Name: Calciumfosfaattransfectie van Primary hippocampus neuronen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-12T18:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 22 s
Description: Leer calciumfosfaattransfectie van primaire hippocampusneuronen voor neurobiologisch onderzoek. Deze efficiënte methode bereikt tot 50% transfectie-efficiëntie en is kosteneffectief voor genintroductie in moeilijk te transfecteren cellen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit werk wordt ondersteund door NIH-subsidie ​​NS065183 en start-up fondsen van de Rutgers Robert Wood Johnson Medical School.

1. Voorbereiden van Rat Astrocyte Cultuur voor geconditioneerde media en Astrocyte-neuron Coculturen. <ol><li> Bereid dissectie buffer (BSS, zie tabel 1 voor recept) en bewaar bij 4 ° C tot klaar voor gebruik. </li><li> Verdoven neonatale rat pups (P0-P2) met isofluraan in een bekerglas van 500 ml. </li><li> Wanneer pups zijn immobiel, spray met 70% ethanol en onthoofden. </li><li> Verwijder de hersenen. <ol><li> Houd het hoofd vast met een paar Dumont # 5 tang, en gebruik fijne schaar om een ​​middellijn incisie door de huid en de schedel. </li><li> Expose de hersenen door te reflecteren de schedel aan de zijkanten, en verwijder de hersenen in een schotel met koud BSS. </li></ol></li><li> Scheid de hersenhelften van het diencephalon en de hersenstam onder een dissectie scope. Verwijder alle hersenvliezen zorgvuldig door het stabiliseren van het weefsel met een pincet en voorzichtig wegrijden de hersenvliezen met een ander paar pincetten. </li><li> Verzamel alle hemisferen in een 60 mm schaal. Met behulp van kleine schaar, gehakt weefsel zo fijn mogelijk. Vervolgens transfer gehakt weefsel in een 50 ml conische buis. </li><li> Voeg 1,5 ml van 1% DNase I en 1,5 ml 2,5% trypsine en 12 ml BSS (totaal volume van 15 ml) tot hersenen. Incubeer in een schuddend waterbad gedurende 15 minuten bij 37 ° C. Om een ​​goede menging te verzekeren, wordt buis wervelde door de hand om de 5 minuten. </li><li> Transfer supernatant door een 70 um cel zeef over een nieuwe 50 ml conische buis. Voeg 3 ml FBS dit supernatant. </li><li> Om de resterende stukken, voeg 13,5 ml van BSS en 1,5 ml 2,5% trypsine en incubeer in het schudden waterbad nog 15 min.. </li><li> Draagt ​​de resterende supernatant door de cel zeef en combineren met de bovenstaande vanaf stap 1.8. </li><li> Centrifugeer bij 1000 rpm gedurende 5 minuten om de cellen te pelleteren. </li><li> Resuspendeer pellets in 5 ml gliale media. Supernatans opnieuw worden gecentrifugeerd om de resterende cellen neer. </li><li> Tellen cellen met een hemocytometer. </li><li> Plaat celIs bij een dichtheid van 1 x 10 7 per 150 cm2 kolf. </li><li> Verander media frisse gliale media de dag na plating. Daarna voeden cellen twee keer per week met gliale media. </li><li> Wanneer de cellen&gt; 80% confluentie (ongeveer 10 dagen na plating) hebben bereikt, bevriezen de cellen in 90% paard serum en 10% DMSO en houden voorraden in vloeibare stikstof. Cellen worden ingevroren bij 2 x 10 6 per flacon. Ongeveer 5 flacons kunnen uit elke kolf worden bevroren. </li><li> Ongeveer 10-14 dagen voor het opzetten van de hippocampus cultuur, zijn gliacellen vergulde uit de bevroren voorraden. We meestal plaat vijf 6-well platen, die voldoende is om de groei van 90 dekglaasjes van hippocampale neuronen (drie 15 mm ronde dekglaasjes per putje) ondersteunen. We hebben ook een extra plaat acht tot tien 60 mm schalen van gliacellen, die wordt gebruikt voor het conditioneren N2.1 media voor transfectie. De dag voor