Name: Diavoorbereidingsmethode om driedimensionale chromatinearchitectuur van testiculaire kiemcellen te behouden (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-01-10T14:15:00.000+00:00
Duration: 7 min 34 s
Description: Leer een driedimensionale diavoorbereidingsmethode om chromatinearchitectuur in testiculaire kiemcellen te behouden. Deze techniek verbetert de detectie van subnucleaire structuren en is geschikt voor diverse fluorescentietoepassingen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ik dank Jeannie T. Lee voor het toezicht op dit project toen ik in het Lee laboratorium was en Tyler Broering voor het bewerken van het manuscript. Dit werk werd ondersteund door de Basil O'Connor Starter Scholar Award van de March of Dimes Foundation en de NIH Grant GM098605.

1.3D Diavoorbereiding
<ol><li>Bereid de volgende reagentia voor:<ol>
<li>CSK buffer: 100 mM NaCl, 300 mM sucrose, 10 mM PIJPEN, 3 mM MgCl2. Stel de pH in op 6,8 met 1 M NaOH. Bewaar de CSK-buffer bij 4 °C.</li>
		<li>CSK-buffer met 0,5% Triton X-100: Voeg 200 μl Triton X-100 toe aan 40 ml CSK-buffer. Meng de oplossing met behulp van een magneetroerder tot triton X-100 volledig is opgelost. Bewaar de CSK buffer met 0,5% Triton X-100 bij 4 °C.</li>
		<li>4% Paraformaldehyde (PFA)–PBS, pH 7.4: Los 4 g PFA op in ongeveer 70-80 ml water. Om het oplossen te versnellen, voegt u ongeveer 20 μl 4 N NaOH toe en houdt u de oplossing in een waterbad op 60 °C totdat de PFA volledig is opgelost en de oplossing transparant is. Dit proces duurt ongeveer 1 uur. Nadat PFA volledig is opgelost, voegt u 10 ml 10x PBS toe. Stel het uiteindelijke volume in op 100 ml met water en koel de oplossing af tot kamertemperatuur (25 °C). Gebruik vers bereide oplossing voor elk nieuw experiment. Opmerking: Vraag institutionele toestemming voor al het dierwerk en houd u aan de relevante richtlijnen voor dierverzorging.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Euthanaseer mannelijke muizen. Verwijder de testis met behulp van een tang en een schaar van de muis. Plaats de testis in PBS (of RPMI 1640). Voer na het verwijderen van testis snel de volgende stappen 1.3-1.4 uit om de afbraak van RNA te voorkomen.</li>
	<li>Breek de testis op een kleine Petrischaal en verwijder de tunica albuginea. Ontrafel de halfnofachtige tubuli in PBS op ijs met behulp van een tang.</li>
	<li>Breng met behulp van een tang verschillende tubuli (verschillende stukken tubuli van ongeveer 5-10 mm lang) over in één put van een 4-putschaal met 500 ml CSK-buffer + 0,5% Triton X-100 op ijs en incubeer gedurende 6 minuten. Overbelichting aan CSK-buffer kan leiden tot verstoring van cellen.</li>
	<li>Breng met behulp van een tang alle tubuli over in één put van een 4-wells schaal met 4% PFA-PBS oplossing. Deze stap kan worden voorgevormd zonder een stereomicroscoop, maar optioneel kan deze worden gebruikt. Incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Begin tegelijkertijd met het voorbereiden van 12 cytospinkamers tijdens de incubatieperioden.</li>
	<li>Breng met behulp van een tang alle tubuli over in één put van een 4-puts schaal met PBS. Incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Breng aan de achterkant van een glazen glijbaan alle tubuli over in 30 μl PBS (de bovenkant van de glijbaan moet worden vermeden vanwege kationische lading). Scheur de tubuli met behulp van de uiteinden van twee tangen in stukken. Hak de tubuli in horizontale richting door tubuli tussen de uiteinden van twee tangen te knippen en de tang horizontaal te trekken. Ga verder met deze stap gedurende ongeveer 10-20 sec.</li>
	<li>Meng de ophanging door te pipetten met een P20 pipet.</li>
