Gelijktijdige elektrofysiologisch registratie en calciumbeeldvorming van neuronen in de suprachiasmatische kern
8 december 2013
Procedures worden beschreven om gelijktijdige opnamen van membraanpotentiaal of stroom en veranderingen in intracellulaire calciumconcentratie uit te voeren. Suprachiasmatische nucleus-neuronen worden gevuld met de calciumindicator bis-fura-2 met behulp van een patch clamp-elektrode in de whole cell patch clamp-configuratie.
Het algemene doel van het volgende experiment is om de interactie tussen veranderingen in spanning of stroom, zoals veranderingen in actiepotentiaalfrequentie en de intracellulaire calciumconcentratie in supra matische nucleus neuronen te onderzoeken. Dit wordt bereikt door de hersenplak voor de opname van SMA nucleus neuronen voor te bereiden met behulp van een micro-elektrode gevuld met de calciumgevoelige sonde. Als tweede stap wordt de micro-elektrode verzegeld met het neuronale membraan.
Vervolgens wordt het neuronale membraan dat met de micro-elektrode is verzegeld, gebroken om de calciumfluorescentiesonde in individuele neuronen te introduceren en om samen met de elektrische activiteit van het membraan resultaten te verkrijgen die metingen van spanning of stroom en beelden van calciumprobefluorescentie bij twee golflengtes weerspiegelen. Verandering in de verhouding van fluorescentie bij deze golflengten weerspiegelt de verandering van intracellulair calcium binnen het neuron. Vervolgens kan analyse worden uitgevoerd om de calciumconcentratie van de cel te bepalen. Het grote voordeel van deze techniek is dat de veranderingen in elektrische activiteit van het membraan en intracellulair calcium veroorzaakt door synaptische activering gelijktijdig kunnen worden gemeten in individuele supra cosmetische nucleus neuronen.
Deze techniek zal worden gedemonstreerd door mijn collega Dr. Robert Irwin. Begin deze procedure door de rattenhersenen op een cirkelvormig filterpapier te plaatsen dat bevochtigd is met snijvloeistof op een glazen petrischaal, rustend op ijs, snijd de hersencorona alleen om het cerebellum en de hersenstam te verwijderen, en snijd delen van de rechter en linkerkant van de cortex af, waardoor een blok hersenen overblijft dat de hypothalamus bevat en bewaar zorgvuldig de ventrale kant van de hersenen die de SCN optische zenuwen en optische chiasma bevat. Verspreid daarna een dunne laag Sano acryllijm, groot genoeg om de hersenen en aros blokken in een ijskoude microtoom snijdkamer te bevestigen.
Breng de ijskoude hersenblokcozijde naar beneden op de lijm met de kant die de SCN bevat gepositioneerd voor het snijden eerst en de optische zenuwen vormen een v die omhoog wijst, plaats de aros blokken op drie andere kanten. Vervolgens vult u de kamer met ijskoud snijvocht en blijft u continu borrelen met carbogen. De Sano acryllijm zal stollen met vocht en houdt de hersenen en aros blokken op hun plaats.
Snijd vervolgens de coronale hypothalamussneden die de SCN bevatten met een dikte van 220 tot 250 micron. Merk op dat de linker aros blok losraakte tijdens het snijden. Dit kan gebeuren als er onvoldoende lijm wordt aangebracht.
Identificeer daarna de snede die de SCN bevat. Typisch wordt een snede gekozen waarbij het optische chiasma ongeveer twee tot vier millimeter breed is en eruitziet als een witte band met de SCN net dorssaal verschijnend als twee kleine indrukkingen in het optische chiasma aan weerszijden van de derde ventrikel. Breng een snede over naar de 36 graden Celsius opnamekamer gemonteerd op het podium van een microscoop.
De kamer wordt gevuld met continu stromende opnameoplossing met twee milliliters per minuut. Geventileerd met 95% carbogen en voorverwarmd met een inline verwarmer. Identificeer de SCN door de twee doorschijnende SCN kernen aan weerszijden van de derde ventrikel, dorssaal van het optische chiasma, te observeren die eruitziet als een zwarte band wanneer het wordt verlicht door doorgelaten licht.
Om de micro-elektrode voor opname voor te bereiden, vult u deze achteraan met de interne oplossing die de calcium sonde bevat, gefilterd met een vier millimeter spuitfilter via een microvulbuis. Plaats vervolgens de micro-elektrode in de micro-elektrodehouder. Breng vervolgens een kleine hoeveelheid continue positieve druk aan op de elektrode.
