Studeren Interacties van Staphylococcus aureus Met Neutrofielen door flowcytometrie en Time Lapse Microscopie

Het algemene doel van het volgende experiment is om de effecten van stafylokokkenfenol, oplosbaar modline of PSM's op humane neutrofielen te bestuderen. Dit wordt bereikt door eerst neutrofielen te isoleren uit menselijk bloed voor verdere in vitro-analyse. Vervolgens worden de neutrofielen ofwel beladen met fluorescerende kleurstof en gemengd met een concentratiereeks van PSM's met en zonder remmer, ofwel toegelaten om S reus-bacteriën te fagocyteren die een A PSM alpha promoter GFP reporterconstruct bevatten.

Uiteindelijk kan activering van de neutrofielen door PSM-stimulatie worden gemonitord door middel van flowcytometrie en expressie van GFP door de gefagocytoseerde. Bacteriën kunnen worden geanalyseerd door middel van fluorescentiemicroscopie. Op deze manier kunt u de effecten van stafylokokken, fenol, soja, molins of neutrofielen bestuderen.

Natuurlijk kan deze methode worden toegepast op veel andere celtypen, stimuli en antagonisten. We hadden eerst het idee voor het microscopiegedeelte van deze methode tijdens het bespreken van een manier om de effecten van PSM's binnen neutrofielen te observeren. Het gebruik van een bacteriële GFP-expressieconstructie en time-lapse microscopie stelt ons in staat om precies dat te doen.

Na het aftappen van vijf buisjes heparine-gehesen veneus bloed, giet 12 milliliter van een 1,119 gram per milliliter dichtheidsfila-oplossing in een 50 milliliter buisje en plaats vervolgens voorzichtig 10 milliliter van een 1,077 gram per milliliter dichtheids-FI-cella-oplossing. Verdun vervolgens het bloed met een gelijk volume PBS en plaats 20 tot 25 milliliter bloed voorzichtig op elke dubbele laag fi call-gradiënt. Centrifugeer de gradiënten gedurende 20 minuten bij 396 keer G en 22 graden Celsius zonder te breken.

En gebruik vervolgens een vacuümpomp voorzien van een steriele pipettetip om de bovenste gele plasma- en PBMC-lagen af te zuigen. En vervolgens de derde witte laag. Gebruik nu een kleine plastic pipette om de polymorf-nucleaire neutrofiel of PMN-fractie van elk buisje over te brengen in een nieuw 50 milliliter buisje.

Voeg vers bereide voorgekoelde PMI aan elk buisje toe, aangevuld met humaan serumalbumine of R-P-M-I-H-S-A om het totale volume op 50 milliliter te brengen. Draai vervolgens de cellen af, zuig de supernatant af met een vacuümpomp en vortex voorzichtig het rode erytrocyt en PMN-bevattende pellet. Voeg vervolgens negen milliliter steriele gedeïoniseerde water toe aan de cellen en start een timer.

Voeg exact 30 seconden toe. Voeg een milliliter 10 keer geconcentreerd PBS toe om de hyperosmotische schok te stoppen. Was vervolgens de cellen in een totaal volume van 50 milliliter koud R-P-M-I-H-S-A.

Na het verwijderen van het supernatant, voeg een milliliter R-P-M-I-H-S-A toe aan elke platte, die nu wit is vanwege de lysis van de erythrocyten. Spuit vervolgens op, suspendeer door te pipetteren en combineer de pellets in één buisje. Tel nu de cellen en pas de concentratie aan tot eenmaal 10 tot de zevende cellen per milliliter.

Laad nu vijf keer 10 tot de zesde cellen per milliliter met twee micromolair flu oh 3:00 uur in R-P-M-I-H-S-A. Bedek de buis met aluminiumfolie om het te beschermen tegen licht. Incubeer vervolgens de cellen gedurende 20 minuten bij temperatuur onder roeren.

Bereid ondertussen een drievoud seriële verdunning van de stimulus voor bij 10 keer de uiteindelijke concentratie. Pre-incubeer vervolgens 30 microliter van de stimulus met een gelijk volume vers bereide 10 keer geconcentreerde remmer of buffer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Was vervolgens de cellen in 10 milliliter R-P-M-I-H-S-A en suspendeer de cellen in vers R-P-M-I-H-S-A bij vijf keer 10 tot de zesde cellen per milliliter.

Vlak voor flowanalyse verdun de cellen tot twee keer 10 tot de zesde cellen per milliliter in R-P-M-I-H-S-A en voeg 200 microliter cellen per faxbuisje toe. Zorg ervoor dat u de cellen niet activeert door te schudden of te pipetteren, laad het eerste buisje op de flowcytometer. Wacht drie seconden en start vervolgens de acquisitie na een vaste tijdsperiode, bijvoorbeeld acht seconden, verwijder het buisje en voeg snel 50 microliter van de laagste verdunning van de stimulus toe aan het monster.

Herlaad onmiddellijk het buisje en vervolg de acquisitie. Wanneer een verdunningsreeks is voltooid, was de naald van de flowcytometer met vers R-P-M-I-H-S-A voordat u een nieuwe reeks meet. Na het doorlopen van het laatste monster, analyseer de gegevens met flowcytometrie-analysesoftware om de bacteriële GFP-expressie te analyseren.

Na PMN-fagocytose laat een S ous-stam die het gewenste reporterconstruct bevat, een nacht groeien in bouillon, verwijder eventueel GFP dat tijdens de nachtelijke cultuur is uitgedrukt door de cellen te verdunnen tot OD 6 60 0 0,01. Laat de cultuur groeien tot OD 6 60 0 0,1. Verdun de cellen een op 30 en monitor vervolgens de groei totdat de cultuur opnieuw een OD zes 60 van 0,1 bereikt.

Verzamel vervolgens de bacteriën door centrifugatie. Was de cellen eenmaal in DPBS en Resus. Suspendeer de cultuur.

Voeg een tot 10 van het oorspronkelijke volume toe om een OD zes 60 van 1,0 of ongeveer vijf keer 10 tot de achtste CFU per milliliter te verkrijgen. Meng vervolgens de bacteriën met de vers geïsoleerde PNS in R-P-M-I-H-S-A in een 10 tot 1-verhouding. Voeg vervolgens gepoold humaan serum toe tot een 1 10de totaal eindvolume van gepoold humaan serum binnen de cellensolutie.

Stimuleren van fagocytose door de celmengsel gedurende 10 minuten bij 37 graden Celsius te schudden. Verdun vervolgens de bacteriebeladen PMN's tot vijf keer 10 tot de vijfde cellen per m