	<li>Breng de suspensie over in een microcentrifugebuis, verdun met PBS tot ongeveer 1,3 ml. Breng 100 μl suspensie aan op elk van de 12 cytospinkamers (totaal 1,2 ml). Bij deze stap hoeft de concentratie van cellen niet te worden bepaald.</li>
	<li>Cytospin de monsters bij 2.000 tpm gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Na cytospinning, droge dia's op lab bank voor een paar minuten bij kamertemperatuur. Nadat dia's enkele minuten volledig hebben mogen drogen, gaat u naar de volgende stap.</li>
	<li>Was de dia's met behulp van een Coplin-pot met PBS gedurende 5 minuten op kamertemperatuur.</li>
	<li>Breng dia's over in een Koplin-pot met 70% ethanol en wacht ten minste 2 minuten voor het starten van RNA FISH. Dia's zijn een paar weken stabiel in 70% ethanol bij 4 °C. Voor langdurige opslag, dehydrateer dia's met behulp van seriële behandeling met 80% en 100% ethanol in Coplin potten voor 2 minuten elk en droog de dia's volledig uit. Bewaren bij -80 °C in een schuifdoos.</li>
</ol>2. Cot-1 DNA-sondevoorbereiding door random Priming
<ol><li>Bereid de volgende reagentia voor:<ol>
<li>Hybridisatiebuffer: Meng de procedurecomponenten om 900 ml hybridisatiebuffervoorraad voor te bereiden; deze oplossing zal worden gebruikt om sondes op te slaan. Deze hybridisatiebuffervoorraad maakt de toevoeging van 10% volume RNase-remmeroplossing (Ribonucleoside Vanadyl Complex) mogelijk voorafgaand aan hybridisatie.<table><tbody>
<tr>
<td>bestanddeel</td>
					<td>Hoeveelheid (μl)</td>
					<td>Eindconcentratie</td>
				</tr>
<tr>
<td>Formamide</td>
					<td>500</td>
					<td>50% (v/v)</td>
				</tr>
<tr>
<td>50% Dextran</td>
					<td>200</td>
					<td>10% (w/v)</td>
				</tr>
<tr>
<td>20x SSC</td>
					<td>100</td>
					<td>2x</td>
				</tr>
<tr>
<td>1% BSA</td>
					<td>100</td>
					<td>0.1%</td>
				</tr>
</tbody></table>Voeg voorafgaand aan hybridisatie 1/10 vol van 200 mM Ribonucleoside Vanadyl Complex of water toe aan de hybridisatiebuffervoorraad om de uiteindelijke concentratie te evenaren. Bij -20 °C is dit mengsel meer dan een jaar stabiel.</li>
		<li>20x SSC: Los 88,2 g natriumcitraat en 175,3 g NaCl op in ongeveer 800 ml water. Stel de pH in op 7,0 met een paar druppels van 1 M HCl. Voeg water toe om het uiteindelijke volume aan te passen aan 1 L. Steriliseer door autoclaaf. Na bereiding kan 20x SSC bij kamertemperatuur worden bewaard.</li>
		<li>50% (m/v) Dextran: Roer water en voeg langzaam 50 g dextransulfaat toe. Blijf 's nachts roeren op kamertemperatuur. Voeg water toe om het uiteindelijke volume aan te passen aan 100 ml. Bewaren bij kamertemperatuur.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Voeg de volgende onderstaande onderdelen toe aan een PCR-buis. Meng en incubeer de oplossing met behulp van een PCR-machine gedurende 5 minuten bij 95 °C.<table><tbody>
<tr>
<td>bestanddeel</td>
				<td align="center">Hoeveelheid per reactie (μl)</td>
				<td align="center">finaal</td>
			</tr>
<tr>
<td>Wieg-1 DNA: 1 mg/ml</td>
				<td align="center">1</td>
				<td align="center">1 μg</td>
			</tr>
<tr>
<td>Random 9mer primer (uit kit)</td>
				<td align="center">10</td>
				<td align="center"></td>
			</tr>
<tr>
<td>Water</td>
				<td align="center">27</td>
				<td align="center"></td>
			</tr>
</tbody></table>
</li>
	<li>Centrifugeer kort en leg op ijs.</li>
	<li>Voeg de volgende onderdelen toe. Meng en incubeer gedurende 30 minuten bij 37 °C met behulp van een PCR-machine. (Voor meer informatie over de gebruikte kit zie de tabel met reagentia en apparatuur).<table><tbody>
<tr>
<td>bestanddeel</td>
				<td align="center">Hoeveelheid per reactie (μl)</td>
				<td align="center">Eindconcentratie</td>
			</tr>
<tr>
<td>Mengsel bereid vanaf stap 2.2</td>