neuronale cultuur moeten de cellen worden gevoed met NB27 media. De astrocyten moet idealiter&gt; 90% confluent bij This punt. We vinden dat sterk bevriezen vermindert het aantal microglia in het astroglial kweken. Aangezien toegenomen neurotoxiciteit wordt waargenomen wanneer microglia aanwezig in de astroglial culturen, gebruiken wij altijd astrogliale cultuur bereid uit bevroren voorraden voor coculture met neuronen. </li></ol> 2. Neuronale Cultuur <ol><li> Schoon glas dekglaasjes door eerst spoelen in milliQ water 2x. Vervolgens worden ze geweekt in geconcentreerd salpeterzuur gedurende 24 uur en gespoeld met milliQ water gedurende minstens vijf keer in totaal 2 uur. Coverslips worden gedroogd en gesteriliseerd door bakken in een oven bij 225 ° C gedurende 6 uur. </li><li> Transfer coverslips tot 60 mm gerechten na sterilisatie. Plaats vier punten steriele paraffine nabij de buitenrand van elk dekglaasje blijven neuronen scheiden van gliacellen tijdens co-kweek. </li><li> Coat dekglaasjes met 1 mg / ml poly-L-lysine in 0,1 M boraatbuffer overnacht in 37 ° C incubator. </li><li> De volgende dag, spoel dekglaasjes tweemaal in steriele milliQ water gedurende ten minste 15 minuten elk. Zij worden vervolgens gedurende een nacht geïncubeerd in plating media 37 ° C incubator. </li><li> Euthanaseren zwangere rat (E18) door isofluraananesthesie gevolgd door pneumothorax, en euthanaseren embryonale ratten door onthoofding. Verwijder de hersenen en ontleden de hersenhelften zoals hierboven beschreven. </li><li> Ontleden de hippocampus van de hersenhelft. Plaats alle hippocampus in een 15 ml conische buis en verteren met 0,25% trypsine (0,5 ml 2,5% trypsine, 4,5 ml BSS) bij 37 ℃ gedurende 15 minuten. </li><li> Verteerd hippocampus worden gespoeld in BSS 3x gedurende 5 minuten elk. Ze worden vervolgens verpulverd met een glazen Pasteur pipet en de celdichtheid wordt bepaald met behulp van een hemocytometer. Neuronen worden vervolgens geënt bij een dichtheid van 2 x 10 5 cellen per 60 mm schaal. </li><li> Ongeveer 2-4 uur na plating, overdracht coverslips met aangehechte neuronen om de schalen met astroglial cellen, met neuronen naar beneden richting de glia. Bij DIV3 toevoegen cytosinearabinoside aan decellen in een eindconcentratie van 5 uM tot glia proliferatie te stoppen. </li></ol> 3. Calcium Transfection <ol><li> Voorwaarde N2.1 media op glia de dag voor transfectie. </li><li> Op de dag van de transfectie, neem geconditioneerde N2.1 media af van glia en over in een nieuw gerecht. Transfer coverslips met neuronen in de geconditioneerde N2.1 media. Laat equilibreren incubator gedurende 10-30 minuten. </li><li> Een set van steriele buizen combineren 1-4 ug DNA, 12,5 gl 2 M CaCl2 en steriel H2O een totaal volume van 100 pl. Om een ​​tweede stel buizen, voeg 100 ul van 2x HBS. </li><li> Voeg ⅛ volume 2x HBS (12,5 pl) tegelijkertijd aan de buis met de CaCl 2 / DNA mengsel vortexen gedurende enkele seconden per keer. Laat de buizen te zitten voor 15 minuten. </li><li> Na 15 min incubatie, voeg de transfectie mengsel druppelsgewijs aan de cellen. Incubeer gedurende 1-1,5 uur. Een laag zand-achtige neerslagen moet zichtbaar zijnonder de microscoop met een 10X objectief. </li><li> Na incubatie, spoel coverslips tweemaal met warm HBS wasbuffer. </li><li> Terug dekglaasjes originele gerechten met glia, voeg kynurenic zuur tot een eindconcentratie van 0,5 mM. </li><li> Getransfecteerde neuronen live worden afgebeeld of verwerkt voor immunocytochemie al de volgende dag. Neuronen kan overleven drie weken na transfectie. </li></ol>

