Name: Productie en zuivering van niet-Replicatieve Canine adenovirus type 2 afgeleide vectoren (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-03T13:50:00.000+00:00
Duration: 14 min 55 s
Description: Leer de productie en zuivering van niet-replicatieve CAV2-vectoren voor gentherapie en vaccinatie. Deze methode maakt efficiënte transductie van cellen in vitro en in vivo mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd financieel ondersteund door subsidies van INSERM, de CNRS, de Fondation pour la Recherche Médicale en de Agence Nationale pour la Recherche (ANR- 10-Blanc-1322) aan D.G-D; Het zevende kaderprogramma van de Europese Commissie aan B.K.; M.S. werd ondersteund door een postdoctorale beurs van FRM (programma "Equipe FRM 2009"); C.B. werd ondersteund door een postdoctorale beurs van UE, onder subsidieovereenkomstnummer 245266 (Orbivac).

1. Constructie van een niet-replicatief CAV2-genoomplasmide
Opmerking: alle plasmiden die in dit protocol worden beschreven, zijn eerder beschreven7 en zijn op aanvraag verkrijgbaar.
<ol>
	<li>Cloneer het GOI in het pShuttle-plasmide, met behulp van geschikte restrictie-enzymen, om pShuttle-GOI te genereren (Figuur 1A).</li>
	<li>Verter 2 μg van pShuttle-GOI door AscI/PacI. De vertering geeft het Shuttle-GOI-fragment vrij (~2,9 kbp + GOI ORF-sequentie) van de plasmidebackbone (2,8 kbp).</li>
	<li>Zuiver het Shuttle-GOI-fragment na agarosegelelektroforese, met behulp van NucleoSpin Gel en PCR Clean-up kit.</li>
	<li>Parallel hieraan verteer 1 μg van het pCAV2 genoomplasmide door SwaI. Het pCAV2-plasmide bevat een uniek SwaI-snijplaats in de E1-regio (Figuur 1B). Verhit-inactiveer dit restrictie-enzym bij 65 °C gedurende 20 min.</li>
	<li>Transformeer competente E. coli BJ5183 bacteriën met 500 ng van het gezuiverde Shuttle-GOI-fragment en 100 ng van gelinealiseerd pCAV2-plasmide voor homologe recombinatie (Figure 1B). Verspreid op LB-Amp platen. Bebroed platen bij 37 °C gedurende minimaal 20 uur.</li>
	<li>Voer PCR-analyse rechtstreeks uit op bacteriële kolonies met EmeraldAmp master mix met voorwaartse (5'-CACGAGGCCCTTTCGTCTTCAA-3') en omgekeerde (5'-GCGGTAGTTTATCACAGTTAAATTGC-3') primers, onder de volgende cycluscondities: 10 min bij 95 °C (voor één cyclus), 95 °C gedurende 1 min; 58 °C gedurende 1 min; 72 °C gedurende 1 min/kbp (voor 39 cycli), en tenslotte 5 min bij 72 °C. Een product van 1 kbp + GOI ORF-sequentie wordt versterkt vanuit pCAV-GOI positieve klonen, terwijl geen PCR-product kan worden gedetecteerd met negatieve klonen.</li>
	<li>Inoculeer ten minste twee positieve kolonies per nacht in 5 ml LB-amp-medium bij 37 °C in een shaker (220 rpm).</li>
