Name: In vitro Coculture Assay om pathogene geïnduceerde neutrofiele trans-epitheliale migratie te beoordelen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-01-06T15:45:00.000+00:00
Duration: 14 min 14 s
Description: Leer een in vitro cocultuurmethode om neutrofiele trans-epitheliale migratie te evalueren bij bacteriële infectie. Dit model helpt onderzoekers de mechanismen van immuunresponsen in slijmvliezen te begrijpen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd financieel ondersteund door NIH (1 R01 AI095338-01A1).

<ol><li>Burns, A. R., Smith, C. W., Walker, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unique+structural+features+that+influence+neutrophil+emigration+into+the+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Unique structural features that influence neutrophil emigration into the lung.</a> Physiol. Rev. 83, 309-336 (2003).</li>
<li>Hurley, B. P., McCormick, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+epithelial+defense+systems+protect+against+bacterial+threats%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Gastroenterol.+Rep%22%5BJournal%5D)">Intestinal epithelial defense systems protect against bacterial threats.</a> Curr. Gastroenterol. Rep. 6, 355-361 (2004).</li>
<li>McCormick, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial-induced+hepoxilin+A3+secretion+as+a+pro-inflammatory+mediator%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+J%22%5BJournal%5D)">Bacterial-induced hepoxilin A3 secretion as a pro-inflammatory mediator.</a> FEBS J. 274, 3513-3518 (2007).</li>
<li>Mumy, K. L., McCormick, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+neutrophils+in+the+event+of+intestinal+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">The role of neutrophils in the event of intestinal inflammation.</a> Curr. Opin. Pharmacol. 9, 697-701 (2009).</li>
<li>Chin, A. C., Parkos, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathobiology+of+neutrophil+transepithelial+migration%3A+implications+in+mediating+epithelial+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Pathobiology of neutrophil transepithelial migration: implications in mediating epithelial injury.</a> Annu. Rev. Pathol. 2, 111-143 (2007).</li>
<li>Segel, G. B., Halterman, M. W., Lichtman, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+paradox+of+the+neutrophil%27s+role+in+tissue+injury%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Leukoc.+Biol%22%5BJournal%5D)">The paradox of the neutrophil's role in tissue injury.</a> J. Leukoc. Biol. 89, 359-372 (2011).</li>
<li>Weiss, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+destruction+by+neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Engl.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">Tissue destruction by neutrophils.</a> N. Engl. J. Med. 320, 365-376 (1989).</li>
<li>Hurley, B. P., Thorpe, C. M., Acheson, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shiga+toxin+translocation+across+intestinal+epithelial+cells+is+enhanced+by+neutrophil+transmigration%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Shiga toxin translocation across intestinal epithelial cells is enhanced by neutrophil transmigration.</a> Infect. Immun. 69, 6148-6155 (2001).</li>
<li>Kohler, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salmonella+enterica+serovar+Typhimurium+regulates+intercellular+junction+proteins+and+facilitates+transepithelial+neutrophil+and+bacterial+passage%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Gastrointest.+Liver+Physiol%22%5BJournal%5D)">Salmonella enterica serovar Typhimurium regulates intercellular junction proteins and facilitates transepithelial neutrophil and bacterial passage.</a> Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 293, 178-187 (2007).</li>
<li>Gane, J., Stockley, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+neutrophil+transmigration+across+the+vascular+endothelium+in+COPD%5BTitle%5D)+AND+%22Thorax%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of neutrophil transmigration across the vascular endothelium in COPD.</a> Thorax. 67, 553-561 (2012).</li>
<li>Grommes, J., Soehnlein, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+neutrophils+to+acute+lung+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Med%22%5BJournal%5D)">Contribution of neutrophils to acute lung injury.</a> Mol. Med. 17, 293-307 (2011).</li>
<li>Nakagome, K., Matsushita, S., Nagata, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophilic+inflammation+in+severe+asthma%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+Arch.+Allergy+Immunol.%22%5BJournal%5D)">Neutrophilic inflammation in severe asthma.</a> Int. Arch. Allergy Immunol.. 158 Suppl 1, 96-102 (2012).</li>
<li>Choi, E. Y., Santoso, S., Chavakis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+neutrophil+transendothelial+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Biosci%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of neutrophil transendothelial migration.</a> Front. Biosci. 14, 1596-1605 (2009).</li>
<li>Louis, N. A., Campbell, E., Colgan, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Model+systems+to+investigate+neutrophil+adhesion+and+chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Model systems to investigate neutrophil adhesion and chemotaxis.</a> Methods Mol. Biol. 412, 257-270 (2007).</li>
<li>Craig, A., Mai, J., Cai, S., Jeyaseelan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+recruitment+to+the+lungs+during+bacterial+pneumonia%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Neutrophil recruitment to the lungs during bacterial pneumonia.</a> Infect. Immun. 77, 568-575 (2009).</li>
<li>Hurley, B. P., McCormick, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translating+tissue+culture+results+into+animal+models%3A+the+case+of+Salmonella+typhimurium%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Translating tissue culture results into animal models: the case of Salmonella typhimurium.</a> Trends Microbiol. 11, 562-569 (2003).</li>
