Name: Studeren Interacties van Staphylococcus aureus Met Neutrofielen door flowcytometrie en Time Lapse Microscopie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-07-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 40 s
Description: Leer hoe Staphylococcus aureus PSM-toxinen menselijke neutrofielen activeren met flowcytometrie en fluorescentiemicroscopie. Deze methode toont bacteriële fagocytose en calciumflux in immuuncellen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<p class="jove_content"&gt; RN werd gedeeltelijk gefinancierd door een Marie Curie-Europese Re-integratie Grants (ERG) uit zevende kaderprogramma van de Europese Gemeenschap, projectnummer 268324.</p&gt;

1. Isolatie van PMN&#39;s uit menselijk bloed door dichtheidscentrifugeren <ol><li> Teken 5 9 ml tubes van heparine veneuze bloed. </li><li> Bereid dual layer Ficoll gradiënten (4 gradiënten van 5 buisjes bloed) als volgt: Giet 12 ml van een dichtheid van 1,119 g / ml Ficoll-oplossing in een 50 ml buis en voorzichtig laag 10 ml met een dichtheid 1,077 g / ml Ficoll-oplossing geplaatst. </li><li> Verdun het bloed met een gelijk volume PBS. </li><li> Layer het verdunde bloed zorgvuldig op de dual layer Ficoll gradiënt; 20-25 ml per gradiënt. </li><li> Centrifugeer 20 minuten bij 396 xg in een swingende emmer rotor, 22 ° C zonder remmen. </li><li> Bereid koud RPMI bevattende 0,05% menselijk serumalbumine (RPMI-HSA). Ook bereiden 9 ml steriel gedemineraliseerd H 2 O. Pre-cool zowel de RPMI en H 2 O op ijs. </li><li> Zuig de bovenste laag met Ficoll plasma (geel gekleurde) en PBMC en de tweede laag van Ficoll (witte kleur) met behulp van een vacuümpomp (zet een steriele pipet opde pipet). </li><li> Verzamel de PMN in 50 ml buizen met behulp van een klein plastic pipet (1 tube voor de PMN fracties van elk 2 hellingen), en leg ze op ijs. </li><li> Voeg koud RPMI-HSA tot een totaal volume van 50 ml en centrifugeer gedurende 10 min bij 249 xg bij 4 ° C. </li><li> Verwijder het supernatant met behulp van een vacuümpomp en de pellet voorzichtig vortex (erytrocyten en PMNs). </li><li> Voeg 9 ml steriel gedemineraliseerd H 2 O en start de timer. Stop de hyper osmotische shock na 30 seconden precies, door het toevoegen van 1 ml 10 keer geconcentreerd PBS. Opmerking: de 30 seconden zijn zeer kritisch. </li><li> Voeg koud RPMI-HSA tot een totaal volume van 50 ml en centrifugeer gedurende 10 min bij 249 xg bij 4 ° C. </li><li> Verwijder het supernatant met behulp van een vacuümpomp en verzamel de PMN pellet in 1 tube met een bepaald volume (1-2 ml) RPMI-HSA. </li><li> Bepaal het aantal cellen en de concentratie aan te passen aan 1,10 7 cellen / ml. Afhankelijk van de donor, de opbrengst van geïsoleerde PMN&#39;s zijn betwenl 5 x 10 6 en 3 x 10 7 PMN van elke 9 ml buisje bloed </li></ol> 2. Flowcytometrische Assay voor het beoordelen van calcium mobilisatie in Human PMN <ol><li> Load cellen (5 x 10 6 cellen / ml) met 2 uM Fluo-3-AM in RPMI-HSA en incubeer gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur langzaam schommelen, met bijvoorbeeld een rocking platform shaker, beschermd tegen licht. </li><li> Bereid intussen een seriële verdunning (bijv. 3-voudig) van de stimulus 10x eindconcentratie. PSMα3 wordt gebruikt in dit protocol, maar elke GPCR prikkel die werkt op neutrofielen geschikt is. </li><li> Bereid 10x geconcentreerde inhibitor van de receptor in RPMI-HSA. Wanneer de remmer werkt op de stimulus (bijvoorbeeld HDL op PSMα3) pre-incubeer 25 gl stimulus met een gelijk volume van remmer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Was de cellen door toevoeging van 10 ml RPMI-HSA en centrifugeer 249 xg bij kamertemperatuur. Resuspendeer cellen 5 x10 6 cellen / ml. </li><li> Vlak voor het experiment Verdun de cellen 2x10 6 cellen / ml in RPMI-HSA en voeg 200 ul FACS cellen per buisje. Verdunde PMN zijn erg kwetsbaar. Houden ze te lang bij deze concentratie zal leiden tot automatische activering; hetzelfde geldt voor heftig schudden of pipetteren. </li><li> Bevestig de buis naar de flowcytometer, wacht 3 sec en start acquisitie. Na een bepaalde periode (bv. 8 sec), opstijgen van de buis en snel voeg 50 ul stimulans voor het monster. Onmiddellijk opnieuw bevestigen van de buis op het monster houder en verder de overname. </li><li> Begin met de laagste en eindigen met de hoogste concentratie van de stimulus. Regelmatig wassen van de flowcytometer naald na elke run met RPMI-HSA. </li><li> Analyseren van gegevens met flowcytometrie-analyse software. Vergelijk de gemiddelde fluorescentiesignaal vóór toevoeging van de stimulus die na toevoeging van de stimulus en gebruik de positieve en negatieve controles voor het berekenen van de aczendvermogen kracht voor elke verdunning gemeten. </li></ol> Ook wanneer de remmer werkt op de receptor pre-incuberen van de cellen met de remmer. 3. Fluorescentie microscopie Analyse van bacteriën GFP expressie na Fagocytose door PMN <ol><li> Groeien S. aureus stammen die een reporter construct van rente over nacht in bouillon (met antibiotica wanneer dat nodig is om de reporter plasmide te behouden). In dit geval stam MW2 met een PSMα GFP reporter construct wordt gebruikt 10, gekweekt in een 50 ml plastic buis met 5 ml LB-kweekmedium. </li><li> Om alle GFP uit O / N uitdrukking te verwijderen, verdunnen de culturen om OD 660 0.01 en groeien tot OD 660 0.1. Redilute deze cultuur 1:30, en de groei te volgen totdat de cultuur een OD 660 van 0,1 bereikt. Verzamel de bacteriën door centrifugeren en een keer wassen in DPBS. Resuspendeer in 1:10 van het oorspronkelijke volume tot een OD 660 van 1,0 of r vindengrondig worden 5.10 8 CFU / ml. </li><li> Meng de bacteriën (1,10 7 / ml) met vers geïsoleerde PMN (1,10 6 / ml) in RPMI-HSA (10:1) in een 1,5 ml microbuisjes en voeg samengevoegd menselijk serum tot een eindconcentratie van 10%. Schudden op een schudplateau gedurende 10 minuten bij 37 ° C te stimuleren fagocytose. Verdun de PMN&#39;s geladen met bacteriën tot 5.10 5 PMN / ml en pipet 250 ul in een put van een 8 goed chambered dekglaasje. </li><li> Beeld de PMNs met bacteriën op een microscoop. Een omgekeerde microscoop uitgerust met een 40X/0.85 NA doelstelling werkt en worden ingekapseld in een donkere omgeving kamer naar de omgeving stabiel te houden op 37 ° C. Afbeeldingen ophalen van een aantal vooraf ingestelde posities met de camera elke 5-10 min in zowel helderveld en GFP kanaal GFP productie in tijd te volgen. </li></ol>

