Diavoorbereidingsmethode om driedimensionale chromatinearchitectuur van testiculaire kiemcellen te behouden
10 januari 2014
Het materiaal hier beschrijft een methode die is ontwikkeld om de driedimensionale chromatinestructuur van testiculaire kiemcellen te behouden. Dit wordt de driedimensionale (3D) diamethode genoemd. Deze methode verbetert de gevoeligheid voor detectie van subnucleaire structuren en is toepasbaar voor immunofluorescentie, DNA en RNA fluorescentie in situ hybridisatie (FISH).
Deze drieduchtige glijmiddelvoorbereidingsmethode behoudt de 3D-chromatine-indeling van cellen, zoals is aangetoond met testiculaire kiemcellen van muizen. Eerst, perme de ferous tubuli om het cytoplasmatische materiaal te verwijderen en de toegankelijkheid van kleurreagentia zoals antilichamen en vissondes te verbeteren. Na het fixeren van de nucleaire materialen, dissocieër de kiemcellen mechanisch met een pincet en cytosine de monsters op dia's.
Vervolgens, verzamel data met meerdere Z-secties om een kern in 3D te bedekken wanneer strategisch toegepast resulteert in 3D-glijmiddelvoorbereidingen. Met behulp van COT een RNA vis kan nucleaire beginnende RNA's tonen om de transcriptioneel actieve gebieden in de kern te detecteren. Ik ontwikkelde deze methode toen ik in het genlaboratorium zat bij Massachusetts General Hospital.
Op dat moment, optimaliseerde ik de glijmiddelvoorbereidingsmethode voor katoenen RNA fluorescente inzichten in hybridisatie, ook wel vis genoemd om nacent.RNA te detecteren. Katoenen sondes kunnen repetitieve sequenties in introns en tls hybridiseren en de plaats van actieve transcriptie visualiseren. Katoenen RA vis vereist behoud van nucleaire RNA-verdeling.
Het sleutelpunt van deze rechtervoorbereidingsmethode is dat de izatie-stappen moeten doorgaan De fixatiestap. Om de Cy Plasmic achtergrond te verwijderen, ontrafelen de OUS tubuli van een gescheurde testis in PBS op ijs, breng verschillende stukken tubuli van vijf tot 10 millimeter in lengte over naar 500 microliters CSK-buffer met 0,5% tritton X 100, en incubeer zes minuten op ijs. Breng nu alle tubuli over naar een 4%P-F-A-P-B-S oplossing in één put van een vierputtenbakje en incubeer gedurende 10 minuten op kamertemperatuur.
Vervolgens, incubeer alle tubuli in PBS gedurende vijf minuten op kamertemperatuur. Zet de cyto spin en cyto spin-kamers op tijdens de incubatieperioden op de achterkant van een glazen dia, breng alle tubuli over in 30 microliters PBS. Gebruik vervolgens de uiteinden van twee pincetten om de tubuli in stukken te scheuren.
Snijd de tubuli in horizontale richting door de tubuli tussen de uiteinden van twee pincetten te klemmen en de pincetten horizontaal te trekken. Voeg na het toevoegen van 30 microliters PBS de suspensie door middel van pipetteren te mengen, breng het vervolgens over naar een microcentrifugebuisje en voeg PBS toe tot een totaal volume van 1,3 milliliters. Breng nu 100 microliters van de suspensie toe op elk van de cyto spin-kamers. Cyto.
Spin de monsters bij 2000 RPM gedurende 10 minuten op kamertemperatuur. Droog de dia's op een laboratoriumbankje gedurende enkele minuten op kamertemperatuur met behulp van een coplan-pot met PBS. Was de dia's gedurende vijf minuten op kamertemperatuur.
Breng vervolgens de dia's over naar 70% ethanol gedurende ten minste twee minuten. Voeg in een 20 microliter reactie 100 nanogram gevangen, 1D NA-sonde, 20 millimolar ribonucleotide vanadyl-complex en hybridisatiebuffer toe. Gebruik een PCR-machine, incubeer gedurende 10 minuten bij 80 graden Celsius, gevolgd door prea.
Knielingstap bij 42 graden Celsius tot het klaar is voor gebruik. Droog de dia's nu opvolgend in 80% ethanol gedurende twee minuten, gevolgd door 100% ethanol gedurende twee minuten. Droog de dia's volledig op de laboratoriumbank bij kamertemperatuur.