<li>Lee, W. Y., Chin, A. C., Voss, S., Parkos, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+neutrophil+transepithelial+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">In vitro neutrophil transepithelial migration.</a> Methods Mol. Biol. 341, 205-215 (2006).</li>
<li>Hurley, B. P., Siccardi, D., Mrsny, R. J., McCormick, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymorphonuclear+cell+transmigration+induced+by+Pseudomonas+aeruginosa+requires+the+eicosanoid+hepoxilin+A3%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Polymorphonuclear cell transmigration induced by Pseudomonas aeruginosa requires the eicosanoid hepoxilin A3.</a> J. Immunol. 173, 5712-5720 (2004).</li>
<li>McCormick, B. A., Colgan, S. P., Delp-Archer, C., Miller, S. I., Madara, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salmonella+typhimurium+attachment+to+human+intestinal+epithelial+monolayers%3A+transcellular+signalling+to+subepithelial+neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Salmonella typhimurium attachment to human intestinal epithelial monolayers: transcellular signalling to subepithelial neutrophils.</a> J. Cell Biol. 123, 895-907 (1993).</li>
<li>McCormick, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+attachment+of+Salmonella+typhimurium+to+intestinal+epithelia+imprints+the+subepithelial+matrix+with+gradients+chemotactic+for+neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Surface attachment of Salmonella typhimurium to intestinal epithelia imprints the subepithelial matrix with gradients chemotactic for neutrophils.</a> J. Cell Biol. 131, 1599-1608 (1995).</li>
<li>Mrsny, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+hepoxilin+A3+in+inflammatory+events%3A+a+required+role+in+neutrophil+migration+across+intestinal+epithelia%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Identification of hepoxilin A3 in inflammatory events: a required role in neutrophil migration across intestinal epithelia.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 7421-7426 (2004).</li>
<li>Tamang, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepoxilin+A%283%29+facilitates+neutrophilic+breach+of+lipoxygenase-expressing+airway+epithelial+barriers%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Hepoxilin A(3) facilitates neutrophilic breach of lipoxygenase-expressing airway epithelial barriers.</a> J. Immunol. 189, 4960-4969 (2012).</li>
<li>McCormick, B. A., Parkos, C. A., Colgan, S. P., Carnes, D. K., Madara, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apical+secretion+of+a+pathogen-elicited+epithelial+chemoattractant+activity+in+response+to+surface+colonization+of+intestinal+epithelia+by+Salmonella+typhimurium%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Apical secretion of a pathogen-elicited epithelial chemoattractant activity in response to surface colonization of intestinal epithelia by Salmonella typhimurium.</a> J. Immunol. 160, 455-466 (1998).</li>
<li>Boll, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enteroaggregative+Escherichia+coli+promotes+transepithelial+migration+of+neutrophils+through+a+conserved+12-lipoxygenase+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Enteroaggregative Escherichia coli promotes transepithelial migration of neutrophils through a conserved 12-lipoxygenase pathway.</a> Cell Microbiol. 14, 120-132 (2012).</li>
<li>Hurley, B. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+two-component+sensor+response+regulator+RoxS%2FRoxR+plays+a+role+in+Pseudomonas+aeruginosa+interactions+with+airway+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Microbes+Infect%22%5BJournal%5D)">The two-component sensor response regulator RoxS/RoxR plays a role in Pseudomonas aeruginosa interactions with airway epithelial cells.</a> Microbes Infect. 12, 190-198 (2010).</li>
<li>Hurley, B. P., Williams, N. L., McCormick, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+phospholipase+A2+in+Pseudomonas+aeruginosa-mediated+PMN+transepithelial+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Lung+Cell+Mol.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Involvement of phospholipase A2 in Pseudomonas aeruginosa-mediated PMN transepithelial migration.</a> Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 290, L703-L709 (2006).</li>
<li>McCormick, B. A., Siber, A. M., Maurelli, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Requirement+of+the+Shigella+flexneri+virulence+plasmid+in+the+ability+to+induce+trafficking+of+neutrophils+across+polarized+monolayers+of+the+intestinal+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Requirement of the Shigella flexneri virulence plasmid in the ability to induce trafficking of neutrophils across polarized monolayers of the intestinal epithelium.</a> Infect. Immun. 66, 4237-4243 (1998).</li>
<li>Savkovic, S. D., Koutsouris, A., Hecht, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Attachment+of+a+noninvasive+enteric+pathogen%2C+enteropathogenic+Escherichia+coli%2C+to+cultured+human+intestinal+epithelial+monolayers+induces+transmigration+of+neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Attachment of a noninvasive enteric pathogen, enteropathogenic Escherichia coli, to cultured human intestinal epithelial monolayers induces transmigration of neutrophils.</a> Infect. Immun. 64, 4480-4487 (1996).</li>
<li>Agbor, T. A., Demma, Z. C., Mumy, K. L., Bien, J. D., McCormick, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ERM+protein%2C+ezrin%2C+regulates+neutrophil+transmigration+by+modulating+the+apical+localization+of+MRP2+in+response+to+the+SipA+effector+protein+during+Salmonella+typhimurium+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The ERM protein, ezrin, regulates neutrophil transmigration by modulating the apical localization of MRP2 in response to the SipA effector protein during Salmonella typhimurium infection.</a> Cell Microbiol. 13, 2007-2021 (2011).</li>