<ol><li>Rigby, K. M., DeLeo, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophils+in+innate+host+defense+against+Staphylococcus+aureus+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Semin.+Immunopathol%22%5BJournal%5D)">Neutrophils in innate host defense against Staphylococcus aureus infections.</a> Semin. Immunopathol. 34, 237-259 (2012).</li>
<li>Voyich, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+into+Mechanisms+Used+by+Staphylococcus+aureus+to+Avoid+Destruction+by+Human+Neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Insights into Mechanisms Used by Staphylococcus aureus to Avoid Destruction by Human Neutrophils.</a> The Journal of Immunology. 175, 3907-3919 (2005).</li>
<li>Kobayashi, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+neutrophil+destruction+following+phagocytosis+of+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Innate+Immun%22%5BJournal%5D)">Rapid neutrophil destruction following phagocytosis of Staphylococcus aureus.</a> J. Innate Immun. 2, 560-575 (2010).</li>
<li>DeLeo, F. R., Otto, M., Kreiswirth, B. N., Chambers, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Community-associated+meticillin-resistant+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet%22%5BJournal%5D)">Community-associated meticillin-resistant Staphylococcus aureus.</a> The Lancet. 375, 1557(2010).</li>
<li>David, M. Z., Daum, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Community-Associated+Methicillin-Resistant+Staphylococcus+aureus%3A+Epidemiology+and+Clinical+Consequences+of+an+Emerging+Epidemic%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Microbiology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Community-Associated Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus: Epidemiology and Clinical Consequences of an Emerging Epidemic.</a> Clinical Microbiology Reviews. 23, 616-687 (2010).</li>
<li>Kretschmer, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Formyl+Peptide+Receptor+2+Senses+Highly+Pathogenic+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+%26+Microbe%22%5BJournal%5D)">Human Formyl Peptide Receptor 2 Senses Highly Pathogenic Staphylococcus aureus.</a> Cell Host & Microbe. 7, 463(2010).</li>
<li>Prat, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+homolog+of+formyl+peptide+receptor-like+1+%28FPRL1%29+inhibitor+from+Staphylococcus+aureus+%28FPRL1+inhibitory+protein%29+that+inhibits+FPRL1+and+FPR%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">A homolog of formyl peptide receptor-like 1 (FPRL1) inhibitor from Staphylococcus aureus (FPRL1 inhibitory protein) that inhibits FPRL1 and FPR.</a> J. Immunol. 183, 6569-6578 (2009).</li>
<li>Prat, C., Bestebroer, J., de Haas, C. J. C., van Strijp, J. A. G., van Kessel, K. P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+New+Staphylococcal+Anti-Inflammatory+Protein+That+Antagonizes+the+Formyl+Peptide+Receptor-Like+1%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">A New Staphylococcal Anti-Inflammatory Protein That Antagonizes the Formyl Peptide Receptor-Like 1.</a> The Journal of Immunology. 177, 8017-8026 (2006).</li>
<li>de Haas, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemotaxis+inhibitory+protein+of+Staphylococcus+aureus%2C+a+bacterial+antiinflammatory+agent%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Chemotaxis inhibitory protein of Staphylococcus aureus, a bacterial antiinflammatory agent.</a> The Journal of Experimental Medicine. 199, 687-695 (2004).</li>
<li>Surewaard, B. G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inactivation+of+Staphylococcal+Phenol+Soluble+Modulins+by+Serum+Lipoprotein+Particles%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Inactivation of Staphylococcal Phenol Soluble Modulins by Serum Lipoprotein Particles.</a> PLoS Pathog. 8, e1002606(2012).</li>
<li>Kubica, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Potential+New+Pathway+for+Staphylococcus+aureus+Dissemination%3A+The+Silent+Survival+of+S.+aureus+Phagocytosed+by+Human+Monocyte-Derived+Macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">A Potential New Pathway for Staphylococcus aureus Dissemination: The Silent Survival of S. aureus Phagocytosed by Human Monocyte-Derived Macrophages.</a> PLoS ONE. 3, e1409(2008).</li>
<li>Surewaard, B. G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staphylococcal+alpha-phenol+soluble+modulins+contribute+to+neutrophil+lysis+after+phagocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Staphylococcal alpha-phenol soluble modulins contribute to neutrophil lysis after phagocytosis.</a> Cellular Microbiology. , In Press (2013).</li>
<li>Queck, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAIII-Independent+Target+Gene+Control+by+the+agr+Quorum-Sensing+System%3A+Insight+into+the+Evolution+of+Virulence+Regulation+in+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">RNAIII-Independent Target Gene Control by the agr Quorum-Sensing System: Insight into the Evolution of Virulence Regulation in Staphylococcus aureus.</a> Molecular Cell. 32, 150(2008).</li>
<li>Baban, C. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioluminescent+Bacterial+Imaging+In+Vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Bioluminescent Bacterial Imaging In Vivo.</a> J. Vis. Exp. (69), e4318(2012).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen.

