Gisttransformatie en klonen
Gist of Saccharomyces cerevisiae, is een wijdverbreid eenvoudig eukaryotisch modelorganisme dat wordt gebruikt in de studie van genetica en celbiologie en dat inzicht kan geven in menselijke cellulaire processen. Deze video bespreekt transformatie - de opname van vreemd DNA door de gisto-cel. Het zal gisto-plasmiden introduceren, hoe gisto-cellen voorbereid kunnen worden voor transformatie, een stapsgewijze transformatieprocedure en enkele toepassingen van deze fundamentele techniek bieden.
Voordat we het hebben over de transformatie van gisten, laten we eerst een type DNA bespreken dat wordt gebruikt bij transformatie: het plasmide. Een plasmide is een klein, circulair, dubbelstrengs DNA dat kan supercoilen zodat het gemakkelijk door poriën in een celmembraan kan passeren.
Plasmiden bevatten een meervoudige kloneringsite of MCS waar restrictie-endonucleasen, ook wel 'restrictie-enzymen' genoemd, DNA kunnen knippen. DNA-fragmenten van belang die met dezelfde enzymen zijn gesneden, kunnen vervolgens worden geligateerd in de MCS. Plasmiden bevatten ook een replicatie-oorsprong of ORI die de cel signaleert waar de replicatie moet beginnen. Bovendien hebben plasmiden een selecteerbaar marker, die de gisto-cellen die het plasmide bevatten, toelaat om te groeien onder specifieke omgevingsomstandigheden. Gisten die het plasmide niet met succes opnemen, zullen niet overleven in media die de selecteerbare marker bevatten. De selecteerbare markers kunnen coderen voor genen die geneesmiddelresistentie mogelijk maken of genen die coderen voor enzymen die een gisto-stam in staat stellen aminozuren te synthetiseren die ze anders niet kunnen produceren.
Shuttle-vectoren zijn plasmiden die in meer dan één gastherensoort kunnen repliceren. Bijvoorbeeld, een plasmide van E. Coli kan groeien in gisten. Gisto-plasmiden kunnen niet-integrerend of integrerend zijn, wat betekent dat het plasmide zich ofwel combineert met het genomische DNA of onafhankelijk blijft.
Er zijn vijf verschillende algemene typen plasmiden of vectoren die in gisten worden gebruikt. De twee die het meest worden gebruikt bij de transformatie van gisten zijn de gisto-episomale plasmide of YEp en het gisto-centrometische plasmide of YCp. Beide typen vectoren bevatten een autonome replicatiesequentie of ARS. De ARS bevat de replicatie-oorsprong en maakt extrachromosomale replicatie in gisten mogelijk.
Er zijn verschillende procedures die kunnen worden gebruikt om gisten te transformeren, waaronder de sfeeroplastmethode, elektroporatie en lithiumacetaat-gemedieerde transformatie. Voor deze video zullen we ons concentreren op de lithiumacetaatprocedure.
Bij deze transformatiemethode neutraliseren positief geladen lithiumkationen ladingen op het celmembraan en het plasmide-DNA Enkelstrengs DNA - toegevoegd aan het transformatiemengsel - bindt aan de celwand van de gisto en laat het plasmide-DNA beschikbaar voor opname door de gisto-cellen. De blootstelling aan een plotselinge temperatuurstijging, of hitteschok, creëert een drukverschil tussen de binnenkant en de buitenkant van de cel en creëert poriën waar plasmide-DNA doorheen kan passeren. Wanneer de temperatuur daalt, zal de gisto-celwand zich herstellen en is de transformatie voltooid.
Laten we beginnen met een stapsgewijze procedure van hoe gisten voor transformatie kunnen worden voorbereid. Gisto-cellen moeten worden voorbereid door eerst een kolonie van een agarplaat te plukken en de kolonie te versterken in gisto-extract pepton dextrose-medium, afgekort YPD - een compleet medium voor gisto-groei.