	<li>Extracteer plasmide-DNA's met behulp van Nucleospin plasmide kit. Transformeer competente E. coli DH5α bacteriën met een aliquot van elke DNA-prep. Verspreid bacteriële suspensie op LB-Amp platen en bebroed overnacht bij 37 °C.</li>
	<li>Inoculeer twee kolonies van elke positieve klonering per nacht in 3 ml LB-amp-medium bij 37 °C in een shaker (220 rpm). Extracteer plasmide-DNA met behulp van Nucleospin plasmide kit.</li>
	<li>Verteer het resulterende DNA en het ouderlijke pCAV2-plasmide (als controle) met NdeI. Het restrictiepatroon van het ouderlijke pCAV2 is 14,8 kbp, 9 kbp, 7,9 kbp en 1,6 kbp. De GOI-expressiecassette is ingezet binnen het 7,9 kbp-fragment en bevat ten minste één NdeI-snijplaats, d.w.z. één in de cassette en de potentiële plaatsen die aanwezig zijn in de GOI.</li>
	<li>Selecteer positieve constructies en ga verder met stap 2 met ten minste 2 onafhankelijke klonen.</li>
</ol>
2. Transfectie van recombinant CAV2-genoomplasmide in DK-E1-cellen
Opmerking: CAV2-afgeleide niet-replicatieve vectoren zijn genetisch gemodificeerde organismen geclassificeerd als Bioveiligheidsniveau 2 (BSL-2), terwijl hun gebruik op diermodellen is geclassificeerd als BSL-1. Gebruik alstublieft de juiste beveiligingsmaatregelen en afvalverwerkingsmaatregelen, inclusief persoonlijke beschermingsmiddelen, en werk onder BSL-2 laminaire stroomkappen.
<ol>
	<li>Een dag voor de transfectie, zaai DK-E1-cellen op een 6-well plaat. Kweek cellen bij 37 °C en 5% CO2, in Dulbecco's Gemodificeerd Eagle Medium (DMEM) met hoge glucose, bevattende 7% hitte-inactiveerd foetaal calf serum (FCS), 1 mM natriumpyruvaat, en 100 U/ml penicilline/100 μg/ml streptomycine. Cellen moeten 70-80% confluÃ«nt zijn voor transfectie.</li>
	<li>Verteer 2 μg van pCAV-GOI-plasmide met AscI, om de niet-virale sequentie van het plasmide vrij te geven. Controleer het resulterende restrictiepatroon door middel van 0,8% agarosegelelektroforese. Vertering moet een ~31 kbp-fragment opleveren dat het recombinante genoom bevat en een 2 kbp-fragment dat overeenkomt met de plasmidebackbone.</li>
	<li>Meng verteerde DNA met 200 μl Jet Prime Buffer door 10 sec te vortexen. Voeg 4 μl Jet Prime toe en meng door 10 sec te vortexen. Draai kort rond om druppels te verwijderen en incubeer gedurende 10 min bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Voeg de transfectiemix druppelsgewijs toe aan cellen. Schud de platen voorzichtig om de mix gelijkmatig te verdelen en incubeer bij 37 °C.</li>
</ol>
3. Propagatie van recombinant CAV2
<ol>
	<li>Een week na transfectie, verzamel cellen en cultuurmedium in een 15 ml polypropyleen buis. Ontwricht cellen door drie vries-dooicycli (-80 °C/37 °C) en verduidelijk het lysaal door centrifugatie gedurende 10 min bij 1.800 x g.</li>
	<li>Verzamel supernatant en bewaar bij -20 °C voor verdere viruspropagatie.</li>
	<li>Besmet een 80-90% confluÃ«nte