In de hier beschreven werkwijzen aantal stappen zeer kritisch. We zullen deze hier benadrukken. Voor de isolatie van neutrofielen door dichtheidsgradiënt centrifugatie is het belangrijk om de lagen te verstoren tijdens of na de centrifugatiestappen. Wanneer opzuigen de neutrofielen met een plastic pipet, zorg ervoor dat niet aan de ballon te knijpen, terwijl in de laag van cellen, zal als het uitwerpen vloeistof de lagen te verstoren. Ook visueel de pellet van neutrofielen na de osmotische s...

Neutrofielen (PMN&#39;s) zijn professionele fagocyten die een belangrijke rol spelen bij de aangeboren immuunrespons tegen Staphylococcus aureus 1. De voortdurende strijd tussen gastheer en microbe heeft geleid tot een wapenwedloop van beide. Onlangs, community-geassocieerde (CA) stammen van meticilline resistente S. aureus (MRSA) naar voren zijn gekomen die lijken erg efficiënt te zijn in het omzeilen van neutrofielen doden 2,3. Overmatige fenol oplosbaar modulin (PSMs) productie van CA-MRSA is geassocieerd met hogere virulentie 4,5. Menselijke neutrofielen kunnen deze PSMs herkennen via FPR2 die leiden tot activering van deze G-eiwit gekoppelde receptor 6. Een van de vroegste gebeurtenissen is de mobilisatie van intracellulaire opslagplaatsen van calcium (Ca2 +). Ca 2 + fungeert als een tweede boodschapper voor verschillende effectorfuncties van PMNs waaronder degranulatie en fagocytose 7. Daarom Ca 2 + is een zeer gevoelige indicator van defunctionele capaciteit van PSMs aan PMN&#39;s te activeren. Om de effecten van PSMs op neutrofielen bestuderen, zijn verse neutrofielen geïsoleerd en geladen met een kleurstof die fluoresceert bij de mobilisatie van calcium. In een flowcytometrie experiment kan deze snelle mobilisatie worden gemeten. Met deze methode is het mogelijk om het directe effect van toxische en andere componenten op neutrofielen bestuderen en bepalen de laagste concentratie waarbij deze actief zijn. Voor ons, het is een zeer nuttig instrument om het effect van vele eiwitten geproduceerd door S. studeren aureus betrokken bij immuun ontduiking, zoals FPR2 remmend eiwit (FLIPR) 8, FLIPR-achtige 7, en Chemotaxis remmend eiwit van Staphylococcus aureus (CHIPS) 9. Al deze eiwitten aangetoond dat het calcium mobilisatie neutrofielen remt door binding aan de receptor herkennen van de agonist. Onlangs heeft onze groep beschreven die PSMs functioneel worden geremd door serum lipoproteïnen 10 &lt;/ Sup&gt;. Deze lipoproteïnen zijn overvloedig aanwezig in het bloed en menselijk weefsel, wat aangeeft dat PSMs oefenen hun functie voornamelijk in de intracellulaire omgeving. De beschikbaarheid van calcium mobilisatie assay toegestaan ​​om het effect van serum lipoproteïnen nauwkeurig te meten bij activering van neutrofielen door PSMs, aangegeven door de aanzienlijke remming door zeer lage concentraties serum. Aangezien de PSMs functioneel geremd door serum, veronderstelden we dat er een belangrijke functie voor PSMs als intracellulaire toxines. We hebben daarom getracht de rol van PSMs na fagocytose bepalen. Om de expressie van de PSMs in de intercellulaire ruimte te onderzoeken, hebben we reporter fusies van de promoter van het operon psmα GFP geconstrueerd. Wanneer deze reporter stammen van S. aureus werden gefagocyteerd door neutrofielen, werd de inductie van expressie waarneembaar met behulp van fluorescentie microscopie 10. Uiteraard is deze technique maakt het onderzoek mogelijk van de expressie van een groot aantal genen in S. aureus of andere ziekteverwekkers na fagocytose. Aangezien voor S. aureus overleven in de intercellulaire niche is zeer belangrijk om het aangeboren immuunsysteem 11 10 12 overwinnen, het bestuderen van de rol van genen geactiveerd in deze niche is zeer relevant voor het begrijpen van de virulentie.