				<td align="center">38</td>
				<td align="center"></td>
			</tr>
<tr>
<td>5x nucleotide buffer (uit kit)</td>
				<td align="center">9.2</td>
				<td align="center"></td>
			</tr>
<tr>
<td>Cy3-dUTP (1 mM)</td>
				<td align="center">0.8</td>
				<td align="center">16 μM</td>
			</tr>
<tr>
<td>Klenow (uit kit)</td>
				<td align="center">2</td>
				<td align="center"></td>
			</tr>
</tbody></table>
</li>
	<li>Voeg 2 μl stopbuffer (uit de kit) toe om de reactie te stoppen.</li>
	<li>Zuiver de gestopte reactie met behulp van microspinkolommen.</li>
	<li>Voeg 50 μg (5 μl) haring sperma DNA (50 voudige overmaat aan cot-1 DNA) toe aan de gezuiverde fractie.</li>
	<li>Meet het totale volume met behulp van een pipet. Voeg 0,7x volume 100% ethanol en 0,1x volume van 3 M natriumacetaat (pH 5,2) toe, meng goed en centrifugeer gedurende 15 minuten bij maximale snelheid (17.000 x g) met behulp van een microcentrifuge bij 4 °C.</li>
	<li>Verwijder de vloeistof en voeg 200 μl 70% ethanol toe, meng goed en centrifugeer gedurende 5 minuten bij maximale snelheid bij 4 °C.</li>
	<li>Verwijder de overtollige vloeistof. Droog het neerslag 10-30 minuten op kamertemperatuur.</li>
	<li>Los de pellet op in 20 μl hybridisatiebuffervoorraad. Omdat de pellet vaak moeilijk op te lossen is, pipet herhaaldelijk. Als alternatieve optie kan ook een vortexmixer worden gebruikt om de pellet efficiënt op te lossen. Sondes kunnen tot gebruik op -20 °C worden gehouden.</li>
</ol>3. Wieg-1 RNA FISH
<ol><li>Voeg de onderstaande componenten toe aan een PCR-buis. Met behulp van een PCR-machine, incubeer gedurende 10 minuten bij 80 °C, gevolgd door een voorlaatste trede van ongeveer 10-30 min bij 42 °C. Bewaren bij 42 °C tot hybridisatie. Ribonucleoside Vanadyl Complex is optioneel; het kan worden vervangen door water.<table><tbody>
<tr>
<td>bestanddeel</td>
				<td align="center">Hoeveelheid per reactie (μl)</td>
				<td align="center">finaal</td>
			</tr>
<tr>
<td>Cot-1 DNA-sonde (50 ng/μl)</td>
				<td align="center">2</td>
				<td align="center">100 ng</td>
			</tr>
<tr>
<td>Ribonucleoside Vanadyl Complex (200 mM)</td>
				<td align="center">2</td>
				<td align="center">20 mM</td>
			</tr>
<tr>
<td>Hybridisatiebuffer</td>
				<td align="center">toegevoegd aan 20</td>
				<td align="center"></td>
			</tr>
</tbody></table>
</li>
	<li>Dehydrateer glijdt in een Koplin pot met 80% ethanol gedurende 2 min, gevolgd door een Coplin pot met 100% ethanol gedurende 2 min. Droog glijdt volledig op laboratoriumbank bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Verwarm een tipboxkamer (gevuld met 2-3 cm water) vooraf voor in een incubator van 42 °C. Plaats de schuif op de tipboxkamer. Centrifugeer de voorgeannealde sondes kort en pipet direct op de gedehydrateerde dia's. Vermijd het maken van bubbels. Bedek de glijbaan voorzichtig met een afdeklip.</li>
	<li>Hybridiseer gedurende 6 uur tot 's nachts (14-15 uur) bij 42 °C.</li>
	<li>Bereid wasoplossingen in Koplin potten (twee potten met zowel 2x SSC als 50% formamide, en twee potten met 2x SSC). Verwarm gedurende 30 minuten voor op 42 °C in een waterbad.</li>
	<li>Gebruik een scheermesje om de afdekstrip van de rand van de glijbaan te verwijderen. Vermijd krassende monsters. Was dia's in een Koplin pot met 2x SSC en 50% formamide gedurende 5 min bij 45 °C. Herhaal deze stap een keer.</li>
	<li>Was de dia's in een Koplin pot met 2x SSC gedurende 5 min bij 45 °C. Herhaal deze stap een keer.</li>
	<li>Voeg 20 μl DAPI-montagemedia toe aan de dia's en dek af met een afdekstrip. Druk voorzichtig op afdekglas om extra montagemedia te verwijderen. Vlek extra montagemedia met reinigingsweefsel. De dia's zijn klaar voor microscopie evaluatie.</li>
</ol>

