Name: Gelijktijdige elektrofysiologisch registratie en calciumbeeldvorming van neuronen in de suprachiasmatische kern (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 42 s
Description: Leer gelijktijdige elektrofysiologische registratie en calciumbeeldvorming van neuronen in de suprachiasmatische kern met patch clamp en bis-fura-2. Deze methode ondersteunt onderzoek naar neurale activiteit.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Het werk werd gefinancierd door een subsidie van het National Institute of General Medical Sciences (GM096972).

1. Preparatie van hypothalamus hersensneden
<ol>
	<li>Verkrijg vooraf goedkeuring van de Institutionele Commissie voor Dierenwelzijn en -gebruik (IACUC) voor alle procedures waarbij dieren betrokken zijn. De hier beschreven dierprocedures zijn in overeenstemming met de AVMA Richtlijnen voor het Euthanaseren van Dieren 2013 en werden vooraf goedgekeurd door de IACUC van de Oregon Health & Science University.</li>
	<li>Bereid 500 ml van de snijbuffer zonder de MgCl2 en CaCl2 voor (Tabel 1). Belucht de oplossing met 95% O2 en 5% CO2 op kamertemperatuur en voeg dan de MgCl2 en CaCl2 toe terwijl je blijft beluchten. Pas de osmolariteit aan op 300 mOsm met sucrose. De osmolariteit wordt gemeten met een dampdrukosmometer.</li>
	<li>Bereid 1 L van het opnamemedium zonder de MgCl2 en CaCl2 voor (Tabel 2). Belucht de oplossing met 95% O2 en 5% CO2 en voeg dan de MgCl2 en CaCl2 toe terwijl je blijft beluchten. Pas de pH aan op 7,2-7,4 met NaOH (10 N) en de osmolariteit op 300 mOsm met sucrose. De toevoeging van HEPES-buffer is optioneel en werd gebruikt om de pH verder te stabiliseren.</li>
	<li>De snij- en opnameoplossingen kunnen enkele dagen in de koelkast worden bewaard voor gebruik.</li>
	<li>Bereid 3% agarose voor en giet deze in een steriele petrischaal (6 mm diep) en plaats in de koelkast.</li>
	<li>Snijd drie blokjes agarose van ongeveer 6 mm x 6 mm x 6 mm.</li>
	<li>Anesthesiseer een vier tot acht weken oude Sprague-Dawley-rat diep met isofluraange. Test de diepte van de anesthesie. De diepte van de anesthesie wordt als passend beschouwd wanneer er geen onttrekkingsreflex van de achterpoot is na het knijpen in de voetzool. Eenmaal goed verdoofd, wordt de rat geëuthanaseerd door snelle onthoofding. </li>
	<li>Verwijder snel de hersenen, wees voorzichtig om de oogzenuwen eerst door te snijden, en plaats in ijskoude snijoplossing verzadigd met 5% CO2 en 95% O2 en laat 2-3 minuten afkoelen.</li>
	<li>Trim de hersenen. Plaats de hersenen met behulp van een pincet op een bevochtigd (met snijoplossing) rond filterpapier dat op een glazen petrischaal op ijs ligt.</li>
	<li>Snijd de hersenen coronaal om de resterende kleine hersenen en hersenstam te verwijderen, vervolgens de rostrale cortex en de zijden, om een blok hersenen over te houden dat de hypothalamus bevat, waarbij de zijde met SCN, oogzenuwen en optische chiasma zorgvuldig wordt bewaard.</li>
	<li>Spreid een dunne laag cyanoacrylaatlijm uit die groot genoeg is om de hersenen en agaroseblokken in een ijskoude maar droge microtoom-snijkamer te bevestigen.</li>
	<li>Breng het ijskoude hersenblok met de caudale zijde naar beneden op de lijm met de zijde die het SCN bevat, gepositioneerd om als eerste te snijden met de oogzenuwen die een 'V' vormen die omhoog wijst.</li>
	<li>Plaats de agaroseblokken op de andere 3 zijden. Vul de kamer met ijskoude snijbuffer die continu wordt beluucht met 5% CO2 en 95% O2. De cyanoacrylaatlijm zal drogen met vocht en de hersenen en agaroseblokken op hun plaats houden.</li>
	<li>Snijd coronale hypothalamussneden (220-250 µm dik) met de SCN met de vibrerende mesmicrotoom. Typisch wordt een snede gekozen waar de optische chiasma ongeveer 2-4 mm breed is, die eruitziet als een witte band met SCN net dorssaal verschijnend als twee kleine 'uitsparingen' in de optische chiasma aan weerszijden van de 3rd ventrikel (Figuur 1A).</li>
	<li>Plaats de sneden in de opnamekamer (36 °C) gemonteerd op het podium van een Leica DMLFS microscoop. De kamer is gevuld met continu stromende opnameoplossing (2 ml/min) beluucht met 95% O2 en 5% CO2 en voorverwarmd met een inlijnverwarming.</li>
	<li>Voer gehele-cel patch clamp en calcium beeldvorming opnames uit in SCN neuronen 0,5-8 uur na bereiding van de snede.</li>
</ol>
2. Patch Clamp Opname
<ol>
	<li>Bereid de elektrodeoplossing (intracellulair) oplossing in de helft van het totale eindvolume water.</li>
	<li>Pas de oplossing aan op pH 7,3 met KOH (1 N).</li>
	<li>Voeg de resterende water toe. De uiteindelijke osmolariteit van de oplossing moet in het bereik van 280-290 mOsm zijn.</li>
	<li>Leid de elektrodeoplossing door een 0,2 µm filter, verdeel in aliquots (0,5 ml) in microfugebuisjes, en bewaar bij -20 °C.</li>
	<li>Bereid de calciumsonde bis-fura-2 hexakaliumzout stockoplossing (10 mM) door 1 mg bis-fura-2 hexakaliumzout te mengen met 99,29 µl van 0,2 µm gefilterd water.</li>
	<li>Verdeel in aparte buisjes (2-5 µl elk) en bevries (-20 °C).</li>
	<li>Ontdooi een aliquot van interne oplossing en de Ca2+ sonde kort voor gebruik. Voeg 2 µl van de bis-fura-2 stockoplossing toe aan 400 µl van de interne oplossing voor een uiteindelijke calciumsondeconcentratie van 50 µM. Schurt kort om de oplossingen te mengen. De calciumsondeconcentratie (10-250 µM) varieert afhankelijk van het experimentele ontwerp en beeldvormingssysteem. Merk op dat bis-fura-2 bestaat uit twee aan elkaar gekoppelde fura-2 moleculen.</li>
	<li>Trek gehele-cel patch