Nadat de kolonie van een plaat is geplukt en in YPD-medium is geplaatst, wordt de cultuur gedurende een nacht bij 30 °C geïncubeerd met schudden op een shaker of rollerapparaat, zoals u hier ziet. De gisto-cellen worden door centrifugatie gepelleteerd en het supernatant wordt verwijderd. De gepelleteerdde cellen worden opgeschort in de gewenste buffer of steriel water. Deze competente bereide gisto-cellen zullen worden gebruikt in de transformatieprocedure.
Eenmaal gisto-cellen zijn voorbereid, kan transformatie worden uitgevoerd door eerst het transformatiemengsel voor te bereiden.
Deze reagentiënmix moet omvatten: sterieel gedistilleerd water; een oplossing van 50% polyethyleenglycol of PEG, 1M lithiumacetaat, 10 mg/ml oplossing van enkelstrengs DNA, plasmide-DNA en competente gisto-cellen. De exacte verhoudingen van elke oplossing moeten worden berekend voordat het experiment wordt gestart door het standaardprotocol van uw laboratorium voor gisto-transformatie te raadplegen.
Het mengsel wordt vervolgens 30 minuten bij 30 °C geïncubeerd met schudden. De oplossing moet worden gemengd, niet gevormd, om ervoor te zorgen dat de gisto-cellen niet uit elkaar vallen.
De cellen worden hitte geschokt door plaatsing in een waterbad van 42 °C gedurende 15 minuten gevolgd door afkoeling op ijs gedurende 2 minuten. De cellen worden vervolgens door centrifugatie geoogst.
Cellen worden opgeschort in dubbel-gedestilleerd water en worden op agarplaten geplaatst die selecteren voor de gewenste transformanten. Transformatieplaten worden vervolgens bij 30 °C gedurende twee tot vier dagen geïncubeerd tot kolonies zich vormen.
Transformatieprocedures moeten altijd positieve en negatieve controleplaten bevatten totdat ze zijn geoptimaliseerd. De positieve controle moet een gisto-celsuspensie zijn met plasmide-DNA op een YPD-plaat die geen selecteerbare marker bevat. Dit toont aan dat de cellen gezond zijn na de transformatieprocedure. De negatieve controleplaat moet een gisto-celsuspensie zijn op een geschikte selectieplaat, zoals een die antibiotica bevat. De plaat mag geen kolonies hebben en toont aan dat er geen besmetting is.
Er zijn een veelvoud aan verschillende toepassingen voor gisto-transformatie. Een toepassing van getransformeerde gisten is het gebruik van een gisto-twee hybride systeem om eiwitten te identificeren die interageren met uw eiwit van belang, of het aas-eiwit. Wanneer een plasmide uit een bibliotheek van kandidaat-bindende partners, of prooi-eiwitten, wordt getransformeerd en er een interactie is, wordt een transcriptiefactor vrijgemaakt die een reportergen activeert, zoals Beta-galactosidase
S. cerevisiae zijn eencellige eukaryoten die een veelgebruikt modelorganisme zijn in biologisch onderzoek. In het verloop van hun werk vertrouwen gist…
Gist of Saccharomyces cerevisiae, is een wijdverbreid eenvoudig eukaryotisch modelorganisme dat wordt gebruikt in de studie van genetica en celbiologie en dat inzicht kan geven in menselijke cellulaire processen. Deze video bespreekt transformatie - de opname van vreemd DNA door de gisto-cel. Het zal gisto-plasmiden introduceren, hoe gisto-cellen voorbereid kunnen worden voor transformatie, een stapsgewijze transformatieprocedure en enkele toepassingen van deze fundamentele techniek bieden.
Voordat we het hebben over de transformatie van gisten, laten we eerst een type DNA bespreken dat wordt gebruikt bij transformatie: het plasmide. Een plasmide is een klein, circulair, dubbelstrengs DNA dat kan supercoilen zodat het gemakkelijk door poriën in een celmembraan kan passeren.
