Name: Membraan-STEKEL: een biochemische Tool om eiwit-eiwit interacties van membraaneiwitten Identificeer In Vivo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-07T19:35:00.000+00:00
Duration: 10 min 53 s
Description: Leer een biochemische methode om eiwit-eiwitinteracties van membraaneiwitten in vivo te identificeren met cross-linking, affiniteitszuivering en massaspectrometrie. Deze techniek detecteert ook zwakke of tijdelijke interacties.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit onderzoek werd ondersteund door subsidies van de Deutsche Forschungsgemeinschaft GraKo1121, Hu1011/2-1 en SFB940 naar SH

Opmerking: Gedetailleerde informatie over buffers in het protocol is in Tabel 1. 1. Fixatie van eiwit-eiwit interacties door Formaldehyde Cross-linking in levende cellen <ol><li> Om te beginnen bereiden groeimedia, stock oplossingen en buffer P1 <ol><li> Bereid 500 ml medium: Het medium moet voorwaarden die de interactie tussen membraan aas eiwit en prooi eiwitten ondersteunen. Daarnaast moet een experiment worden uitgevoerd onder omstandigheden waarbij geen interactie verwacht (bv. zonder cross-linking). Opmerking: We vergelijken eiwit-eiwit interacties in gestresst en niet gestresst bacteriën. Daarom bereiden we 500 ml Luria Bertani (LB) medium (tabel 1) die wij vullen met een stress-inducerende middel (bijvoorbeeld 0,5 M NaCl) in een 2 L Erlenmeyer kolf. Voor controle, gebruiken we normaal LB-medium met 0,17 M NaCl (pH 7,0). </li><li> Bereid Tris-buffer (20 mM Tris-HCl, pH 8,0) en 0,1 M ethyleendiaminetetra-azijnzuur (EDTA), pH 8,0 stockoplossing (tabel 1). </li><li> Bereid buffer P1. Los sucrose tot een uiteindelijke concentratie van 0,5 M in Tris-buffer. Steriliseer buffer P1 door filtratie en bewaard bij 4 ° C. </li></ol></li><li> Groeien cellen die het membraan aas eiwit met een C-terminale Strep-tag fusie van een vector. Induceren de expressie van membraan lokaas eiwitten gedurende een voldoende tijd. Opmerking: We induceren de expressie van bacteriële membraan aas eiwitgehalte bij vroege log-fase (600 A = 0,3) door toevoeging van 250 gl 1 M isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside (IPTG) tot 500 ml medium (eindconcentratie 0,5 mM) . Om voldoende expressie mogelijk te maken, broeden we de bacteriën tot in de late-log-fase (A 600 = 1.2). </li><li> Bereid je voor elke cultuur twee centrifuge bekers met een minimaal volume van elk 300 ml en leg ze op ijs. </li><li> Voer formaldehyde verknoping. CAUTIE: Formaldehyde is zeer giftig We raden werken onder een veiligheids zuurkast.. <ol><li> Breng de cultuur vat onder een veiligheids zuurkast. Splitsen elk monster in twee monsters, een weglating verknopen (- X) en een met inbegrip van het formaldehyde verknopen (+ X). Voeg 4 ml 37% formaldehyde-oplossing 250 ml cultuur tot een eindconcentratie van 0,6% te bereiken. </li></ol></li><li> De cultuur schepen terug te boeken en te groeien cellen voor nog eens 20 minuten als voorheen. </li><li> Vul uw culturen in de centrifuge buizen onder een veiligheid zuurkast. Verzamel cellen door centrifugeren bij 3000 xg gedurende 30 minuten. </li><li> Gooi supernatant door voorzichtig pipetteren het omhoog onder een veiligheid zuurkast. Verzamel giftige formaldehyde bevattende supernatant en gooi het goed. </li><li> Om een ​​optimale opbrengst te bereiken tijdens membraaneiwit voorbereiding, bereiden eerst sferoplasten. Hier bieden we een protocol voor sferoplast vorming van Gram-negatieve bacteriën: <ol><li> Prepare buffer P2 (tabel 1) van gevriesdroogd poeder. Voorzichtig los 2 mg lysozym in 0,1 M EDTA, pH 8, in een 1,5 ml buis. Bereiden altijd buffer P2 vers voor de dag van het experiment. </li><li> Bereid Tris-buffer met proteaseremmer (buffer P3). Aan 10 ml Tris-buffer, voeg 0,1 ml 1 M fenylmethylsulfonylfluoride (PMSF) (tabel 1) tot een eindconcentratie van 10 mM. Gebruik de buffer onmiddellijk een goede werking van PMSF waarborgen proteaseremmer. </li><li> Resuspendeer celpellets in 10 ml Tris-buffer met proteaseremmer en transferoplossing een 15 ml conische buis. </li><li> Voeg 1 ml buffer P2 en incubeer op ijs gedurende 30 minuten. </li><li> Verzamel sferoplasten door centrifugeren bij 3000 xg gedurende 30 minuten en gooi supernatant voorzichtig. </li></ol></li><li> Incubeer de sferoplast pellets nacht bij -20 ° C. </li></ol> 2. Zuivering van Strep-tag membraaneiwit (Bait) <ol><li> Plaats sferoplast pellet op ijs. &lt;/ Li&gt; <li> Gedurende de tijd dat de sferoplast pellets ontdooien op ijs, bereiden 10 ml buffer P3 voor elke sferoplast voorbereiding. Voorzichtig los 1 mg DNaseI in 10 ml Tris-buffer. Voeg 0,1 ml 1 M PMSF vlak voor gebruik. </li><li> Resuspendeer de pellet in 6 ml vers bereid P3. Ultrasone trillingen het