<ol><li>Bading, H., Ginty, D. D., Greenberg, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+gene+expression+in+hippocampal+neurons+by+distinct+calcium+signaling+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Regulation of gene expression in hippocampal neurons by distinct calcium signaling pathways.</a> Science. 260, 181-186 (1993).</li>
<li>Ghosh, A., Ginty, D. D., Bading, H., Greenberg, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+regulation+of+gene+expression+in+neuronal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Calcium regulation of gene expression in neuronal cells.</a> J. Neurobiol. 25, 294-303 (1994).</li>
<li>Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+patch-clamp+techniques+for+high+resolution+current+recording+from+cells+and+cell-free+membrane+patches%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Arch%22%5BJournal%5D)">Improved patch-clamp techniques for high resolution current recording from cells and cell-free membrane patches.</a> Pflugers Arch. 391, 85-100 (1981).</li>
<li>Grynkiewicz, G., Poenie, M., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+generation+of+Ca2%2B+indicators+with+greatly+improved+fluorescence+properties%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties.</a> J. Biol. Chem. 260, 3440-3450 (1985).</li>
<li>Higley, M. J., Sabatini, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+signaling+in+dendrites+and+spines%3A+practical+and+functional+considerations%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Calcium signaling in dendrites and spines: practical and functional considerations.</a> Neuron. 59, 902-913 (2008).</li>
<li>Colwell, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circadian+modulation+of+calcium+levels+in+cells+in+the+suprachiasmatic+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Circadian modulation of calcium levels in cells in the suprachiasmatic nucleus.</a> Eur. J. Neurosci. 12, 571-576 (2000).</li>
<li>Ikeda, M., Yoshioka, T., Allen, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+and+circadian+changes+in+Ca2%2B+mobilization+mediated+by+GABAA+and+NMDA+receptors+in+the+suprachiasmatic+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Developmental and circadian changes in Ca2+ mobilization mediated by GABAA and NMDA receptors in the suprachiasmatic nucleus.</a> Eur. J. Neurosci. 17, 58-70 (2003).</li>
<li>Irwin, R. P., Allen, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GABAergic+signaling+induces+divergent+neuronal+Ca2%2B+responses+in+the+suprachiasmatic+nucleus+network%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">GABAergic signaling induces divergent neuronal Ca2+ responses in the suprachiasmatic nucleus network.</a> Eur. J. Neurosci. 30, 1462-1475 (2009).</li>
<li>Berson, D. M., Dunn, F. A., Takao, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phototransduction+by+retinal+ganglion+cells+that+set+the+circadian+clock%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Phototransduction by retinal ganglion cells that set the circadian clock.</a> Science. 295, 1070-1073 (2002).</li>
<li>Hattar, S., Liao, H. W., Takao, M., Berson, D. M., Yau, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Melanopsin-containing+retinal+ganglion+cells%3A+architecture%2C+projections%2C+and+intrinsic+photosensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Melanopsin-containing retinal ganglion cells: architecture, projections, and intrinsic photosensitivity.</a> Science. 295, 1065-1070 (2002).</li>
<li>Hartwick, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-Evoked+Calcium+Responses+of+Isolated+Melanopsin-Expressing+Retinal+Ganglion+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Light-Evoked Calcium Responses of Isolated Melanopsin-Expressing Retinal Ganglion Cells.</a> J. Neurosci. 27, 13468-13480 (2007).</li>
<li>Castel, M., Belenky, M., Cohen, S., Ottersen, O. P., Storm-Mathisen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutamate-like+immunoreactivity+in+retinal+terminals+of+the+mouse+suprachiasmatic+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Glutamate-like immunoreactivity in retinal terminals of the mouse suprachiasmatic nucleus.</a> Eur. J. Neurosci. 5, 368-381 (1993).</li>
<li>Card, J. P., Moore, R. Y. The organization of visual circuits influencing the circadian activity of the suprachiasmatic nucleus. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCard%2C+JP+%22In+Suprachiasmatic+Nucleus+-+The+Mind%27s+Clock%22">In Suprachiasmatic Nucleus - The Mind's Clock</a>. Reppert, S. M., Klein, D. C., Moore, R. Y. , Oxford University Press. Oxford. 51-76 (1991).</li>
<li>Shigeyoshi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-induced+resetting+of+a+mammalian+circadian+clock+is+associated+with+rapid+induction+of+the+mPer1+transcript%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Light-induced resetting of a mammalian circadian clock is associated with rapid induction of the mPer1 transcript.</a> Cell. 91, 1043-1053 (1997).</li>
<li>Albrecht, U., Sun, Z. S., Eichele, G., Lee, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+differential+response+of+two+putative+mammalian+circadian+regulators%2C+mper1+and+mper2%2C+to+light%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A differential response of two putative mammalian circadian regulators, mper1 and mper2, to light.</a> Cell. 91, 1055-1064 (1997).</li>