<table><tbody><tr><td>Fluo-3, AM</td><td>Molecular Probes / Life Technologies</td><td>F-1241</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-Paque</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5442-03</td><td>dichtheid 1,077 g/ml</td></tr><tr><td>Histopaque</td><td>Sigma</td><td>11191</td><td>dichtheid 1,119 g/ml</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Gibco, Life Technologies</td><td>52400-025</td><td>bevat 25 mM HEPES en L-glutamine</td></tr><tr><td>Leica TCS SP5 microscope</td><td>Leica Microsystems, The Netherlands</td><td>TCS SP5</td><td>objectief: HCX PL APO 40x/0.85 </td></tr><tr><td>FACSCalibur</td><td>BD Biosciences</td><td>FACSCalibur</td><td>Zeer belangrijk dat de buis tijdens het meetproces kan worden verwijderd en vervangen</td></tr></tbody></table>

studeren interacties van<em&gt; staphylococcus aureus</em&gt; met neutrofielen door flowcytometrie en time lapse microscopie

Studying Interactions of Staphylococcus aureus with Neutrophils by Flow Cytometry and Time Lapse Microscopy

We methode om het effect van fenol oplosbare modulins (PSMs) en andere toxinen geproduceerd en uitgescheiden door Staphylococcus aureus op neutrofielen bestuderen. Om de effecten van de PSMs op neutrofielen we isoleren verse neutrofielen behulp dichtheidsgradiëntcentrifugatie bestuderen. De neutrofielen worden geladen met een kleurstof die fluoresceert bij calcium mobilisatie. De activering van neutrofielen door PSMs initieert een snelle en voorbijgaande verhoging van de vrije intracellulaire calciumconcentratie. In een flow cytometrie experiment kan deze snelle mobilisatie gemeten door het volgen van de fluorescentie van een vooraf geladen kleurstof die reageert op de verhoogde concentratie vrije Ca 2 +. Met deze methode kunnen we de PSM concentratie nodig om de neutrofielen activeren, en meet de effecten van specifieke en algemene remmers van de neutrofiel activatie bepalen. Om de expressie van de PSMs onderzoeken in de intracellulaire ruimte, we reporter fusies van de promoter van het operon PSMα GFP geconstrueerd hebben. Wanneer deze reporter stammen van S. aureus gefagocyteerd door neutrofielen, kan de inductie van expressie worden waargenomen met behulp van fluorescentie microscopie.

Flow cytometrische assay voor de beoordeling van calcium mobilisatie in menselijke PMN Incuberen neutrofielen met een concentratie reeks synthetische PSMα3 resulteert in snelle activering zoals gemeten door calcium flux, die blijkt uit een toename van het signaal FL-1. Pre-incubatie van synthetische PSMα3 met 0,01%, 0,1% en 1% menselijk serum remde het vermogen om calcium fluxen (figuur 1) opwekken. Analyse van GFP expressie in bacteriën na fagocytose ...

We methode om het effect van PSMs en andere toxines uitgescheiden door bestuderen<em&gt; Staphylococcus aureus</em&gt; Op neutrofielen behulp van flowcytometrie en fluorescentie microscopie.

Studeren Interacties van<em&gt; Staphylococcus aureus</em&gt; Met Neutrofielen door flowcytometrie en Time Lapse Microscopie

We present methods to study the effect of phenol soluble modulins (PSMs)  and other toxins produced and secreted by Staphylococcus  aureus on neutrophils. ...