<ol><li>Karra, D., Dahm, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfection+techniques+for+neuronal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Transfection techniques for neuronal cells.</a> J. Neurosci. 30, 6171-6177 (2010).</li>
<li>Zeitelhofer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-efficiency+transfection+of+mammalian+neurons+via+nucleofection%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">High-efficiency transfection of mammalian neurons via nucleofection.</a> Nat. Protoc. 2, 1692-1704 (2007).</li>
<li>Janas, J., Skowronski, J., Van Aelst, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentiviral+delivery+of+RNAi+in+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Method+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Lentiviral delivery of RNAi in hippocampal neurons.</a> Method Enzymol. 406, 593-605 (2006).</li>
<li>Graham, F. L., vander Eb, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+technique+for+the+assay+of+infectivity+of+human+adenovirus+5+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">A new technique for the assay of infectivity of human adenovirus 5 DNA.</a> Virology. 52, 456-467 (1973).</li>
<li>Craig, A. M. Transfecting cultured neurons. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCraig%2C+AM+%22Culturing+Nerve+Cells%22">Culturing Nerve Cells</a>. Banker, G. aG. K. , 2nd edition, MIT Press. Cambridge, MA. (1998).</li>
<li>Alavian, K. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bcl-xL+regulates+metabolic+efficiency+of+neurons+through+interaction+with+the+mitochondrial+F1FO+ATP+synthase%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Bcl-xL regulates metabolic efficiency of neurons through interaction with the mitochondrial F1FO ATP synthase.</a> Nat. Cell Biol. 13, 1224-1233 (2011).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+synaptic+function+by+VAC14%2C+a+protein+that+regulates+the+phosphoinositides+PI%283%2C5%29P%282%29+and+PI%285%29P%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Modulation of synaptic function by VAC14, a protein that regulates the phosphoinositides PI(3,5)P(2) and PI(5)P.</a> EMBO J. 31, 3442-3456 (2012).</li>
<li>Dudek, H., Ghosh, A., Greenberg, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+phosphate+transfection+of+DNA+into+neurons+in+primary+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Protoc.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Calcium phosphate transfection of DNA into neurons in primary culture.</a> Curr. Protoc. Neurosci. Chapter 3, Unit 3 11(2001).</li>
<li>Goslin, K. A. H., Banker, G. Rat Hippocampal Neurons in Low-Density Culture. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGoslin%2C+KAH+%22Culturing+Nerve+Cells%22">Culturing Nerve Cells</a>. Banker, G. aG. K. , MIT Press. Cambridge, MA. (1998).</li>
<li>Kohrmann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast%2C+convenient%2C+and+effective+method+to+transiently+transfect+primary+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Res%22%5BJournal%5D)">Fast, convenient, and effective method to transiently transfect primary hippocampal neurons.</a> J. Neurosci. Res. 58, 831-835 (1999).</li>
<li>Jiang, M., Chen, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+Ca2%2B-phosphate+transfection+efficiency+in+low-density+neuronal+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">High Ca2+-phosphate transfection efficiency in low-density neuronal cultures.</a> Nat. Protoc. 1, 695-700 (2006).</li>
<li>Goetze, B., Grunewald, B., Baldassa, S., Kiebler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemically+controlled+formation+of+a+DNA%2Fcalcium+phosphate+coprecipitate%3A+application+for+transfection+of+mature+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Chemically controlled formation of a DNA/calcium phosphate coprecipitate: application for transfection of mature hippocampal neurons.</a> J. Neurobiol. 60, 517-525 (2004).</li>
</ol>

Geen tegenstrijdige geïnteresseerd verklaard.

