Gisttransformatie en kloneren

Gist, of Saccharomyces cerevisiae, is een wijdverspreid simpel eukaryoot modelorganisme dat wordt gebruikt bij de studie van genetica en celbiologie en dat inzicht kan geven in menselijke cellulaire processen. Deze video bespreekt transformatie: de opname van vreemd DNA door de gistcel. Er wordt ingegaan op gistplasmiden, het voorbereiden van gistcellen voor transformatie, een stapsgewijze transformatieprocedure en enkele toepassingen van deze fundamentele techniek.

Voordat we de transformatie van gist bespreken, gaan we eerst in op een type DNA dat bij transformatie wordt gebruikt: het plasmide. Een plasmide is een klein, circulair, dubbelstrengs DNA dat kan supercoilen, waardoor het gemakkelijk door poriën in een celmembraan kan passeren.

Plasmiden bevatten een multiple cloning site of MCS waar restrictie-endonucleasen, ook wel "restrictie-enzymen" genoemd, het DNA kunnen knippen. DNA-fragmenten van belang die met dezelfde enzymen zijn geknipt, kunnen vervolgens in de MCS worden geligeerd. Plasmiden bevatten daarnaast een replicatieoorsprong of ORI die de cel signaleert waar de replicatie moet beginnen. Bovendien beschikken plasmiden over een selecteerbare marker, waardoor gistcellen die het plasmide bevatten kunnen groeien onder specifieke omgevingsomstandigheden. Gist die het plasmide niet succesvol heeft opgenomen, zal niet overleven in media die de selecteerbare marker bevatten. De selecteerbare markers kunnen coderen voor genen die drugresistentie mogelijk maken of genen die enzymen coderen waardoor een giststam aminozuren kan synthetiseren die ze anders niet kunnen produceren.

Shuttle-vectoren zijn plasmiden die kunnen repliceren in meer dan één gastsoort. Zo kan een plasmide uit E. Coli in gist groeien. Gistplasmiden kunnen niet-integrerend of integrerend zijn, wat betekent dat het plasmide zich ofwel combineert met het genomisch DNA of onafhankelijk blijft.

Er zijn vijf verschillende algemene typen plasmiden of vectoren die in gist worden gebruikt. De twee die het vaakst worden gebruikt bij de transformatie van gist zijn het gist-episomaal plasmide of YEp en het gist-centromerisch plasmide of YCp. Beide typen vectoren bevatten een autonome replicatiesequentie of ARS. De ARS bevat de replicatieoorsprong en maakt extrachromosomale replicatie in gist mogelijk.

Er zijn verschillende procedures die kunnen worden gebruikt om gist te transformeren, waaronder de sferoplastmethode, elektroporatie en lithiumacetaat-gemedieerde transformatie. In deze video richten we ons op de lithiumacetaatprocedure.

Bij deze transformatiemethode neutraliseren positief geladen lithiumcations de ladingen op het celmembraan en het plasmide-DNA. Enkelstrengs DNA - toegevoegd aan het transformatiemengsel - bindt aan de celwand van de gist, waardoor het plasmide-DNA beschikbaar blijft voor opname door de gistcellen. Blootstelling aan een plotselinge temperatuurverhoging, of hitteshock, creëert een drukverschil tussen de binnen- en buitenkant van de cel, waardoor poriën ontstaan waar het plasmide-DNA doorheen kan passeren. Wanneer de temperatuur wordt verlaagd, vormt de celwand van de gist zich opnieuw en is de transformatie voltooid.

Laten we beginnen met een stapsgewijze procedure over hoe gist wordt voorbereid voor transformatie. Gistcellen moeten worden voorbereid door eerst een kolonie van een agarplaat te plukken en de kolonie te amplifieren in gistextract-pepton-dextrose medium, afgekort YPD - een compleet medium voor gistgroei.

