Het kweken en onderhouden

Het algemene doel van deze procedure is het isoleren van C. difficile uit fecale monsters om C. difficile te kweken voor de bereiding van glycerolstocks voor langdurige bewaring, en het voorbereiden en tellen van sporestocks voor diverse downstream-toepassingen. Dit wordt bereikt door C. difficile eerst te isoleren uit ontlastingsmonsters door uitplaten op selectief medium. De tweede stap is het kweken van C. difficile in vloeibaar medium en het in stand houden van langdurige C. difficile-stocks in glycerol.

Vervolgens wordt C difficile uit bevroren glycerolstocks gehaald en uitgezaaid op agarplaten. In de laatste stap worden C difficile sporestocks klaargemaakt en uiteindelijk geteld door deze protocollen te volgen. C difficile kan op diverse media worden gekweekt om de identiteit te verifiëren en te bevestigen, en om succesvol te worden gecultiveerd en onderhouden.

Deze glycerolstocks en culturen kunnen verder worden gebruikt in talrijke downstream-toepassingen, waaronder dierstudies en aanvullende moleculair-biologische studies. Het belangrijkste voordeel van het gebruik van een vinyl anaerobe kamer voor het kweken van c difficile ten opzichte van andere methoden, zoals het gebruik van kaarsglazen, is dat een strikt anaerobe omgeving kan worden gehandhaafd, waardoor een consistente en betrouwbare groei van c difficile mogelijk is. Over het algemeen kunnen mensen die nieuw zijn met deze technieken problemen ondervinden door een gebrek aan behendigheid binnen de kamer vanwege de handschoenen, en ook vanwege de kritische noodzaak om hun experimenten vooraf zorgvuldig te plannen.

Deze procedures worden in het begin gedemonstreerd door een technicus uit mijn laboratorium, Jose Suarez. Deze procedure kan onder aerobe omstandigheden worden uitgevoerd. Weeg eerst het ontlastingmonster.

Dit is noodzakelijk voor het tellen van c difficile in de ontlasting. Resuspendeer vervolgens het ontlastingsmonster in één XPBS en vortex om er zeker van te zijn dat het ontlastingsmonster volledig is geresuspendeerd. Maak daarna seriële verdunningen van het geresuspendeerde ontlastingsmonster in één XPBS voor de verdere passende isolatie of telling van colony forming units of CFU per gram ontlasting.

Voer de procedure onder anaerobe omstandigheden uit om ervoor te zorgen dat vegetatieve cellen van C difficile niet aan zuurstof worden blootgesteld. De anaerobe kamer die in dit experiment wordt gebruikt, wordt op 37 graden Celsius gehouden. Gebruik hierbij aseptische technieken.

Breng 100 µL van elke seriële verdunning aan op Toro collate oxetaan, cyclo Seine, fructose agar of T-C-C-F-A platen. Deze platen zijn gedurende ten minste één tot twee uur voorbehandeld in de anaerobe kamer om de verwijdering van residuele zuurstof te garanderen. Dit dient om kolonies te isoleren voor nauwkeurige enumeratie of voor andere downstream toepassingen.

Gebruik een steriele entlus om de aangebrachte cultuur gelijkmatig over het oppervlak van de T-C-C-F-A plaat uit te strijken. Incubeer de platen anaeroob gedurende 48 uur bij 37 °C. Identificeer c difficile-kolonies op basis van hun platte, onregelmatige matte glasachtige verschijning om te garanderen dat vegetatieve c difficile niet zijn gedood door blootstelling aan zuurstof.

Platen voor het isoleren van kolonies voor downstream-applicaties moeten te allen tijde in de anaerobe kamer worden bewaard. Voor de enumeratie van kolonies kunnen de platen uit de anaerobe kamer worden gehaald. Houd er rekening mee dat zodra een plaat uit de kamer wordt gehaald, vegetatieve c difficile wordt blootgesteld aan zuurstof en zal afsterven.

Deze C difficile-koloniën kunnen niet worden gered, zelfs niet als de plaat wordt teruggeplaatst in de kamer. Tel de C difficile-koloniën van elke verdunning en bereken het aantal CFU per gram fecesmonster om c difficile te kweken en glycerolstocks van c difficile te maken. Gebruik een steriele entlus om een individuele kolonie op te pikken en uit te strijken op een pre-reduced brain heart infusion.

Strijk individuele kolonies en kwadranten uit op een gistextract-gesupplementeerde of BHIS-agarplaat, gesupplementeerd met 0,03% cysteine, waarbij voor elk kwadrant een nieuwe steriele entlus wordt gebruikt. Incubeer de platen anaeroob bij 37 °C gedurende 16 tot 24 uur. Zodra er geïsoleerde kolonies op de BHIS-agarplaten verschijnen, wordt een individuele geïsoleerde kolonie geselecteerd en resuspendeert in 10 milliliter vooraf gereduceerd vloeibaar BHIS-medium, gesupplementeerd met 0,03% L-cysteine, en gedurende één nacht geïncubeerd.