Het algemene doel van het volgende experiment is om de effecten van staphylococcale fenoloplosbare modulines of PSM's op menselijke neutrofielen te bestuderen. Dit wordt bereikt door eerst neutrofielen uit menselijk bloed te isoleren voor daaropvolgende in vitro analyse. Vervolgens worden de neutrofielen ofwel geladen met een fluorescerende kleurstof en gemengd met een concentratiereeks PSM's met en zonder inhibitoren, of ze krijgen de gelegenheid om S. aureus bacteriën te fagocyteren die een PSM alpha promoter GFP reporter-construct bevatten.Uiteindelijk kan de activatie van de neutrofielen door PSM-stimulatie worden gemonitord via flowcytometrie, en de expressie van GFP door de gefagocyteerde bacteriën kan met deze methode via fluorescentiemicroscopie worden geanalyseerd. Met deze methode kunt u de effecten van staphylococale fenyl-soja-molines op neutrofielen bestuderen.Natuurlijk kan deze methode worden toegepast op veel andere celtypen, stimuli en antagonisten. We kregen voor het eerst het idee voor het microscopiegedeelte van deze methode tijdens het bespreken van een manier om de effecten van PSM's in neutrofielen waar te nemen. Het gebruik van een bacterieel GFP-expressieconstruct en time-lapse microscopie stelt ons in staat om precies dat te doen.Nadat er vijf buisjes gehepariniseerd veneus bloed zijn afgenomen, giet u 12 milliliters van een Ficoll-oplossing met een dichtheid van 1.119 grams per milliliter in een buis van 50 milliliter, en breng vervolgens voorzichtig 10 milliliters van een Ficoll-oplossing met een dichtheid van 1.077 grams per milliliter aan als bovenlaag. Verdun daarna het bloed met een gelijk volume PBS en breng 20 tot 25 milliliters bloed voorzichtig aan op elke dubbele Ficoll-gradiëntlaag. Centrifugeer de gradiënten gedurende 20 minuten bij 396 ×g en 22 °C zonder te remmen.Gebruik vervolgens een vacuümpomp voorzien van een steriele pipetpunt om de bovenste gele plasmalaag en de PBMC-lagen af te zuigen, gevolgd door de derde witte laag. Gebruik nu een kleine plastic pipet om de polymorfnucleaire neutrofielen- of PMN-fractie uit elke buis over te brengen naar een nieuwe buis van 50 milliliter.Voeg vers bereid, vooraf gekoeld RPMI aangevuld met humaan serumalbumine of R-P-M-I-H-S-A toe aan elke buis om het totale volume op 50 milliliters te brengen. Centrifugeer vervolgens de cellen, aspireer het supernatant met een vacuümpomp en vortex voorzichtig het pellet dat rode erytrocyten en PMN bevat. Voeg daarna negen milliliters steriel gedeïoniseerd water toe aan de cellen en start een timer.Voeg exact 30 seconden toe. Voeg één milliliter 10 keer geconcentreerde PBS toe om de hyperosmotische shock te stoppen. Was de cellen vervolgens in een totaal volume van 50 milliliter koude R-P-M-I-H-S-A.Verwijder het supernatant en voeg één milliliter R-P-M-I-H-S-A toe aan elk pellet, dat nu wit is door lyse van de erytrocyten. Resuspendeer vervolgens door te pipetteren en voeg de pellets samen in één buis. Tel nu de cellen en stel de concentratie in op 1 × 10⁷ cellen per milliliter.Laad nu 5 × 10⁶ cellen per milliliter met 2 µM FluoH-3 AM in RPMI-1640. Bedek de buis met aluminiumfolie om deze tegen licht te beschermen. Incubeer de cellen vervolgens gedurende 20 minuten bij 37 °C onder agitatie.Bereid ondertussen een drievoudige seriële verdunning van de stimulus voor tegen 10 keer de uiteindelijke concentratie. Pre-incubeer vervolgens 30 µL van de stimulus met een gelijk volume vers bereide 10 keer geconcentreerde inhibitor of buffer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Was daarna de cellen in 10 mL R-P-M-I-H-S-A en resuspendeer de cellen in vers R-P-M-I-H-S-A