<li>Yan, L., Silver, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+induction+and+localization+of+mPer1+and+mPer2+during+advancing+and+delaying+phase+shifts%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Differential induction and localization of mPer1 and mPer2 during advancing and delaying phase shifts.</a> Eur. J. Neurosci. 16, 1531-1540 (2002).</li>
<li>Lowrey, P. L., Takahashi, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetics+of+the+mammalian+circadian+system%3A+Photic+entrainment%2C+circadian+pacemaker+mechanisms%2C+and+posttranslational+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">Genetics of the mammalian circadian system: Photic entrainment, circadian pacemaker mechanisms, and posttranslational regulation.</a> Annu. Rev. Genet. 34, 533-562 (2000).</li>
<li>Ding, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resetting+the+biological+clock%3A+Mediation+of+nocturnal+circadian+shifts+by+glutamate+and+NO%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Resetting the biological clock: Mediation of nocturnal circadian shifts by glutamate and NO.</a> Science. 266, 1713-1717 (1994).</li>
<li>Ding, J. M., Fairman, L. E., Hurst, W. J., Kuriashkina, L. R., Gillette, M. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resetting+the+biological+clock%3A+mediation+of+nocturnal+CREB+phosphorylation+via+light%2C+glutamate%2C+and+nitric+oxide%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Resetting the biological clock: mediation of nocturnal CREB phosphorylation via light, glutamate, and nitric oxide.</a> J. Neurosci. 17, 667-675 (1997).</li>
<li>Ding, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+neuronal+ryanodine+receptor+mediates+light-induced+phase+delays+of+the+circadian+clock%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A neuronal ryanodine receptor mediates light-induced phase delays of the circadian clock.</a> Nature. 394, 381-384 (1998).</li>
<li>Bollmann, J. H., Helmchen, F., Borst, J. G., Sakmann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postsynaptic+Ca2%2B+influx+mediated+by+three+different+pathways+during+synaptic+transmission+at+a+calyx-type+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Postsynaptic Ca2+ influx mediated by three different pathways during synaptic transmission at a calyx-type synapse.</a> J. Neurosci. 18, 10409-10419 (1998).</li>
<li>Irwin, R. P., Allen, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+Response+to+Retinohypothalamic+Tract+Synaptic+Transmission+in+Suprachiasmatic+Nucleus+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Calcium Response to Retinohypothalamic Tract Synaptic Transmission in Suprachiasmatic Nucleus Neurons.</a> J. Neurosci. 27, 11748-11757 (2007).</li>
<li>Smetters, D., Majewska, A., Yuste, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detecting+action+potentials+in+neuronal+populations+with+calcium+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Detecting action potentials in neuronal populations with calcium imaging.</a> Methods. 18, 215-221 (1999).</li>
<li>Spruston, N., Johnston, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perforated+patch-clamp+analysis+of+the+passive+membrane+properties+of+three+classes+of+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Perforated patch-clamp analysis of the passive membrane properties of three classes of hippocampal neurons.</a> J. Neurophysiol. 67, 508-528 (1992).</li>
<li>Horn, R., Marty, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscarinic+activation+of+ionic+currents+measured+by+a+new+whole-cell+recording+method%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Muscarinic activation of ionic currents measured by a new whole-cell recording method.</a> J. Gen. Physiol. 92, 145-159 (1988).</li>
<li>Marty, A., Neher, E. Tight-seal whole-cell recording. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMarty%2C+A+%22Single-channel+recording%22">Single-channel recording</a>. Sakmann, B., Neher, E. 2, Plenum Press. New York. 31-52 (1995).</li>
<li>Sarantopoulos, C., McCallum, J. B., Kwok, W. M., Hogan, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beta-escin+diminishes+voltage-gated+calcium+current+rundown+in+perforated+patch-clamp+recordings+from+rat+primary+afferent+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">Beta-escin diminishes voltage-gated calcium current rundown in perforated patch-clamp recordings from rat primary afferent neurons.</a> J. Neurosci. Methods. 139, 61-68 (2004).</li>
<li>Hatae, J., Fujishiro, N., Kawata, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectroscopic+properties+of+fluorescence+dye+fura-2+with+various+divalent+cations%5BTitle%5D)+AND+%22Jap.+J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Spectroscopic properties of fluorescence dye fura-2 with various divalent cations.</a> Jap. J. Physiol. 46, 423-429 (1996).</li>
<li>Poenie, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alteration+of+intracellular+Fura-2+fluorescence+by+viscosity%3A+a+simple+correction%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">Alteration of intracellular Fura-2 fluorescence by viscosity: a simple correction.</a> Cell Calcium. 11, 85-91 (1990).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.