<ol><li>Kaufmann, J. K., Nettelbeck, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virus+chimeras+for+gene+therapy%2C+vaccination%2C+and+oncolysis%3A+adenoviruses+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Mol.+Med%22%5BJournal%5D)">Virus chimeras for gene therapy, vaccination, and oncolysis: adenoviruses and beyond.</a> Trends Mol. Med. 18, 365-376 (2012).</li>
<li>Curr, Topics Microbiol. Immunol. 343, 195-224 (2010).</li>
<li>Zak, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Merck+Ad5%2FHIV+induces+broad+innate+immune+activation+that+predicts+CD8%28%2B%29+T-cell+responses+but+is+attenuated+by+preexisting+Ad5+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Merck Ad5/HIV induces broad innate immune activation that predicts CD8(+) T-cell responses but is attenuated by preexisting Ad5 immunity.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 3503-3512 (2012).</li>
<li>Paillard, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advantages+of+non-human+adenoviruses+versus+human+adenoviruses%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Advantages of non-human adenoviruses versus human adenoviruses.</a> Hum. Gene Ther. 8, 2007-2009 (1997).</li>
<li>Ackermann, A., Guelzow, T., Staeheli, P., Schneider, U., Heimrich, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+viral+dissemination+in+the+mouse+nervous+system%2C+using+a+green+fluorescent+protein-expressing+Borna+disease+virus+vector%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Visualizing viral dissemination in the mouse nervous system, using a green fluorescent protein-expressing Borna disease virus vector.</a> J. Virol. 84, 5438-5442 (2010).</li>
<li>Bru, T., Salinas, S., Kremer, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+update+on+canine+adenovirus+type+2+and+its+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">An update on canine adenovirus type 2 and its vectors.</a> Viruses. 2, 2134-2153 (2010).</li>
<li>Bouet-Cararo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Canine+adenoviruses+elicit+both+humoral+and+cell-mediated+immune+responses+against+rabies+following+immunisation+of+sheep%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Canine adenoviruses elicit both humoral and cell-mediated immune responses against rabies following immunisation of sheep.</a> Vaccine. 29, 1304-1310 (2011).</li>
<li>Soudais, C., Skander, N., Kremer, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+in+vivo+transduction+of+neurons+throughout+the+rat+CNS+using+novel+helper-dependent+CAV-2+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Long-term in vivo transduction of neurons throughout the rat CNS using novel helper-dependent CAV-2 vectors.</a> FASEB J. 18, 391-393 (2004).</li>
<li>Deinhardt, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rab5+and+Rab7+control+endocytic+sorting+along+the+axonal+retrograde+transport+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Rab5 and Rab7 control endocytic sorting along the axonal retrograde transport pathway.</a> Neuron. 52, 293-305 (2006).</li>
<li>Soudais, C., Laplace-Builhe, C., Kissa, K., Kremer, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preferential+transduction+of+neurons+by+canine+adenovirus+vectors+and+their+efficient+retrograde+transport+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Preferential transduction of neurons by canine adenovirus vectors and their efficient retrograde transport in vivo.</a> FASEB J. 15, 2283-2285 (2001).</li>
<li>Peltekian, E., Garcia, L., Danos, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurotropism+and+retrograde+axonal+transport+of+a+canine+adenoviral+vector%3A+a+tool+for+targeting+key+structures+undergoing+neurodegenerative+processes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Neurotropism and retrograde axonal transport of a canine adenoviral vector: a tool for targeting key structures undergoing neurodegenerative processes.</a> Mol. Ther. 5, 25-32 (2002).</li>
<li>Chartier, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+generation+of+recombinant+adenovirus+vectors+by+homologous+recombination+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Efficient generation of recombinant adenovirus vectors by homologous recombination in Escherichia coli.</a> J. Virol. 70, 4805-4810 (1996).</li>
<li>Reed, L. J., Muench, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+of+estimating+fifty+percent+endpoints%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Hyg%22%5BJournal%5D)">A simple method of estimating fifty percent endpoints.</a> Am. J. Hyg. 27, 493-497 (1938).</li>
<li>Segura, M. M., Puig, M., Monfar, M., Chillon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatography+purification+of+canine+adenoviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Ther.+Methods%22%5BJournal%5D)">Chromatography purification of canine adenoviral vectors.</a> Human Gene Ther. Methods. 23, 182-197 (2012).</li>
<li>Segura, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+real-time+PCR+assay+for+quantification+of+canine+adenoviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+virological%22%5BJournal%5D)">A real-time PCR assay for quantification of canine adenoviral vectors.</a> Journal of virological. 163, 129-136 (2010).</li>
<li>Fernandes, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioprocess+development+for+canine+adenovirus+type+2+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Bioprocess development for canine adenovirus type 2 vectors.</a> Gene Ther. , (2012).</li>
<li>Rinne, A., Littwitz, C., Bender, K., Kienitz, M. C., Pott, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenovirus-mediated+delivery+of+short+hairpin+RNA+%28shRNA%29+mediates+efficient+gene+silencing+in+terminally+differentiated+cardiac+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Adenovirus-mediated delivery of short hairpin RNA (shRNA) mediates efficient gene silencing in terminally differentiated cardiac myocytes.</a> Methods Mol. Biol. 515, 107-123 (2009).</li>
<li>Huang, B., Kochanek, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenovirus-mediated+silencing+of+huntingtin+expression+by+shRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Adenovirus-mediated silencing of huntingtin expression by shRNA.</a> Hum. Gene Ther. 16, 618-626 (2005).</li>
<li>Tordo, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Canine+adenovirus+based+rabies+vaccines%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Canine adenovirus based rabies vaccines.</a> Dev. Biol. 131, 467-476 (2008).</li>
</ol>

