (mRNAs) bijeenkomen. Huidige miRNA detectiemethoden verschillen in gevoeligheid en specificiteit. We beschrijven een protocol dat in situ hybridisatie en immunokleuring voor gelijktijdige detectie van miRNA en eiwit moleculen op muis hart weefselsecties combineert.

Weefsel-specifieke miRNA expressie profilering in muis hart secties gebruiken In Situ hybridisatie

We beschrijven een protocol voor lasermicrodissectie van subsegmenten van de menselijke nier, waaronder de glomerulus, proximale tubulus, dikke opgaande ledemaat, het verzamelen van kanaal en interstitium. Het RNA wordt vervolgens geïsoleerd uit de verkregen compartimenten en RNA-sequencing wordt uitgevoerd om wijzigingen in de transcriptomische handtekening binnen elk subsegment te bepalen.

Toepassing van lasermicrodissectie om regionale transcriptomics in menselijk nierweefsel te ontdekken

Dit artikel presenteert een protocol voor het detecteren van microRNA-expressie in de nieren van een muismodel met acuut nierletsel met behulp van kwantitatieve real-time reverse-transcriptie polymerasekettingreactie. Dit protocol legt de nadruk op een ischemisch nierletselmuismodel en de zorgvuldige extractie van microRNA-monsters.

Een kwantitatieve detectiemethode voor microRNA's in de nier van een ischemisch nierletsel muismodel

We beschrijven een methode voor het evalueren van de microRNA-expressie in de nieren van muizen met eenzijdige ureterale obstructie (UUO) door kwantitatieve reverse-transcriptie polymerase kettingreactie. Dit protocol is geschikt voor het bestuderen van niermicroRNA expressieprofielen bij muizen met UUO en in de context van andere pathologische aandoeningen.

Kwantitatieve real-time PCR-evaluatie van microRNA-expressies in muisnier met eenzijdige ureterale obstructie

microRNA's zijn betrokken bij de pathogenese van IgA-nefropathie. We hebben een betrouwbare methode ontwikkeld voor het detecteren van microRNA-expressieniveaus in de nieren van een IgA-nefropathiemuismodel (HIGA-muizen). Deze nieuwe methode zal het gemakkelijker maken om te controleren op betrokkenheid van miRNA's bij IgA-nefropathie.

Detectie van microRNA-expressie in de nieren van immunoglobuline A nefropathische muizen

Hier leveren we exogene kunstmatig gesynthetiseerde miRNA-nabootsingen aan de nier via staartaderinjectie van een niet-virale vector en polyethylenimine nanodeeltjes in verschillende nierziektemuismodellen. Dit leidde tot significante overexpressie van doelmiRNA in de nier, wat resulteerde in geremde progressie van nierziekte in verschillende muismodellen.

Levering van exogene kunstmatig gesynthetiseerde miRNA-nabootsing aan de nier met behulp van polyethylenimine nanodeeltjes in verschillende nierziektemuismodellen

Het protocol beschrijft een tandem-immunofluorescentiehybridisatietest met in formaline gefixeerd in paraffine ingebed weefsel om microRNA en gemultiplexte eiwitten tegelijkertijd te detecteren en te kwantificeren.

MicroRNA-amplificatie en -herkenning door middel van locked-nucleic-acid in situ hybridisatie als een nieuwe detectie- en kwantificeringsmethode

Leer microRNA in situ hybridisatie voor nierweefsel met kleurmetrische detectie. Deze methode lokaliseert en kwantificeert microRNA-expressie in formaline-gefixeerde niersecties voor nierbiologie-onderzoek.

MicroRNA

Meer video's verkennen