Plaats nu de dia op een tipboxkamer bij 42 graden Celsius. Centrifugeer vervolgens de preneed-sondes kort en pipet ze direct op de gedehydrateerde dia's. Plaats voorzichtig een dekglas over de dia voor de hybridisatie-stap van minimaal zes uur bij 42 graden Celsius.
Verwarm de wasoplossingen voor in coplan-potten bij 42 graden Celsius gedurende 30 minuten in een waterbad met behulp van een scheermesje, verwijder het dekglas van de rand van de dia zonder de monsters te krassen, dompel de dia's geleidelijk in de wasoplossing gedurende vijf minuten per stuk. Begin met de eerste coplan-pot met twee XSSC en 50% formamid, gevolgd door de tweede coplan-pot met twee XSSC en 50% formamid. En dan de laatste twee potten met twee XSSC.
Voeg vervolgens 20 microliters DPI-montagemedium toe aan de monsters en plaats een dekglas. Druk voorzichtig op het glazen plaatje en dep het extra montagemedium af met een schoonmaakdoekje. In dit experiment werd caught one RNA vis uitgevoerd om gelijktijdig beginnende transcriptie en immunokleuring van eiwitten die zich lokaliseren in de XY-lichaamsimmunohistochemie te detecteren.
Op deze PACU detecteerde spermatocyt de heterochromatine-eiwit CCB X een en ook een gefosforyleerde vorm van histone-variant H twee A X op het XY-lichaam. De resulterende vis caught one signalen accumuleerden op de e chromatische gebieden in oppervlakteverspreidingen behandeld met hypotone oplossing. De driedimensionale chromatinestructuur is verstoord en alle myotische chromosoomassen kunnen binnen een enkele Z-vlak worden vastgelegd.
3D-glijmiddelvoorbereiding behoudt echter de intacte chromatinestructuur. Deze rechtervoorbereidingsmethode is toepasbaar voor immunofluorescence DNA en RNA vis, en de combinatie van deze detectiemethoden.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel presenteert een nieuwe methode voor de bereiding van driedimensionale (3D) preparaten die de chromatinestructuur van testiculaire kiemcellen behoudt. De methode verhoogt de gevoeligheid voor het detecteren van subnucleaire structuren en is geschikt voor diverse fluorescentietechnieken.
Belangrijkste Onderdeel van de Studie
Wetenschappelijk vakgebied
- Neurowetenschap
- Celbiologie
- Genetica
Achtergrond
- Het begrijpen van de chromatinestructuur is cruciaal voor het bestuderen van genexpressie.
- Traditionele methoden behouden 3D-chromatine-arrangementen mogelijk niet op adequate wijze.
- Testiculaire kiemcellen dienen als model voor het bestuderen van chromatinedynamiek.
- Immunofluorescentie en FISH zijn sleuteltechnieken voor het visualiseren van chromatine.
Doel van de studie
- Om een methode te ontwikkelen die de 3D-structuur van chromatine in kiemcellen behoudt.
- Om de detectie van kernstructuren te verbeteren met behulp van geavanceerde beeldvormingstechnieken.
- Om de studie van transcriptioneel actieve regio's binnen de kern te faciliteren.
Gebruikte methoden
- Permeabilisatie van ferous tubuli om de toegankelijkheid voor kleuring te verbeteren.
- Mechanische dissociatie van kiemcellen voor de bereiding van preparaten.
- Toepassing van meerdere Z-secties voor 3D-beeldvorming van kernen.
- Gebruik van COT one RNA-FISH voor de visualisatie van nascente RNA's.
Belangrijkste resultaten
- De 3D-preparaatmethode bewaart de chromatinestructuur effectief.
- Er werd een verhoogde gevoeligheid bereikt voor het detecteren van subnucleaire structuren.
- Succesvolle visualisatie van transcriptioneel actieve regio's in de nucleus.
- De methode is toepasbaar voor diverse fluorescentietechnieken.
Conclusies
- De methode voor de bereiding van 3D-preparaten is een belangrijke vooruitgang in het chromatineonderzoek.
- Deze techniek kan ons begrip van genregulatie verbeteren.