op een concentratie van 5 × 10⁶ cellen per mL.Vlak voor de flowanalyse worden de cellen verdund tot 2 × 10⁶ cellen per milliliter in R-P-M-I-H-S-A en wordt 200 µL cellen per fax-buis toegevoegd. Laad de eerste buis in de flowcytometer, waarbij voorzichtig wordt voorkomen dat de cellen worden geactiveerd door schudden of pipetteren. Wacht drie seconden en start vervolgens de acquisitie. Na een vaste tijdsperiode, bijvoorbeeld acht seconden, wordt de buis verwijderd en worden er snel 50 µL van de laagste verdunning van de stimulus aan het monster toegevoegd.Laad de buis onmiddellijk opnieuw en ga verder met de acquisitie. Wanneer een verdunningsreeks is voltooid, spoel de naald van de flowcytometer met vers R-P-M-I-H-S-A voordat een nieuwe reeks wordt gemeten. Analyseer na het runnen van het laatste monster de gegevens met flowcytometrie-analysesoftware om de bacteriële GFP-expressie te analyseren.Kweek na PMN-fagocytose een S ous-stam die het reporterconstruct van belang bevat gedurende de nacht in bouillon; verwijder alle GFP die tijdens de nachtelijke kweek is tot expressie gebracht door de cellen te verdunnen tot een OD 6 60 0 0,01. Kweek de cultuur tot een OD 6 60 0,1. Verdun de cellen 1 op 30 en monitor vervolgens de groei totdat de cultuur opnieuw een OD 6 60 van 0,1 bereikt.Verzamel vervolgens de bacteriën door middel van centrifugatie. Was de cellen één keer in DPBS en resuspendeer de cultuur.Voeg één tot 10 keer het oorspronkelijke volume toe om een OD₆₀₀ van 1,0 of ongeveer 5 × 10⁸ CFU per milliliter te verkrijgen. Meng de bacteriën vervolgens met de vers geïsoleerde PNS in RPMI-HSA in een verhouding van 10:1. Voeg daarna gepoold menselijk serum toe tot een eindvolume van 1/10e gepoold menselijk serum binnen de celoplossing.Stimuleer fagocytose door het celmengsel 10 minuten te schudden bij 37 °C. Verdun vervolgens de bacteriebeladen PMN's tot vijf keer 10⁵ cellen per milliliter en breng 250 µL van de cellen over naar elke put van een dekglas met acht kamers. Beeld de cellen tot slot af met een omgekeerde microscoop die is uitgerust met een 40 x objectief en is geplaatst in een donkere omgevingskamer, en leg elke vijf tot 10 minuten beelden vast op meerdere locaties in de kamers van het dekglas in zowel het brightfield- als het GFP-kanaal om de bacteriële GFP-productie in real-time te volgen; incubatie van neutrofielen met een concentratiereeks van synthetisch PSM alpha drie resulteert in een dosisafhankelijke snelle activatie van de cellen, zoals gemeten door calciumflux.Pre-incubatie van het PSM alfa drie peptide met 0,01%, 0,1% of 1% menselijk serum remde het vermogen van de stimulus om een calciumrespons op te wekken significant. Opnieuw gebeurde dit op een dosisafhankelijke wijze bij 1% serum. Er is nauwelijks enige activatie zichtbaar bij deze concentraties van PSM alfa drie.Op deze afbeeldingen zijn twee neutrofielen te zien die gefagocyteerde bacteriën bevatten met een PSM alpha GFP-reporterconstruct. De bacteriën beginnen ongeveer één uur na fagocytose te fluoresceren, wat duidt op de expressie van GFP vanuit de PSM Alpha-promotor. Bacteriën buiten de neutrofielen fluoresceren niet, wat aangeeft dat de PSM alpha-expressie snel wordt ingeschakeld, maar uitsluitend wanneer de bacteriën gefagocyteerd worden.Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat er altijd verse neutrofielen moeten worden gebruikt voor optimale resultaten. Na het bekijken van deze video hoop ik dat u een goed inzicht heeft gekregen in het meten van de calciumflux via flowcytometrie en het meten van bacteriële genexpressie in eukaryote cellen met behulp van fluorescentiemicroscopie.

