Niet-menselijke primaat longdecellurisatie en recellerisatie met behulp van een gespecialiseerde bioreactor voor grote organen
December 15th, 2013
Decellularisatie van hele organen produceert natuurlijke biologische scaffolds die kunnen worden gebruikt voor regeneratieve geneeskunde. Er wordt een beschrijving gepresenteerd van een niet-menselijke primaatmodel van longregeneratie waarbij hele longen worden gedecellulariseerd en vervolgens worden gezaaid met volwassen stamcellen en endotheelcellen in een bioreactor die vasculaire circulatie en vloeibare media-ventilatie vergemakkelijkt.
Het algemene doel van deze procedure is om biologische matrices van het hele orgaan te isoleren uit de longen van Reus Maccas en deze matrices te gebruiken als scaffolds voor het onderzoek naar longweefsel engineering toepassingen. Dit wordt bereikt door eerst de hele Reus Maca longen te decellulariseren met detergenten, zouten en enzymen. De tweede stap is om de gedecellulariseerde long scaffolds in een bioreactor te installeren die in staat is om zowel de luchtweg te beluchten als de pulmonale vaatbundel te perfunderen met vloeibaar celkweekmedium.
Vervolgens worden de long scaffolds gevuld met stamcellen via de luchtweg en endotheelcellen via de pulmonale vaatbundel. De laatste stap is om de cellen binnen de long scaffold te kweken onder de ventilatie- en perfusiecondities die worden geboden door de bioreactor gedurende de gewenste tijdsduur, gevolgd door analyse van de resulterende cellulaire en weefselmorfologie. Uiteindelijk resulteert de reïnvasie van acellulaire Maca long scaffolds met stamcellen en endotheelcellen in geënginnerd weefsel dat de anatomische en histologische kenmerken van natuurlijk longweefsel nabootst.
Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van sleutelvragen in de longweefsel Engineering velden, zoals of stam- of voorlopercellen kunnen worden gebruikt om pulmonair weefsel te regenereren, hetzij alleen of in samenwerking met volwassen pulmonaire epitheliale en endotheelcellen. De implicaties van deze techniek strekken zich uit tot therapie voor longziekten in het eindstadium omdat reïnvasie van acellulaire longmatrices met door patiënten afgeleide stam- of voorlopercellen het potentieel heeft om het aantal donorlongen beschikbaar voor longtransplantatie te verhogen. Bovendien kunnen de resulterende longen die zijn geënginnerd met de eigen stamcellen van de patiënt mogelijk resistent zijn tegen immuunafstoting.
We kregen voor het eerst het idee voor deze methode toen we een eerder gepubliceerde Joe video bekeken van leden van het laboratorium van Dr. Laura Nicholson aan de Yale University. Hier presenteren we aanpassingen van hun procedure voor knaagdieren om te passen bij de behoeften van ons grote dieren Resus Meac model. Er moet uiterst voorzichtig worden gehandeld om besmettelijke blootstellingsincidenten te voorkomen bij het werken met maca weefsels.
Voor het hanteren van weefsels van niet-menselijke primaten, draag persoonlijk beschermingsmateriaal, inclusief een chirurgisch masker, gezichtsschild, één laag chirurgische handschoenen, wegwerpjas en een tweede laag chirurgische handschoenen met de longen plat in een dissectief bakje, canuleer de longslagader met een vrouwelijke lure connector met een geschikte scherpe rand. Bevestig de canule met een met alcohol gesteriliseerde kabelbinder. Plaats een plastic kabelbinder rond de luchtpijp.
Plaats een vrouwelijke lure connector in de trachea opening en draai de kabelbinder rond de scherpe rand van de connector om de luchtpijp rond de rand te houden. Verwijder de gevangen lucht uit de longen door fosfaatgebufferd zoutoplossing of PBS te instilleren dat 30 eenheden per milliliter heparine en vijf microgram per milliliter natrium nitropress side bevat. Afgekort SNP. Laat de oplossing door natuurlijke terugtrekking worden uitgedreven voordat herhaald wordt.
Installeer nogmaals twee keer na de derde luchtweginstallatie met de PBS Heparine SNP oplossing. Sluit de trachea lure canule af met een lure plug. Snijd de top van het hart af en irrigeer de interne ventrikels met PBS Heparine SNP om resterend bloed te verwijderen. Lacereer beide atria om de drainage van de pulmonale circuit te vergemakkelijken bij perfusie.
