Drosophila-onderhoud

Succesvol onderzoek met Drosophila melanogaster hangt af van het correct onderhouden en verzorgen van dit waardevolle modelorganisme. De volgende video bespreekt de nodige stappen die vereist zijn voor de juiste voeding, huisvesting en hantering van de vlieg.

Hoewel Drosophila melanogaster algemeen bekend staat als de fruitvlieg, leeft deze in werkelijkheid van micro-organismen, zoals gist, die groeien op fermenterend fruit. In het laboratorium wordt het dieet van de vlieg om praktische redenen aangepast. Er zijn verschillende recepten beschikbaar, en deze bevatten allemaal de essentiële componenten: suiker en gist. Het volgende recept is afkomstig van de University of Indiana in Bloomington, bekend om zijn enorme verscheidenheid aan vliegenstammen. Het bestaat uit: steriel water, gist, sojameel, gele maïsgries, agar voor de textuur, glucosestroop en propionzuur om schimmel- en bacteriegroei te remmen. Deze ingrediënten worden gecombineerd, verhit, geroerd en vervolgens met een pomp verdeeld over plastic kweekbuisjes. Nadat ze zijn gevuld, worden de buisjes afgesloten met een katoenen prop, ingepakt en afgekoeld bij 4 °C. Zodra het voeding is gestold, wordt het gesteriliseerd via autoclaving.

Nu we hebben geleerd wat vliegen eten, kijken we naar waar ze leven en hoe ze worden beheerd.

Voor het huisvesten van vliegen worden verschillende soorten containers gebruikt. Vials worden gebruikt voor het onderhoud van vliegen en bevatten idealiter 50-100 volwassen exemplaren. Flessen worden gebruikt voor grotere culturen en huisvesten 300-600 volwassen vliegen. Incubatoren controleren de omgeving en kunnen honderden vials en flessen herbergen. De normale bewaarcondities voor vliegen zijn 25 °C en 60-65% relatieve vochtigheid.

Bij het werken met vliegen is het belangrijk om correcte etikettering en documentatie toe te passen en een schone omgeving te behouden om de integriteit van vliegenlijnen en experimenten te waarborgen. Een container moet worden gewisseld wanneer ongeveer de helft van de poppen is uitgekomen, oftewel de poppenhuls heeft verlaten. De hulzen zullen er helder uitzien.

Ter informatie: het popstadium vindt plaats tussen de larvale en adulte stadia, en is de periode waarin de larven incuberen en zich ontwikkelen tot een adult dier. Om te bepalen of poppenhulzen helder zijn, houdt u de container tegen een lichtbron en inspecteert u de pop.

Vliegen worden overgebracht naar vials met vers medium — een chique benaming voor vliegenvoeding — via een proces dat bekend staat als "flipping flies." Inspecteer vóór het overzetten het medium op integriteit. Vliegen kunnen niet overleven op voedsel dat door uitdroging is gebarsten of besmet is met schimmels of bacteriën.

Om de vliegen over te zetten, tikt u eerst zachtjes met de vliegenvial op het aanrecht om de vliegen van de wanden van de vial te schudden. Verwijder vervolgens snel de stop en keer de vliegen uit de oude container snel om in een nieuwe. Dit proces wordt snel uitgevoerd om te voorkomen dat vliegen ontsnappen of door de stop worden geplet, en om te voorkomen dat losse vliegen tijdens het overzetten de vial binnendringen.

Hoewel het omkeren van vliegen de voorkeursmethode is voor het bulktransport van Drosophila, is anesthesie vereist voor het sorteren van vliegen. Er zullen hier twee methoden van anesthesie worden besproken: koelen en het gebruik van koolstofdioxide. Om vliegen te koelen, plaatst u de cultuur gedurende 8-12 minuten in een vriezer van -20 °C. Plaats de vliegen vervolgens op een gekoelde, vlakke werkplek voor selectie. Vliegen kunnen ook door kou worden geanestheseerd door ze direct op een bevroren oppervlak te koelen.