Plasmiden bevatten een meervoudige kloneringsite of MCS waar restrictie-endonucleasen, ook wel 'restrictie-enzymen' genoemd, DNA kunnen knippen. DNA-fragmenten van belang die met dezelfde enzymen zijn gesneden, kunnen vervolgens worden geligateerd in de MCS. Plasmiden bevatten ook een replicatie-oorsprong of ORI die de cel signaleert waar de replicatie moet beginnen. Bovendien hebben plasmiden een selecteerbaar marker, die de gisto-cellen die het plasmide bevatten, toelaat om te groeien onder specifieke omgevingsomstandigheden. Gisten die het plasmide niet met succes opnemen, zullen niet overleven in media die de selecteerbare marker bevatten. De selecteerbare markers kunnen coderen voor genen die geneesmiddelresistentie mogelijk maken of genen die coderen voor enzymen die een gisto-stam in staat stellen aminozuren te synthetiseren die ze anders niet kunnen produceren.
Shuttle-vectoren zijn plasmiden die in meer dan één gastherensoort kunnen repliceren. Bijvoorbeeld, een plasmide van E. Coli kan groeien in gisten. Gisto-plasmiden kunnen niet-integrerend of integrerend zijn, wat betekent dat het plasmide zich ofwel combineert met het genomische DNA of onafhankelijk blijft.
Er zijn vijf verschillende algemene typen plasmiden of vectoren die in gisten worden gebruikt. De twee die het meest worden gebruikt bij de transformatie van gisten zijn de gisto-episomale plasmide of YEp en het gisto-centrometische plasmide of YCp. Beide typen vectoren bevatten een autonome replicatiesequentie of ARS. De ARS bevat de replicatie-oorsprong en maakt extrachromosomale replicatie in gisten mogelijk.
Er zijn verschillende procedures die kunnen worden gebruikt om gisten te transformeren, waaronder de sfeeroplastmethode, elektroporatie en lithiumacetaat-gemedieerde transformatie. Voor deze video zullen we ons concentreren op de lithiumacetaatprocedure.
Bij deze transformatiemethode neutraliseren positief geladen lithiumkationen ladingen op het celmembraan en het plasmide-DNA Enkelstrengs DNA - toegevoegd aan het transformatiemengsel - bindt aan de celwand van de gisto en laat het plasmide-DNA beschikbaar voor opname door de gisto-cellen. De blootstelling aan een plotselinge temperatuurstijging, of hitteschok, creëert een drukverschil tussen de binnenkant en de buitenkant van de cel en creëert poriën waar plasmide-DNA doorheen kan passeren. Wanneer de temperatuur daalt, zal de gisto-celwand zich herstellen en is de transformatie voltooid.
Laten we beginnen met een stapsgewijze procedure van hoe gisten voor transformatie kunnen worden voorbereid. Gisto-cellen moeten worden voorbereid door eerst een kolonie van een agarplaat te plukken en de kolonie te versterken in gisto-extract pepton dextrose-medium, afgekort YPD - een compleet medium voor gisto-groei.
Nadat de kolonie van een plaat is geplukt en in YPD-medium is geplaatst, wordt de cultuur gedurende een nacht bij 30 °C geïncubeerd met schudden op een shaker of rollerapparaat, zoals u hier ziet. De gisto-cellen worden door centrifugatie gepelleteerd en het supernatant wordt verwijderd. De gepelleteerdde cellen worden opgeschort in de gewenste buffer of steriel water. Deze competente bereide gisto-cellen zullen worden gebruikt in de transformatieprocedure.
Eenmaal gisto-cellen zijn voorbereid, kan transformatie worden uitgevoerd door eerst het transformatiemengsel voor te bereiden.