Bevestig een 60 cc spuit gevuld met de PBS Heparine SNP oplossing aan de longslagader canule en verwijder voorzichtig de zuiger om de vloeistof in het vaatstelsel te laten stromen. Verwijder de plug uit de trachea canule en laat de vloeistof in de luchtweg door natuurlijke terugtrekking worden uitgedreven. Continueer de perfusie totdat zoveel mogelijk bloed is verwijderd uit het pulmonale vaatstelsel.
Het moeilijkste aspect van de procedure is het effectief spoelen en wassen van de long luchtweg met vloeistoffen. Vloeistofstroming is geïnhibeerd in vergelijking met gassen omdat luchtwegen niet zijn bedoeld om vloeistoffen te geleiden. Tijd en geduld zijn noodzakelijk om deze stappen uit te voeren. We adviseren door te gaan met het protocol, ondanks resterende vloeistof die aanwezig blijft in de luchtweg terwijl de decellularisatie vordert en cellulair puin wordt weggespoeld. De vloeistofviscositeit zal laag blijven en de longen zullen in staat zijn om vloeistoffen efficiënt uit te drijven Op dag één. Dompel het hart longblok onder in gedeïoniseerd water, blaas op en perfundeer de long met gedeïoniseerd water met behulp van 60 cc spuiten die zijn bevestigd aan de ondergedompelde trachea en arteriële canule respectievelijk. Herhaal effectief de luchtweg en vasculaire wasbeurten met gedeïoniseerd water.
Vier keer meer voor een totaal van vijf spoelingen van ongeveer 0,5 tot één liter elk na vijf wasbeurten, verwijder de longen uit het water en dompel het blok onder in Triton oplossing. Blaas op en perfundeer de longen met Triton oplossing. Herhaal zoals eerder de installatie een tweede keer en incubeer de ondergedompelde organen in Triton oplossing overnacht bij vier graden Celsius.
Na een overnachtelijke incubatie, verwijder het longblok uit de Triton oplossing en was extern met gedeïoniseerd water. Dompel vervolgens het blok onder in verse gedeïoniseerd water. Breng de gedeïoniseerd water vijf keer in de luchtpijp en longslagader aan om de Triton oplossing en cellulair puin weg te spoelen.
Verwijder de longen uit gedeïoniseerd water en dompel onder in 2% Sodium deoxy coate of SDC oplossing. Blaas op en perfundeer met SDC oplossing op dezelfde manier. Dompel de longen onder in SDC oplossing overnacht bij vier graden Celsius op dag drie.
Was het weefsel opnieuw extern en via de luchtweg en vaatbundel vijf keer met gedeïoniseerd water. Verwijder zoals eerder het weefsel uit gedeïoniseerd water en dompel onder in de één molar natrium chloride oplossing. Blaas op en perfundeer met natrium chloride oplossing zoals eerder en dompel het weefsel in natrium chloride oplossing voor een uur bij kamertemperatuur na het wassen van de longen schoon van natrium chloride oploss
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Deze studie presenteert een methode voor de decellularisatie van hele Reus Macca-longen om biologische skeletten te creëren voor longweefsel engineering. De decellulariseerde longen worden gezaaid met volwassen stamcellen en endotheelcellen in een bioreactor die vasculaire circulatie en ventilatie ondersteunt.
Belangrijkste studieonderdelen
Wetenschapsgebied
- Regeneratieve geneeskunde
- Weefsel engineering
- Celcultuur
Achtergrond
- De decellularisatie van hele organen creëert skeletten die de natuurlijke architectuur van organen behouden.
- Deze skeletten kunnen worden gebruikt voor regeneratieve toepassingen in longweefsel engineering.
- Het gebruik van een bioreactor maakt gecontroleerde omstandigheden voor celcultuur mogelijk.
- Volwassen stamcellen en endotheelcellen zijn cruciaal voor het nabootsen van natuurlijk longweefsel.
Doel van de studie
- Om biologische matrices van Reus Macca-longen te isoleren.
- Om het potentieel van deze matrices als skeletten voor longweefsel engineering te onderzoeken.
- Om de cellulaire en weefselmorfologie van geëngINEERED longweefsels te analyseren.
Gebruikte methoden
- Decellularisatie van hele Reus Macca-longen met behulp van detergentia, zouten en enzymen.