<li>Pazos, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multidrug+resistance-associated+transporter+2+regulates+mucosal+inflammation+by+facilitating+the+synthesis+of+hepoxilin+A3%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Multidrug resistance-associated transporter 2 regulates mucosal inflammation by facilitating the synthesis of hepoxilin A3.</a> J. Immunol. 181, 8044-8052 (2008).</li>
<li>Agace, W. W., Patarroyo, M., Svensson, M., Carlemalm, E., Svanborg, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Escherichia+coli+induces+transuroepithelial+neutrophil+migration+by+an+intercellular+adhesion+molecule-1-dependent+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Escherichia coli induces transuroepithelial neutrophil migration by an intercellular adhesion molecule-1-dependent mechanism.</a> Infect. Immun. 63, 4054-4062 (1995).</li>
<li>Bhowmick, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+Disease+during+Streptococcus+pneumoniae+Acute+Lung+Infection+Requires+12-Lipoxygenase-Dependent+Inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Systemic Disease during Streptococcus pneumoniae Acute Lung Infection Requires 12-Lipoxygenase-Dependent Inflammation.</a> J. Immunol. , (2013).</li>
<li>Hurley, B. P., Pirzai, W., Mumy, K. L., Gronert, K., McCormick, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+eicosanoid-generating+capacity+of+cytoplasmic+phospholipase+A2+in+Pseudomonas+aeruginosa-infected+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Lung+Cell+Mol.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Selective eicosanoid-generating capacity of cytoplasmic phospholipase A2 in Pseudomonas aeruginosa-infected epithelial cells.</a> Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 300, 286-294 (2011).</li>
<li>Hurley, B. P., Sin, A., McCormick, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adhesion+molecules+involved+in+hepoxilin+A3-mediated+neutrophil+transepithelial+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Exp.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Adhesion molecules involved in hepoxilin A3-mediated neutrophil transepithelial migration.</a> Clin. Exp. Immunol. 151, 297-305 (2008).</li>
<li>Frank, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Research+Topic+on+Pseudomonas+aeruginosa%2C+Biology%2C+Genetics%2C+and+Host-Pathogen+Interactions.%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Research Topic on Pseudomonas aeruginosa, Biology, Genetics, and Host-Pathogen Interactions.</a> Front. Microbiol. 3, 20 (2012).</li>
<li>Lyczak, J. B., Cannon, C. L., Pier, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lung+infections+associated+with+cystic+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Microbiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Lung infections associated with cystic fibrosis.</a> Clin. Microbiol. Rev. 15, 194-222 (2002).</li>
<li>Bucior, I., Mostov, K., Engel, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudomonas+aeruginosa-mediated+damage+requires+distinct+receptors+at+the+apical+and+basolateral+surfaces+of+the+polarized+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Pseudomonas aeruginosa-mediated damage requires distinct receptors at the apical and basolateral surfaces of the polarized epithelium.</a> Infect. Immun. 78, 939-953 (2010).</li>
<li>Kierbel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudomonas+aeruginosa+exploits+a+PIP3-dependent+pathway+to+transform+apical+into+basolateral+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Pseudomonas aeruginosa exploits a PIP3-dependent pathway to transform apical into basolateral membrane.</a> J. Cell Biol. 177, 21-27 (2007).</li>
<li>Lee, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+secreted+Salmonella+protein+induces+a+proinflammatory+response+in+epithelial+cells%2C+which+promotes+neutrophil+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">A secreted Salmonella protein induces a proinflammatory response in epithelial cells, which promotes neutrophil migration.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 12283-12288 (2000).</li>
<li>Zurawski, D. V., Mumy, K. L., Faherty, C. S., McCormick, B. A., Maurelli, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shigella+flexneri+type+III+secretion+system+effectors+OspB+and+OspF+target+the+nucleus+to+downregulate+the+host+inflammatory+response+via+interactions+with+retinoblastoma+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Shigella flexneri type III secretion system effectors OspB and OspF target the nucleus to downregulate the host inflammatory response via interactions with retinoblastoma protein.</a> Mol. Microbiol. 71, 350-368 (2009).</li>
<li>Brazil, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+migration+across+intestinal+epithelium%3A+evidence+for+a+role+of+CD44+in+regulating+detachment+of+migrating+cells+from+the+luminal+surface%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Neutrophil migration across intestinal epithelium: evidence for a role of CD44 in regulating detachment of migrating cells from the luminal surface.</a> J. Immunol. 185, 7026-7036 (2010).</li>
<li>Lawrence, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antiadhesive+role+of+apical+decay-accelerating+factor+%28CD55%29+in+human+neutrophil+transmigration+across+mucosal+epithelia%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Antiadhesive role of apical decay-accelerating factor (CD55) in human neutrophil transmigration across mucosal epithelia.</a> J. Exp. Med. 198, 999-1010 (2003).</li>
<li>Hodges, K., Hecht, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interspecies+communication+in+the+gut%2C+from+bacterial+delivery+to+host-cell+response%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Interspecies communication in the gut, from bacterial delivery to host-cell response.</a> J. Physiol. 590, 433-440 (2012).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.