<ol><li>Peters, A. H., Plug, A. W., van Vugt, M. J., de Boer, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+drying-down+technique+for+the+spreading+of+mammalian+meiocytes+from+the+male+and+female+germline%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosome+Res%22%5BJournal%5D)">A drying-down technique for the spreading of mammalian meiocytes from the male and female germline.</a> Chromosome Res. 5, 66-68 (1997).</li>
<li>Namekawa, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postmeiotic+sex+chromatin+in+the+male+germline+of+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Postmeiotic sex chromatin in the male germline of mice.</a> Curr Biol. 16, 660-667 (2006).</li>
<li>Namekawa, S. H., Lee, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+nascent+RNA%2C+single-copy+DNA+and+protein+localization+by+immunoFISH+in+mouse+germ+cells+and+preimplantation+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Detection of nascent RNA, single-copy DNA and protein localization by immunoFISH in mouse germ cells and preimplantation embryos.</a> Nat Protoc. 6, 270-284 (2011).</li>
<li>Mahadevaiah, S. K., Costa, Y., Turner, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+RNA+FISH+to+study+gene+expression+during+mammalian+meiosis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">Using RNA FISH to study gene expression during mammalian meiosis.</a> Methods in molecular biology. 558, 433-444 (2009).</li>
<li>Hall, L. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+ectopic+human+XIST+gene+can+induce+chromosome+inactivation+in+postdifferentiation+human+HT-1080+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">An ectopic human XIST gene can induce chromosome inactivation in postdifferentiation human HT-1080 cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 8677-8682 (2002).</li>
<li>Huynh, K. D., Lee, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inheritance+of+a+pre-inactivated+paternal+X+chromosome+in+early+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Inheritance of a pre-inactivated paternal X chromosome in early mouse embryos.</a> Nature. 426, 857-862 (2003).</li>
<li>Namekawa, S. H., VandeBerg, J. L., McCarrey, J. R., Lee, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sex+chromosome+silencing+in+the+marsupial+male+germ+line%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Sex chromosome silencing in the marsupial male germ line.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 9730-9735 (2007).</li>
<li>Namekawa, S. H., Payer, B., Huynh, K. D., Jaenisch, R., Lee, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-step+imprinted+X+inactivation%3A+repeat+versus+genic+silencing+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Two-step imprinted X inactivation: repeat versus genic silencing in the mouse.</a> Mol Cell Biol. 30, 3187-3205 (2010).</li>
<li>Ichijima, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MDC1+directs+chromosome-wide+silencing+of+the+sex+chromosomes+in+male+germ+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">MDC1 directs chromosome-wide silencing of the sex chromosomes in male germ cells.</a> Genes Dev. 25, 959-971 (2011).</li>
<li>Sin, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNF8+regulates+active+epigenetic+modifications+and+escape+gene+activation+from+inactive+sex+chromosomes+in+post-meiotic+spermatids%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">RNF8 regulates active epigenetic modifications and escape gene activation from inactive sex chromosomes in post-meiotic spermatids.</a> Genes Dev. 26, 2737-2748 (2012).</li>
</ol>