Deze reagentiënmix moet omvatten: sterieel gedistilleerd water; een oplossing van 50% polyethyleenglycol of PEG, 1M lithiumacetaat, 10 mg/ml oplossing van enkelstrengs DNA, plasmide-DNA en competente gisto-cellen. De exacte verhoudingen van elke oplossing moeten worden berekend voordat het experiment wordt gestart door het standaardprotocol van uw laboratorium voor gisto-transformatie te raadplegen.
Het mengsel wordt vervolgens 30 minuten bij 30 °C geïncubeerd met schudden. De oplossing moet worden gemengd, niet gevormd, om ervoor te zorgen dat de gisto-cellen niet uit elkaar vallen.
De cellen worden hitte geschokt door plaatsing in een waterbad van 42 °C gedurende 15 minuten gevolgd door afkoeling op ijs gedurende 2 minuten. De cellen worden vervolgens door centrifugatie geoogst.
Cellen worden opgeschort in dubbel-gedestilleerd water en worden op agarplaten geplaatst die selecteren voor de gewenste transformanten. Transformatieplaten worden vervolgens bij 30 °C gedurende twee tot vier dagen geïncubeerd tot kolonies zich vormen.
Transformatieprocedures moeten altijd positieve en negatieve controleplaten bevatten totdat ze zijn geoptimaliseerd. De positieve controle moet een gisto-celsuspensie zijn met plasmide-DNA op een YPD-plaat die geen selecteerbare marker bevat. Dit toont aan dat de cellen gezond zijn na de transformatieprocedure. De negatieve controleplaat moet een gisto-celsuspensie zijn op een geschikte selectieplaat, zoals een die antibiotica bevat. De plaat mag geen kolonies hebben en toont aan dat er geen besmetting is.
Er zijn een veelvoud aan verschillende toepassingen voor gisto-transformatie. Een toepassing van getransformeerde gisten is het gebruik van een gisto-twee hybride systeem om eiwitten te identificeren die interageren met uw eiwit van belang, of het aas-eiwit. Wanneer een plasmide uit een bibliotheek van kandidaat-bindende partners, of prooi-eiwitten, wordt getransformeerd en er een interactie is, wordt een transcriptiefactor vrijgemaakt die een reportergen activeert, zoals Beta-galactosidase
Gist of Saccharomyces cerevisiae, is een wijdverbreid eenvoudig eukaryotisch modelorganisme dat wordt gebruikt in de studie van genetica en celbiologie en dat inzicht kan geven in menselijke cellulaire processen. Deze video bespreekt transformatie - de opname van vreemd DNA door de gisto-cel. Het zal gisto-plasmiden introduceren, hoe gisto-cellen voorbereid kunnen worden voor transformatie, een stapsgewijze transformatieprocedure en enkele toepassingen van deze fundamentele techniek bieden.
Voordat we het hebben over de transformatie van gisten, laten we eerst een type DNA bespreken dat wordt gebruikt bij transformatie: het plasmide. Een plasmide is een klein, circulair, dubbelstrengs DNA dat kan supercoilen zodat het gemakkelijk door poriën in een celmembraan kan passeren.
Plasmiden bevatten een meervoudige kloneringsite of MCS waar restrictie-endonucleasen, ook wel 'restrictie-enzymen' genoemd, DNA kunnen knippen. DNA-fragmenten van belang die met dezelfde enzymen zijn gesneden, kunnen vervolgens worden geligateerd in de MCS. Plasmiden bevatten ook een replicatie-oorsprong of ORI die de cel signaleert waar de replicatie moet beginnen. Bovendien hebben plasmiden een selecteerbaar marker, die de gisto-cellen die het plasmide bevatten, toelaat om te groeien onder specifieke omgevingsomstandigheden. Gisten die het plasmide niet met succes opnemen, zullen niet overleven in media die de selecteerbare marker bevatten. De selecteerbare markers kunnen coderen voor genen die geneesmiddelresistentie mogelijk maken of genen die coderen voor enzymen die een gisto-stam in staat stellen aminozuren te synthetiseren die ze anders niet kunnen produceren.