Auteurs hebben niets te onthullen.

De eenvoudige methode die hierin wordt beschreven, aangepast van de goed gedocumenteerde Ad5-technologie, maakt de efficiënte productie van niet-replicatieve CAV2-vectoren mogelijk met een typische klooncecapaciteit van ongeveer 4,2 kbp. Wat betreft tijdoverwegingen, wordt een recombinant CAV2-genoom meestal in twee weken gegenereerd, terwijl het nog eens 5 weken zal duren om virale suspensies te versterken, zuiveren en titreren.
Hoewel de productie van de eerste batch CAV2-afgeleide vectoren ...

In de afgelopen decennia hebben adenovirus- (Ad-) afgeleide vectoren hun effectiviteit bewezen voor gentherapie en vaccinatie, evenals in oncolytische virotherapie 1. Ads zijn niet-omhulde icosaëdrische virussen van de Adenoviridae-familie, die zijn geïsoleerd uit zoogdieren, vogels, reptielen, amfibieën en vissen. Sinds hun ontdekking in 1953 zijn Ads intensief bestudeerd als modellen om virus/cel-interacties te bestuderen en, meer recent, als vector-gebaseerde gentransportsystemen 2. Inderdaad bieden op Ads gebaseerde vectoren veel voordelen, zoals hun brede gastheerbereik en goed gekarakteriseerde biologie, samen met de gemakkelijkheid waarmee ze genetisch gemanipuleerd en geamplificeerd kunnen worden voor grootschalige productie.
Om klinische moeilijkheden te overwinnen die verband houden met pre-existente immuniteit in menselijke populaties tegenover vectoren afgeleid van humane Ads 3, zijn wij en anderen begonnen om vectoren af te leiden van niet-menselijke Ads 4. Bovendien lijken niet-menselijke adenovirale vectoren meer aangepast te zijn voor massale vaccinatie in de veterinaire geneeskunde dan de klassiek gebruikte adenovirustype 5 (Ad5), omdat ze meer voldoen aan veiligheids- en beveiligingsvereisten tijdens de risicobeoordeling door de nationale regelgevende autoriteiten. Aan het einde van de jaren 1990 beschreven we de eerste recombinante CAV2 als een niet-menselijke alternatief voor vectoren afgeleid van Ad5 5. Sindsdien hebben talrijke studies het potentieel van CAV2-vectoren voor therapeutische of antigene genoverdracht bevestigd (voor reviews 6,7). Net als andere Ads zijn CAV2-afgeleide vectoren stabiel en kunnen ze in hoge titers worden geproduceerd, wat hun gebruik in vivo vergemakkelijkt. Ze zijn ook veilig, omdat ze niet integratief zijn, hoewel ze langdurige transgeenexpressie in vivo mogelijk maken (>1 jaar) 8. Opmerkelijk is dat CAV2-vectoren, beter dan humane Ads-serotypen, zeer neurotrofisch zijn gebleken, met een zeer efficiënte retrograde transport in axonen 9,10. Deze intrinsieke eigenschap heeft geleid tot het idee om recombinante CAV2-vectoren te gebruiken om neuronen van specifieke hersengebieden te transduceren die moeilijk toegankelijk zijn voor lentivirale vectoren, tot nu toe algemeen gebruikt voor genoverdracht in het centrale zenuwstelsel 11.
Hier beschrijven we een eenvoudig en klassiek protocol om niet-replicatieve CAV2-vectoren af te leiden van de Manhattan-stam te construeren, produceren en zuiveren. Recombinante CAV2-genomen worden geconstrueerd door het gewenste gen van belang (GOI) te klonen in een cassette stroomafwaarts van de cytomegalovirus (CMV) vroege promotor, die een ubiquiteit expressie biedt. CAV2-vectoren hebben een kloombekwaamheid van ~4,2 kbp, wat het mogelijk maakt grote cDNA te exprimeren. In een tweede stap wordt deze expressiecassette door homologe recombinatie in plaats van de E1-regio van het CAV2-genoom geplaatst, wat leidt tot een niet-replicatief virus (dlE1), zoals oorspronkelijk beschreven door Chartier et al.12 Uiteindelijk worden virale deeltjes geproduceerd na transfectie van het genomische plasmide in een CAV2-E1-expresserende hondenniercellijn (DK-E1) en worden ze serieel geamplificeerd voorafgaand aan concentratie en zuivering van virale stockoplossingen. De hier beschreven methode maakt gebruik van een tweestaps ultracentrifugering in cesiumchloride (CsCl) gradiënten, wat verrijking van infectieuze deeltjes met een hoge uiteindelijke titer mogelijk maakt (gewoonlijk meer dan 1010 infectieuze deeltjes per ml). De virale suspensie wordt vervolgens door chromatografie door wegwerpbare Sephadex G-25 kolommen ontzilt, zodat deze uiteindelijk zuiver genoeg is om direct in vivo te worden gebruikt.