De auteur heeft niets te onthullen.

Bij 3D-diavoorbereiding gaat de permeabilisatiestap vooraf aan de fixatiestap. Deze stappen worden direct uitgevoerd op seminifereuze tubuli, waardoor de driedimensionale chromatinestructuur behouden blijft. Een alternatieve optie voor het behoud van chromatinestructuur voor RNA/ DNA FISH is om de permeabilisatiestap en de fixatiestap tegelijkertijd uit te voeren. Deze alternatieve techniek is uitgevoerd in buideldierkiemcellen en in muisvoorplantatieembryo's7,8. Als de fixatiestap echter voorafgaat aan de per...

Bij teelballen onderscheiden kiemcellen zich van diploïde spermatogonia via meiose tot volwassen, haploïde spermatozoa. Tijdens dit proces wordt de nucleaire chromatinestructuur van kiemcellen continu en dynamisch geremodelleerd. Oppervlaktespreads worden vaak gebruikt voor het cytologisch onderzoek van individuele spermatogene cellen. Een heersende methode van oppervlaktespreiding maakt gebruik van hypotone behandeling waarbij individuele spermatogene cellen worden verspreid en afgevlakt1. Deze aandoeningen zijn optimaal voor gedetailleerde analyse van meiotische chromosomen. Chromosomale kenmerken zoals synaptische status en recombinatie foci kunnen gemakkelijk worden waargenomen met behulp van deze methode. De hypotone behandeling verstoort echter de subnucleaire chromatinearchitectuur, dus deze techniek is niet geschikt voor structurele analyse van kernen. Bijgevolg is een verbeterde methode ontworpen om de driedimensionale chromatinestructuur van testiculaire kiemcellen te behouden. Deze methode wordt de driedimensionale (3D) diamethode genoemd (figuur 1). De 3D-diamethode heeft de detectie van ontluikende RNA-lokalisatie in kernen mogelijk gemaakt, omdat deze aanvankelijk was geoptimaliseerd om genexpressie en chromatinetoestanden te onderzoeken tijdens testiculaire kiemceldifferentiatie door RNA-fluorescentie in situ hybridisatie (FISH)2,3. Deze 3D-methode is ook van toepassing op de combinatie van immunofluorescentie, DNA en RNA FISH. Bovendien heeft deze methode geholpen bij de ontdekking van postmeiotisch sekschromtine (PMSC), een stil compartiment van de geslachtschromosomen gevonden in postmeiotische spermatids2.
De 3D-diamethode werd oorspronkelijk geoptimaliseerd door de combinatie van twee essentiële stappen van diavoorbereiding die vaak worden gebruikt voor nucleaire kleuring: de fixatiestap die is ontworpen om nucleaire materialen te fixeren en de permeabilisatiestap die bedoeld is om cytoplasmatische materialen te verwijderen om de toegankelijkheid van kleurreagentia, zoals antilichamen en FISH-sondes, te verbeteren. Zoals eerder beschreven in een andere publicatie3, is vastgesteld dat de permeabilisatiestap vooraf moet gaan aan de fixatiestap om optimale resultaten met een lage cytoplasmatische achtergrond te verkrijgen. In deze 3D-diamethode worden de permeabilisatiestap en de daaropvolgende fixatiestap rechtstreeks op seminifereuze tubuli uitgevoerd en gevolgd door de mechanische dissociatie van kiemcellen met tang voorafgaand aan cytospinning op dia's. In een ander laboratorium werd een alternatieve methode voor RNA FISH van spermatogene cellen ontwikkeld4. Bij deze methode, in overeenstemming met de 3D-methode, moet de permeabilisatiestap voorafgaan aan de fixatiestap om optimale resultaten van RNA FISH te verkrijgen.
Het volgende protocol beschrijft de 3D-diamethode en geeft een voorbeeld van een mogelijke toepassing, Cot-1 RNA FISH voor de detectie van nucleaire ontluikende RNA's. Cot-1 DNA bestaat uit repetitieve elementen in het genoom. Hier wordt een Cot-1 DNA-sonde gehybridiseerd tot een intron en UTR van de ontluikende transcripties, waardoor de transcriptieactieve gebieden in kern5,6worden gedetecteerd. 3D-dia's zijn veelzijdig en kunnen worden toegepast op een combinatie van immunofluorescentie-, DNA- en RNA FISH-technieken om gedetailleerd onderzoek te verkrijgen naar ruimtelijke relaties tussen chromatinearchitectuur.

