Een experimenteel model om te studeren Tuberculose-Malaria Coinfection op Natuurlijke Transmissie van Mycobacterium tuberculosis En Plasmodium berghei
17 februari 2014
Tuberculose en malaria zijn twee van de meest voorkomende infecties bij mensen en de belangrijkste oorzaken van morbiditeit en mortaliteit in arme bevolking in de tropen. Wij vestigden een experimenteel model systeem om resultaten van malaria-tuberculose co-infectie te bestuderen in muizen na challenge met beide ziekteverwekkers via hun natuurlijke route van infectie.
Het algemene doel van deze procedure is om een experimenteel muismodel op te zetten dat kan worden gebruikt om de gevolgen van de gelijktijdige infectie met tuberculose en malaria in vivo te onderzoeken. Dit wordt eerst bereikt door de experimentele dieren bloot te stellen aan em. Tuberculose bevattende besmettelijke aerosoldruppels met behulp van een inhalatie-expositiesysteem.
In de tweede stap wordt de opname van het gewenste aantal M. tuberculosis geverifieerd door CFU-analyse van het longweefsel. Een dag na aerosolinfectie, 40 dagen later, worden de muizen blootgesteld aan besmettelijke muggen voor natuurlijke transmissie van plasmodium-sporozoieten, die tijdens de bloedmaaltijd onder de gehele huid worden afgezet. In de laatste stap wordt de ontwikkeling van de malaria bloedstadium parasiet gemonitord door analyse van giemsa-vlekken, bloedsmeertjes.
Uiteindelijk kan de belasting van em-tuberculose in de long en het aantal parasieten in het bloed van geco-ïnfecteerde dieren worden geteld om het verloop van respectievelijk tuberculose en malaria te bepalen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van sleutelvragen op het gebied van tuberculose, malaria-co-infectie, zoals Hoe beïnvloedt co-infectie met het malariaparasiet de pathogenese en controle van mycobacterium tuberculosis-infectie? Dit protocol is ontwikkeld om te onderzoeken hoe co-infectie met odium buri de chronische fase van microbium tuberculosis beïnvloedt, een immunocompetent C 57 PL zes muizen.
Het kan ook worden toegepast op andere muisstammen, inclusief knockout-muizen, of worden gebruikt met andere mycobacterium- of odium-soorten. Begin door mycobacterium tuberculosis op te warmen. Voorraden met een bekend CFU-titer.
Wanneer de cellen zijn ontdooid, gebruik een ene milliliter spuit voorzien van een 27 gauge naald om de suspensie vijf keer voorzichtig te mengen om de bacterieklompjes te verspreiden, waarbij de productie van aerosolen wordt vermeden, afhankelijk van de gewenste infectiedosis, breng het vereiste volume van de mycobacterium-voorraad over in een 50 milliliter buis bevattende steriele PBS tot een eindvolume van zes milliliters. Plaats vervolgens de experimentele dieren afzonderlijk in gecompartimenteerd gaasmanden. Plaats de manden in de cirkelvormige aerosolkamer en sluit het deksel van de kamer.
Bevestig de Venturi-nebulisatorunit op de drie roestvrijstalen aansluitingen. Aspirieer de mycobacterium-suspensie in een 10 milliliter spuit, voorzien van een 18 gauge stompe naald en breng de spuit naar de aerosolkamer in een gesloten transportdoos. Verwijder nu de nebulizer-schroefdop en injecteer voorzichtig de mycobacteriënsuspensie in de unit.
Zorg ervoor dat de aerosolvorming wordt vermeden. Gooi de spuit in een puntcontainer met 2%Burton en verzegel vervolgens de nebulizer. Laat de inhalatieapparatuur draaien wanneer de cyclus voltooid is.
Bevestig dat de mycobacteriënsuspensie volledig is verneveld voordat u de aerosolkamer opent. Trek een gemotoriseerde luchtzuiverende helm aan, zet de dieren vervolgens terug in hun kooien, steriliseer de nebulizer-manden en de binnenkant van de aerosolkamer een dag na aerosolinfectie, plaats aangewezen geëuthanaseerd controledieren op absorberend papier op een dissectiebord in een klasse twee bioveiligheidskast en desinfecteer de muizen met 70%ethanol voor elke muis. Maak eerst een kleine incisie in het midden van de buik en trek vervolgens de huid over het hoofd van het dier terug.
Gebruik vervolgens chirurgische schaar om de buik en de borstkas te openen. Verwijder de borstwand zodat de longen toegankelijk zijn en verwijder ze vervolgens. Breng de longen over in een 15 milliliter buis met twee milliliters homogenisatiebuffer en gebruik vervolgens de zuiger van een vijf milliliter spuit om het weefsel door 100 micrometer zeefjes in een kleine petrischaal te drukken.