monster vier maal gedurende 1 min continu op ijs met 1 min. pauze tussen elke burst, om sferoplasten verstoren. </li><li> Centrifugeer het monster bij 10.000 xg gedurende 10 min te oogsten celresten. Breng de bovenstaande behulp van een pipet om een ​​ultracentrifuge buis. </li><li> Pellet de membraanfractie bij 100.000 xg gedurende 30 minuten. Was de pellet voorzichtig in Tris-buffer zonder het op te lossen. Droog de ​​buis met een papieren tissue (bijvoorbeeld Kleenex). Vermijd de pellet te verstoren op elk moment. </li><li> Resuspendeer de pellet (= membranen) voorzichtig in 1 ml Tris-buffer. Gebruik een 20 pi aliquot de eiwitconcentratie te bepalen, bijvoorbeeld door BCA assay. Bij deze stap worden de membranen shock li bevrorenquid stikstof en bewaard bij -80 ° C. </li></ol> 3. Zuivering van Strep-tag Membraan Bait Eiwit en SDS-PAGE <ol><li> Normaliseren van de eiwitconcentratie van de membraanfractie met 5 mg / ml met Tris-buffer. Neem 2,5 ml membraanfractie (5 mg / ml) in een ultracentrifuge buis en voeg 0,25 ml 20% Triton X-100 tot een eindconcentratie van 2% bedragen, teneinde het membraan eiwitten oplosbaar. Voeg een micro-magnetische staaf en roeren op ijs gedurende 1 uur. Noot: Hoewel algemeen hebben we goede resultaten met Triton X-100 als detergens, kan het handig zijn de wasmiddel voor optimalisatie veranderen. In dit opzicht hebben we de beste resultaten met die reinigingsmiddelen voor functionele zuivering van de respectievelijke membraan aas eiwit. </li><li> Tijdens het uitvoeren van stap 3.1, bereiden 50 ml buffer W en 5 ml buffer E uit (tabel 1). Vul 10 ml 5x buffer W concentraat 50 ml en voeg 150 ul 20% Triton X-100. <ol><li> Vul 1 ml 5x buffer E concentraat 10 ml en voeg 30 ul 20% Triton X-100. Equilibreer een 1 ml Strep-Tactin superflow zwaartekracht kolom stroom met 8 ml buffer W. Opmerking: Het is essentieel om de wasmiddel voor de solubilisatie in een concentratie 10-voudig boven de kritische micel concentratie (CMC) heeft in een buffer tijdens de zuiveringsprocedure te voegen. </li></ol></li><li> Verwijder de micro-magnetische staaf van het oplosbaar monster en ultracentrifuge bij 100.000 xg gedurende 30 min, de onoplosbare membraanfractie pelleteren. Verwijder het supernatant met een pipet voor verdere zuivering. </li><li> Plaats het supernatant op de kolom. Voer de kolom alleen met zwaartekracht. Was de kolom met 5 ml buffer inch Herhaal deze wasstap 5x. </li><li> Elueren membraan aas eiwitten met 1 ml buffer E. Herhaal deze elutiestap 4x. </li><li> Concentraat elutiefracties 2, 3, en 4 300 pl met een centrifugale filtereenheid. </li><li> Meng 200 gl van elk monster met 50 ul 5x SDS-PAGE ladingskleurstof. Split elke bereiding in 125 ul porties. Kook een aliquot van elk preparaat gedurende 20 minuten bij 95 ° C, formaldehyde verknopingen keren. Laat monsters afkoelen tot kamertemperatuur gedurende ten minste 10 minuten op de bank top. </li><li> Belasting 30 pi van elk monster een enkele rijstrook van een polyacrylamide-gel geschikt voor immunoblotting. Gebruik een voorgekleurde molecuulgewichtsmerker voor de beste oriëntatie en draaien SDS-PAGE 10. </li></ol> 4. Immunoblotanalyse interactiepartners bevestigen <ol><li> Zodra stap 3.8 is voltooid, overdracht eiwitten aan een nitrocellulose membraan door bijvoorbeeld halfdroge. </li><li> Blokkeer het membraan niet-specifieke labeling voorkomen. Bereid blokkerende buffer door weging runderserumalbumine (BSA) tot 3% gewicht per volume te bereiken in Tris-gebufferde zoutoplossing aangevuld met een uiteindelijke concentratie van 0,05% Tween-20 (TBS-T). Gebruik een voldoende hoeveelheid blockingbuffer het membraan bedekken. Blokkeer het membraan gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. </li><li> Verdun eennd incubeer de prooi eiwit specifieke eerste antilichaam zoals gewoonlijk. Gebruik een HRP-gekoppeld antilichaam als tweede antilichaam. </li><li> Ontwikkel de immunoblot met een chemiluminescentiedetectie kit met een hoge gevoeligheid. Bekijk het signaal met behulp van een klassieke film veredeling of digitale imaging apparatuur. </li></ol> 5. NanoLC-ESI-MS/MS hoge resolutie Experimenten interactiepartners identificeren <ol><li> Indien er geen specifiek antilichaam beschikbaar voor de prooi eiwit of onbekende interactiepartners worden geïdentificeerd, gebruikt massaspectrometrie (MS) voor identificatie. Om keratine besmetting te voorkomen, gebruiken precasted gels voor scheiding van eiwitten. </li><li> Zilverkleuring de SDS-PAGE met behulp van een MS-compatibele kleuring kit volgens het protocol van de fabrikant. Voer alle vlekken en wassen stappen in glas tanks. </li><li> Accijnzen respectievelijke bands en deze analyseren door hoge resolutie LC / MS 9. </li></ol>