De hierboven beschreven methoden bieden een krachtige tool om gelijktijdig de link tussen elektrische activiteit van neuronmembranen en de intracellulaire calciumconcentratie op te nemen. De methode heeft een aantal sterke punten omdat het twee zeer goed gekarakteriseerde methoden combineert - whole cell patch clamp opname en meting van intracellulair calcium met behulp van fluorescerende kleurstoffen. Onze aanpak is vergelijkbaar met die beschreven door andere onderzoekers6,23.
<p class="jove_c...

Veranderingen in genexpressie zijn bekend als ze optreden in neuronen als gevolg van synaptische signalering. Signalering door het excitatoire neurotransmitter glutamaat kan het neuronale membraanpotentiaal depolariseren, wat uiteindelijk leidt tot gentranscriptie en translatie1,2. Activering van ionotropische receptoren door glutamaat laat extracellulaire calciumionen de cel binnen, wat wordt gedacht een kritische rol te spelen als tweede boodschapper bij het activeren van gentranscriptie. Het evalueren van de relatie tussen membraan elektrische activiteit, zoals de frequentie van actiepotentiaalvuren, en veranderingen in intracellulaire calciumconcentratie vereist de combinatie van twee methoden - gehele cel patch clampen en kwantitatief beeldvorming van fluorescente calcium proben3-5, wat het mogelijk maakt om de relatie te bestuderen in individuele neuronen. De enkelcel opnametechniek maakt het mogelijk om de activiteit van individuele neuronen op identificeerbare delen van de hersenen op te nemen. De gehele cel opnametechniek maakt het mogelijk om het membraanvoltage of de stroom te controleren, wat experimentele manipulatie van specifieke ionisatorkanaalstromen mogelijk maakt. Het gebruik van micropipetten gevuld met fluorescente calcium proben zorgt er ook voor dat de neuron goed gevuld is met calcium sonde. Deze techniek heeft een duidelijk voordeel bij het werken met hersenslice preparaten van volwassen slice preparaten, omdat deze neuronen bijzonder moeilijk te laden zijn met de meer gebruikelijke cell permeante proben en reduceert potentiële achtergrondfluorescentie problemen6-8.
Licht is de belangrijkste manier waarop zoogdieren hun circadiane klok aanpassen, die zich bevindt in de suprachiasmatische kern (SCN) van de hypothalamus. Lichtinformatie die in het netvlies wordt getransduceerd, wordt overgebracht 9-11 via de retinohypothalamische tractus (RHT) waar glutamaat wordt vrijgegeven in de SCN12,13. Glutamaat opent NMDA en AMPA ionotropische receptoren op SCN neuronen waardoor een influx van calcium en natrium ontstaat, en een intracellulaire signaleringskaskade wordt geïnitieerd die uiteindelijk leidt tot het veranderen van de expressie van een familie van klokgenen14-17 en faseverschuivingen van de circadiane klok18-20. Calcium kan echter neuronen binnentreden via ionotropische glutamaatreceptoren of door membraandepolarisatie en activering van spanningsafhankelijke calciumkanalen (VDCC)21. Daarom hebben we een experimenteel protocol ontwikkeld om de relatie tussen de intracellulaire calciumconcentratie en membraan elektrische activiteit in SCN neuronen te onderzoeken, zoals optreedt bij actiepotentiaalvuren en synaptische input22.