Neutrofiele migratie over mucosale epitheeloppervlakken is een veel voorkomend kenmerk in ziektepathologie na infectie met bacteriële pathogenen3. De hierin beschreven methodologie biedt een snelle, eenvoudige aanpak om deze discrete gebeurtenis experimenteel te isoleren met behulp van een in vitro coculture assay-systeem dat een kenmerk modelleert van het ontstekingsproces dat wordt veroorzaakt door bacteriële infecties. Dit systeem werd oorspronkelijk ontwikkeld met behulp van gepolariseerde intesti...

Mucosale oppervlakken dienen als fysieke en immunologische barrières die bescherming bieden tegen externe bedreigingen die alomtegenwoordig zijn in het milieu1,2. Deze beschermende epitheelbarrière kan worden aangetast wanneer pathogene organismen binnendringen2. In het geval van een bacteriële ziekteverwekker veroorzaakt deze ontmoeting vaak een ontstekingsproces door het aangeboren immuunsysteem te activeren en een snelle mobilisatie van eerstehulpgranulocyten bekend als neutrofielen2-4te activeren . Chemotactische middelen die neutrofiele rekrutering vergemakkelijken, worden gedeeltelijk geproduceerd door de mucosale epitheelcellen die de gastheer van de beledigende ziekteverwekker2-4willen bevrijden. Overmatige of onopgeloste neutrofiele infiltratie van het mucosale epitheeloppervlak kan significante pathologie veroorzaken1,5. Dit is een gevolg van niet-specifieke weefselschade veroorzaakt door het antibacteriële neutrofielenarsenaal5-7. In dergelijke gevallen wordt de bacteriële klaringscapaciteit van neutrofielen overschaduwd door vernietiging van gastheerweefsel tijdens een infectieuze belediging.  Verstoring van de beschermende epitheliale barrièrefunctie kan leiden tot een verhoogde blootstelling van onderliggend weefsel aan micro-organismen en/of toxines, waardoor de ziektepathologie verder wordt verergerd8,9. Deze gevolgen kunnen worden waargenomen in meerdere orgaansystemen, waaronder de longen en het spijsverteringskanaal1,5. Bovendien worden niet-infectieuze ontstekingsaandoeningen zoals ernstige aanvallen van astma, chronische obstructieve longziekte (COPD), acuut respiratoir distress syndroom (ARDS) en inflammatoire darmziekte (IBD) gekenmerkt door de pathologische breuk van de mucosale epitheelbarrière door een overmatige neutrofiele respons4,5,10-12.
Het complexe proces van neutrofiele rekrutering na mucosale infectie omvat verschillende gecompartimenteerde stappen1,5,13,14. Ten eerste moeten neutrofielen uit de circulatie vertrekken via een reeks cel-naar-celinteracties die trans-endotheelmigratie vergemakkelijken1,13. Neutrofielen navigeren vervolgens door bestaande interstitiële ruimte met extracellulaire matrix1,14. Om het lumen van het geïnfecteerde slijmvlies te bereiken, moeten neutrofielen vervolgens migreren over de epitheelbarrière1,4,5. Dit ingewikkelde multistep-fenomeen wordt vaak in geaggregeerde zin onderzocht met behulp van in vivo diermodellen van infectie15. Dergelijke modellen zijn nuttig