Shuttle-vectoren zijn plasmiden die in meer dan één gastherensoort kunnen repliceren. Bijvoorbeeld, een plasmide van E. Coli kan groeien in gisten. Gisto-plasmiden kunnen niet-integrerend of integrerend zijn, wat betekent dat het plasmide zich ofwel combineert met het genomische DNA of onafhankelijk blijft.
Er zijn vijf verschillende algemene typen plasmiden of vectoren die in gisten worden gebruikt. De twee die het meest worden gebruikt bij de transformatie van gisten zijn de gisto-episomale plasmide of YEp en het gisto-centrometische plasmide of YCp. Beide typen vectoren bevatten een autonome replicatiesequentie of ARS. De ARS bevat de replicatie-oorsprong en maakt extrachromosomale replicatie in gisten mogelijk.
Er zijn verschillende procedures die kunnen worden gebruikt om gisten te transformeren, waaronder de sfeeroplastmethode, elektroporatie en lithiumacetaat-gemedieerde transformatie. Voor deze video zullen we ons concentreren op de lithiumacetaatprocedure.
Bij deze transformatiemethode neutraliseren positief geladen lithiumkationen ladingen op het celmembraan en het plasmide-DNA Enkelstrengs DNA - toegevoegd aan het transformatiemengsel - bindt aan de celwand van de gisto en laat het plasmide-DNA beschikbaar voor opname door de gisto-cellen. De blootstelling aan een plotselinge temperatuurstijging, of hitteschok, creëert een drukverschil tussen de binnenkant en de buitenkant van de cel en creëert poriën waar plasmide-DNA doorheen kan passeren. Wanneer de temperatuur daalt, zal de gisto-celwand zich herstellen en is de transformatie voltooid.
Laten we beginnen met een stapsgewijze procedure van hoe gisten voor transformatie kunnen worden voorbereid. Gisto-cellen moeten worden voorbereid door eerst een kolonie van een agarplaat te plukken en de kolonie te versterken in gisto-extract pepton dextrose-medium, afgekort YPD - een compleet medium voor gisto-groei.
Nadat de kolonie van een plaat is geplukt en in YPD-medium is geplaatst, wordt de cultuur gedurende een nacht bij 30 °C geïncubeerd met schudden op een shaker of rollerapparaat, zoals u hier ziet. De gisto-cellen worden door centrifugatie gepelleteerd en het supernatant wordt verwijderd. De gepelleteerdde cellen worden opgeschort in de gewenste buffer of steriel water. Deze competente bereide gisto-cellen zullen worden gebruikt in de transformatieprocedure.
Eenmaal gisto-cellen zijn voorbereid, kan transformatie worden uitgevoerd door eerst het transformatiemengsel voor te bereiden.
Deze reagentiënmix moet omvatten: sterieel gedistilleerd water; een oplossing van 50% polyethyleenglycol of PEG, 1M lithiumacetaat, 10 mg/ml oplossing van enkelstrengs DNA, plasmide-DNA en competente gisto-cellen. De exacte verhoudingen van elke oplossing moeten worden berekend voordat het experiment wordt gestart door het standaardprotocol van uw laboratorium voor gisto-transformatie te raadplegen.
Het mengsel wordt vervolgens 30 minuten bij 30 °C geïncubeerd met schudden. De oplossing moet worden gemengd, niet gevormd, om ervoor te zorgen dat de gisto-cellen niet uit elkaar vallen.
De cellen worden hitte geschokt door plaatsing in een waterbad van 42 °C gedurende 15 minuten gevolgd door afkoeling op ijs gedurende 2 minuten. De cellen worden vervolgens door centrifugatie geoogst.
Cellen worden opgeschort in dubbel-gedestilleerd water en worden op agarplaten geplaatst die selecteren voor de gewenste transformanten. Transformatieplaten worden vervolgens bij 30 °C gedurende twee tot vier dagen geïncubeerd tot kolonies zich vormen.