- Installatie van decellulariseerde longskeletten in een bioreactor voor ventilatie en perfusie.
- Gezaaid worden van skeletten met stamcellen via de luchtwegen en endotheelcellen via het longvatensysteem.
- Het kweken van cellen onder bioreactoromstandigheden voor analyse van morfologie.
Belangrijkste resultaten
- GeëngINEERED weefsels bootsen de anatomische en histologische kenmerken van natuurlijke longweefsels na.
- Succesvolle integratie van stamcellen en endotheelcellen in de skeletten.
- Demonstratie van de effectiviteit van de bioreactor bij het ondersteunen van longweefsel engineering.
- Analyse toont veelbelovende resultaten voor toekomstige regeneratieve toepassingen.
Conclusies
- De decellularisatie van hele organen is een haalbare methode voor het creëren van longskeletten.
- Gezaaid worden met stam- en endotheelcellen kan leiden tot functionele weefsel engineering.
- Deze aanpak kan regeneratieve geneeskunde voor longziekten bevorderen.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
This method addresses the critical shortage of donor lungs for transplantation by enabling the generation of bioartificial lung scaffolds from nonhuman primate tissues. It provides a translational model that bridges rodent proof-of-concept studies and potential clinical applications in regenerative medicine. The approach supports mechanistic de-risking of stem cell-based lung tissue engineering strategies prior to human trials.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of stem cell differentiation potential within a physiologically relevant lung extracellular matrix scaffold.
- Operational Value: Provides a reproducible decellularization protocol that preserves native lung architecture for consistent target validation assays.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates decellularized lung scaffolds that support quantitative assessment of cell seeding efficiency and tissue maturation under biomechanical cues.
- Operational Value: Standardizes scaffold preparation for high-throughput evaluation of stem cell and endothelial cell integration in a controlled bioreactor environment.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Utilizes nonhuman primate lungs to enhance predictive confidence in the translatability of bioartificial lung tissue to human applications.
- Operational Value: Establishes a preclinical workflow for evaluating vascular perfusion and airway ventilation conditions that direct lineage-specific cell differentiation.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum by providing acellular scaffolds for stem cell screening, followed by bioreactor-based culture to assess functional tissue formation under perfusion and ventilation conditions.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of stem cell engraftment and differentiation within a native lung matrix devoid of cellular contaminants.
- Screening: Enables standardized assessment of cell attachment, proliferation, and spatial distribution in decellularized lung scaffolds under perfusion and stretch conditions.
- Analytics: Facilitates morphological and molecular readouts such as histology, western blot, and qPCR to evaluate tissue maturation and lineage commitment.
- Translational Research: Connects discovery-stage scaffold generation to preclinical validation using a clinically relevant nonhuman primate model.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable decellularization and bioreactor platform for iterative testing of multiple cell types and culture conditions in lung tissue engineering programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in stem cell-based lung regeneration by demonstrating cell-matrix interactions in a physiologically relevant scaffold.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized decellularization and bioreactor culture conditions that maintain scaffold integrity and support uniform cell seeding.
- Strategic Value: Reduces late-stage biological risk by enabling preclinical evaluation of tissue-engineered lung constructs in a model with high anatomical and physiological similarity to humans.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted advancement decisions by providing data on scaffold recellularization efficiency and tissue morphology prior to IND-enabling studies.
Implementation Considerations
- Requires expertise in organ handling, decellularization chemistry, and sterile tissue culture techniques when working with nonhuman primate tissues.
- Dependent on access to a specialized large-organ bioreactor capable of simultaneous negative pressure ventilation and pulsatile vascular perfusion.
- Necessitates cross-team standardization between explantation, decellularization, and cell culture units to ensure scaffold quality and consistency.
- Involves adaptation considerations for different cell sources (e.g., mesenchymal stem cells, endothelial cells) and seeding strategies via airway versus vascular routes.
- Includes practical limitations such as the need for extended culture times (3–7 days) and the challenge of complete liquid clearance from airways during decellularization washes.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
2:28
Whole-organ Macaque Lung Preparation
4:58
Whole-organ Macaque Lung Decellularization
8:48
Large-organ Bioreactor
12:03
Results: Confirmation of Decellularization in Lung Scaffolds and Recellularization with Bone Marrow-derived Mesenchymal Stem Cells (BMSC) and Endothelial Cells
15:41
Conclusion