Gebruik een ene milliliter pipet uitgerust met een barrièretip om de zeef meerdere keren te spoelen en verdeel vervolgens ongeveer 250 microliters van de longhomogenaat over acht agar platen. Gebruik wegwerpverspreiders om de monsters voorzichtig te plateren wanneer de platen droog zijn. Verzegel elke plaat met perfil.
Wickel ze in aluminiumfolie en incubeer ze rechtop bij 37 graden Celsius gedurende minimaal vier weken. Om naïeve of mycobacterium-geïnfecteerde muizen met malaria te infecteren door muggenbeten, plaats verdoofde dieren op het gaas van de muggenkooien, waarbij de besmette muggen door het membraan kunnen voeden om een succesvolle sporozoietenoverdracht te garanderen. Laat muizen 10 tot 15 minuten op de kooien.
Breng muizen terug in hun kooien op een papieren handdoek en dek ze af met een papieren handdoek om ze warm te houden tot ze wakker worden van de verdoving. Dood de muggen door ze met 70%ethanol of andere desinfectiemiddelen door het gaas van de kooi te sproeien en steriliseer de kooien door ze te autoclaveren. Om de para te monitoren, gebruik een naald om de uiteinden van de ader van elk geïnfecteerd dier te prikken en verzamel één druppel bloed.
Gebruik aan elk uiteinde van een glasplaatje een ander plaatje om een druppel bloed over de helft van de lengte van de onderplaat te trekken. Draai vervolgens het uitspreidplaatje om en gebruik de andere rand voor de tweede uitstrijk. Plaats de plaatjes in een kleurraak.
Fixeer de bloeduitstrijkjes kort in absoluut methanol en droog vervolgens in de lucht. Dompel de uitstrijkjes vervolgens in Giza. Na 10 minuten dompelt u de plaatjes in en uit in kleuringsvees gevuld met gedeïoniseerd water een paar keer om de overtollige verf weg te spoelen.
Laat de plaatjes vervolgens in een verticale positie in de lucht drogen. Sporozoiet-geïnduceerde infectie van experimentele dieren door muggenbeten resulteert in een infectiepercentage van 100%, zoals bevestigd door de aanwezigheid van bloedstadiumparasieten vier tot vijf dagen later. Zoals geïllustreerd in de tabel, resulteert de infectie van zowel naïeve als m. tuberculosis-geïnfecteerde muizen met plasmodium buri door muggenbeten in de consistente en reproduceerbare infectie van alle dieren binnen een experimentele groep.
Door de pre-patentie en de naïeve controlemuis te ver
Overzicht
Deze studie stelt een experimenteel muismodel vast om de effecten van gelijktijdige tuberculose- en malaria-infecties te onderzoeken. Het model maakt het mogelijk om de interacties tussen deze twee significante pathogenen in vivo te bestuderen.
Belangrijkste componenten van de studie
Wetenschapsgebied
- Infectieziekten
- Immunologie
- Experimentele modellen
Achtergrond
- Tuberculose en malaria zijn veelvoorkomende infecties die leiden tot een hoge morbiditeit en mortaliteit.
- Het begrijpen van de dynamiek van co-infecties is cruciaal voor de ontwikkeling van effectieve behandelingen.
- Deze studie richt zich op de interacties tussen Mycobacterium tuberculosis en Plasmodium-soorten.
- Het model kan worden aangepast voor verschillende muisstammen en andere pathogenen.
Doel van de studie
- Om de impact van malaria op de pathogenese van tuberculose te onderzoeken.
- Om de last van beide infecties in een gecontroleerde omgeving te beoordelen.
- Om inzicht te verschaffen in de immuunrespons tijdens co-infectie.
Gebruikte methoden
- Inhalatie-blootstellingssysteem voor tuberculose-infectie.
- Verificatie van de infectie via CFU-analyse van longweefsel.
- Natuurlijke transmissie van malaria door muggenbeten.
- Monitoring van malariaparasieten in de bloedfase met behulp van Giemsa-kleuringen.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle vestiging van co-infectie in muizen met een infectiegraad van 100%.
- Vertraagde prepatentie waargenomen bij muizen die eerder met tuberculose waren geïnfecteerd.
- Kwantificering van de tuberculose- en malarialast bij co-geïnfecteerde dieren.
- Inzichten in de pathogenese van beide infecties tijdens co-infectie.
Conclusies
- Het model demonstreert effectief de interacties tussen tuberculose en malaria.
- De bevindingen kunnen toekomstig onderzoek naar behandelstrategieën voor gecoinfecteerde patiënten informeren.