<table><tbody><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Scientific Co.</td><td>S271-3</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fisher Scientific Co.</td><td>P217-500</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4&bull;H2O</td><td>Sigma Chemical Co.</td><td>S-9638</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2&bull;6H2O</td><td>Fisher Scientific Co.</td><td>M33-500</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2&bull;2H2O</td><td>Fisher Scientific Co.</td><td>C79-500</td><td></td></tr><tr><td>D-glucose</td><td>Fisher Scientific Co.</td><td>D16-500</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Fisher Scientific Co.</td><td>S233-500</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Fisher Scientific Co.</td><td>S5-500</td><td></td></tr><tr><td>Potassium D-gluconate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G4500</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>Adenosine 5&prime;-triphosphate dipotassium salt dihydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8937</td><td></td></tr><tr><td>Guanosine 5&prime;-triphosphate tris salt</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9002</td><td></td></tr><tr><td>Agarose (ultrapure)</td><td>Life Technologies</td><td>15510-027</td><td>Gel pored into sterile Petri dish 6 mm thick layer</td></tr><tr><td>KOH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-6310</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S-5881</td><td></td></tr><tr><td>Bis-fura-2, hexapotassium salt</td><td>Invitrogen</td><td>B6810</td><td>Cell impermeant</td></tr><tr><td>Naam van apparatuur</td><td>Bedrijf</td><td>Catalogusnummer</td><td>Opmerkingen</td></tr><tr><td>Microtoom</td><td>Leica</td><td>VT1000S</td><td>Weefselsnijden</td></tr><tr><td>Cyanoacrylaatlijm (Roti-Coll1)</td><td>Carl Roth GmbH+Co</td><td>Art-Nr. 0258.1</td><td></td></tr><tr><td>Micro-elektrode-trekker</td><td>Narshige International USA</td><td>PP-83</td><td></td></tr><tr><td>Micro-elektrode capillaire buizen</td><td>World Precision Instruments</td><td>1B150F-4</td><td></td></tr><tr><td>Microfil 34 g</td><td>World Precision Instruments</td><td>MF34G-5</td><td></td></tr><tr><td>Spuitfilter</td><td>Corning</td><td>#431212</td><td></td></tr><tr><td>Microscoop</td><td>Leica</td><td>DM LFS</td><td>Met 4X, 40X UV en 63X UV objectieven, en epifluorescentie</td></tr><tr><td>CCD-camera</td><td>Hamamatsu</td><td>ORCA ER</td><td>12 bit CCD</td></tr><tr><td>Fura-2 Filter Cube</td><td>Chroma</td><td>71500A</td><td>Set met UG11 filter</td></tr><tr><td>Polychrome IV</td><td>Till Photonics GmBH</td><td></td><td>Monochroom</td></tr><tr><td>Ultraviolet blokkerende veiligheidsbril</td><td>Ultra-Violet Products</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EPC-9 versterker</td><td>HEKA Elektronik</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Metafluor</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td>Beeldverwerkingssoftware</td></tr><tr><td>Patchmaster</td><td>HEKA Elektronik</td><td></td><td>Dataverzamelingsoftware</td></tr><tr><td>Igor versie 6</td><td>Wavemetrics</td><td></td><td>Elektrofysiologie &amp; Ca2+ Data Analyse</td></tr><tr><td>VAPRO 5520</td><td>Westcor</td><td></td><td>Vapor pressure osmolmeter</td></tr></tbody></table>

gelijktijdige elektrofysiologisch registratie en calciumbeeldvorming van neuronen in de suprachiasmatische kern

Simultaneous Electrophysiological Recording and Calcium Imaging of Suprachiasmatic Nucleus Neurons

