Name: Gebruik Caenorhabditis elegans Als een modelsysteem voor de Protein Homeostase studeren in een meercellige (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-18T14:15:00.000+00:00
Duration: 12 min 38 s
Description: Leer proteostase bestuderen in een meercellig organisme met Caenorhabditis elegans. Gedragsassays en immunofluorescentie onthullen hoe eiwitmisfolding verband houdt met stress en veroudering.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Alle nematodensoorten die in dit werk werden gebruikt, werden ter beschikking gesteld door het Caenorhabditis Genetics Center, dat wordt gefinancierd door het NIH National Center for Research Resources (NCRR). De monoklonale antilichamen die door H.F. Epstein werden ontwikkeld, werden verkregen van de Developmental Studies Hybridoma Bank, ontwikkeld onder auspiciën van de NICHD en onderhouden door het Department of Biology, University of Iowa. N. Shemesh werd ondersteund door de Fay and Bert Harbour award. A.B.-Z. werd ondersteund door een Alon Fellowship van de Israeli Council for Higher Education, door een Marie Curie International Reintegration grant, en door subsidies van de Binational Science Foundation en de Israeli Science Foundation (subsidienummer 91/11).

Gebruik maken van gedragsanalyses om eiwitvouwing in een levend organisme te monitoren
1. Synchroniseren van dieren voor gedragsanalyses
<ol>
	<li>Volg standaardmethoden voor het onderhouden van C. elegans36, inclusief media- en platenvoorbereiding, voedselvoorbereiding en groeiomstandigheden voor dieren. Beheer de kweekcondities zorgvuldig, inclusief temperatuur (15-25 °C), populatiegrootte en voedselbeschikbaarheid. Gooi elke plaat weg die bacteriële of schimmelbesmetting vertoont.</li>
	<li>Pluk 15-30 embryo's, breng ze over naar nieuwe platen en kweek ze op de gewenste temperatuur (15-25 °C) gedurende de duur van het experiment. Als alternatief, zet 10-20 drachtige volwassenen op een plaat, laat ze 30-60 minuten eieren leggen en verwijder ze dan van de plaat. Zowel direct plukken van embryo's als het zetten van drachtige volwassenen zal enige variabiliteit in leeftijd geven (±6 uur). Om deze variabiliteit te verminderen, pluk ofwel embryo's in een specifiek stadium, bijvoorbeeld het kommastadium, ofwel zet 10-20 volwassenen die net beginnen eieren te leggen (dag 2 van volwassenheid). Vermijd synchronisatie door bleken waar mogelijk, aangezien deze behandeling stressvol is en proteostase kan beïnvloeden.</li>
	<li>Pluk gesynchroniseerde dieren, breng ze over naar een proefplaat voor scoren en gooi ze dan weg.</li>
</ol>
2. Bewegingsproef
Pluk gesynchroniseerde dieren en breng ze over naar een schone plaat op de gewenste temperatuur voor bewegingsscoren (15-25 °C). Score voor elke biologische replica >20 dieren en herhaal de proef minstens 3x per experimentele conditie. Gebruik de Wilcoxon Mann-Whitney rangsomtest om twee onafhankelijke experimentele omstandigheden te vergelijken.
<ol>
	<li>Om lichte bewegingsbeperking te meten, zet 5-7 dieren samen in het midden van een schone bacteriële laag en laat de dieren 2 min op de plaat bewegen. Dit tijdsinterval werd bepaald op basis van de tijd die 90% van de wildtype dieren nodig had om een cirkel van 1 cm te doorkruisen.</li>
	<li>Tel het aantal dieren dat geen cirkel van 1 cm doorkruiste (bijv. dat binnen een straal van 1 cm van het punt waarop ze werden geplaatst bleef) binnen 2 min als ongecoördineerd.</li>
	<li>Om ernstige bewegingsbeperking te meten, zet de dieren op een schone bacteriële laag.</li>
	<li>Fotograaf verschillende dieren op tijd nul (t=0) en weer 5 min later (t=5). Score dieren die na 5 min geen lichaamslengte zijn bewogen als verlamd.</li>
</ol>
3. Thermo-resistentie
<ol>
	<li>Pluk >20 gesynchroniseerde dieren en breng ze over naar een 24-wellplaat met 450 µl Heat Shock (HS) buffer (Tabel 1). Score voor elke biologische replica >20 dieren en herhaal de proef minstens 4x per experimentele conditie.</li>
	<li>Breng de 24-wellplaat over naar een verwarmd bad. HS temperatuur en duur zijn sterk afhankelijk van groeiomstandigheden, in het bijzonder de kweektemperatuur.</li>
	<li>Voeg 9 µl SYTOX oranje toe aan de HS buffer.</li>
	<li>Score overleving van dieren door de opname van kleurstof te controleren, met behulp van een fluorescerende stereomicroscoop met een TXR-filter. Dieren die de kleurstof hebben opgenomen, zijn dood. Gebruik de Wilcoxon Mann-Whitney rangsomtest om twee onafhankelijke experimentele omstandigheden te vergelijken.</li>
</ol>
Gebruik maken van immunokleuring en getagde eiwitten om eiwitvouwing in specifieke cellen te monitoren
4. Lokalisatie van eiwitten bewaken door middel van immunokleuring
<ol>
	<li>In het vereiste stadium, breng ten minste 30 dieren over in een Eppendorfbuisje met M9 buffer36.</li>
	<li>Was de dieren een paar keer met M9 buffer door een korte, lage snelheid centrifugatiestap uit te voeren (3.000 rpm/900 x g, 2 min) en opnieuw op te schorsen.</li>
	<li>Plaats de buisjes een paar minuten op ijs om af te koelen.</li>
	<li>Verwijder overtollig vocht en incubeer met 500 µl ijskoud 4% paraformaldehyde-oplossing (Tabel 2). De incubatietijd moet voor elk onderzochte eiwit worden gekalibreerd en zou rond de 5-30 min bij kamertemperatuur moeten zijn. Verlengde incubatie bij 4 °C kan ook worden uitgevoerd, maar dit kan de permeabilisatie van het monster verstoren.</li>
	<li>Was vaste dieren 3x met PBS-Tween (pH 7.2) buffer door centrifugatie (3.000 rpm, 1-2 min). De dieren kunnen in dit stadium enkele weken worden bewaard bij 4 °C.</li>
	<li>Verzamel de dieren door centrifugatie (3.000 rpm, 1-2 min).</li>
	<li>In de kap, verwijder het meeste supernatant en schud het pellet op in 1 ml β-mercaptoethanol (β-ME) oplossing (Tabel 2).</li>
	<li>Incubeer 37 °C overnacht met zacht schudden op een nutator.</li>
	<li>In de kap, was dieren 3x met PBS-Tween (pH 7.2) buffer.</li>
	<li>Schud de dieren op in 50-100 µl van PBS-Tween (pH 7.2). De dieren kunnen in dit stadium enkele weken worden bewaard bij 4 °C.</li>
	<li>Verzamel de dieren door centrifugatie (3.000 rpm, 1-2 min) en verwijder het meeste PBS-Tween buffer.</li>
	<li>Voeg 100-150 µl van collagenase-oplossing toe aan elke buis en incubeer bij 37 °C met krachtige agitatie (met be