om de noodzaak vast te stellen van specifieke factoren, zoals chemokinen, adhesiemoleculen of signaleringsroutes die deelnemen aan het algehele proces, maar zijn grotendeels ontoereikend voor het oplossen van moleculaire bijdragen die van cruciaal belang zijn voor elke afzonderlijke gecompartimenteerde stap16. Coculturele in vitro systemen die trans-endotheel-, transmatrix- of transepitheelmigratie van neutrofielen modelleren, zijn in dit opzicht bijzonder nuttig geweest1,14,16,17.
Er is een robuust coculture-assaysysteem ontwikkeld voor het ontcijferen van mechanismen die verantwoordelijk zijn voor neutrofiele transepitheelmigratie als reactie op pathogene infectie18-22. Dit model omvat het infecteren van het apicale oppervlak van gepolariseerde menselijke epitheelcellagen met een bacteriële ziekteverwekker gevolgd door toepassing van vers geïsoleerde menselijke neutrofielen op het basolaterale oppervlak18-22. Neutrofielen migreren over de epitheelbarrière als reactie op epitheliale chemotactische producten die zijn uitgescheiden na pathogene infectie18,21-23. Dit modelsysteem is gebruikt met behulp van intestinale en longepitheelculturen die zijn blootgesteld aan geschikte weefselspecifieke bacteriële pathogenen en heeft nieuwe moleculaire mechanismen onthuld die waarschijnlijk belangrijk zijn voor het wervingsproces van neutrofielen tijdens mucosale infectie3,8,19,24-28. De kracht van dit in vitro coculture model is dat een reductionistische benadering de onderzoeker in staat stelt om de ziekteverwekker, epitheelbarrière en/of neutrofiel experimenteel te manipuleren in een goed gecontroleerd, zeer reproduceerbaar, vrij goedkoop systeem. Inzicht verkregen uit deze aanpak kan effectief worden gebruikt om gerichte analyse uit te voeren van gecompartimenteerde gebeurtenissen tijdens neutrofiele rekrutering met behulp van in vivo infectiemodellen22,29,30.
Dit artikel demonstreert de meerdere stappen die nodig zijn voor de succesvolle vaststelling van dit reproduceerbare model om pathogene geïnduceerde neutrofiele trans-epitheelmigratie te onderzoeken. Longepitheelbarrières geïnfecteerd met de ziekteverwekker Pseudomonas aeruginosa komen in dit artikel voor; andere weefselepithlia en pathogenen kunnen echter worden vervangen door kleine wijzigingen. Zaaien en cultiveren van gepolariseerde longepitheelcellagen op omgekeerde collageen gecoate permeabele transwellfilters wordt hierin beschreven, net als de groei van pathogene P. aeruginosa en de isolatie van neutrofielen uit volbloed. Hoe deze componenten worden gecombineerd om door pathogenen geïnduceerde neutrofiele transepitheelmigratie te observeren, wordt gepresenteerd, samen met passende positieve en negatieve controles om een reproduceerbare test vast te stellen. De veelzijdigheid van deze benadering om verschillende aspecten van pathogene geïnduceerde neutrofiele transepitheelmigratie te onderzoeken, wordt besproken met betrekking tot specifieke studies in de literatuur.