studying-interactions-staphylococcus-aureus-with-neutrophils-flow

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

In dit artikel wordt eerst een procedure voor het isoleren van humane endotheelcellen van de navelstreng aderen en dan laat zien hoe deze cellen te gebruiken om neutrofielen transmigratie onderzoeken op stromingscondities. Door een laag volume stromingskamer gemaakt van een polymeer met de optische eigenschappen van glas levende cellen fluorescerende beeldvorming zeldzame celpopulaties is ook mogelijk.

Isolatie van humane navelstreng endotheel cellen en hun gebruik in de studie van de neutrofielen transmigratie onder stroomtoestanden

Source: Barbero, A. M., et al. Fluorescence Assays for the Study of Mycobacterium tuberculosis Interaction with the Immune Receptor SLAMF1. J. Vis. Exp. (2025)This video demonstrates the procedure for labeling host immune receptors that bind bacterial surface antigens, enabling their detection through flow cytometry.

Analysis of Macrophage Receptor Interactions with Pathogenic Bacteria Using Flow Cytometry

This video demonstrates an in vitro assay to study neutrophil-biofilm interaction. The pathogenic bacteria embedded in the biofilm and isolated neutrophils were tagged using fluorescent labels, and the immune response by the neutrophils and the evasion of the immune response by the bacteria were assessed using a fluorescence microscope.