Er zijn een aantal belangrijke parameters die moeten zorgvuldig worden gecontroleerd voor consistent succesvol transfecties 10,11. De meest kritische parameter voor calciumfosfaat transfectie is de pH van 2x HBS, die in onze handen varieert meestal tussen 7,10-7,15. Wij raden het maken van drie partijen van de voorraden met pH-waarden in stappen van 0,05 om rekening te houden met het verschil tussen de pH-meter. Als alternatief, de Clontech zoogdieren transfectiekit biedt 2x HBS die consequent levert goede ef...

Primaire neuronen zijn een van de moeilijkste celtypen te transfecteren ze postmitotic en zijn zeer gevoelig voor micro-omgevingsveranderingen. Er zijn vier courante methoden voor expressie van exogene genen en korte haarspeld RNA (shRNAs) in deze cellen 1. Elk heeft zijn eigen voor-en nadelen. Zo wordt elektroporatie meestal uitgevoerd op vers geïsoleerde neuronen 2, zoals cellen in cuvetten voor transfectie moet worden overgedragen. Virusinfectie kan bereiken doorgaans zeer hoog rendement 3, maar is meer arbeidsintensief en riskant voor de exploitanten. Veel lipide gemedieerde transfectie reagentia zijn commercieel verkrijgbaar, met wisselend succes in neuronen en verschillende niveaus van cytotoxiciteit. Calciumfosfaattransfectie is een gemakkelijke en economische methode voor het introduceren van vreemde genen in neuronen. De werkwijze werd eerst gebruikt om adenovirus DNA in zoogdierlijke cells door Graham en Van der Eb (1973) 4. Transfectie werd uitgevoerd door mengen van calciumchloride met recombinant DNA in een fosfaatbuffer. Dit maakt de vorming van DNA / calciumfosfaat precipitaten die bij geleidelijk vallen op een monolaag van cellen hechten aan het celoppervlak worden door endocytose taken en voert uiteindelijk de kern 5. Dit proces leidt tot de expressie van geïntroduceerde vreemde genen in de doelcel. Typische rendementen van calciumfosfaattransfectie bereik tussen 0,5-5% 6-8. Echter, met een zorgvuldige optimalisatie en consistente uitvoering van het experimentele protocol, is het mogelijk om een ​​transfectie-efficiëntie van bijna 50% bereikt. Hier beschrijven we gedetailleerd protocol voor calciumfosfaat transfectie van primaire hippocampale neuronen, die worden gekweekt samen met astrogliale cellen in een sandwich formaat 9.

<table><tbody><tr><td>Dumont #5 forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-20</td><td></td></tr><tr><td>Fine scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>14090-09</td><td>recht / scherp 8,5 cm</td></tr><tr><td>Vannas-Tubinger veerschaar</td><td>Fine Science Tools</td><td>15008-08</td><td>gebogen / scherp / 8,5 cm / 5 mm snijrand</td></tr><tr><td>Standaard forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11000-16</td><td></td></tr><tr><td>Student chirurgische schaar</td><td>Fine Science Tools</td><td>91401-14</td><td>blunt / 14,5 cm</td></tr><tr><td>Veerschaar</td><td>Fine Science Tools</td><td>15006-09</td><td>zijwaarts gebogen / 9 cm / 10 mm snijrand</td></tr><tr><td>Isofluraan</td><td>Webster Veterinary</td><td>14043-225-06</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-lysine</td><td>Sigma</td><td>P2636</td><td></td></tr><tr><td>MEM</td><td>Sigma</td><td>M2279</td><td></td></tr><tr><td>100 mM Natriumpyruvaat</td><td>Sigma</td><td>S8636</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>10x HBSS</td><td>Sigma</td><td>H4385</td><td></td></tr><tr><td>1 M HEPES, pH 7.3</td><td>Gibco/Invitrogen</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Gibco/Invitrogen</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal Media</td><td>Gibco/Invitrogen</td><td>21130-049</td><td></td></tr><tr><td>B27 Supplement (50x)</td><td>Gibco/Invitrogen</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>N2 Supplement</td><td>Gibco/Invitrogen</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>Ovalbumine</td><td>Sigma</td><td>A5503</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Gibco/Invitrogen</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>2,5% Trypsin</td><td>Gibco/Invitrogen</td><td>15090-046</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Sigma</td><td>DN-25</td><td></td></tr><tr><td>Cytosine arabinoside</td><td>Calbiochem/EMD Millipore</td><td>251010</td><td></td></tr><tr><td>Kynureninezuur</td><td>Sigma</td><td>K3375</td><td></td></tr></tbody></table>