- Toekomstige toepassingen kunnen worden uitgebreid naar andere celtypen en onderzoeksgebieden.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Topprofessionals
Het behouden van de natuurlijke chromatinestructuur maakt een nauwkeurige beoordeling van de transcriptionele activiteit en de nucleaire organisatie in kiemcelmodellen mogelijk. Deze methode ondersteunt de validatie van doelwitten door de ruimtelijke relaties tussen DNA, RNA en eiwitcomplexen tijdens differentiatie te behouden. Het biedt een reproduceerbaar platform voor mechanistische risicoreductie in vroege discovery-workflows.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Onderzoekt therapeutische hypothesen door de 3D-chromatinestructuur te behouden voor een nauwkeurige beoordeling van de target-interactie.
- Operationele waarde: Maakt functionele target-validatie mogelijk door detectie van nascent RNA en eiwit-colokalisatie in intacte kernen.
- Voorspellende waarde: Ondersteunt portfolio-triage door chromatinestructuren te onthullen die gekoppeld zijn aan transcriptionele regulatie in ziekte-relevante systemen.
Screening & Assayontwikkeling
- Klaarheid voor Assay: Bereidt gevalideerde biologische systemen voor op immunofluorescentie en FISH-gebaseerde screening van chromatine-modulerende verbindingen.
- Kwantitatieve Output: Genereert gestandaardiseerde, multi-sectie Z-stack-gegevens die een betrouwbare vergelijking van nucleaire kleuringspatronen mogelijk maken.
- Schaalbaarheid: Ondersteunt hergebruik van het platform voor meerdere targets door de gevoeligheid voor subnucleaire structuren te behouden voor downstream-applicaties.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Ziekte-relevantie: Handhaaft de continuïteit van het chromatine, van modellen voor kiemceldifferentiatie tot preklinische validatie van epigenetische targets.
- Afstemming van biomarkers: Faciliteert de translationele ontwikkeling van biomarkers door ruimtelijke RNA-DNA-interacties te behouden die indicatief zijn voor transcriptionele toestanden.
- Risicogestuurde vooruitgang: Maakt mechanische risicoreductie mogelijk door directe visualisatie van veranderingen in de nucleaire architectuur als reactie op perturbaties.
Pipeline- & workflowintegratie
De methode integreert in discovery biology-workflows door de chromatinestructuur te behouden voor hypothesetoetsing en pathway-verduidelijking in kiemcelmodellen.
- Ontdekkingsbiologie: Ondersteunt hypothesetoetsing door inheemse chromatine-arrangementen te behouden voor een nauwkeurige interpretatie van beelduitslagen.
- Screening: Zorgt voor assay-gereedheid via reproduceerbare preparatie van coupes die compatibel zijn met gemultiplexe immunofluorescentie en FISH-detectie.
- Analytica: Maakt kwantitatieve vergelijking van kernstructuren mogelijk via Z-sectie imaging en metingen van signaal-colokalisatie.
- Translationeel onderzoek: Sluit aan bij preklinische continuïteit door chromatinetoestanden te behouden die relevant zijn voor de validatie van epigenetische mechanismen.
- Bedrijfsbrede herbruikbaarheid: Vestigt een herbruikbaar cytospin-gebaseerd platform voor het behoud van de chromatinestructuur over meerdere stadia van kiemcellen.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Biedt voorspellend vertrouwen bij doelwitvalidatie door mechanische ambiguïteit in studies naar nucleaire organisatie te verminderen.
- Operationele waarde: Garandeert standaardisatie en reproduceerbaarheid door gedefinieerde stappen voor permeabilisatie, fixatie en cytospin.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen door directe visualisatie van transcriptionele activiteit in intacte chromatinecontexten mogelijk te maken.
- Impact op portfolio: Ondersteunt risico-gecorrigeerde prioritering via chromatine-gebaseerde functionele validatie van doelwitten in kiemceldifferentiatiemodellen.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in chromatinbiologie en fluorescentiemicroscopie voor een correcte uitvoering en interpretatie.
- Afhankelijk van cytosine-centrifugeapparatuur en geoptimaliseerde buffersystemen voor een consistente preparatie van de coupes.
- Vereist standaardisatie tussen teams van de timing van permeabilisatie en fixatie om de distributie van nucleair RNA te behouden.
- Omvat overwegingen voor aanpassing bij het toepassen van de methode op andere celtypen met een verschillende nucleaire fragiliteit.
- Beperkt door de noodzaak van zorgvuldige mechanische dissociatie om chromatinestoring tijdens de tubulusverwerking te voorkomen.