<table><tbody><tr><td>Cot-1 DNA&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>18440-016</td><td></td></tr><tr><td>Stratagene Prime-It Fluor Fluorescence Labeling Kit</td><td>Agilent</td><td>300380</td><td></td></tr><tr><td>Herring sperm DNA Solution</td><td>Invitrogen</td><td>15634-017</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol. 200 proof (absolute)</td><td>Pharmco-aaper</td><td>111000200</td><td></td></tr><tr><td>Sodium acetate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2889</td><td></td></tr><tr><td>Formamide deionized</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB00600-00500</td><td></td></tr><tr><td>Sodium citrate tribasic dihydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8532</td><td></td></tr><tr><td>Bovine serum albumin</td><td>Lifeblood Medical</td><td>77110-100</td><td></td></tr><tr><td>Dextran sulfate sodium salt from Leuconostoc spp.</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6001</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Invitrogen</td><td>A10491-01</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>PIPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6757</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium chloride hexahydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M0250</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>76240</td><td></td></tr><tr><td>Sodium hydroxide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>221465</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate buffered saline</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>VECTASHIELD Mounting Medium with DAPI</td><td>Vector Laboratories</td><td>H1200</td><td></td></tr><tr><td>Ribonucleoside-vanadyl complex</td><td>New England Biolabs</td><td>S1402S</td><td></td></tr><tr><td>Illustra MicroSpin G-50 Columns</td><td>GE Healthcare</td><td>27-5330-01</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5424</td><td></td></tr><tr><td>Forceps</td><td>VWR</td><td>300-050</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuge tubes</td><td>Bioexpress</td><td>C-3262-1</td><td></td></tr><tr><td>Cytospin 3</td><td>Shandon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Coplin Jar</td><td>Fisher</td><td>08-815</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost /Plus Microscope Slides</td><td>Fisher</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>4-well dish</td><td>Fisher</td><td>12-566-301</td><td></td></tr><tr><td>Cover glass&nbsp;</td><td>Fisher</td><td>12-544-G</td><td></td></tr><tr><td>Air incubator</td><td>Revolutionary Science</td><td>RS-IF-203</td><td></td></tr></tbody></table>

diavoorbereidingsmethode om driedimensionale chromatinearchitectuur van testiculaire kiemcellen te behouden

Slide Preparation Method to Preserve Three-dimensional Chromatin Architecture of Testicular Germ Cells

Tijdens testiculaire kiemceldifferentiatie verandert de structuur van nucleaire chromatine dynamisch. Het volgende beschrijft een methode die is ontworpen om de driedimensionale chromatine-opstelling van testiculaire kiemcellen bij muizen te behouden; deze methode wordt de driedimensionale (3D)-diamethode genoemd. Bij deze methode worden testiculaire tubuli direct behandeld met een permeabilisatiestap die cytoplasmatisch materiaal verwijdert, gevolgd door een fixatiestap die nucleaire materialen fixeert. Tubuli worden dan gedissocieerd, de celsuspensie is cytospun en cellen hechten zich aan dia's. Deze methode verbetert de gevoeligheid voor detectie van subnucleaire structuren en is toepasbaar voor immunofluorescentie, DNA en RNA fluorescentie in situ hybridisatie (FISH) en de combinatie van deze detectiemethoden. Als voorbeeld van een mogelijke toepassing van de 3D-diamethode wordt een Cot-1 RNA FISH getoond om ontluikende RNA's te detecteren. De 3D-diamethode vergemakkelijkt het gedetailleerde onderzoek van ruimtelijke relaties tussen chromatinestructuur, DNA en RNA tijdens testiculaire kiemceldifferentiatie.