calciumfosfaattransfectie van primary hippocampus neuronen

Calcium Phosphate Transfection of Primary Hippocampal Neurons

Calciumfosfaatprecipitatie een gemakkelijke en economische methode voor transfectie van gekweekte cellen. Met optimalisatie is het mogelijk om deze methode te gebruiken op moeilijk te transfecteren cellen zoals primaire neuronen. Hier beschrijven we gedetailleerd protocol voor calciumfosfaattransfectie van hippocampale neuronen gekweekt samen met astrogliale cellen.

Wanneer de verschillende parameters van de transfectie worden geoptimaliseerd en zorgvuldig gecontroleerd van experiment tot experiment, is het mogelijk transfectie efficiënties van tot 50% te verkrijgen. Figuur 1 toont een gebied van neuronen die zijn getransfecteerd met GFP op DIV4. Het veld bevat een totaal van 28 neuronen, waaronder 16 werden getransfecteerd. Dit vertegenwoordigt een rendement van meer dan 50%. Een steekproef van andere velden op dezelfde dekglaasje toont een totaal rendement van on...

Calciumfosfaattransfectie van Primary hippocampus neuronen

Calcium phosphate precipitation is a convenient and economical method for transfection of cultured cells. With optimization, it is possible to use this ...

Het algemene doel van deze procedure is het introduceren van genen en korte hairpin RNA's in gekweekte neuronen. Dit wordt bereikt door eerst astroglia culturen van neonatale ratten op te zetten om de neuronale groei te ondersteunen. Hippocampusneuronen van E 18-ratten worden vervolgens meegekweekt met de gliacellen.De volgende stap is het transfecteren van de hippocampusneuronen met behulp van een calciumfosfaatprecipitatiemethode, de getransfecteerde neuronen worden vervolgens gevisualiseerd door middel van fluorescentiemicroscopie. Met deze methoden kan de transfectie-efficiëntie oplopen tot 50% Het belangrijkste voordeel van deze techniek boven bestaande methoden is dat het relatief eenvoudig, economisch en zeer efficiënt is. Hoewel ons protocol zich richt op de transfectie van gekweekte hippocampusneuronen, kan het ook worden toegepast op andere moeilijk te transfecteren cellijnen.Voor dit protocol moet BSS-dissectiebuffer bij vier graden Celsius klaar voor gebruik zijn voorbereid. Na het onthoofden van een jong, houd het hoofd stevig vast met een paar nummer vijf forceps en gebruik een fijne schaar om een middenlijnsnede door de huid en schedel te maken. Breng de hersenen blo

calcium-phosphate-transfection-of-primary-hippocampal-neurons

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

De dissectie en de groei van cellen van een persoon hersengebied vergemakkelijkt onderzoek van cellulaire en fysiologische parameters. We beschrijven een methode voor primaire celcultuur dat neuron verrijkte culturen produceert in een serum-vrije omgeving.

Primaire Cultuur van hippocampale neuronen van P0 pasgeboren ratten

Live-cell imaging is met name van nut bij het bestuderen van de dynamiek van organel mensenhandel. Hier beschrijven we een protocol voor live beeldvorming van dense-core blaasjes in gekweekte neuronen met behulp van wide-field fluorescentie microscopie. Dit protocol is flexibel en kan worden aangepast aan image andere organellen, zoals mitochondriën, endosomen, en peroxisomen.