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.

Probes van de cellulaire proteostasecapaciteit moeten zeer gevoelig zijn voor veranderingen in de vouwomgeving en gemakkelijk te volgen zijn om realtime beoordeling van de kwaliteitscontrolecapaciteiten van eiwitvouwing te kunnen bieden. Door metastabiele eiwitten te gebruiken als proeven van de proteostasecapaciteit, hebben we veranderingen in fenotype, subcellulaire eiwitlokalisatie en eiwitconformatie gemonitord. De hier gepresenteerde protocollen richten zich op fenotypen die verband houden met spiereiwitten, inclusi...

De interactie van de verschillende stappen van eiwitbiosynthese, zoals mRNA-transcriptie, verwerking en translatie, evenals eiwitvouwing, translocatie en assemblage/demontage, bepaalt de belasting van metastabiele eiwitten die afhankelijk zijn van de cellulaire eiwitkwaliteitscontrolemechanismen voor hun functie1. Het ontbreken of de storing van eiwitkwaliteitscontrolemechanismen kan daarom resulteren in de functionele achteruitgang van verschillende soorten cellulaire mechanismen en in het ontstaan van eiwitmisvouwingsziekten2-7. Wanneer de capaciteit van eiwitvouwing en opruimingsmechanismen in balans is met de belasting van metastabiele eiwitten, wordt eiwithomeostase (proteostase) bereikt, een toestand die uiteindelijk de accumulatie van misgevouwen eiwitten en aggregaatvorming binnen cellen voorkomt6. Accumulatie van misgevouwen eiwitten wordt gezien als het signaal dat stress-inducerbare transcriptiefactoren activeert, zoals hitteschokfactor (HSF-1), en resulteert in de activering van cyto-beschermende stressresponsen6,8.
Ons begrip van de functies van proteostasenetwerken in metazoa is voornamelijk afgeleid van in vitro reconstituaties en van observaties gemaakt met weefselkweekcellen en eencellige organismen9. Bijvoorbeeld, onderzoek naar moleculaire chaperones die eiwitbeschadiging voorkomen en oplossen, heeft zich gericht op biochemische en cellulair-biologische studies van de mechanismen van chaperone-gemedieerde eiwitvouwing, disaggregatie en translocatie10-13. In vergelijking daarmee is er beperkte informatie beschikbaar over de geïntegreerde functie van verschillende proteostasecomponenten in de verschillende cellen en weefsels van metazoa onder 'normale' groeiomstandigheden en in reactie op stress11. De ontdekking dat in C. elegans cellulaire eiwitkwaliteitscontrole ook cel-niet-autonoom kan worden gereguleerd, zoals blijkt uit experimenten die mutaties in de twee neuronen die temperatuur waarnemen, de activering van de hitteschokrespons kunnen blokkeren en de thermotolerantie verminderen, heeft de noodzaak aangetoond om proteostase-regulatie in meercellige organismen te bestuderen14-17. Wat echter ontbreekt, is een samenhangend beeld van hoe proteostasenetwerken, zoals de verschillende moleculaire chaperone-families, functioneren in de weefsels van een intact metazoon en hoe dynamisch deze netwerken zijn tijdens ontwikkeling en veroudering. Om dit doel te bereiken, zijn betrouwbare sensoren nodig voor het bewaken van proteoomonderhoud in levende dieren om de proteostatische capaciteit van verschillende cellen in een meercellig organisme tijdens ontwikkeling en veroudering te bepalen.