Figuur 2 geeft een representatief resultaat van een 3D-diaweer . In dit experiment werd Cot-1 RNA FISH uitgevoerd om ontluikende transcriptie samen met immunostaining te detecteren met behulp van anti CBX1- en γH2AX-antilichamen. Om RNA FISH en immunostaining te combineren, werd eerst immunostaining uitgevoerd, gevolgd door RNA FISH zoals beschreven in3. CBX1 is een heterochromatine-eiwit dat zich lokaliseert naar pericentromerische heterochromatine en stille geslachtschromosomen in meiose, ee...

Het materiaal hier beschrijft een methode die is ontwikkeld om de driedimensionale chromatinestructuur van testiculaire kiemcellen te behouden. Dit wordt de driedimensionale (3D) diamethode genoemd. Deze methode verbetert de gevoeligheid voor detectie van subnucleaire structuren en is toepasbaar voor immunofluorescentie, DNA en RNA fluorescentie in situ hybridisatie (FISH).

Diavoorbereidingsmethode om driedimensionale chromatinearchitectuur van testiculaire kiemcellen te behouden

During testicular germ cell differentiation, the structure of nuclear chromatin dynamically changes. The following describes a method designed to preserve ...

Deze drieduchtige glijmiddelvoorbereidingsmethode behoudt de 3D-chromatine-indeling van cellen, zoals is aangetoond met testiculaire kiemcellen van muizen. Eerst, perme de ferous tubuli om het cytoplasmatische materiaal te verwijderen en de toegankelijkheid van kleurreagentia zoals antilichamen en vissondes te verbeteren. Na het fixeren van de nucleaire materialen, dissocieër de kiemcellen mechanisch met een pincet en cytosine de monsters op dia's.Vervolgens, verzamel data met meerdere Z-secties om een kern in 3D te bedekken wanneer strategisch toegepast resulteert in 3D-glijmiddelvoorbereidingen. Met behulp van COT een RNA vis kan nucleaire beginnende RNA's tonen om de transcriptioneel actieve gebieden in de kern te detecteren. Ik ontwikkelde deze methode toen ik in het genlaboratorium zat bij Massachusetts General Hospital.Op dat moment, optimaliseerde ik de glijmiddelvoorbereidingsmethode voor katoenen RNA fluorescente inzichten in hybridisatie, ook wel vis genoemd om nacent.RNA te detecteren. Katoenen sondes kunnen repetitieve sequenties in introns en tls hybridiseren en de plaats van actieve transcriptie visualiseren. Katoenen RA vis vereist behoud van nucleaire RNA-verdeling.

slide-preparation-method-to-preserve-three-dimensional-chromatin

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Deze video protocol illustreert de squash techniek die gebruikt wordt in de Johansen laboratorium voor te...

De voorbereiding van Drosophila polytheen Chromosoom Pompoenen voor antilichaam Labeling

Chromosomen kunnen worden geïsoleerd uit levende cellen zoals lymfocyten of huidfibroblasten en organismen, met inbegrip van mensen of muizen. Deze chromosoom preparaten kunnen verder worden gebruikt voor routinematige G-banding en moleculaire cytogenetische procedures zoals fluorescentie in situ hybridisatie (FISH), vergelijkende genomische hybridisatie (CGH) en spectrale karyotypering (SKY).

Chromosoom Voorbereiding Van gekweekte cellen

Werkwijzen voor het isoleren en het voorbereiden van Drosophila testes monsters (wonen en vast) voor beeldvorming door fase-contrast en fluorescentie microscopie worden hierin beschreven.