<table><tbody><tr><td>NCl-H292 cellen</td><td>ATCC</td><td>CRL-1848</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640 medium</td><td>ATCC</td><td>30-2001</td><td></td></tr><tr><td>Pseudomonas aeruginosa PAO1</td><td>ATCC</td><td>#47085</td><td></td></tr><tr><td>Escherichia coli MC1000</td><td>ATCC</td><td>#39531</td><td></td></tr><tr><td>D-PBS (1x) vloeistof</td><td>Invitrogen</td><td>14190-144</td><td>zonder calcium en magnesium</td></tr><tr><td>Heat Inactivated Fetal bovien serum</td><td>Invitrogen</td><td>10082-147</td><td>10% toegevoegd aan het kweekmedium</td></tr><tr><td>Penicilline-Streptomycine</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td>100x: 10.000 eenheden penicilline en 10.000 &micro;g streptomycine per ml.</td></tr><tr><td>Trypsine-EDTA (0,05%)</td><td>Invitrogen</td><td>25300-062</td><td>50 ml aliquoten worden bevroren bewaard bij -20 &ordm;C.&nbsp; Aliquot in gebruik kan op korte termijn worden bewaard bij 4 &ordm;C.&nbsp;&nbsp;</td></tr><tr><td>Hank's Balanced Salt Solution - HBSS(-)</td><td>Invitrogen</td><td>14175-079</td><td>Steriele, zonder calcium en magnesium</td></tr><tr><td>Trypan Blauw oplossing</td><td>Invitrogen</td><td>15250-061.</td><td>Stock = 0,4%</td></tr><tr><td>Collagene, Rattenstaart</td><td>Invitrogen</td><td>A10483-01</td><td>Kan ook in het laboratorium direct van de staarten van ratten worden geïsoleerd met behulp van standaardprotocollen</td></tr><tr><td>Citroenzuur</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1909-500G</td><td>Component van 1 M citraatbuffer en zure citraat dextrose (ACD) oplossing</td></tr><tr><td>Natriumcitraat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S4641-500G</td><td>Component van 1 M citraatbuffer</td></tr><tr><td>Dextrose anhydrous</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8066-250G</td><td>Component van zure citraat dextrose (ACD) oplossing</td></tr><tr><td>Ammoniumchloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>213330-500G</td><td>Component van rode bloedcel (RBC) lyse buffer</td></tr><tr><td>Natriumbicarbonaat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6014-500G</td><td>Component van rode bloedcel (RBC) lyse buffer</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>ED-100G</td><td>Component van rode bloedcel (RBC) lyse buffer</td></tr><tr><td>HBSS(+) poeder</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1387-10L</td><td>Belangrijkste component van HBSS+</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375-500G</td><td>Component van HBSS+</td></tr><tr><td>Sigmacote</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SL2-25ML</td><td>Volg de instructies van de leverancier om glazen pipettenpunten te coaten</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T-9284</td><td></td></tr><tr><td>2,2'-Azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonzuur) diammoniumzout (ABTS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9941-50TAB</td><td>Belangrijkste component van ABTS substraat oplossing</td></tr><tr><td>30% Waterstofperoxide oplossing</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1009-100ML</td><td>Component van ABTS substraat oplossing</td></tr><tr><td>N-Formyl-Met-Leu-Phe (fMLP of fMLF)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F-3506</td><td>Een stockoplossing van 10 mM in DMSO moet worden bereid en aliquoten worden bewaard bij -20 &ordm;C.</td></tr><tr><td>Gelatine Type B</td><td>Fisher Scientific</td><td>M-12026</td><td></td></tr><tr><td>Pseudomonas isolatie agar&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0927-17-1</td><td>Volg de instructies van de fabrikant om PIA platen te maken</td></tr><tr><td>Ficoll-Paque PLUS&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>45-001-749</td><td>Optioneel, kan de zuiverheid van neutrofielen verbeteren</td></tr><tr><td>24-well migratie plaat</td><td>Corning Incorporated</td><td>#3524</td><td></td></tr><tr><td>24-well wasplaat</td><td>Falcon</td><td>35-1147</td><td>Kan worden hergebruikt als het in 70% ethanol wordt gedrenkt en grondig wordt gewassen voordat het opnieuw wordt gebruikt</td></tr><tr><td>96-well plaat</td><td>Fisher Scientific</td><td>#12565501</td><td></td></tr><tr><td>Transwell Permeable Supports&nbsp;</td><td>Corning Incorporated</td><td>#3415</td><td>Polycarbonaat; Diameter: 6,5 mm; Groeigebied: 0,33 cm2; Dish stijl: 24-well plaat; Poriegrootte: 3,0 &micro;m</td></tr><tr><td>Petri schaal</td><td>Falcon</td><td>35-1013</td><td>Elke Petri schaal bevat 24 omgekeerde 0,33 cm2 Transwells.&nbsp;&nbsp;</td></tr><tr><td>500 ml 0,2 &mu;m filter / kolf</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-740-25A</td><td>Om zure citraat dextrose (ACD) oplossing te steriliseren</td></tr><tr><td>5-3/4 inch glas Pasteur pipet</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-20A</td><td>Coat punten met Sigmacote voor gebruik</td></tr><tr><td>Hemostat</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-812-14</td><td>Gebogen, Gekarteld</td></tr><tr><td>Invertoskop Omgekeerde Microscoop</td><td>Zeiss</td><td>#342222</td><td></td></tr><tr><td>Versa-Max Microplate Reader</td><td>Molecular Devices</td><td>#432789</td><td></td></tr></tbody></table>