<ol><li>Krogh, A., Larsson, B., von Heijne, G., Sonnhammer, E. L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Predicting+transmembrane+protein+topology+with+a+hidden+markov+model%3A+application+to+complete+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Predicting transmembrane protein topology with a hidden markov model: application to complete genomes.</a> J. Mol. Biol. 305, 567-580 (2001).</li>
<li>Bakheet, T. M., Doig, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Properties+and+identification+of+human+protein+drug+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Properties and identification of human protein drug targets.</a> Bioinformatics. 25, 451-457 (2009).</li>
<li>Yildirim, M. A., Goh, K. I., Cusick, M. E., Barabasi, A. L., Vidal, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug-target+network%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Drug-target network.</a> Nat. Biotechnol. 25, (2007).</li>
<li>Daley, D. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+assembly+of+membrane+proteins+into+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">The assembly of membrane proteins into complexes.</a> Curr. Opin. Struct. Biol. 18, 420-424 (2008).</li>
<li>Jung, K., Fried, L., Behr, S., Heermann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histidine+kinases+and+response+regulators+in+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Histidine kinases and response regulators in networks.</a> Curr. Opin. Microbiol. 15, 118-124 (2012).</li>
<li>Müller, V. S., Jungblut, P. R., Meyer, T. F., Hunke, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane-SPINE%3A+An+improved+method+to+identify+protein-protein+interaction+partners+of+membrane+proteins+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Membrane-SPINE: An improved method to identify protein-protein interaction partners of membrane proteins in vivo.</a> Proteomics. 11, 2124-2128 (2011).</li>
<li>Herzberg, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SPINE%3A+A+method+for+the+rapid+detection+and+analysis+of+protein-protein+interactions+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">SPINE: A method for the rapid detection and analysis of protein-protein interactions in vivo.</a> Proteomics. 7, 4032-4035 (2007).</li>
<li>Sutherland, B. W., Toews, J., Kast, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Utility+of+formaldehyde+cross-linking+and+mass+spectrometry+in+the+study+of+protein-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Utility of formaldehyde cross-linking and mass spectrometry in the study of protein-protein interactions.</a> J. Mass Spectrom. 43, 699-715 (2008).</li>
<li>Hernandez, P., Müller, M., Appel, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+protein+identification+by+tandem+mass+spectrometry%3A+Issues+and+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Mass+Spectrom.+Rev%22%5BJournal%5D)">Automated protein identification by tandem mass spectrometry: Issues and strategies.</a> Mass Spectrom. Rev. 25, 235-254 (2006).</li>
<li>Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cleavage+of+structural+proteins+during+the+assembly+of+the+head+of+bacteriophage+T4%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.</a> Nature. 227, 680-685 (1970).</li>
<li>Hunke, S., Keller, R., Müller, V. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signal+integration+by+the+Cpx-envelope+stress+system%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol.+Lett%22%5BJournal%5D)">Signal integration by the Cpx-envelope stress system.</a> FEMS Microbiol. Lett. 326, 12-22 (2012).</li>
<li>Weber, R. F., Silverman, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Cpx+proteins+of+Escherichia+coli+K12+%3A+Structure+of+the+CpxA+polypeptide+as+an+inner+membrane+component%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">The Cpx proteins of Escherichia coli K12 : Structure of the CpxA polypeptide as an inner membrane component.</a> J. Mol. Biol. 203, 467-478 (1988).</li>
</ol>