Transformatieprocedures moeten altijd positieve en negatieve controleplaten bevatten totdat ze zijn geoptimaliseerd. De positieve controle moet een gisto-celsuspensie zijn met plasmide-DNA op een YPD-plaat die geen selecteerbare marker bevat. Dit toont aan dat de cellen gezond zijn na de transformatieprocedure. De negatieve controleplaat moet een gisto-celsuspensie zijn op een geschikte selectieplaat, zoals een die antibiotica bevat. De plaat mag geen kolonies hebben en toont aan dat er geen besmetting is.
Er zijn een veelvoud aan verschillende toepassingen voor gisto-transformatie. Een toepassing van getransformeerde gisten is het gebruik van een gisto-twee hybride systeem om eiwitten te identificeren die interageren met uw eiwit van belang, of het aas-eiwit. Wanneer een plasmide uit een bibliotheek van kandidaat-bindende partners, of prooi-eiwitten, wordt getransformeerd en er een interactie is, wordt een transcriptiefactor vrijgemaakt die een reportergen activeert, zoals Beta-galactosidase
View the full transcript and gain access to JoVE Science Education videos
Q1: What is a plasmid and what are its key components?
A plasmid is a small, circular, double-stranded DNA molecule that can supercoil to pass through cell membrane pores. Key components include a multiple cloning site (MCS) where restriction enzymes cut DNA, an origin of replication (ORI) that signals where replication begins, and a selectable marker allowing transformed cells to survive under specific environmental conditions.
Q2: How do yeast cells prepare for transformation?
Yeast cells are prepared by picking a colony from an agar plate and amplifying it in YPD medium overnight at 30°C with agitation. Cells are then pelleted by centrifugation, the supernatant is removed, and pelleted cells are resuspended in buffer or sterile water to create competent cells ready for the transformation procedure. Growth and maintenance of saccharomyces cerevisiae requires careful culture conditions.
Q3: What happens during the lithium acetate transformation method?
Positively-charged lithium cations neutralize charges on the cell membrane and plasmid DNA. Single-stranded DNA binds to the cell wall, leaving plasmid DNA available for uptake. Heat shock at 42°C creates pores allowing DNA entry. When temperature decreases, the cell wall reforms, completing transformation.
Q4: What is the difference between YEp and YCp plasmid vectors?
YEp (yeast episomal plasmid) and YCp (yeast centromeric plasmid) are the most commonly used vectors in yeast transformation. Both contain an autonomous replication sequence (ARS) that enables extrachromosomal replication in yeast. YEp plasmids are non-integrating and replicate as independent elements, while YCp plasmids associate with yeast centromeres.
Q5: Why are positive and negative controls important in yeast transformation?
Positive controls use plasmid DNA on YPD plates without selectable markers to confirm cells remain healthy after transformation. Negative controls use selection plates with no plasmid to verify absence of contamination. These controls validate that the transformation procedure works correctly and results are reliable.
Q6: How does the yeast-two hybrid system identify protein interactions?
Transformed yeast containing prey protein plasmids from a library are screened for interactions with a bait protein. When interaction occurs, a transcription factor activates a reporter gene like beta-galactosidase. Colonies with interactions turn blue on plates containing X-gal substrate, allowing researchers to identify binding partners.
Q7: What are practical applications of yeast transformation in research?
Yeast transformation enables control of gene expression, induction of genetic deletions, expression of recombinant proteins, and labeling of subcellular structures. Researchers use fluorescently-labeled proteins to study mutation effects on protein-protein interactions. Flow cytometry selects cells expressing GFP, and fluorescent microscopy visualizes cellular processes essential for understanding human biology.
Hoofdstukken in deze video
0:00
Overview
0:41
Important Aspects of Yeast Transformation
2:42
Principles Behind Yeast Transformation
3:38
Lithium Acetate Transformation Procedure
6:31
Applications
8:04
Summary