in vitro coculture assay om pathogene geïnduceerde neutrofiele trans-epitheliale migratie te beoordelen

In vitro Coculture Assay to Assess Pathogen Induced Neutrophil Trans-epithelial Migration

Mucosale oppervlakken dienen als beschermende barrières tegen pathogene organismen. Aangeboren immuunreacties worden geactiveerd bij het detecteren van pathogenen die leiden tot de infiltratie van weefsels met migrerende ontstekingscellen, voornamelijk neutrofielen. Dit proces heeft het potentieel om destructief te zijn voor weefsels als het overmatig is of in een onopgeloste toestand wordt gehouden.  Gecocultureerde in vitro modellen kunnen worden gebruikt om de unieke moleculaire mechanismen te bestuderen die betrokken zijn bij pathogene geïnduceerde neutrofiele trans-epitheliale migratie. Dit type model biedt veelzijdigheid in experimenteel ontwerp met de mogelijkheid voor gecontroleerde manipulatie van de ziekteverwekker, epitheelbarrière of neutrofiel. Pathogene infectie van het apicale oppervlak van gepolariseerde epitheliale monolagen gekweekt op permeabele transwellfilters veroorzaakt fysiologisch relevante basolaterale tot apicale transepitheelmigratie van neutrofielen die op het basolaterale oppervlak worden toegepast. Het hierin beschreven in vitro model toont de vele stappen aan die nodig zijn om neutrofiele migratie aan te tonen over een gepolariseerde longepitheelmonolayer die is geïnfecteerd met pathogene P. aeruginosa (PAO1). Zaaien en cultiveren van doorlatende transwells met menselijke afgeleide longepitheelcellen wordt beschreven, samen met isolatie van neutrofielen uit volledig menselijk bloed en cultivering van PAO1 en nietpathogene K12 E. coli (MC1000).  Het emigratieproces en de kwantitatieve analyse van met succes gemigreerde neutrofielen die zijn gemobiliseerd als reactie op pathogene infectie, worden aangetoond met representatieve gegevens, waaronder positieve en negatieve controles. Dit in vitro modelsysteem kan worden gemanipuleerd en toegepast op andere mucosale oppervlakken. Ontstekingsreacties waarbij overmatige neutrofiele infiltratie betrokken is, kunnen destructief zijn voor gastheerweefsels en kunnen optreden bij afwezigheid van pathogene infecties. Een beter begrip van de moleculaire mechanismen die neutrofiele transepitheelmigratie bevorderen door experimentele manipulatie van het in vitro coculture assay-systeem dat hierin wordt beschreven, heeft een aanzienlijk potentieel om nieuwe therapeutische doelen te identificeren voor een reeks mucosale infectieuze en inflammatoire ziekten.

Verschillende studies hebben aangetoond dat met ziekteverwekkers geïnfecteerde epitheellagen neutrofiele transepitheelmigratie vergemakkelijken3,8,19,24-28,31,32. Dit gebeurt via een pathogene-specifieke inductie van een epitheelcel-afgeleide neutrofiele chemotactische gradiënt3,23. Bijvoorbeeld, pathogene P. aeruginosa interactie met het apicale oppervlak van longepitheelcellen zorgt ervoor dat een aanzienlijk aantal neutrofielen migreren over de epitheellaag18,22,25,26,33,34. D...

Neutrofiele trans-epitheliale migratie als reactie op mucosale bacteriële infectie draagt bij aan epitheelletsel en klinische ziekte. Er is een in vitro model ontwikkeld dat pathogene, menselijke neutrofielen en gepolariseerde menselijke epitheelcellagen combineert die op transwellfilters zijn gekweekt om onderzoeken naar het ontrafelen van de moleculaire mechanismen die dit fenomeen orkestreren te vergemakkelijken.

In vitro Coculture Assay om pathogene geïnduceerde neutrofiele trans-epitheliale migratie te beoordelen

Mucosal surfaces serve as protective barriers against pathogenic organisms.&#160;Innate immune responses are activated upon sensing pathogen leading to ...

Het algemene doel van het volgende experiment is om het aantal neutrofielen te bepalen dat een monolaag van epitheelcellen is gekruist als reactie op infectie. Dit wordt bereikt door collageencodering van transwells voordat epitheelcellen monolagen worden gekweekt met behulp van de omgekeerde transwellfiltermanoeuvre. Als tweede stap wordt een bacteriepathogeen gekweekt om het apicale oppervlak van de epitheellaag te infecteren die op de transwellfilters is gekweekt, wat ervoor zorgt dat de epitheelcellen endogene neutrofiele chemo-attractanten produceren.Vervolgens worden neutrofielen geïsoleerd uit vol bloed toegevoegd aan de basolaterale zijde van geïnfecteerde epitheellagen die op transwellfilters zijn gekweekt voor het testen van migratie van neutrofielen van de basolaterale naar de apicale zijde. Er worden resultaten verkregen die een significante toename laten zien in het aantal trans-epitheliale migrerende neutrofielen dat wordt waargenomen als reactie op geïnfecteerde epitheellagen op basis van kwantificering van myeloperoxidase van gemigreerde neutrofielen. Visuele demonstratie van deze methode is cruciaal, aangezien de omgekeerde transwellfiltermanoeuvre om epitheelbarri

in-vitro-coculture-assay-to-assess-pathogen-induced-neutrophil-trans

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

In dit artikel wordt eerst een procedure voor het isoleren van humane endotheelcellen van de navelstreng aderen en dan laat zien hoe deze cellen te gebruiken om neutrofielen transmigratie onderzoeken op stromingscondities. Door een laag volume stromingskamer gemaakt van een polymeer met de optische eigenschappen van glas levende cellen fluorescerende beeldvorming zeldzame celpopulaties is ook mogelijk.