<table><tbody><tr><td>Beperkingsenzymen</td><td>New England Biolabs</td><td>Verschillend</td><td></td></tr><tr><td>Jet Prime transfectiekit</td><td>Polyplus</td><td>114-01</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco (Life Technologies)</td><td>10567014</td><td></td></tr><tr><td>E. coli BJ5183 bacteriën</td><td>Agilent</td><td>200154</td><td></td></tr><tr><td>PD-10 ontzoutingskolom</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0851-01</td><td></td></tr><tr><td>EmeraldAmp polymerase</td><td>Takara</td><td>RR320A</td><td></td></tr><tr><td>Nucleospin plasmidkit</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740558.250</td><td></td></tr><tr><td>NucleoSpin Gel en PCR Clean-up</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740609.50</td><td></td></tr><tr><td>14 ml buizen, Ultra Clear</td><td>Beckman</td><td>344060</td><td></td></tr></tbody></table>

productie en zuivering van niet-replicatieve canine adenovirus type 2 afgeleide vectoren

Production and Purification of Non Replicative Canine Adenovirus Type 2 Derived Vectors

Adenovirus (Ad) afgeleide vectoren zijn op grote schaal gebruikt voor korte of lange termijn genoverdracht, zowel voor gentherapie als voor vaccintoepassingen. Vanwege de frequente reeds bestaande immuniteit tegen het klassiek gebruikte humane adenovirus type 5, is hondenadenovirus type 2 (CAV2) voorgesteld als een alternatieve vector voor humane genoverdracht. De goed gekarakteriseerde biologie van CAV2, samen met de gemakkelijke genetische manipulatie, bieden grote voordelen, met name voor genoverdracht naar het centrale zenuwstelsel, of voor het induceren van een breed scala aan beschermende immuunresponsen, van humorale tot cellulaire immuniteit. Tegenwoordig vertegenwoordigt CAV2 een van de meest aantrekkelijke niet-menselijke adenovirussen voor gebruik als vaccinvector. Dit protocol beschrijft een eenvoudige methode om recombinante CAV2-vectoren te construeren, produceren en titeren. Na het klonen van de expressiecassette van het gen van belang in een shuttle-plasmide, wordt het recombinante genomische plasmide verkregen door homologe recombinatie in de E. coli BJ5183 bacteriestam. Het resulterende genomische plasmide wordt vervolgens getransfecteerd in hondenniercellen die de complementerende CAV2-E1-genen (DK-E1) tot expressie brengen. Een virale amplificatie maakt de productie van een groot viraal stock mogelijk, die gezuiverd wordt door ultracentrifugatie door cesiumchloridegradiënten en ontzilt door middel van dialyse. De resulterende virale suspensie heeft routinematig een titer van meer dan 1010 besmettelijke deeltjes per ml en kan direct in vivo worden toegediend.

De productie van recombinante CAV2-vectoren is gebaseerd op basis- maar essentiële moleculaire biologische technieken. Alvorens virale vectoren kunnen worden geproduceerd, is het noodzakelijk om een recombinant CAV2-genoom te construeren dat een expressiecassette voor het transgen bevat. Deze constructie bestaat uit twee stappen: eerst wordt het gen van interesse (GOI) in een shuttle-plasmide gekloond als expressiecassette (i.e. met promoter en polyadenyleringssignaal). Dit functionele element wordt geflankeerd ...