Laat de micro-elektrode zakken in de opnamekamer met behulp van rood lichtverlichting. Plaats vervolgens de micro-elektrode over de SCN met behulp van een laag vermogen objectief. Schakel daarna de microscoop naar een hoge vergroting voor het selecteren van een subregio van SCN en een individuele SCN neuron.
Ga door met het toepassen van lichte positieve druk op de micro-elektrode terwijl deze wordt geavanceerd naar het cellijf. Zodra het op het oppervlak is, brengt u lichte negatieve druk aan om een afdichting te vormen met een weerstand van drie tot 10 giga ohms. Pas daarna de membraanspanning aan op minus 60 millivolt.
Breng vervolgens extra negatieve druk aan op de elektrode om de celmembraan te breken om de gehele cel patch clamping te vormen. Bij het betreden van de gehele celmodus zullen de soma en dendrieten van het SCN neuron worden gevuld met de fluorescente sonde. Meet de membraanspanning in stroomklemmodus of de stroom in spanningklemmodus.
Terwijl de calcium sonde beeldgegevens worden gemonitord en opgeslagen, kunnen de verkregen beelden worden bekeken samen met een grafiek van 340 nanometer en 380 nanometer verhoudingsfluorescentiegegevens. Tijdens het experiment wordt een monochronometer gebruikt om de calciummetingen kwantitatief te verkrijgen door de SCN snel bloot te stellen aan UV-licht. Bij 340 nanometer en 380 nanometer passeert het excitatielicht een UG 11 optisch filter om harmonische golflengten boven de 400 nanometer te beperken en een 400 nanometer DCLP dichromatisch spiegel reflecteert het licht op het weefsel.
Het uitgestraalde licht passeert een 510 nanometer emissiefilter en wordt gevangen door de camera. Om het resultaat te analyseren, selecteert u een gebied van belang vanuit het oorspronkelijke beeld en een achtergrondgebied om te worden omgezet in relatieve fluorescentie-intensiteits eenheden. De gegevens van het gebied van belang worden tijdens het experiment in realtime gezien.
De achtergrond wordt later gebruikt in de daaropvolgende gegevensanalyse. Hier is een lichtveldbeeld van een coronale snede van hypothalamus die de SCN en het optische chiasma bevat. Een glazen micro-elektrode gevuld met interne oplossing die BISRA twee bevat, is verzegeld op een enkele neuron.
Hier worden de calciumresponsen weergegeven voor een reeks van 50 spanningstappen die zijn opgenomen vanuit een spanningsklemgezette SCN neuron. De spanningsgestuurde natriumstromen werden geremd met 0,5 micromolair TTX, en dit is een schermopnamebeeld van somatische en dendritische
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel beschrijft procedures voor gelijktijdige registraties van membraanpotentiaal of stroom en veranderingen in de intracellulaire calciumconcentratie in neuronen van de nucleus suprachiasmaticus. Met behulp van een patchclamp-elektrode worden de neuronen gevuld met de calciumindicator bis-fura-2 om deze metingen te faciliteren.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk gebied
- Neurowetenschappen
- Elektrofysiologie
- Calcium-imaging
Achtergrond
- Het begrijpen van neuronale activiteit is essentieel voor neurowetenschappelijk onderzoek.
- Calciumionen spelen een belangrijke rol bij neuronale signalering.
- Gelijktijdige meting van elektrische activiteit en calciumconcentratie biedt inzicht in de neuronale functie.
- De nucleus suprachiasmaticus is belangrijk voor circadiane ritmes.
Doel van de studie
- Om de interactie tussen veranderingen in het membraanpotentiaal en de intracellulaire calciumconcentratie te onderzoeken.
- Om een methode te ontwikkelen voor gelijktijdige registraties in individuele neuronen.
- Om het begrip van de effecten van synaptische activatie op de neuronale activiteit te verbeteren.
Gebruikte methoden
- Voorbereiding van hersenplakjes voor registratie.
- Gebruik van een micro-elektrode gevuld met een calciumgevoelige probe.
- Afdichten van de micro-elektrode tegen het neuronale membraan.
- Doorbreken van het membraan om de calciumprobe te introduceren en elektrische activiteit te registreren.
Belangrijkste resultaten
- Gelijktijdige metingen van spanning/stroom en calciumfluorescentie werden verkregen.
- Veranderingen in fluorescentieverhoudingen gaven wijzingen op variaties in de intracellulaire calciumconcentraties.
- De resultaten toonden het vermogen aan om de effecten van synaptische activatie op individuele neuronen te meten.
- De analyse verschaft inzicht in de veranderingen van de calciumconcentratie binnen het neuron.
Conclusies
- Deze techniek maakt gedetailleerde studie van neuronale activiteit en calciumdynamiek mogelijk.