Gelijktijdige elektrofysiologische en fluorescerende beeldvormingsmethoden werden gebruikt om de rol van veranderingen in membraanpotentiaal of stroom in het reguleren van de intracellulaire calciumconcentratie te bestuderen. Veranderende omgevingsomstandigheden, zoals de licht-donkercyclus, kunnen neuronale en neurale netwerkactiviteit en de expressie van een familie van circadiane klokgenen binnen de suprachiasmatische kern (SCN), de locatie van de master circadiane klok in de zoogdierhersenen, aanpassen. Excitatorische synaptische transmissie leidt tot een toename van de post-synaptische Ca2+-concentratie waarvan wordt aangenomen dat deze de signaalroutes activeert die de ritmische expressie van circadiane klokgenen verschuiven. Hypothalamische plakjes die de SCN bevatten, werden patch-clamped met behulp van micro-elektroden gevuld met een interne oplossing die de calciumindicator bis-fura-2 bevat. Nadat er een verzegeling was gevormd tussen de micro-elektrode en de neuronale membraan van de SCN, werd het membraan verbroken met behulp van zachte zuiging en diffuseerde de calciumprobe in de neuronen waarbij zowel het soma als de dendrieten werden gevuld. Kwantitatieve ratiometrische metingen van de intracellulaire calciumconcentratie werden gelijktijdig opgenomen met het membraanpotentiaal of de stroom. Met behulp van deze methoden is het mogelijk om de rol van veranderingen in de intracellulaire calciumconcentratie, geproduceerd door synaptische activiteit en actiepotentiaalvuren van individuele neuronen, te bestuderen. In deze presentatie demonstreren we de methoden om gelijktijdig elektrofysiologische activiteit samen met intracellulair calcium op te nemen van individuele SCN-neuronen die worden behouden in hersensneden.

Met behulp van hypothalamus-hersensecties hebben we gelijktijdig veranderingen in het intracellulaire calcium gemeten in whole-cell modus onder zowel voltage- als current-clamp condities. De micro-elektrode die wordt getoond in Figuur 1A wordt bij hoge vergroting (40X of 63X UV-objectieven) met een kleine hoeveelheid aangebrachte positieve druk in positie gebracht. Na contact met het neuron wordt er door middel van zachte zuiging een gigaohm-seal gevormd. In voltage-clamp modus, nadat het membraanpotenti...

Procedures worden beschreven om gelijktijdige opnamen van membraanpotentiaal of stroom en veranderingen in intracellulaire calciumconcentratie uit te voeren. Suprachiasmatische nucleus-neuronen worden gevuld met de calciumindicator bis-fura-2 met behulp van een patch clamp-elektrode in de whole cell patch clamp-configuratie.

Gelijktijdige elektrofysiologisch registratie en calciumbeeldvorming van neuronen in de suprachiasmatische kern

Simultaneous electrophysiological and fluorescent imaging recording methods were used to study the role of changes of membrane potential or current in ...