De afgelopen 15 jaar hebben honden-adenovirus type 2 (CAV2)-afgeleide vectoren hun efficiëntie bewezen om cellen in vitro en in vivo te transduceren en worden ze veel gebruikt voor vaccinatie en gentherapie. Hier beschrijven we een procedure om CAV2-vectoren te construeren, produceren en zuiveren, wat leidt tot virale suspensies met een hoog titer.

Productie en zuivering van niet-Replicatieve Canine adenovirus type 2 afgeleide vectoren

Adenovirus (Ad) derived vectors have been widely used for short or long-term gene transfer, both for gene therapy and vaccine applications. Because of the ...

Het algemene doel van deze procedure is om honden adenovirus type twee afgeleide vectoren te construeren, produceren en zuiveren. Dit wordt bereikt door eerst het gen van belang in een shuttle plasmide te klonen. De tweede stap is om een recombinant genoom plasmide te verkrijgen door homologe recombinatie.Vervolgens worden de recombinante defecte calf, twee virussen geproduceerd en geamplificeerd in een trans complementerende cellijn. De laatste stap is het zuiveren en concentreren van het resulterende recombinante virus voor diverse toepassingen in vivo en in vitro. Uiteindelijk wordt immunofluorescence confocale microscopie gebruikt om voorbeelden van virale transductie in de hersenen van knaagdieren te tonen.Het belangrijkste voordeel van deze technieken boven bestaande methoden zoals vectoren afgeleid van humane ad neurose is dat er geen pre-existente immuniteit tegen calf twee bestaat in de menselijke populatie. Dus deze methode kan helpen om belangrijke vragen in de vaccinatie of gentherapie velden te beantwoorden, zoals het beoordelen van de rol van eiwitten die in specifieke hersengebieden worden geexpresseerd. Dus het demonstreren van deze procedure zal door May KY en Corin Bergeron zijn.Twee postdoctorale onderzoekers uit onze laboratoria bereiden zich voor op deze procedure een dag voorafgaand aan de transfectie door DKE een cellen te zaaien op een zes-puts plaat. Groei cellen bij 37 graden Celsius en 5% CO2 in DMEM met hoge glucose bevattend 7% hitte, geïnactiveerd foetaal runderserum, natrium, pyruvaat, penicilline en streptomycine. Op de volgende dag moeten de cellen 70 tot 80% confluent zijn voor transfectie. Digest twee microgram van pcal GOI, het recombinante cav twee genoom plasmide met ASC een om de niet-virale sequentie van het plasmide vrij te maken, controleer het resulterende restrictiepatroon door 0,8% Agro gel elektroforese. Digestie zou een fragment van ongeveer 31 kilobasenpaar moeten opleveren dat het recombinante genoom bevat en een fragment van twee kilobasenpaar dat overeenkomt met de plasmide ruggengraat. Meng het gedigesteerde DNA met 200 microliters jet prime buffer en vortex gedurende 10 seconden.Voeg vier microliters jet prime toe en meng door 10 seconden te vortexen. Draai kortjes om druppels te verwijderen en incubeer gedurende 10 minuten. Bij kamertemperatuur, voeg de transfectiemix druppelsgewijs toe aan de DKE een cellen.Schud de plaat zachtjes om het mengsel gelijkmatig te verdelen en incubeer bij 37 graden Celsius. Een week na transfectie verzamel cellen en kweekmedium in een 15 milliliter polypropyleen buis. Verstoren cellen door drie vries-doodcycli.Verwijder het lysaat door centrifugatie gedurende 10 minuten bij 1.800 keer G. Verzamel de supernatant