We hebben niets te onthullen.

Membraan STEKEL analyse is een biochemische benadering die men in staat stelt om te bevestigen en om te identificeren om dit punt onbekende interactie partners van membraaneiwitten. Membraan STEKEL combineert in vivo verknoping door formaldehyde met zuivering van een Strep-gelabeld membraan aas eiwit. De combinatie met immunoblotting vergemakkelijkt de bevestiging van voorspelde interactiepartners (figuur 2). Bovendien, de combinatie met MS analyse maakt de identificatie van onbekende interacti...

Om de functie van een proteïne te begrijpen is het essentieel om de interactiepartners kennen. Verschillende klassieke technieken beschikbaar voor de identificatie van interactiepartners van oplosbare eiwitten. Echter, deze technieken niet gemakkelijk overdraagbaar eiwitten door hun hydrofobe aard 4 membraan. Om deze beperking te overwinnen, hebben we de Membraan Strep-eiwit interactie-experiment (Membraan-STEKEL) 6 ontwikkeld. Het is gebaseerd op de SPINE methode, die alleen voor oplosbare eiwitten 7. Membraan-SPINE profiteert van twee voordelen van het verknopingsmiddel formaldehyde: eerste, formaldehyde gemakkelijk membranen binnendringen en genereert daardoor een nauwkeurige momentopname van de interactoom van een levende cel 8. Ten tweede, kan formaldehyde dwarsverbanden worden teruggedraaid door koken 9. Hier worden deze twee voordelen gebruikt om niet alleen vaste maar ook tijdelijke PPI membraan prote identificerenins 6. In het kort wordt een Strep-tag gefuseerd met de C-terminus van de integrale membraan eiwitten aas. Cellen die het membraan aas eiwit geïncubeerd met formaldehyde crosslinks prooi eiwitten aan het membraan aas eiwit (Figuur 1). Wijzigingen van prooi eiwitten zijn niet nodig. Vervolgens wordt de membraan fractie bereid. Daarom zijn membraaneiwitten opgelost door detergensbehandeling en aas eiwitten co-gezuiverd met prooi eiwitten met affiniteitszuivering. Vervolgens wordt het verknopen omgekeerd door koken en het aas en de co-elueerde prooi eiwitten gescheiden door SDS-PAGE. Tenslotte kan prooi eiwitten worden geïdentificeerd door immunoblot analyse of massaspectrometrie.