Het algemene doel van het volgende experiment is om de interactie tussen veranderingen in spanning of stroom, zoals veranderingen in actiepotentiaalfrequentie en de intracellulaire calciumconcentratie in supra matische nucleus neuronen te onderzoeken. Dit wordt bereikt door de hersenplak voor de opname van SMA nucleus neuronen voor te bereiden met behulp van een micro-elektrode gevuld met de calciumgevoelige sonde. Als tweede stap wordt de micro-elektrode verzegeld met het neuronale membraan.Vervolgens wordt het neuronale membraan dat met de micro-elektrode is verzegeld, gebroken om de calciumfluorescentiesonde in individuele neuronen te introduceren en om samen met de elektrische activiteit van het membraan resultaten te verkrijgen die metingen van spanning of stroom en beelden van calciumprobefluorescentie bij twee golflengtes weerspiegelen. Verandering in de verhouding van fluorescentie bij deze golflengten weerspiegelt de verandering van intracellulair calcium binnen het neuron. Vervolgens kan analyse worden uitgevoerd om de calciumconcentratie van de cel te bepalen. Het grote voordeel van deze techniek is dat de veranderingen in elektrische activiteit van het membraan en intracellulair calcium veroorzaakt door synaptische activering gelijktijdig kunnen worden gemeten in individuele supra cosmetische nucleus neuronen.Deze techniek zal worden gedemonstreerd door mijn collega Dr. Robert Irwin. Begin deze procedure door de rattenhersenen op een cirkelvormig filterpapier te plaatsen dat bevochtigd is met snijvloeistof op een glazen petrischaal, rustend op ijs, snijd de hersencorona alleen om het cerebellum en de hersenstam te verwijderen, en snijd delen van de rechter en linkerkant van de cortex af, waardoor een blok hersenen overblijft dat de hypothalamus bevat en bewaar zorgvuldig de ventrale kant van de hersenen die de SCN optische zenuwen en optische chiasma bevat. Verspreid daarna een dunne laag Sano acryllijm, groot genoeg om de hersenen en aros blokken in een ijskoude microtoom snijdkamer te bevestigen.Breng de ijskoude hersenblokcozijde naar beneden op de lijm met de kant die de SCN bevat gepositioneerd voor het snijden eerst en de optische zenuwen vormen een v die omhoog wijst, plaats de aros blokken op drie andere kanten. Vervolgens vult u de kamer met ijskoud snijvocht en blijft u continu borrelen met carbogen. De Sano acryllijm zal stollen met vocht en houdt de hersenen en aros blokken op hun plaats.Snijd vervolgens de coronale hypothalamussneden die de SCN bevatten met een dikte van 220 tot 250 micron. Merk op dat de linker aros blok losraakte tijdens het snijden. Dit kan gebeuren als er onvoldoende lijm wordt aangebracht.Identificeer daarna de snede die de SCN bevat. Typisch wordt een snede gekozen waarbij het optische chiasma ongeveer twee tot vier millimeter breed is en eruitziet als een witte band met de SCN net dorssaal verschijnend als twee kleine indrukkingen in het optische chiasma aan weerszijden van de derde ventrikel. Breng een snede over naar de 36 graden Celsius opnamekamer gemonteerd op het podium van een microscoop.De kamer wordt gevuld met continu stromende opnameoplossing met twee milliliters per minuut. Geventileerd met 95% carbogen en voorverwarmd met een inline verwarmer. Identificeer de SCN door de twee doorschijnende SCN kernen aan weerszijden van de derde ventrikel, dorssaal van het optische chiasma, te observeren die eruitziet als een zwarte band wanneer het wordt verlicht door doorgelaten licht.Om de micro-elektrode voor opname voor te bereiden, vult u deze achteraan met de interne oplossing die de calcium sonde bevat, gefilterd met een vier millimeter spuitfilter via een microvulbuis. Plaats vervolgens de micro-elektrode in de micro-elektrodehouder. Breng vervolgens een kleine hoeveelheid continue positieve druk aan op de elektrode.Laat de micro-elektrode zakken in de opnamekamer met behulp van rood lichtverlichting. Plaats vervolgens de micro-elektrode over de SCN met behulp van een laag vermogen objectief. Schakel daarna de microscoop naar een hoge vergroting voor het selecteren van een subregio van SCN en een individuele SCN neuron.Ga door met het toepassen van lichte positieve druk op de micro-elektrode terwijl deze wordt geavanceerd naar het cellijf. Zodra het op het oppervlak is, brengt u lichte negatieve druk aan om een afdichting te vormen met een weerstand van drie tot 10 giga ohms. Pas daarna de membraanspanning aan op minus 60 millivolt.Breng vervolgens extra negatieve druk aan op de elektrode om de celmembraan te breken om de gehele cel patch clamping te vormen. Bij het betreden van de gehele celmodus zullen de soma en dendrieten van het SCN neuron worden gevuld met de fluorescente sonde. Meet de membraanspanning in stroomklemmodus of de stroom in spanningklemmodus.Terwijl de calcium sonde beeldgegevens worden gemonitord en opgeslagen, kunnen de verkregen beelden worden bekeken samen met een grafiek van 340 nanometer en 380 nanometer verhoudingsfluorescentiegegevens. Tijdens het experiment wordt een monochronometer gebruikt om de calciummetingen kwantitatief te verkrijgen door de SCN snel bloot te stellen aan UV-licht. Bij 340 nanometer en 380 nanometer passeert het excitatielicht een UG 11 optisch filter om harmonische golflengten boven de 400 nanometer te beperken en een 400 nanometer DCLP dichromatisch spiegel reflecteert het licht op het weefsel.Het uitgestraalde licht passeert een 510 nanometer emissiefilter en wordt gevangen door de camera. Om het resultaat te analyseren, selecteert u een gebied van belang vanuit het oorspronkelijke beeld en een achtergrondgebied om te worden omgezet in relatieve fluorescentie-intensiteits eenheden. De gegevens van het gebied van belang worden tijdens het experiment in realtime gezien.De achtergrond wordt later gebruikt in de daaropvolgende gegevensanalyse. Hier is een lichtveldbeeld van een coronale snede van hypothalamus die de SCN en het optische chiasma bevat. Een glazen micro-elektrode gevuld met interne oplossing die BISRA twee bevat, is verzegeld op een enkele neuron.Hier worden de calciumresponsen weergegeven voor een reeks van 50 spanningstappen die zijn opgenomen vanuit een spanningsklemgezette SCN neuron. De spanningsgestuurde natriumstromen werden geremd met 0,5 micromolair TTX, en dit is een schermopnamebeeld van somatische en dendritische

simultaneous-electrophysiological-recording-calcium-imaging

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

We hebben een methode ontwikkeld voor gelijktijdige functionele magnetische resonantie imaging en elektrofysiologische opname in het knaagdieren hersenen, een platform te bieden voor het onderzoek van de relatie tussen de neurale activiteit en het bloed zuurstof niveau afhankelijk (BOLD) MRI-signaal.