en bewaar bij min 20 voor subsequente virus propagatie om het virus te propageren. Infecteer een 80 tot 90% confluente monolaag van DKE een cellen gekweekt in een put van een zes-puts plaat met 0,5 milliliter van het virus bevattende supernatant. Incubeer bij 37 graden Celsius gedurende een uur onder milde agitatie. Na een uur. Verwijder het inoculum en vervang het met 1,5 milliliter volledige DMEM bevattend 5% hitte geïnactiveerd FCS. Incubeer cellen bij 37 graden Celsius gedurende drie tot vier dagen.Cellen moeten dagelijks worden gecontroleerd op het optreden van een cytpathische effect of CPE. Als er geen duidelijk CPE zichtbaar is. Oogst cellen na vier dagen van cultuur en herhaal de virale amplificatie wanneer een duidelijk CPE de meerderheid van de cellen aantast.Gewoonlijk na twee tot vier virale amplificatierondes, verzamel cellen met kweekmedium en vries-dood drie keer zoals eerder gedemonstreerd. Infecteer 80 tot 90% confluent. DKE een cellen gekweekt in drie 10 centimeter diameter weefselkweek schalen met behulp van 1,5 milliliter van virus bevattend supernatant per schaal na drie tot vier dagen wanneer CPE compleet is.Oogst cellen van deze 10 centimeter diameter schalen, verstoren ze door drie vries-doodcycli en verwijder het lysaat door centrifugatie gedurende 10 minuten bij 1.800 keer G. Verzamel de supernatant en bewaar bij min 20 voor grootschalige Cav twee amplificatie om de opschalingsprocedure te beginnen. Infecteer 80 tot 90% confluente monolayers van DKE een cellen gekweekt in 40 tien centimeter diameter weefselkweek schalen voor elke schaal gebruik 0,1 milliliter van virus bevattend supernatant verdund in één milliliter van volledige DMEM zonder FCS. Incubeer cellen bij 37 graden Celsius gedurende drie tot vier uur onder milde agitatie. Na drie tot vier uur, voeg vijf milliliter volledige DMEM toe bevattend 5% FCS en incubeer gedurende drie dagen.Na drie dagen, oogst geïnfecteerde cellen van de 40 tien centimeter schalen in 50 milliliter polypropyleen buizen, pellet cellen bij 1.200 keer G gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius. Resuspendeer ze in 15 milliliter DMEM medium, verstoren cellen door drie vries-doodcycli. Verwijder cellulaire deeltjes door centrifugatie gedurende 10 minuten bij 1.800 keer G.Bewaar de supernatant bij min 20 voorafgaand aan zuivering van virale deeltjes voor zuivering van virale deeltjes. Bereid een discontinu cesiumchloride gradiënt voor in een 14 milliliter UltraClear buis. Giet eerst twee milliliter van de hogere dichtheid cesiumchloride oplossing in de bodem van de buis.Voeg vervolgens langzaam twee milliliter van de lagere dichtheid cesiumchloride oplossing toe bovenop de eerste oplossing. Laad voorzichtig het virale supernatant op bovenop het cesiumchloride gradiënt. Vul de buis met minerale olie tot twee tot drie millimeter vanaf de bovenkant. Centrifugeer in een draaiende SW 40 rotor gedurende een uur en 30 minuten bij 130.000 keer g en 18 graden Celsius na centrifugatie.Twee witte banden zijn duidelijk zichtbaar op het grensvlak tussen de twee cesiumchloride oplossingslagen. Gebruik een 21 gauge naald en een spuit om door zijpunctie de onderste band te verzamelen die volwassen cav twee deeltjes bevat. Probeer zoveel mogelijk te vermijden het verzamelen van de bovenste band die overeenkomt met lege virale