- Het kan worden toegepast om de rol van calcium bij synaptische transmissie te onderzoeken.
- De methode vergroot ons begrip van de neuronale functie in de nucleus suprachiasmaticus.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Management
Gelijktijdige elektrofysiologische metingen en calcium-imaging in neuronen van de nucleus suprachiasmaticus maken een mechanistische risicoreductie bij de validatie van circadiane targets mogelijk door membraanexciteerbaarheid te koppelen aan intracellulaire signaleringsdynamiek. Deze aanpak vergroot het voorspellend vertrouwen in de vroege ontdekkingsfase door te kwantificeren hoe neuronale vuurpatronen calciumafhankelijke pathways moduleren die betrokken zijn bij ritmeregulatie. De methode biedt een ziekterellevant systeem voor het screenen van verbindingen die de expressie van circadiane klokgenen beïnvloeden via real-time, duale-parameter read-outs.
Strategische toepassingen in biofarma R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Onderzoekt therapeutische hypothesen door het correleren van actiepotentiaal-firing met calciumtransiënten in SCN-neuronen.
- Operationele waarde: Maakt biologische risicoreductie van circadiane targets mogelijk door directe meting van de excitatie-secretiekoppeling.
- Voorspellende waarde: Ondersteunt portfoliotriage door te kwantificeren hoe verschuivingen in het membraanpotentiaal de calciumafhankelijke expressie van klokgenen aansturen.
Screening & assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Bereidt gevalideerde neuronale systemen voor op downstream assay-standaardisatie met behulp van ratiometrische calciumimaging.
- Operationele waarde: Levert kwantitatieve, reproduceerbare resultaten via 340/380 nm fluorescentieverhoudingsmetingen.
- Schaalbaarheidswaarde: Ondersteunt hergebruik van het platform voor het evalueren van effecten van verbindingen op neuronale exciteerbaarheid en calciumflux.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Behoudt de relevantie voor de ziekte door circadiane klokmechanismen in een centrale pacemakerkern te onderzoeken.
- Operationele waarde: Waarborgt translationele continuïteit van ontdekking tot preklinische validatie via geconserveerde elektrofysiologische calciumkoppeling.
- Risicobeheersing: Informeert risico-gecorrigeerde beslissingen over verdere ontwikkeling door verbindingen te identificeren die de neuronale integratie van de SCN verstoren.
Integratie van pipeline en workflow
De methode kan worden geïntegreerd in vroege discovery-workflows door hypothese-testen van circadiane targets mogelijk te maken via gelijktijdige voltage- en calciummetingen, wat de identificatie van lead-compounds ondersteunt via functionele screening van neuronale activiteit.
- Discovery Biology: Ondersteunt de verduidelijking van signaalpaden door synaptische activatie te koppelen aan calciumafhankelijke signalering in SCN-neuronen.
- Screening: Maakt assays gereed voor gebruik via stabiele, duale-parameter registraties in hersenplakpreparaten.
- Analytics: Biedt ratiometrische calcium- en elektrofysiologische read-outs die kwantitatieve vergelijking van neuronale responsen mogelijk maken.
- Translationeel onderzoek: Sluit aan bij preklinische continuïteit door circadiane regulatie te modelleren in een ziekte-relevant neuraal circuit.
- Enterprise Reuse: Vestigt een herbruikbare capaciteit voor het evalueren van chronobiotische verbindingen over verschillende discovery-campagnes heen.
Operationele en zakelijke impact
- Wetenschappelijke waarde: Predictieve zekerheid bij targetvalidatie door mechanisch inzicht in calciumafhankelijke circadiane regulatie.
- Operationele waarde: Standaardisatie en reproduceerbaarheid via ratiometrische imaging en patchclamp-elektrofysiologie.
- Strategische waarde: Verbeterde go/no-go-beslissingen door het verminderen van mechanische ambiguïteit in de modulatie van circadiane pathways.
- Impact op portfolio: Risico-gecorrigeerde prioritering op basis van functionele effecten op SCN-neuronale integratie en klokgendynamiek.
Overwegingen bij de implementatie
- Vereist expertise in patchclamp-elektrofysiologie en fluorescentiemicroscopie.
- Afhankelijk van instrumentatie voor excitatie op twee golflengten en emissiefiltering.
- Vereist standaardisatie van het laden van calciumindicatoren en ratiometrische analyse tussen teams.
- Overwegingen voor adaptatie omvatten variërende neuronale subtypes en specificiteit van hersengebieden.
- Praktische beperkingen omvatten risico's van UV-licht en beperkingen in de levensvatbaarheid van coupes tijdens langdurige opnames.
