Het analyseren van Protein Dynamics gebruik van waterstof Exchange Massaspectrometrie

Het algemene doel van het volgende experiment is om de conformationele flexibiliteit in eiwitten en veranderingen daarin als reactie op omgeving, ligandbinding of eiwit-eiwitinteracties te analyseren. Dit wordt bereikt door de eiwit van belang voor te incuberen onder verschillende omstandigheden die worden vermoed de conformatie van het eiwit te beïnvloeden, zoals ligandbinding. De reactiemixtuur wordt vervolgens verdund in deuteriumoxide, gedurende verschillende tijdsintervallen geïncubeerd en vervolgens geanalyseerd door middel van vloeistofchromatografie-massaspectrometrie om de mate van deutero-incorporatie in de peptideruggengraat te bepalen.

Amidegroepen, omdat beschermde gebieden een verminderde incorporatie van deutero's hebben, onthult het vergelijken van de peptidespectra van het experiment in de afwezigheid en aanwezigheid van een bindingspartner een verschuiving van de OID van de spectra als gevolg van het gewichtsverschil tussen proton en deuteron. Gebieden die prominente bescherming vertonen na toevoeging van een bindingspartner zijn potentiële bindingsplaatsen. Afhankelijk van de sequentiedekking en de beschikbaarheid van overlappende peptiden, kunnen bindingsplaatsen worden beperkt tot een paar aminozuren.

Deze methode kan helpen om belangrijke vragen te beantwoorden in het gebied van eiwitvouwing en eiwitdynamica, zoals hoe eiwitten vouwen, hoe ze zich ontvouwen, hoe ze reageren op fysische en chemische invloeden zoals temperatuurverhoging of zware metalen. Hoe gelijkende binding en eiwit-eiwitinteracties de conformatie van een eiwit kunnen beïnvloeden. Het is ook zeer belangrijk voor de ontwikkeling van eiwitmedicijnen voor verificatie van juiste vouwing en voor algemene kwaliteitscontrole.

Over het algemeen kunnen individuen die nieuw zijn met deze methode verschillende moeilijkheden tegenkomen. Als het eiwit bijvoorbeeld niet goed wordt verteerd door pepsine, zal de sequentiedekking laag zijn. Als het eiwit erg neiging tot aggregering heeft, kan het tijdens incubatie of na het toevoegen van de quench-buffer aggregeren en resulteren in lage signaalintensiteiten in de massaspectrometer.

In deze demonstratie zullen we de binding van de gistmoleculaire chaperone, HP 90 naar zijn cos-chaperone Sty one onderzoeken met behulp van waterstofuittwisselingsmassaspectrometrie. STY one bindt aan HP 90 en vergemakkelijkt clientbinding door remming van HB negentig's ABAs-activiteit. Begin deze procedure met de voorbereiding van buffers, monsters en kralen zoals beschreven in het tekstprotocol. Om de kolommen voor amidewaterstofuitwisseling voor te bereiden, schroef een zijde van de guardkolom los en verwijder de filter stevig.

Schroef de vultrechter op het open uiteinde van de kolom. Gebruik een 16e duim adapter om een lege vijf milliliter spuit aan de onderkant van de kolom te bevestigen. Zorg ervoor dat deze gasdicht op de guardkolom wordt bevestigd.

Breng een paar druppels slurrykralenmateriaal aan de bovenkant van de trechter aan. Trek de zuiger van de spuit om de slurry door de trechter in de guardkolom te zuigen. Breng meer slurrykralenmateriaal op de trechter aan en zet de procedure voort totdat de guardkolom volledig is gevuld met kralenmateriaal.

Verwijder vervolgens de trechter voordat u de filter en filterring op het open uiteinde stevig plaatst. Schroef de kolomdop op de guardkolom en verwijder de spuit van de andere kant. Sluit beide uiteinden van de guardkolommen met pluggen.

Om uitdroging van kolommateriaal te voorkomen om het systeem voor waterstofuittwisselingsmassaspectrometrie op te zetten. Verbind eerst de trapkolom met de hoge prestatie vloeistofchromatografie of HPLC-systeem. Equilibreer de kolom door de stroomsnelheid van pomp A in te stellen op 0,4 milliliter per minuut met 0,1%mierenzuur als oplosmiddel.

Na het kalibreren van de massaspectrometer, verbind de uitlaat van de HPLC met de bron van de massaspectrometer. Om de peptische peptiden eerst te bepalen, verbind eerst de Pepin-kolom en vervolgens de analytische kolom aan het systeem. Stel de parameters voor chromatografie en massaspectrometrie in de besturingssoftware in door de gradiënttype en massaspectrometriemethode te kiezen.

Kies een lange gradiënt om een goede chromatografische resolutie te garanderen. Schakel tandemmassaspectra in op de massaspectrometer. Bereid 100 tot 200 pomo van hitteschokeiwit 90 of HSP 90 in 100 microliters van H twee L-buffer voor.

Voeg 100 microliters van quench-buffer toe en meng door omhoog en omlaag te pipetteren. Injecteer de 200 microliters monster in de injectiepoort van de injectieklep met een Hamilton-spuit. Schakel de injectieklep in de injectiepositie en start het chromatografieprogramma.

Identificeer vervolgens peptische peptiden van hitteschokeiwit 90 door een database te doorzoeken naar de resulterende peptiden. Verlaag de systeemtemperatuur tot nul graden Celsius door ijswater toe te voegen. Herhaal deze stap zonder tandemmassaspectrometrie en met de gradiënt die zal worden gebruikt voor het eigenlijke waterstofuittwisselingsexperiment.

Voor hitteschokeiwit 90 en STI een, gebruik een 10 minutengradiënt van 90%oplosmiddel, een 10%oplosmiddel B tot 45%oplosmiddel, A 55%oplosmiddel B, bepaal de retentietijden van de geïdentificeerde peptische peptiden in de gebruikte gradiënt en maak een lijst met peptidesequentie, peptidelading, toestand en retentietijd. Dit zal worden gebruikt om elk peptide na waterstofuittwisselingsexperimenten te identificeren. Om eiwit-eiwitinteractie-interfaces te identificeren, stelt u eerst de gradiënt en massaspectrometriemethode in.

Gebruik in de besturingssoftware een 10 minuten lineaire gradiënt van 90%oplosmiddel, een 10%oplosmiddel B tot 45%oplosmiddel. Een 55%oplosmiddel B laad een massaspectrometriemethode die is geoptimaliseerd voor detectie tussen 300 tot 1.500 massa-tot-ladingsverhoudingen, hoewel de meeste peptiden onder de 1000 massa-tot-ladingsverhouding zullen zijn. Stel de injectieklep in de laadpositie en de zespoortklep.

Stel in de laadpositie van de zoutverwijdering de stroomsnelheid van de laadpomp in op 0,4 milliliter per minuut. Na het uitvoeren van de onveranderde referentie en