Nadat de kolonie van een plaat is geplukt en in YPD-medium is geplaatst, wordt de cultuur overnight geïncubeerd bij 30 °C met agitatie op een schudapparaat of roller, zoals hier te zien is. De gistcellen worden door centrifugatie gepellet en het supernatant wordt verwijderd. De gepellette cellen worden resuspendeerd met de gewenste buffer of steriel water. Deze voorbereide competente gistcellen zullen worden gebruikt in de transformatieprocedure.

Zodra de gistcellen zijn voorbereid, kan de transformatie worden uitgevoerd door eerst het transformatiemengsel voor te bereiden.

Dit reagensmengsel moet bevatten: steriel gedestilleerd water; een oplossing van 50% polyethyleenglycol of PEG, 1M lithiumacetaat, een 10 mg/ml oplossing van enkelstrengs DNA, plasmide-DNA en competente gistcellen. De exacte proporties van elke oplossing moeten vóór aanvang van het experiment worden berekend door het standaardprotocol voor gisttransformatie van uw laboratorium te raadplegen.

Het mengsel wordt vervolgens 30 minuten geïncubeerd bij 30 °C met schudden. De oplossing moet worden gemengd, niet gevortexd, om ervoor te zorgen dat de gistcellen niet uit elkaar vallen.

De cellen ondergaan een hitte-shock door plaatsing in een waterbad van 42 °C gedurende 15 minuten, gevolgd door koeling op ijs gedurende 2 minuten. De cellen worden vervolgens geoogst door centrifugatie.

Cellen worden resuspendeerd in dubbel gedestilleerd water en worden geplaatst op agarplaten die selecteren voor de gewenste transformanten. Transformatieplaten worden vervolgens twee tot vier dagen geïncubeerd bij 30 °C totdat er kolonies worden gevormd.

Transformatieprocedures moeten altijd positieve en negatieve controleplaten bevatten totdat ze zijn geoptimaliseerd. De positieve controle moet een gistcelsuspensie met plasmide-DNA zijn op een YPD-plaat die geen selecteerbare marker bevat. Dit toont aan dat de cellen gezond zijn na de transformatieprocedure. De negatieve controleplaat moet een gistcelsuspensie zijn op een geschikte selectieplaat, zoals een plaat die antibiotica bevat. De plaat mag geen kolonies bevatten, wat aantoont dat er geen contaminatie is.

Er zijn talloze verschillende toepassingen voor gisttransformatie. Eén toepassing van getransformeerde gist is het gebruik van een yeast-two-hybrid-systeem om eiwitten te identificeren die interageren met het eiwit van belang, of het lokaas-eiwit. Wanneer een plasmide uit een bibliotheek van kandidaat-bindingspartners, of prooi-eiwitten, wordt getransformeerd en er sprake is van een interactie, komt er een transcriptiefactor vrij die een reportergen activeert, zoals Beta-galactosidase. Het reportergen zorgt ervoor dat kolonies met een interactie blauw kleuren op platen die X-gal bevatten — een substraat voor beta-galactosidase.

Meerdere deleties kunnen in gist worden aangebracht via een techniek die gebruikmaakt van seksuele cycli. Haploïde cellen die een reporter en een gedeleteerde locus bevatten, worden samengevoegd tot één cel door middel van willekeurige segregatie of meiotische recombinatie. Selecteerbare markers worden gebruikt om gist te selecteren die de deleties succesvol heeft geïncorporeerd. In dit geval wordt flowcytometrie gebruikt om cellen te selecteren die GFP tot expressie brengen.

Gist kan worden getransformeerd met eiwitten die fluorescent gelabeld zijn om het effect van mutaties op eiwit-eiwitinteracties te bestuderen. In dit video-artikel werd fluorescentiemicroscopie gebruikt om de effecten van verschillende mutaties op eiwit-eiwitinteracties te bestuderen die essentieel zijn voor endocytose.

U heeft zojuist de JoVE-video over gisttransformatie bekeken. U begrijpt nu de basisaspecten van een plasmide, hoe u gistcellen voorbehandelt voor transformatie en hoe u de transformatieprocedure uitvoert. Zoals altijd, bedankt voor het kijken!