Anaeroob bij 37 °C of totdat de cultuur troebel wordt. Voeg de volgende dag 333 µL 50% glycerol en 666 µL van de C. difficile-cultuur toe aan een cryogene buis van 1,8 mL. Sluit de cryogene buis stevig af en meng deze om een voorraad van de geïsoleerde stam in 15% glycerol te creëren.

Verwijder de stock onmiddellijk uit de anaerobe kamer en plaats deze in een vriezer van -80 °C voor langetermijnbewaring. Om met deze procedure te beginnen, haalt u de bevroren glycerolstock van c difficile uit de vriezer van -80 °C. Om ontdooiing te voorkomen.

Plaats de bevroren glycerolstock onmiddellijk in een koelrek dat vóór gebruik is bewaard bij -80 °C. Breng de bevroren glycerolstock in het koelrek naar de anaerobe kamer met behulp van aseptische techniek en een steriele inoculatielus. Plaats een kleine hoeveelheid van de stock op de plaat en strijk deze uit over één kwadrant van de plaat.

Draai de plaat 90 graden en strijk met een nieuwe steriele inoculatielus over het tweede kwadrant. Herhaal dit voor het derde en vierde kwadrant om de isolatie van individuele kolonies te waarborgen. Verwijder onmiddellijk de bevroren glycerolstock uit de anaerobe kamer en plaats deze terug in de vriezer van -80 °C.

Incubeer de plaat anaeroob gedurende de nacht bij 37 °C om sporen uit de c. difficile-cultuur te zuiveren. Breng stammen uit een bevroren glycerolstock over op vooraf gereduceerde BHIS-platen. Volg hierbij de procedure zoals aangetoond in het vorige segment.

Incubeer anaeroob overnacht bij 37 °C en streken de volgende dag individuele kolonies uit op verschillende gereduceerde 70 30 platen. Incubeer anaeroob bij 37 °C gedurende 24 tot 48 uur.

Zodra de sporen zijn gevormd, worden de platen uit de anaerobe kamer gehaald. Schraap de platen met een steriele entlus en resuspendeer de cellen in 10 milliliters steriele one XPBS. Gooi de platen weg en pelletteer de cellen bij 3000 G gedurende 15 minuten.

Verwijder het supernatant, voeg één milliliter 1 XPBS-resuspensie toe, resuspendeer en pelletteer opnieuw op deze wijze. Was de cellen tweemaal in PBS en incubeer ze gedurende de nacht bij vier graden Celsius om de lysis van vegetatieve cellen en moedercellen op de volgende dag te vergemakkelijken; incubeer vervolgens bij 70 graden Celsius gedurende 20 minuten om eventuele resterende vegetatieve cellen te doden. Om het aantal CFU per milliliter te bepalen, wordt elke sporenpreparaat serieel verdund in 1 XPBS en geplaatst op pre-reduced BHIS plus 0,1% Sodium Toro collate; incubeer de platen bij 37 graden Celsius gedurende minimaal 24 uur voordat de koloniën worden geteld.

Sporen kunnen worden bewaard in één XPBS, bij kamertemperatuur voor kortstondige bewaring of bij vier graden Celsius voor langdurige bewaring. A. Een voorbeeld van c difficile gekweekt op BHIS en Columbia anaerobe schapenbloedagarmedia is hier te zien.

C difficile vormt onregelmatige kolonies die plat zijn en een matglasachtig uiterlijk hebben dat op beide media duidelijk zichtbaar is. Paneel A toont een erythromycine-gevoelig klinisch isolaat c difficile 630 E dat gedurende 24 uur is gekweekt op BHIS-agar, een verrijkt niet-selectief medium. Bij 37 °C zien de kolonies op Columbia anaerobe schapenbloedagar, getoond in paneel B, er onder wit licht vergelijkbaar uit als die welke op BHIS zijn gekweekt.

Het gebruik van dit medium maakt echter ook de detectie mogelijk van de groenachtige of citruskleurige fluorescentie die C difficile vertoont onder ultraviolet licht met een lange golflengte, zoals getoond in paneel C na het volgen van deze procedure. Andere methoden, zoals groeicurves in vloeibaar medium, DNA- en RNA-isolatie van koloniën, PCR en andere moleculaire biologische technieken en manipulaties geschikt voor C difficile, evenals het gebruik van C difficile-sporen voor dierstudies, kunnen worden uitgevoerd om aanvullende moleculair biologische vragen te beantwoorden. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht moeten hebben in het isoleren, kweken en onderhouden van C difficile vegetatieve cellen en sporen binnen een anaerobe omgeving.

Vergeet niet dat c difficile een menselijke en dierlijke pathogeen is die gastro-intestinale ziekten kan veroorzaken. Experimenten met c difficile moeten worden uitgevoerd onder passende biosafety level twee-omstandigheden.