<table><tbody><tr><td>37% Formaldehyde</td><td>Roth</td><td>4979.1</td><td>Mag niet ouder zijn dan een jaar</td></tr><tr><td>DNaseI</td><td>Sigma</td><td>DN25</td><td></td></tr><tr><td>BCA protein assay kit</td><td>Pierce</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>Micromagnetic rod</td><td>Roth</td><td>0955.2</td><td>5 mm in lengte, 2 mm in diameter</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Roth</td><td>6683.1</td><td>standaard detergent voor solubilisatie</td></tr><tr><td>n-Dodecyl-&beta;-maltoside</td><td>Glycon</td><td>D97002-C</td><td>het beste detergent om CpxA te solubiliseren</td></tr><tr><td>1 ml Strep-Tactin superflow gravity flow column</td><td>IBA</td><td>2-1207-050</td><td></td></tr><tr><td>Strep-tag protein purification buffer set</td><td>IBA</td><td>2-1002-001</td><td>Bevat buffer W en buffer E</td></tr><tr><td>Amicon Ultra-4 centrifugal filter</td><td>Millipore</td><td>UFC803024</td><td></td></tr><tr><td>SuperSignal West Pico Chemiluminescent substrate</td><td>Pierce</td><td>34080</td><td></td></tr><tr><td>SilverQuest Silverstaining kit</td><td>Invitrogen</td><td>LC6070</td><td></td></tr><tr><td>FireSilver Staining Kit</td><td>Proteome Factory</td><td>P-S-2001</td><td></td></tr><tr><td>Ultracentrifuge</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

membraan-stekel: een biochemische tool om eiwit-eiwit interacties van membraaneiwitten identificeer in vivo

Membrane-SPINE: A Biochemical Tool to Identify Protein-protein Interactions of Membrane Proteins In Vivo

Membraaneiwitten zijn essentieel voor de levensvatbaarheid van de cellen en zijn daarom belangrijke therapeutische doelen 1-3. Omdat ze functioneren in complexen 4, methoden om hun interacties te identificeren en karakteriseren nodig 5. Daarom hebben wij de membraan Strep-eiwitinteractie experiment genoemd Membraan-SPINE 6. Deze techniek combineert in vivo verknopen met de omkeerbare cross-linker formaldehyde met affiniteit zuivering van een Strep-gelabeld membraan aas eiwit. Tijdens de procedure, verknoopte prooi eiwitten co-gezuiverd met het membraan aas eiwit en vervolgens gescheiden door koken. Daarom kunnen twee grote taken worden uitgevoerd bij de analyse van eiwit-eiwit interacties (PPI) van membraaneiwitten gebruik Membraan-STEKEL: ten eerste, de bevestiging van een voorgenomen interactiepartner door immunoblotting, en ten tweede, de identificatie van nieuwe interactie partners door massaspectrometrie-analyse . Bovendien, zelfs low affiniteit, voorbijgaande PPI&#39;s zijn detecteerbaar door deze techniek. Tot slot, Membraan-STEKEL is aanpasbaar aan vrijwel elk type cel, waardoor het van toepassing als een krachtig screening tool om PPI&#39;s van membraaneiwitten te identificeren.