- Deze benadering kan worden aangewend voor verdere studies naar andere pathogenen.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie
Coinfectiemodellen die natuurlijke transmissieroutes nabootsen, zijn cruciaal voor het begrijpen van complexe gastheer-pathogeeninteracties die relevant zijn voor wereldwijde gezondheidsportefeuilles. Dit experimentele systeem maakt een mechanistische risicoreductie mogelijk van immuunmodulatie en ziekteprogressie bij tuberculosis-malaria-coinfectie, wat bijdraagt aan het voorspellend vertrouwen voor translationeel onderzoek. De aanpak biedt inzicht voor vroege ontdekking en preklinische besluitvorming voor anti-infectieve strategieën in co-endemische regio's.
Strategische toepassingen in Biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Maakt onderzoek naar interacties tussen immuunpaden tijdens gelijktijdige infecties mogelijk.
- Ondersteunt biologische risicoreductie door het verduidelijken van pathogeen-specifieke en door co-infectie gedreven responsen.
- Faciliteert functionele validatie van targets voor interventies gericht op de gastheer of het pathogeen.
- Biedt een platform voor voorspellend vertrouwen in hypothesen over immuunmodulatie.
Screening & assayontwikkeling
- Bereidt gevalideerde in vivo-systemen voor voor downstream immunologische analyses en assays voor de pathogenenlast.
- Waarborgt reproduceerbaarheid en standaardisatie via natuurlijke infectieroutes en kwantitatieve read-outs.
- Maakt een betrouwbare evaluatie mogelijk van de effectiviteit van verbindingen of vaccins in coinfectie-instellingen.
- Ondersteunt schaalbaarheid en platformhergebruik over verschillende muizenstammen en pathogeensoorten heen.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Sluit aan bij ziekterellevante modellen voor de ontdekking van translationele biomarkers.
- Bewaart de continuïteit van mechanistische ontdekking tot preklinische validatie in contexten van co-endemische ziekten.
- Informeert de risico-gecorrigeerde ontwikkeling van anti-infectieuze kandidaten die gericht zijn op complexe gastheer-pathogeen-dynamiek.
- Biedt voorspellende risicoreductie voor portfolio-prioritering in pijplijnen voor infectieziekten.
Integratie van Pipeline & Workflow
Dit model slaat een brug tussen vroege ontdekking, targetvalidatie en preklinisch onderzoek voor portefeuilles van infectieziekten, met name in regio's met een hoge prevalentie van co-infecties.
- Ontdekkingsbiologie: Ondersteunt hypothesetoetsing op immuunmodulatie en de interactie met pathogenen in vivo.
- Screening: Levert gestandaardiseerde, reproduceerbare infectiegegevens en kwantitatieve resultaten van de pathogenenlast.
- Analytiek: Maakt CFU-telling, kwantificering van parasitemie en profilering van de immuunrespons mogelijk voor comparatieve analyse.
- Translationeel onderzoek: Verbindt mechanistische bevindingen met ziekte-relevante preklinische modellen voor de afstemming van biomarkers.
- Bedrijfsbrede herbruikbaarheid: Aanpasbaar voor verschillende muizenstammen en pathogeensoorten voor brede R&D-toepasbaarheid.
Operationele en bedrijfsmatige impact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen en vermindert mechanistische ambiguïteit in de biologie van co-infecties.
- Operationele waarde: Standaardiseert in vivo workflows en ondersteunt reproduceerbaarheid over verschillende studies heen.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen en de kapitaalefficiëntie voor de ontwikkeling van anti-infectieve middelen.
- Portfolio-impact: Maakt risicogecorrigeerde prioritering van kandidaten mogelijk voor co-endemische ziektecontexten.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in infectieziektenmodellering en operaties op biosafety-niveau 3.
- Vereist gespecialiseerde instrumentatie voor aerosolinfectie en overdracht via muggen.
- Maakt standaardisatie tussen teams noodzakelijk voor infectieverificatie en kwantitatieve assays.
- Aanpasbaar aan diverse muisstammen en pathogeencombinaties door middel van protocolaanpassingen.
- Beperkt door bioveiligheids- en ethische overwegingen die inherent zijn aan werk met pathogenen met een hoog risico.
Veelgestelde vragen over Biofarmacie
Chapters in this video
0:05
Title
1:53
Aerosol Infection of Mice with Mycobacterium tuberculosis using a Glas-Col Aerosol Chamber
3:44
Verify Uptake of Desired CFU in Lungs
5:05
Malaria Infection of Mice by Mosquito Bite
5:50
Monitoring Parasitemia
6:47
Results: Tuberculosis-Malaria Co-Infection upon Natural Transmission of Mycobacterium tuberculosis and Plasmodium berghei
8:06
Conclusion