production-purification-non-replicative-canine-adenovirus-type-2

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Recombinant adeno-associated virus (rAAVs) vectoren worden steeds waardevol...

Productie en Titering van recombinant adeno-geassocieerde virale vectoren

Hier beschrijven protocol alleen gebaseerd op cel infectie, hetgeen het rendement van recombinant parvovirus productie van meer dan 100 maal in vergelijking met andere protocollen gebruikt verbetert. Dit protocol is gebaseerd op het gebruik van een nieuw adenovirus 5 gebaseerde helper met de parvovirus VP transcriptie-eenheid (Ad-VP).

Efficiënte Recombinant Parvovirus productie met de hulp van Adenovirus-afgeleide systemen

Source: Ehrke-Schulz, E., et al. Cloning and Large-Scale Production of High-Capacity Adenoviral Vectors Based on the Human Adenovirus Type 5. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates the large-scale amplification of high-capacity adenoviral vectors in suspension-adapted human embryonic kidney cells expressing Cre recombinase for use in gene delivery applications requiring high-titer, helper-free vector preparations.

Large-Scale Production of High-Capacity Adenoviral Vectors 

Een protocol voor de generatie van adenovirale vectoren met hoge capaciteit waarbij alle virale coderende sequenties ontbreken, wordt gepresenteerd. Het klonen van transgenen die in het vectorgenoom zijn opgenomen, is gebaseerd op homing-endonucleasen. Virusamplificatie in producencellen die als adhesieven cellen worden gekweekt en in suspensie is afhankelijk van een helpervirus dat virale genen in trans levert.

Klonen en grootschalige productie van hoge capaciteit adenovirale vectoren op basis van de menselijke adenovirus type 5

Hier beschrijven we een efficiënte en reproduceerbare strategie om te produceren, titer en kwaliteitscontrole batches van adeno-associated virus vectoren. Het stelt de gebruiker om de voorbereiding van een vector met hoge-titer (≥1 x 1013 vector genomen/mL) en een hoge zuiverheid, in vitro of in vivo gebruiksklaar.

Productie, zuivering en kwaliteitscontrole voor Adeno-associated Virus gebaseerde vectoren

Hier presenteren we een protocol voor de productie van adenovirus met behulp van het pAdEasy-systeem. De technologie omvat de recombinatie van de pAdTrack en pAdEasy-1 plasmiden, de verpakking en versterking van het adenovirus, de zuivering van de adenovirale deeltjes uit cellysaat en kweekmedium, de virale titratie en het functioneel testen van het adenovirus.

Een efficiënte methode voor de productie van Adenovirus

Hier bieden we een gedetailleerde procedure voor grootschalige productie van onderzoekskwaliteit AAV-vectoren met behulp van adherente HEK 293-cellen gekweekt in celstapels en affiniteitschromatografiezuivering. Dit protocol levert consequent &gt;1 x 1013 vectorgenomen /ml op, wat vectorhoeveelheden oplevert die geschikt zijn voor grote dierstudies.

Productie van Adeno-geassocieerde virusvectoren in celstapels voor preklinische studies in grote diermodellen

In dit protocol wordt de AAV2-vector geproduceerd door het co-kweken van Spodoptera frugiperda (Sf9) insectencellen met baculovirus (BV)-AAV2-groen fluorescerend eiwit (GFP) of therapeutisch gen en BV-AAV2-rep-cap geïnfecteerde Sf9-cellen in suspensiecultuur. AAV-deeltjes komen vrij uit de cellen met behulp van detergent, worden geklaard, gezuiverd door affiniteitskolomchromatografie en geconcentreerd door tangentiële stromingsfiltratie.

Procesontwikkeling voor de productie en zuivering van Adeno-geassocieerd virus (AAV)2 Vector met behulp van Baculovirus-Insect Cell Culture System

Hier bieden we een gedetailleerde procedure voor de productie, zuivering en kwantificering van high-titer recombinant Newcastle disease virus. Dit protocol levert consequent &gt; 6 × 109 plaquevormende eenheden/ml op, wat virushoeveelheden oplevert die geschikt zijn voor in vivo dierstudies. Aanvullende kwaliteitscontroletests om de veiligheid in vivo te waarborgen, worden beschreven.

Productie van High-titer Recombinant Newcastle Disease Virus uit Allantoic Fluid

Hier wordt een op suspensie HEK293-cel gebaseerd AAV-productieprotocol gepresenteerd, wat resulteert in minder tijd en arbeid die nodig is voor vectorproductie met behulp van componenten die beschikbaar zijn voor onderzoeksdoeleinden van commerciële leveranciers.

Productie van Adeno-geassocieerde vectorbatches met hoog rendement met behulp van HEK293-suspensiecellen

Leer de productie en zuivering van niet-replicatieve CAV2-vectoren voor gentherapie en vaccinatie. Deze methode maakt efficiënte transductie van cellen in vitro en in vivo mogelijk.

Productie en zuivering van niet-Replicatieve Canine adenovirus type 2 afgeleide vectoren

Meer video's verkennen