Gelijktijdig fMRI en elektrofysiologie bij knaagdieren Brain

Gelijktijdig opnemen van Calcium Signalen van geïdentificeerde neuronen en eetgedrag van de Drosophila melanogaster</em

Inzicht in de functie van de gewervelde centrale zenuwstelsel heeft opnames van vele neuronen omdat corticale functie ontstaat op het niveau van populaties van neuronen. Hier hebben we een optische methode om suprathreshold neurale activiteit op te nemen met single-cell en single-spike resolutie te beschrijven, dithered random-access scanning. Deze methode neemt somatische fluorescentie calcium signalen van tot 100 neuronen met een hoge temporele resolutie. Een maximum-likelihood-algoritme...

Optische registratie van suprathreshold neurale activiteit met single-cell en single-spike resolutie

De bereiding van acute hersenplakjes van hippocampi geïsoleerd, evenals de gelijktijdige elektrofysiologische opnames van astrocyten en neuronen...

Dubbele Elektrofysiologische Opnames van synaptisch-opgeroepen astrogliale en Neuronale responsen bij acute hippocampus Slices

We beschrijven de bereiding van dunne netvlies plakken uit het water levende tijger salamanders...

Gelijktijdige Whole-cell Opnames van Photoreceptors en Tweede-orde neuronen In amfibievliegtuig netvlies Slice Voorbereiding

Gelijktijdige extracellulaire langdurige opnames van twee verschillende hersengebieden neuropiles of twee verschillende anatomische traktaten werden opgericht in honingbijen. Deze opnamen kan de onderzoek temporele aspecten van neuronale verwerking in verschillende hersengebieden in het neuron en op het ensemble niveau in een dier gedragen.

Gelijktijdige Langdurige Recordings op Twee Neuronale Processing Fasen in Behaving Honingbijen

Dit protocol beschrijft een eenvoudige methode voor gelijktijdige opname van co gelokaliseerde elektro-encefalografie (EEG) en multi-laminaire lokale veld potentieel in een narcose rat. Een burr gat geboord in de schedel voor het inbrengen van een micro-elektrode is aangetoond dat het te verwaarlozen vervorming van het EEG signaal veroorzaken.

Gelijktijdige opname van elektro-encefalografie mede gelokaliseerde en lokale veld potentieel in knaagdier

Deze studie introduceert een methode voor het gelijktijdig opnemen van lokale veld potentieel in de hersenen, elektrocardiogrammen, electromyograms en signalen voor een vrij bewegend rat te ademen. Deze techniek, die experimentele kosten vermindert en vereenvoudigt gegevensanalyse, zal bijdragen aan het begrip van de interacties tussen de hersenen en perifere organen.

Gelijktijdige opnamen van corticale lokale veld Potentials, elektrocardiogram Electromyogram en ademhaling ritme van een vrij bewegende Rat

Netvliesprothesen hebben het vermogen om visuele waarnemingen te genereren. Om de ontwikkeling van nieuwe prothesen te bevorderen, zijn ex vivo-methoden nodig om apparaten te testen voordat ze worden geïmplanteerd. Dit artikel biedt een uitgebreid protocol voor het bestuderen van calciumactiviteit in de retinale ganglioncellaag bij blootstelling aan elektrische stimulatie.

Calciumbeeldvorming in elektrisch gestimuleerde plat gemonteerde netvliezen

Dit protocol biedt een uitgebreide beschrijving van een methode voor het gelijktijdig registreren van calciumsignalen van neuronen en astrocyten over meerdere geheugengerelateerde hersengebieden en demonstreert de toepassing ervan tijdens een leer- en geheugengedragsparadigma.

Een tweekleurige vezelfotometriemethode voor het registreren van activiteit van astrocytenneuronen over meerdere hersengebieden tijdens leer- en geheugengedrag

Leer gelijktijdige elektrofysiologische registratie en calciumbeeldvorming van neuronen in de suprachiasmatische kern met patch clamp en bis-fura-2. Deze methode ondersteunt onderzoek naar neurale activiteit.

Gelijktijdige elektrofysiologisch registratie en calciumbeeldvorming van neuronen in de suprachiasmatische kern

Meer video's verkennen