De Slice kweekmethode voor Na Ontwikkeling van Tooth Germs In explantaatkweek

Het algemene doel van het volgende experiment is om de tandvorming gedurende meerdere dagen te volgen. Bij explan-kweek in vitro wordt dit bereikt door de ontwikkelende kaak van foetale muizen te dissecteren in levende plakken om de zich ontwikkelende tandkiemen bloot te leggen als tweede stap. De plakken worden geselecteerd, op filters boven een kweekmedium geplaatst en geïncubeerd om ontwikkeling mogelijk te maken.

Daarna worden plakken gelabeld met een lijntracer om cellulaire beweging tijdens de kweekperiode te volgen, resultaten worden verkregen die de dynamische aard van tandweefsels laten zien terwijl ze zich ontwikkelen tijdens explan-kweek. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van conventionele explant-kweek is dat intern zich ontwikkelende organen zoals tandkiemen kunnen worden waargenomen gedurende hun ontwikkeling binnen de context van het omringende weefsel. Visuele demonstratie van deze methode is cruciaal omdat de stappen van snijden en selecteren moeilijk kunnen zijn als de opstelling van de machine of de oriëntatie van het weefsel onnauwkeurig is.

Bereid eerst het dissectie- en kweekmedium voor de embryonale organen door 1%glutamaat en 1%penicilline-streptomycine toe te voegen aan 500 milliliter geavanceerd ECCOs gemodificeerd adelaarsmedium F 12. Dan, zoals beschreven in het videoartikel door Takahashi Sumi, dissecteer muisembryo's tussen stadia E 11.5 en E 15.5 van ontwikkeling en plaats ze in een petrischaal met vers medium. Vervolgens onthoofd je de embryo's met een vers geslepen steriele wolfraamnaald en breng je de koppen over in een verse schaal met gekoeld medium op ijs.

Isoleer vervolgens de kaken van de koppen door een naald in de mondholte te plaatsen en tijdelijk naar de achterkant van het hoofd te snijden. Bewaar de geïsoleerde kaken in gekoeld medium op ijs voordat ze worden gesneden. Voordat het kaakweefsel wordt gesneden, maak de montageschijf en het mes van de weefselsnijder schoon met 70%ethanol en zorg ervoor dat het mes vlak ligt op de montageschijf.

Wanneer het valt, moet het mes worden vervangen na het snijden van ongeveer 200 kaken, stel de snijdiepte in op tussen de 200 en 400 micrometer afhankelijk van de leeftijd van het specimen, en afhankelijk van of de hele tandkiem vereist is voor een E 14.5 embryo waarbij isolatie van de tandkiem vereist is, wordt een snijdiepte van 250 micrometer gebruikt. Breng vervolgens een kaak over naar de plastic montageschijf en rangschik hem zo dat de zich ontwikkelende tong in een frontale transversale oriëntatie staat. Wanneer je kiezen dissecteert om snijtanden te isoleren, neem je sagittale plakken door de kaak.

Eenmaal correct gepositioneerd, verwijder je het overtollige medium rond het weefsel. Met behulp van filterpapier zal dit een kaak lichtjes aandrijven en deze op de montageschijf fixeren. Direct na het drogen met het filterpapier, plaats je de schijf op de ronde roestvrijstalen tafel van de snijder.

Stel vervolgens de meskracht op maximum, zet de machine aan en druk op start. De tafel beweegt automatisch van links naar rechts terwijl tegelijkertijd de snijarm met het mes wordt opgeheven en tot 200 slagen per minuut wordt neergelaten. Zodra het weefsel volledig is gesneden, zet je de machine uit.

Zorg ervoor dat de mesarmb in de verhoogde positie staat en verwijder vervolgens de schijf. Zorg ervoor dat je geen vingers onder de mesarmb plaatst of de machine onbeheerd achterlaat. Bij het snijden van weefsel, neem je de montageschijf en voeg je onmiddellijk medium toe aan de plakken op de schijf om overmatig uitdrogen te voorkomen.

Vervolgens los je het plakweefsel voorzichtig van de onderkant van de schijf met behulp van een wolfraamnaald of pipet en pipet ze in een kleine petrischaal met medium. Scheid vervolgens de afzonderlijke plakken met een naald en selecteer vervolgens de weefselsneden die het gebied van belang bevatten onder een stereomicroscoop. Plaats de geselecteerde plakken in kweekschalen met vers medium, bereid metalen roosters voor het kweeksysteem voor door stroken van vier centimeter bij 1,5 centimeter uit vellen van roestvrij staal platweefsel te snijden.

Boor vervolgens een gat in het midden met een standaard stationaire pons en buig de zijden zodat het rooster vlak over de centrale put past en evenwijdig ligt aan de bodem van de schaal. Zodra de roosters correct zijn gevormd, steriliseer ze in een autoclaaf voor gebruik. Bereid vervolgens de centrale putorganen voor de kweek voor door twee milliliter autoclaafwater toe te voegen aan de buitenste put om uitdroging te voorkomen.

Plaats vervolgens een steriele metalen raster over het midden van de schaal. Snijd een stuk transparant polyethyleentereftalaatmembraan met een poriegrootte van 0,4 micrometer zodat het groot genoeg is om het gat in het raster te bedekken. Plaats vervolgens het gesneden membraan in de schaal met een geselecteerde kaaksnede als lijntracering gewenst is.

Bereid eerst een glazen capillaire naald voor door het glas met een naaldtrekker te trekken. Breek vervolgens de punt van de naald af en plaats deze punt naar beneden in een lipofiele kleurstofoplossing zoals dai eye of dai o, en trek wat van de kleurstofoplossing op door capillaire werking. Na een paar minuten plaats je de gevulde naald in een houder en bevestig je deze aan een mond Aspirator.

Plaats de punt van de naald in het kweekmedium zodat het het te labelen gebied raakt, zoals hier de tandfollikel. Verplaats vervolgens een kleine hoeveelheid kleurstof op het weefsel. Breng vervolgens de snede over naar een fluorescente microscoopstandaard en controleer of de snede succesvol is gelabeld.

Eenmaal succesvol gelabeld, til je de snede voorzichtig op bovenop het membraan en breng je het membraan vervolgens uit het medium met de snede afgeplat in het midden. Plaats vervolgens de filter over het ronde gat in het midden van het raster op ongeveer een milliliter kweekmedium naar de put totdat het niveau