Isolatie van humane navelstreng endotheel cellen en hun gebruik in de studie van de neutrofielen transmigratie onder stroomtoestanden

Neutrofielaanhechting aan de geactiveerde endotheel op plaatsen van infectie is een integraal onderdeel van de gastheer ontstekingsreactie. Beschreven in dit rapport is een neutrofiel binding assay die het mogelijk maakt voor...

Kwantitatief<em&gt; In vitro</em&gt; Assay om neutrofieladhesie Maatregel om Activated primaire humane microvasculaire endotheelcellen onder statische omstandigheden

We presenteren een ex vivo celmigratie analyse die exacte kwantificering van enterische neurale celmigratie potentieel in aanwezigheid van verschillende groeifactoren maakt.

Een kwantitatieve cel-migratie test voor Muriene Enterisch neurale voorlopercellen

Uitvoeren celkweektesten voor het onderzoeken bacteriële adhesie en invasie onder aërobe omstandigheden is meestal niet representatief van...

Enterische Bacteriële invasie van darmepitheelcellen<em&gt; In Vitro</em&gt; Is het drastisch verbeterde Met behulp van een verticale Diffusion Kamer Model

We ontwikkelden een in vitro model dat een belangrijke component van de acute ontstekingsreactie tijdens infectie van de blaas uropathogene Escherichia coli nabootst. De transuroepithelial neutrofiel migratie assay maakt kwantitatieve beoordeling van menselijke neutrofiel migratie over blaas epitheel, gekweekt op permeabele dragers, in reactie op bacteriële infectie of chemoattractant stoffen.

Kwantitatieve beoordeling van Human migratie van neutrofielen door een Gekweekte blaas epitheel

Leukocyten steken de endotheelcellen monolaag met behulp van de paracellulaire of de transcellulaire route. We ontwikkelden een eenvoudige test om te volgen de verdeling van endogene junctionele VE-cadherine en PECAM-1 tijdens de migratie van leukocyten onder fysiologische stroom te maken tussen de twee transmigratie routes.

Real-time beeldvorming van endotheelcellen-cel Junctions Tijdens Neutrophil Transmigration onder fysiologische Flow

Hier presenteren we een protocol om te evalueren van het effect van peptiden op de migratie van bronchiale epitheliale cellen. Deze methode zorgt voor de snelle en zeer reproduceerbaar accumulatie van kwantitatieve gegevens over de snelheid van cel migratie en wond sluiting.

Een roman In Vitro wond genezing Assay om te evalueren van de cel migratie

Ontregelde intestinale epitheliale barrièrefunctie en immuunresponsen zijn kenmerken van inflammatoire darmziekten die slecht worden onderzocht vanwege een gebrek aan fysiologische modellen. Hier beschrijven we een muis intestinale lus model dat een goed gevasculariseerd en exteriorized darmsegment gebruikt om mucosale permeabiliteit en leukocyten rekrutering in vivo te bestuderen.

Functionele beoordeling van intestinale permeabiliteit en neutrofiele transepitheliale migratie bij muizen met behulp van een gestandaardiseerd intestinale lusmodel

Escherichia coli veroorzaakt sepsis bij pasgeborenen die de bacteriën rond het moment van geboorte binnenkrijgen. Het proces dat betrokken is bij het vermogen van E. coli om van het enterische kanaal naar de bloedbaan te reizen, is slecht begrepen. Dit in vitro model beoordeelt het vermogen van E. coli stammen om door de darmepitheelcellen te reizen.

Beoordeling van intestinale transcytose van neonatale Escherichia coli bacteriëmie-isolaten

Dit protocol biedt een methode voor primaire muizen T-celisolatie en time-lapse-microscopie van T-celmigratie onder specifieke omgevingsomstandigheden met kwantitatieve analyse.

Real-time in-vitromigratietest voor primaire muizen CD8+ T-cellen

De studie presenteert een methode voor in vitro onderzoek van bacteriële infecties met behulp van intestinale organoïden afkomstig van weefselstamcellen. Het protocol beschrijft hoe organoïden in twee dimensies kunnen worden gekweekt en onderscheiden, geïnfecteerd met adherent-invasieve Escherichia coli, en belangrijke metingen worden beoordeeld, waaronder het doorbreken van de epitheliale barrière, infectiebeeldvorming en de repitheliale RNA-respons.

Een tweedimensionale organoïde cultuur op invasine of basement membraanextract om gastheer-bacteriën interacties te bestuderen

Leer een in vitro cocultuurmethode om neutrofiele trans-epitheliale migratie te evalueren bij bacteriële infectie. Dit model helpt onderzoekers de mechanismen van immuunresponsen in slijmvliezen te begrijpen.

In vitro Coculture Assay om pathogene geïnduceerde neutrofiele trans-epitheliale migratie te beoordelen

Meer video's verkennen