Membraan STEKEL analyse kan de co-zuivering van membraaneiwitten en transient interagerende proteïne partners. De co-zuivering wordt mogelijk door de verknoping middel formaldehyde. Twee parameters zijn cruciaal voor niet-specifieke cross-verbindingen te voorkomen: de formaldehyde concentratie en de verknoping tijd. Het voldoende, maar niet overmatig gebruik van formaldehyde kan eenvoudig worden gecontroleerd door immunoblotting. Formaldehyde verknoopte eiwitcomplexen kunnen worden gescheiden door koken maar niet door S...

Een biochemische benadering wordt beschreven in vivo eiwit-eiwit interacties (PPI) van membraaneiwitten identificeren. De methode combineert eiwit verknoping, affiniteitszuivering en massaspectrometrie, en is aanpasbaar aan vrijwel elk type cel of organisme. Met deze benadering ook de identificatie van voorbijgaande PPI mogelijk.

Membraan-STEKEL: een biochemische Tool om eiwit-eiwit interacties van membraaneiwitten Identificeer In Vivo

Membrane proteins are essential for cell viability and are therefore important therapeutic targets1-3. Since they function in complexes4, methods to ...

Het algemene doel van deze procedure is om in vivo eiwit, eiwitinteracties van membraaneiwitten te identificeren door middel van een membraan strep-eiwitinteractie-experiment of membraanspina. Dit wordt bereikt door in vivo crosslinking met behulp van de omkeerbare crosslinker voor formaldehyde. De tweede stap is het zuiveren van het strep-gelabelde membraaneiwit samen met de gekruiste prooi-eiwitten.Vervolgens wordt de crosslink omgekeerd door te koken. De laatste stap is de scheiding van het membraaneiwit en de gezuiverde prooi-eiwitten door natriumdodesulfaat, polyacrylamidegelelektroforese of SDS-pagina. Uiteindelijk wordt immunoblotting en massaspectrometrie-analyse gebruikt om de prooi-eiwitten te identificeren, waardoor analyse van membraaneiwitinteracties mogelijk is.Ik ben Sabina Hunka en we zullen u vandaag de membraanspina-technologie laten zien. Het belangrijkste voordeel van deze technologie ten opzichte van bestaande methoden zoals co IP, is dat het u zelfs toestaat om lage affiniteit of voorbijgaande eiwit-eiwitinteracties te detecteren. Kline Shaana zal u de procedure demonstreren.Zij is een van mijn PhD-studenten die het protocol ontwikkelde. Om deze procedure te beginnen, kweekt u bacteriële cellen die het membraaneiwit met een C-terminaal strep-tag-fusie tot expressie brengen, induceert u de expressie van membraaneiwitten in de vroege logfase door toevoeging van 0,5 millimolair IPTG aan 500 milliliter medium om voldoende expressie mogelijk te maken. Incubeer de bacteriën tot de late logfase. Bereid u voor om formaldehyde cross-linking uit te voeren onder een veiligheidskap vanwege de toxiciteit van de formaldehyde.Breng de kweekvaten onder een veiligheidskap over. Verdeel elk monster in twee monsters, een waarbij de cross-linking wordt weggelaten en een, inclusief de formaldehyde cross-linking. Voeg vier milliliter 37% formaldehyde-oplossing toe aan een 250 milliliter kweek om een eindconcentratie van 0,6% te bereiken. Breng de kweekvaten terug en laat de cellen nog 20 minuten groeien zoals eerder.Vul vervolgens de culturen onder een veiligheidskap in centrifugeerbuizen. Verzamel de cellen door centrifugatie bij 3000 keer G gedurende 30 minuten. Verwijder het supernatant door eerst af te decanteren en vervolgens door zuiging.Gebruik een pipet onder een veiligheidskap om de supernatanten weg te gooien en verwijder de giftige formaldehyde bevattende supernatant op de juiste manier. Om een optimale opbrengst te bereiken tijdens de bereiding van membraaneiwitten, bereidt u eerst Sphero platen om te beginnen twee milligram lysozym voorzichtig op te lossen in 0,1 molaire E-D-T-A-P-H acht in een 1,5 milliliter buisje. Om buffer P twee te