Productie en zuivering van niet-Replicatieve Canine adenovirus type 2 afgeleide vectoren

Het algemene doel van deze procedure is om honden adenovirus type twee afgeleide vectoren te construeren, produceren en zuiveren. Dit wordt bereikt door eerst het gen van belang in een shuttle plasmide te klonen. De tweede stap is om een recombinant genoom plasmide te verkrijgen door homologe recombinatie.

Vervolgens worden de recombinante defecte calf, twee virussen geproduceerd en geamplificeerd in een trans complementerende cellijn. De laatste stap is het zuiveren en concentreren van het resulterende recombinante virus voor diverse toepassingen in vivo en in vitro. Uiteindelijk wordt immunofluorescence confocale microscopie gebruikt om voorbeelden van virale transductie in de hersenen van knaagdieren te tonen.

Het belangrijkste voordeel van deze technieken boven bestaande methoden zoals vectoren afgeleid van humane ad neurose is dat er geen pre-existente immuniteit tegen calf twee bestaat in de menselijke populatie. Dus deze methode kan helpen om belangrijke vragen in de vaccinatie of gentherapie velden te beantwoorden, zoals het beoordelen van de rol van eiwitten die in specifieke hersengebieden worden geexpresseerd. Dus het demonstreren van deze procedure zal door May KY en Corin Bergeron zijn.

Twee postdoctorale onderzoekers uit onze laboratoria bereiden zich voor op deze procedure een dag voorafgaand aan de transfectie door DKE een cellen te zaaien op een zes-puts plaat. Groei cellen bij 37 graden Celsius en 5% CO2 in DMEM met hoge glucose bevattend 7% hitte, geïnactiveerd foetaal runderserum, natrium, pyruvaat, penicilline en streptomycine. Op de volgende dag moeten de cellen 70 tot 80% confluent zijn voor transfectie. Digest twee microgram van pcal GOI, het recombinante cav twee genoom plasmide met ASC een om de niet-virale sequentie van het plasmide vrij te maken, controleer het resulterende restrictiepatroon door 0,8% Agro gel elektroforese. Digestie zou een fragment van ongeveer 31 kilobasenpaar moeten opleveren dat het recombinante genoom bevat en een fragment van twee kilobasenpaar dat overeenkomt met de plasmide ruggengraat. Meng het gedigesteerde DNA met 200 microliters jet prime buffer en vortex gedurende 10 seconden.

Voeg vier microliters jet prime toe en meng door 10 seconden te vortexen. Draai kortjes om druppels te verwijderen en incubeer gedurende 10 minuten. Bij kamertemperatuur, voeg de transfectiemix druppelsgewijs toe aan de DKE een cellen.

Schud de plaat zachtjes om het mengsel gelijkmatig te verdelen en incubeer bij 37 graden Celsius. Een week na transfectie verzamel cellen en kweekmedium in een 15 milliliter polypropyleen buis. Verstoren cellen door drie vries-doodcycli.

Verwijder het lysaat door centrifugatie gedurende 10 minuten bij 1.800 keer G. Verzamel de supernatant en bewaar bij min 20 voor subsequente virus propagatie om het virus te propageren. Infecteer een 80 tot 90% confluente monolaag van DKE een cellen gekweekt in een put van een zes-puts plaat met 0,5 milliliter van het virus bevattende supernatant. Incubeer bij 37 graden Celsius gedurende een uur onder milde agitatie. Na een uur. Verwijder het inoculum en vervang het met 1,5 milliliter volledige DMEM bevattend 5% hitte geïnactiveerd FCS. Incubeer cellen bij 37 graden Celsius gedurende drie tot vier dagen.

Cellen moeten dagelijks worden gecontroleerd op het optreden van een cytpathische effect of CPE. Als er geen duidelijk CPE zichtbaar is. Oogst cellen na vier dagen van cultuur en herhaal de virale amplificatie wanneer een duidelijk CPE de meerderheid van de cellen aantast.

Gewoonlijk na twee tot vier virale amplificatierondes, verzamel cellen met kweekmedium en vries-dood drie keer zoals eerder gedemonstreerd. Infecteer 80 tot 90% confluent. DKE een cellen gekweekt in drie 10 centimeter diameter weefselkweek schalen met behulp van 1,5 milliliter van virus bevattend supernatant per schaal na drie tot vier dagen wanneer CPE compleet is.

Oogst cellen van deze 10 centimeter diameter schalen, verstoren ze door drie vries-doodcycli en verwijder het lysaat door centrifugatie gedurende 10 minuten bij 1.800 keer G. Verzamel de supernatant en bewaar bij min 20 voor grootschalige Cav twee amplificatie om de opschalingsprocedure te beginnen. Infecteer 80 tot 90% confluente monolayers van DKE een cellen gekweekt in 40 tien centimeter diameter weefselkweek schalen voor elke schaal gebruik 0,1 milliliter van virus bevattend supernatant verdund in één milliliter van volledige DMEM zonder FCS. Incubeer cellen bij 37 graden Celsius gedurende drie tot vier uur onder milde agitatie. Na drie tot vier uur, voeg vijf milliliter volledige DMEM toe bevattend 5% FCS en incubeer gedurende drie dagen.

Na drie dagen, oogst geïnfecteerde cellen van de 40 tien centimeter schalen in 50 milliliter polypropyleen buizen, pellet cellen bij 1.200 keer G gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius. Resuspendeer ze in 15 milliliter DMEM medium, verstoren cellen door drie vries-doodcycli. Verwijder cellulaire deeltjes door centrifugatie gedurende 10 minuten bij 1.800 keer G.

Bewaar de supernatant bij min 20 voorafgaand aan zuivering van virale deeltjes voor zuivering van virale deeltjes. Bereid een discontinu cesiumchloride gradiënt voor in een 14 milliliter UltraClear buis. Giet eerst twee milliliter van de hogere dichtheid cesiumchloride oplossing in de bodem van de buis.

Voeg vervolgens langzaam twee milliliter van de lagere dichtheid cesiumchloride oplossing toe bovenop de eerste oplossing. Laad voorzichtig het virale supernatant op bovenop het cesiumchloride gradiënt. Vul de buis met minerale olie tot twee tot drie millimeter vanaf de bovenkant. Centrifugeer in een draaiende SW 40 rotor gedurende een uur en 30 minuten bij 130.000 keer g en 18 graden Celsius na centrifugatie.

Twee witte banden zijn duidelijk zichtbaar op het grensvlak tussen de twee cesiumchloride oplossingslagen. Gebruik een 21 gauge naald en een spuit om door zijpunctie de onderste band te verzamelen die volwassen cav twee deeltjes bevat. Probeer zoveel mogelijk te vermijden het verzamelen van de bovenste band die overeenkomt met lege virale