Cytologische analyse van Spermatogenese: Live and Vaste Bereidingen van<em&gt; Drosophila</em&gt; Testes

Wij bieden hier een efficiënt en betrouwbaar protocol voor immunokleuringen, fluorescentie in situ hybridisatie, DNA kleuring gevolgd door kwantitatieve, hoge-resolutie beeldvorming in whole-mount Arabidopsis thaliana eitjes. Deze methode is succesvol gebruikt om chromatine modificaties en nucleaire architectuur te analyseren.

Een efficiënte methode voor kwantitatieve, single-cell analyse van chromatine modificatie en Nucleaire Architectuur in zijn geheel-mount Ovules in<em&gt; Arabidopsis</em

Meiose is het ontwikkelings proces waaraan gameten worden gevormd door een ronde van DNA-replicatie en twee opeenvolgende ronden van chromosoom segregatie. Zoogdieren meiose kan worden onderzocht met behulp van een techniek ter voorbereiding Meiotische chromosoom spreads. Hier tonen we een methode voor te bereiden oppervlak-spread kernen van muis spermatocyten.

Voorbereiding van Meiotische chromosoom verspreidt van muis spermatocyten

Oögenese bij zoogdieren is bekend dat zij vergissing-geneigd, met name als gevolg van chromosoom missegregation. Dit manuscript chromatine verspreid voorbereiding worden methoden beschreven voor muis profase, metafase I en II-geënsceneerde eicellen. Deze fundamentele technieken toestaan voor de studie van chromatine-gebonden eiwitten en chromosoom morfologie in zoogdieren oögenese.

Chromatine verspreid preparaten voor de analyse van muis oöcyt progressie van profase naar metafase II

Gepresenteerd hier is een protocol voor het verrijken van pachytene spermatocyten, ronde spermatiden, en rek spermatiden uit volwassen muis testes met behulp van een discontinu bovine serumalbumine dichtheidsgradiënt met standaard laboratoriumapparatuur.

Verrijking van Pachyteen spermatocyten en spermatiden van muis testes met behulp van Standaard laboratoriumapparatuur

Nucleaire oppervlaktespreads zijn een onmisbaar hulpmiddel voor het bestuderen van chromosoomgebeurtenissen tijdens meiose. Hier demonstreren we een methode om meiotische chromosomen voor te bereiden en te visualiseren tijdens profase I van zebravissen spermatocyten.

Bereiding van Meiotic Chromosome Spreads van Zebrafish Spermatocyten

Het doel van dit protocol is om celdeling in intact weefsel te analyseren door levende en vaste celmicroscopie met drosophila meiotic spermatocyten. Het protocol laat zien hoe hele, intacte teelballen van Drosophila larven en vroege poppen te isoleren, en hoe ze te verwerken en te monteren voor microscopie.

Voorbereiding van Drosophila Larval en Pupal Testes voor analyse van celafdeling in levend, intact weefsel

We presenteren hier een verbeterd protocol voor de hele montering van drosophila-teelballen, geschikt voor confocale microscopie en ook reproduceerbaar en betrouwbaar labelen mogelijk. We illustreren dit protocol door 3D-representatie en kwantificering van colocalisatie-experimenten op de grote S4-S5 spermatocyten.

Immunostaining van Whole-Mount Drosophila Testes voor 3D Confocale Analyse van Grote Spermatocyten

Meiotische fouten in synapsen en recombinatie komen vaak voor bij eicellen van zoogdieren. Grondige analyse van eiwitten die bij deze processen betrokken zijn, is essentieel om te begrijpen hoe en waarom oögenese vaak fout gaat. De hier gepresenteerde technieken maken een uitgebreide monitoring van recombinatie en synapsen mogelijk om de eicelkwaliteit bij muizen te evalueren.

Voorbereiding van meiotische chromosoomspreads van eicellen van muizen voor beoordeling van synapsis en recombinatie

Leer een driedimensionale diavoorbereidingsmethode om chromatinearchitectuur in testiculaire kiemcellen te behouden. Deze techniek verbetert de detectie van subnucleaire structuren en is geschikt voor diverse fluorescentietoepassingen.

Diavoorbereidingsmethode om driedimensionale chromatinearchitectuur van testiculaire kiemcellen te behouden

Meer video's verkennen