Koolstofdioxide is een voorkeursmethode voor anesthesie omdat het geen acute mortaliteit bij vliegen veroorzaakt en geen gevaar vormt voor de onderzoeker. Het CO2-toedieningssysteem bestaat uit: een CO2-cilinder; een slang verbonden met een naald, om vliegen in vials en flesjes te anesthetiseren; en een slang verbonden met een CO2-plaat voor analyse onder de microscoop.

Om vliegen te anesthetiseren, steekt u de CO2-naald door de stop. Alternatief tikt u de container tegen een oppervlak, verwijdert u de stop en keert u de vliegen snel om op een CO2-plaat, waarbij u een gesloten afdichting behoudt tot de vliegen immobiel zijn. Verplaats de vliegen met een penseel of een pincet voorzichtig naar de nieuwe container.

Om ongewenste vliegen af te voeren, stort u ze in een vliegenmorgue, bestaande uit een grote fles gevuld met isopropanol of ethanol en minerale olie, voorzien van een trechter.

Nu we hebben gezien hoe vliegen in het laboratorium worden onderhouden en gehanteerd, bekijken we hoe de huisvestings- en voedingsomstandigheden worden aangepast voor verschillende experimenten.

Sommige experimenten vereisen alternatieve huisvesting om een grotere hoeveelheid vliegen te kunnen bevatten.

In dit experiment gebruikt de onderzoeker een populatiekooi voor vliegen om een grote hoeveelheid embryo's te verzamelen. Een populatiekooi voor vliegen is een doorzichtige plastic box die duizenden vliegen kan herbergen. De onderzoeker laat de gewenste vliegen uit verschillende flesjes in de populatiekooi vrij en plaatst vervolgens agarplaten in de kooi om de embryo's op te vangen.

Sommige experimenten vereisen de manipulatie van het dieet van de vlieg.

In dit experiment wil de onderzoeker de ontsnappingsreactie observeren van transgene vliegen die een lichtgeactiveerd ionkanaal tot expressie brengen in neuronen die de ontsnappingsreactie van de vliegen reguleren. Het Drosophila-dieet wordt aangevuld met "all-trans-retinal", wat een cofactor is voor dit kanaal en het in staat stelt te functioneren. Dit gebeurt door het voedsel te smelten en het reagens toe te voegen. De vlieg wordt vervolgens blootgesteld aan blauw licht dat het kanaal activeert en de ontsnappingsreactie induceert, waarna de benodigde vliegtijd wordt gemeten.

Een verscheidenheid aan huisvestings- en hanteercondities kan voor experimentele doeleinden worden gemanipuleerd.

In dit experiment wordt een ingenieuze "power tower" gecreëerd om de effecten van lichaamsbeweging op Drosophila te bestuderen. De power tower is een machine die voortdurend stijgt en daalt, waarbij gebruik wordt gemaakt van de natuurlijke reactie van de vlieg om omhoog te bewegen, tegen de zwaartekracht in, wat bekend staat als "negatieve geotaxis."

De prestaties van de vliegen die in de power tower zijn getraind, worden gemeten met een Rapid Iterative Negative Geotaxis assay, afgekort als RING-assay. Vliegen in lege flesjes worden voor een camera geplaatst. De flesjes worden aangetikt en de afgelegde klimafstand wordt geregistreerd. Dit experiment laat zien dat lichaamsbeweging, in vergelijking met een controlegroep, een positief effect had op de activiteit over tijd.

Deze JoVE-video heeft het onderhoud en de verzorging van Drosophila melanogaster behandeld. Na het bekijken van deze video zou u in staat moeten zijn om vliegvoedingsmedium te bereiden, de juiste huisvesting te identificeren, vliegen over te zetten en eenvoudige experimenten uit te voeren. Bedankt voor het kijken!