bereiden, die vers moet worden gemaakt op de dag van het experiment.Hervat de celpelletten in 10 milliliter vers bereide tris-sucrosebuffer met proteaseremmer en breng de oplossing over in een 15 milliliter kegelvormig buisje. Voeg een milliliter buffer P twee toe en incubeer op ijs gedurende 30 minuten. Verzamel de Sphero platen door centrifugatie bij 3000 keer G gedurende 30 minuten en gooi het supernatant weg.Incubeer de Sphero plast-pelletten voorzichtig een nacht bij min 20 graden Celsius terwijl u op ijs werkt. Hervat de Sphero Plast-palaten in zes milliliter vers bereid buffer. P drie.Soniceer het monster vier keer gedurende één minuut continu op ijs met een minuut pauze tussen elke burst. Om de Sphero plast te verstoren, centrifugeert u het monster bij 10.000 keer G gedurende 10 minuten om celdebris te verzamelen na centrifugatie. Breng het supernatant met behulp van een pipet over naar een ultracentrifugebuisje.Pelleteer de membraanfractie bij 100.000 keer G gedurende 30 minuten. Was de pellet voorzichtig in 20 millimolaire trisbuffer pH acht zonder het op te lossen. Drijf vervolgens een buisje met een papieren tissue aan en vermijd het pellet op enig moment te verstoren.Om de pellet met de membranen te hersuspenderen, voegt u een milliliter tris toe, buffer een micromagnetische staaf en hersuspendeert u de pellet, deels met een pipet, roer op ijs gedurende een uur, gebruik een 20 microliter aliquot om de eiwitconcentratie te bepalen. Normaliseer de eiwitconcentratie van de membraanfractie tot vijf milligram per milliliter met trisbuffer. Pipet 2,5 milliliter van de membraanfractie naar een ultracentrifugebuisje en voeg 0,25 milliliter 20% Triton X 100 toe om een eindconcentratie van 2% te bereiken om de membraaneiwitten op te lossen. Voeg vervolgens een micromagnetische staaf toe en roer gedurende een uur op ijs.Breng een een milliliter strept-actine superflow zwaartekrachtstroomkolom in evenwicht met acht milliliter buffer. W. Verwijder de micromagnetische staaf uit het oplossingsmonster en ultracentrifugeer bij 100.000 keer G gedurende 30 minuten om de onoplosbare membraanfractie te pelleteren nadat de run voltooid is, verwijder de sate met behulp van een pipet. Voor verdere zuivering, brengt u het supernatant toe op de kolom met behulp van zwaartekrachtstroom.Was de kolom met vier milliliter buffer W en herhaal deze wasstap vijf keer. Eluteer de membraaneiwitten met een milliliter buffer E.Herhaal deze elutie. Stap vier keer, concentreer de eluteerde fracties.Twee, drie en vier tot 300 microliter met een centrifugeerfiltereenheid. Meng 200 microliter van elk monster met 50 microliter vijf x als DS-pagina laadkleurstof. Verdeel elke voorbereiding in 125 microliter aliquots voor het koken.Een aliquot van elk voorbereid gedurende 20 minuten bij 95 graden Celsius om formaldehyde crosslinks om te keren. Laat de monsters afkoelen tot kamertemperatuur gedurende minimaal 10 minuten op de werkbank. Laad 30 microliter van elk monster op een enkele baan van een polyacrylamidegel die geschikt is voor immunoblotting.Gebruik een voorgekleurde molecuulgewichtsmarker voor de beste oriëntatie en voer een DS-pagina uit na overdracht van eiwitten naar een nitrocellulosemembraan. Blokkeer het membraan om niet-specifieke labelering gedurende een uur te voorkomen. Bij kamertemperatuur verdunt en incubeert u het primaire anti

membrane-spine-biochemical-tool-to-identify-protein-protein

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

Deze video laat zien experimenten met daarop volgende analyse van eiwit-eiwit interacties door het gebruik van micro-oppervlakken met een patroon. De aanpak biedt de mogelijkheid om eiwit interacties op te sporen in levende cellen en combineert een hoge doorvoer-mogelijkheden met de mogelijkheid te extraheren kwantitatieve informatie.