Live-Imaging van dicht-core Blaasjes in het jeugdwerk Gekweekte hippocampale neuronen

Dit protocol beschrijft de stappen die nodig zijn om te ontleden, transfecteren via elektroporatie en cultuur muis hippocampus en corticale neuronen. Op korte termijn culturen kan worden gebruikt voor studies van axon uitgroei en begeleiding, terwijl de lange-termijn culturen kunnen worden gebruikt voor onderzoek naar synaptogenese en dendritische rug analyse.

Nucleofection en Primaire Cultuur van de embryonale Mouse hippocampus en de corticale neuronen

Source: Calvo-Rodríguez, et al. Fluorescence and Bioluminescence Imaging of Subcellular Ca2+ in Aged Hippocampal Neurons. J. Vis. Exp. (2015). This video demonstrates the use of fluorescence imaging to measure cytosolic calcium levels in short-term and long-term rat hippocampal cultures. By comparing young and aged neurons, it highlights how increased L-type voltage-gated calcium channel density and prolonged activation in aged neurons result in calcium overloading, a hallmark of neuronal aging.

In Vitro Calcium Imaging in Short-Term and Long-Term Rat Hippocampal Cultures

Cultures met lage dichtheid van primaire hippocampale neuronen vereisen meestal een glia-feederlaag om neurotrofe factoren te leveren en hun levensduur te ondersteunen. We beschrijven hier een vereenvoudigde methode om ultra-lage dichtheidsneuronen op glazen dekglasjes te kweken in de aanwezigheid van een neuronale feederlaag met hoge dichtheid, wat de onderzoek naar specifieke neuronaal-autonome mechanismen vergemakkelijkt.

Een vereenvoudigde methode voor de Ultra-Low Density, Long-Term Primaire hippocampus Neuron Cultuur

Hier wordt een procedure gepresenteerd om selectief een neuronaal eiwit te activeren met een korte lichtpuls door genetisch een foto-reactieve onnatuurlijke aminozuur te coderen in een doelneuronaal eiwit dat tot expressie wordt gebracht in neuronen in cultuur of in vivo.

Optische controle van een neuronaal proteïne met behulp van een genetisch gecodeerde Onnatuurlijke aminozuren in neuronen

Dit artikel beschrijft het protocol voor het kweken van lage dichtheid primaire hippocampale neuronen groeien op dekglaasjes omgedraaid naar een gliale monolaag. Het neuron en gliale lagen worden gescheiden door paraffinewas kralen. De neuronen gekweekt volgens deze methode geschikt voor hoge-resolutie optische beeldvorming en functionele assays.

Low-Density primaire hippocampus Neuron Cultuur

Synaptic vesikel endocytose is gedetecteerd door de lichte microscopie van pHluorin gefuseerd met synaptic vesikel eiwit en elektronenmicroscopie van vesikel opname.

Meten van Synaptic vesikel endocytose in gekweekte Hippocampal neuronen

Hier beschreven we een protocol om de assemblage en structuur van de axon initiële segmenten (AIS) van hippocampale neuronen die geen vooraf geassembleerde AIS missen vanwege de afwezigheid van een gigantische ankyrine-G kwantitatief te bestuderen.

Gebruik van primaire gekweekte hippocampale neuronen om de assemblage van axon-initiële segmenten te bestuderen

Hier laten we zien hoe transfectie van primaire hippocampale knaagdierneuronen kan worden gecombineerd met confocale beeldvorming met levende cellen om pathologische eiwitgeïnduceerde effecten op axonaal transport te analyseren en mechanistische routes te identificeren die deze effecten mediëren.

Beeldvorming van levende cellen gebruiken om de effecten van pathologische eiwitten op axonaal transport in primaire hippocampusneuronen te meten

Leer calciumfosfaattransfectie van primaire hippocampusneuronen voor neurobiologisch onderzoek. Deze efficiënte methode bereikt tot 50% transfectie-efficiëntie en is kosteneffectief voor genintroductie in moeilijk te transfecteren cellen.

Calciumfosfaattransfectie van Primary hippocampus neuronen

Meer video's verkennen