An In Vitro Assay to Study the Interaction between Neutrophils and Biofilm

The video demonstrates a method for investigating the impact of stromal cells on leukocyte recruitment. In a parallel plate flow chamber model, pro-inflammatory cytokines induce the expression of adhesion receptors by endothelial cells, facilitating neutrophil recruitment and migration. The cross-talk between stromal cells and endothelial cells diminishes neutrophil recruitment to the endothelial cells.

An In Vitro Flow Investigation of the Effect of Stromal Cells on Leukocyte Recruitment

Leukocyten steken de endotheelcellen monolaag met behulp van de paracellulaire of de transcellulaire route. We ontwikkelden een eenvoudige test om te volgen de verdeling van endogene junctionele VE-cadherine en PECAM-1 tijdens de migratie van leukocyten onder fysiologische stroom te maken tussen de twee transmigratie routes.

Real-time beeldvorming van endotheelcellen-cel Junctions Tijdens Neutrophil Transmigration onder fysiologische Flow

Het vermogen van ontstoken endotheel om leukocyten werven van stroom wordt geregeld door mesenchymale stromale cellen. We beschrijven twee in vitro modellen die primaire humane cellen die kunnen worden gebruikt om neutrofielen werving beoordelen van stroom en onderzoekt de rol van mesenchymale stromale cellen spelen in het reguleren van dit proces.

Het analyseren van de effecten van stromale cellen op de recrutering van leukocyten van Flow

Deze studie beschrijft de microscopische monitoring van pneumococcus hechting aan Von Willebrand factor snaren geproduceerd op het oppervlak van gedifferentieerde menselijke primaire endotheliale cellen onder shear stress in gedefinieerde stromingsomstandigheden. Dit protocol kan worden uitgebreid naar gedetailleerde visualisatie van specifieke celstructuren en kwantificering van bacteriën door differentiële immunokleurings procedures toe te passen.

Pneumococcus-infectie van primaire humane endotheliale cellen in constante stroming

Dit live-bacteriële celbeeldvormingsprotocol maakt visualisatie mogelijk van interacties tussen meerdere bacteriële soorten op het eencellige niveau in de tijd. Time-lapse imaging maakt het mogelijk om elke bacteriesoort in monocultuur of cocultuur te observeren om interspecies interacties te ondervragen in bacteriële gemeenschappen met meerdere soorten, waaronder individuele celmotiliteit en levensvatbaarheid.

Kinetische visualisatie van single-cell interspecies bacteriële interacties

Dit protocol beschrijft de studie van neutrofiel-biofilm interacties. Staphylococcus aureus biofilms worden in vitro vastgesteld en geïncubeerd met perifere bloed-afgeleide menselijke neutrofielen. De oxidatieve burst-respons van neutrofielen wordt gekwantificeerd en de neutrofiellokalisatie in de biofilm wordt bepaald door microscopie.

Gestandaardiseerde in vitro assays om interacties tussen menselijke neutrofielen en staphylococcus aureus biofilms te visualiseren en te kwantificeren

Dit protocol beschrijft een kwantitatieve benadering om microbiële autoaggregatie te meten met behulp van beeldvormende flowcytometrie.

Beeldvorming flowcytometrie om microbiële autoaggregatie te bestuderen

In dit manuscript bieden we een uitgebreid protocol voor het beoordelen van de antibioticaoverleving voor Pseudomonas aeruginosa en Staphylococcus aureus, waarbij plasmiden worden getransformeerd in P. aeruginosa en S. aureus om reporterstammen te creëren en fenotypische varianten, zoals persisters, te visualiseren door time-lapse epifluorescentiemicroscopie.

Time-Lapse Epifluorescentiemicroscopie Beeldvorming van Pseudomonas aeruginosa en Staphylococcus aureus Heterogene fenotypes

Leer hoe Staphylococcus aureus PSM-toxinen menselijke neutrofielen activeren met flowcytometrie en fluorescentiemicroscopie. Deze methode toont bacteriële fagocytose en calciumflux in immuuncellen.

Studeren Interacties van

Meer video's verkennen