In-vivo detectie van eiwit-eiwit interacties op de Micro-oppervlakken met een patroon

Het testen van eiwit-eiwit interacties is onmisbaar voor dissectie van eiwitten functionaliteit. Hier introduceren we...

Eiwit Membraan Overlay Test: een protocol om interactie tussen oplosbare en onoplosbare eiwitten Test In vitro</em

Surface Plasmon Resonance (SPR) is een label vrij werkwijze voor het detecteren van biomoleculaire interacties in real time. Hierin, een protocol voor een membraaneiwit: wordt receptor interactie experiment beschreven, terwijl de discussie over de voors en tegens van de techniek.

Real Time Metingen van membraaneiwit: Receptor Interacties gebruik Surface Plasmon Resonance (SPR)

Hier presenteren we een protocol om de oriëntatie en topologie van integrale membraaneiwitten in levende cellen te bepalen. Dit eenvoudige protocol is gebaseerd op de selectieve proteasegevoeligheid van chimaeren tussen het eiwit van belang en GFP.

Het bepalen van membraaneiwit Topologie behulp Fluorescentie protease Protection (FPP)

Veel eiwitten voeren hun functie uit wanneer ze aan membraanoppervlakken zijn gehecht. De binding van extrinsieke eiwitten op nanodisc-membranen kan indirect worden afgebeeld door transmissie-elektronenmicroscopie. We laten zien dat de karakteristieke stapelvorming (rouleau) van nanodiscs, veroorzaakt door de negatieve kleuring natriumfosfowolframaat, wordt voorkomen door de binding van extrinsiek eiwit.

Methode om te visualiseren en te analyseren Membrane interagerende eiwitten door Transmission Electron Microscopy

Hier presenteren wij een breukmembraan fractioneringsprotocol dat een robuuste procedure voor het isoleren van eiwitten uit verschillende synaptische compartimenten vertegenwoordigt.

Breinmembraanfractie: An<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Aanpak om de subsynaptische eiwit lokalisatie te beoordelen

Hier presenteren we een protocol voor het controleren van de montage en demontage van de toxine van de bloedzweer met behulp van biolayer interferometrie (BLI). Na montage/demontage op de biosensor oppervlak, de grote eiwitcomplexen worden vrijgegeven uit het oppervlak voor visualisatie en identificatie van onderdelen van de complexen met behulp van elektronenmicroscopie en massaspectrometrie, respectievelijk.

Analyseren van de dynamische eiwitcomplexen op gemonteerd en vrijgelaten uit Biolayer interferometrie Biosensor met behulp van spectrometrie van de massa en elektronenmicroscopie

Hier presenteren we een protocol voor een verterings techniek op membraan voor de bereiding van monsters voor massaspectrometrie. Deze techniek vergemakkelijkt de gemakkelijke analyse van eiwit-eiwit interacties.

Evaluatie van eiwit-eiwit interacties met behulp van een on-membraan Vergistings techniek

Hier wordt een protocol gepresenteerd voor de bepaling van oligomere toestand van membraaneiwitten dat gebruik maakt van een inheems celmembraan nanodeeltjessysteem in combinatie met elektronenmicroscopie.

Native Cell Membrane Nanodeeltjes Systeem voor Membraan Eiwit-Eiwit Interactie Analyse

Deze studie beschrijft de procedure voor het reconstitueren van het membraaneiwit TWIK-gerelateerd zuurgevoelig K+ -kanaal 2 (Task2) in nanodiscs. De succesvolle assemblage werd bevestigd door single-particle cryo-elektronenmicroscopie, die goed gedefinieerde tweedimensionale klassegemiddelden opleverde.

Een techniek voor het stabiliseren van membraaneiwitten in nanodiscs

Leer een biochemische methode om eiwit-eiwitinteracties van membraaneiwitten in vivo te identificeren met cross-linking, affiniteitszuivering en massaspectrometrie. Deze techniek detecteert ook zwakke of tijdelijke interacties.

Membraan-STEKEL: een biochemische Tool om eiwit-eiwit interacties van membraaneiwitten Identificeer In Vivo

Meer video's verkennen