Confocale beeldvorming van Single mitochondriaal superoxide Knippert Intact Heart of In Vivo

Het algemene doel van deze procedure is om enkele mitochondriale gebeurtenissen zoals superoxide-flitsen en membraanpotentiaalfluctuaties in situ of in vivo te monitoren om een realtime evaluatie van mitochondriale functie in een fysiologisch relevante context te bereiken. Dit wordt bereikt door eerst de skeletspier in de achterpoot van de muis bloot te stellen. Vervolgens worden time-lapse confocale beelden van skeletspieren in vivo verkregen.

Vervolgens wordt het muizenhart geperfundeerd en geimaged met behulp van confocale microscopie. Ten slotte worden de beelden verwerkt en worden de gegevens geanalyseerd. Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die enkele mitochondriale superoxide-flitsen en membraanpotentiaalfluctuaties in skeletspieren, in vivo of in geperfundeerd hart, tonen door middel van time-lapse en tweedimensionale confocale beelden.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande spieren zoals het evalueren van mitochondriale functie door het isoleren van mitochondriën is dat deze techniek de realtime evaluatie van enkelvoudige mitochondriale functie in een fysiologisch relevante conditie mogelijk maakt. De demonstratie van deze methode is van cruciaal belang, omdat confocale beeldvorming met mes, dier of mesweefsel moeilijk te leren is omdat het een steile en gecompliceerde procedure is. Na het bereiden van isotone gebalanceerde zoutoplossing of IBSS, Krebs HENSEL Light Buffer of KHB en chirurgische instrumenten volgens het tekstprotocol, verdoof een muis met een intraperitoneale injectie van Pentobarbital en voer een teenprikken uit om te bevestigen dat het dier verdoofd is.

Gebruik een scheermes om het haar op een van de achterpoten te verwijderen voordat u de plaats desinfecteert met 70% ethanol. Maak vervolgens een incisie in de huid langs de buitenkant van de poot om de maagspier te ontbloten. Gebruik vervolgens scherpe pincetten om het epimysium voorzichtig op te pakken en maak een incisie doorheen met behulp van een schaar.

Verder dissecteren om het epimysium te verwijderen en de spiervezels eronder bloot te leggen. Voeg 500 nanomolair tetraethyl, rod domine methyl ester of TMRM toe aan de IBSS en dompel de spier gedurende 30 minuten in de oplossing. Na het laden van TMRM in de spier, spoel de spier af met TMRM-vrije IBSS met behulp van een 40 x olieobjectief.

Plaats de muis op zijn zij op de confocale microscooptafel en houd de achterste poot vast zodat de blootgestelde skeletspier in een op maat gemaakte kamer tegen de dekglas ligt. Druk vervolgens voorzichtig op het been om een strakke contact tussen het weefsel en het dekglas te maken en dompel de blootgestelde spieren in IBSS met behulp van een acht bit pixeldiepte en een samplesnelheid van één seconde per frame een tweedimensionale seriële scan van de spier op te nemen. Verzamel opeenvolgende beelden door eerst op te winden bij 405 nanometer en te verzamelen bij meer dan 505 nanometer.

Vervolgens op te winden bij 488 nanometer terwijl u verzamelt bij meer dan 505 nanometer. Voor dubbele golflengte opwinding van MT.CCP YFP, gebruik opeenvolgende opwinding bij 405 488 en 543 nanometer en verzamel emissie bij 505 tot 5 45.505 tot 5 45 en meer dan 560 nanometer respectievelijk. Voor drievoudige golflengte opwindingsbeeldvorming van M-T-C-P-Y-F-P en TMRM om het muizenhart te beeldvormen, injecteer het dier met 200 eenheden heparine.

Na 10 minuten te hebben gewacht en de muis te hebben geëuthanaseerd door een thoracotomie, verwijder snel het hart en de longen en het thymus dat eraan is bevestigd. Breng het geïmplanteerde weefsel snel over naar ijskou IBSS. Identificeer vervolgens de lobben van de thymus en pel ze voorzichtig terug.

Om de opgaande aorta bloot te leggen, verwijder de long en het thymus en isoleer de aorta door voorzichtig alle omringende weefsel te verwijderen. Maak vervolgens een snede aan het bovenste uiteinde van de opgaande aorta vóór de eerste tak van de aortaboog. Houd vervolgens met twee micro-naaiforceps de wand van de aorta voorzichtig vast om het lumen te onthullen en plaats het voorzichtig op een canule.

Gebruik een micro-vatenklemp om de aorta op zijn plaats te houden en knoop snel hechtingen eromheen. Verwijder de klem en gebruik pincetten om voorzichtig te controleren of het uiteinde van de canule boven de aortawortel ligt. Beveilig extra banden indien nodig om het hart op zijn plaats te houden.

Schakel de peristaltische pomp in en perfundeer het hart. Bij één milliliter per minuut zal het hart na perfusie weer gaan kloppen. Na 10 minuten stabilisatie, perfundeer het hart met 10 micromolair BLEs statin en 100 tot 500 nanomolair TMRM.

Het hartslag zal na 10 minuten langzamer worden. Pas vervolgens de positie van het perfusiesysteem aan en plaats het hart op de microscooptafel die is uitgerust met een adapter om de kamer op 37 graden Celsius te verwarmen. Voeg een milliliter KHB-perfusieoplossing in de kamer toe om het hart gedeeltelijk te laten onderdompelen.

Gebruik een peristaltische pomp om het effluënt uit de kamer te verwijderen. Verhoog geleidelijk de snelheid van de pomp om voldoende stroom naar het hart te bieden om een goede contact van het hart met het dekglas te garanderen en om de hartslag verder te onderdrukken, oefen zachte druk uit op het hart. Beeld het orgaan af zoals beschreven voor de spier eerder in deze video, door de focale vlak aan te passen om het duidelijkste beeld mogelijk te maken.

Gebruik de fysiologische analysemodule van de confocale microscoopsoftware. Begin met het openen van de automatisch gegenereerde database en vervolgens het 2D-beeldbestand dat moet worden geanalyseerd. Klik op het gebied van belang of ROI-gemiddelde.

Om over te schakelen naar de gemiddelde ROI-modus. Schakel de weergave van kanalen uit, behalve CP YFP bij 488 nanometer voor het selecteren van de flitsen. Zoom in op het beeld en verplaats handmatig de schuifbalk om de seriële 2D-beelden af te spelen.