Voor een bepaald eiwit om als sensor van cellulaire proteostase te functioneren, moet het reageren op veranderingen in de cellulaire vouwomgeving terwijl het de vouwing van niet-gerelateerde eiwitten in de cel minimaal interfereert. Om het onderhoud en herstel van cellulaire proteostase in een levend organisme te onderzoeken, kunnen twee complementaire benaderingen die afhankelijk zijn van vouwingsensoren worden gebruikt. De eerste is gebaseerd op ontworpen vouwingsensoren, gebaseerd op experimenteel geïdentificeerde metastabiele eiwitten waarvan bekend is dat ze afhankelijk zijn van proteostase-machinerie, zoals vuurvlieg-luciferase18-20 of GFP gekoppeld aan een degron21-24. In de tweede benadering worden endogene metastabiele eiwitten, zoals temperatuurgevoelige (ts) of leeftijdsafhankelijke aggregatieve eiwitten die reageren op incrementele veranderingen in de cellulaire omgeving, getraceerd25-27. Ontworpen vouwingsensoren dienen geen essentiële biologische functie, maar bieden het voordeel dat ze detecteerbaar zijn door krachtige rapportage-assays, zoals GFP-gelabelde eiwitten, en kunnen worden gebruikt met veel verschillende cellulaire en diermodellen18. Echter, omdat het introduceren van een enkel vreemd eiwit de vouwomgeving kan beïnvloeden27, kunnen dergelijke polypeptiden de cellulaire proteostase-machinerie overbelasten. Alternatief, ontworpen vouwingsensoren die niet inheems zijn in de cel waarop ze rapporteren, kunnen niet worden beïnvloed door veranderingen in de proteostasecapaciteit van de cel. Bijvoorbeeld, een GFP-gelabelde proteasoomreportersubstraat vereiste ~90% van het proteasoom om geïnhibeerd te worden voordat een fenotype kon worden gedetecteerd23. In tegenstelling daarmee bieden endogene metastabiele eiwitten die afhankelijk zijn van de proteostase-machinerie van de cel het voordeel dat ze binnen het cellulaire gevoeligheidsbereik liggen. Echter, het functieverlies geassocieerd met het misvouwen van dergelijke eiwitten kan ook de celfunctie en organisma-levensvatbaarheid beïnvloeden. Hier zullen we ons concentreren op het gebruik van endogene C. elegans vouwingsensoren.
C. elegans is een goed gevestigd metazoa-model voor de studie van zowel ontwikkeling als veroudering dat veel geconserveerde biologische paden gebruikt en kan worden gebruikt om eiwitvouwing in de cel te volgen, door een combinatie van celbiologie, biochemische en genetische benaderingen. We hebben metastabiele eiwitten gebruikt als sondes van proteostatische capaciteit door veranderingen in hun fenotype, lokalisatie en stabiliteit te monitoren. Bovendien kunnen een verscheidenheid aan eiwitfuncties worden bestudeerd door eenvoudige gedragsanalyse. Evenzo treedt aanzienlijke mislokalisatie van eiwitten op wanneer cellulaire eiwitkwaliteitscontrolenetwerken niet kunnen aanpassen aan cellulaire eisen. Eiwitten kunnen gemakkelijk worden gevisualiseerd in cellen van levende dieren met behulp van fluorescentie-gelabelde eiwitten of via immunokleuring. Ten slotte is het mogelijk om eiwitexpressie en stabiliteit te monitoren met behulp van ex vivo methoden. Dit maakt snelle en eenvoudige screening van gedrags- en fysiologische veranderingen mogelijk, gekoppeld aan diepgaande analyse van eiwitlokalisatie en stabiliteit, wat het mogelijk maakt om proteostase-modifiers te monitoren. Door deze verschillende methoden te combineren, kan een breed beeld van de eiwitvouwomgeving van een cel worden verkregen. Inderdaad, deze strategie is met succes gebruikt om proteostase-verstoring te monitoren in C. elegans, gist, weefselkweek en bacter

<table><tbody><tr><td>Antibody staning and fiaxtion</td><td>paraformaldehyde</td><td>Merc</td><td>8187151000</td></tr><tr><td>Tween-20&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>1706531</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase</td><td>Sigma</td><td>C5138-100MG</td><td></td></tr><tr><td>DABCO</td><td>Merc</td><td>8034560100</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Alfa Aesar</td><td>A16046</td><td></td></tr><tr><td>&beta; -ME</td><td>Sigma</td><td>8057400250</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Di Cam</td><td>000-40-100</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;Partial digest&nbsp;</td><td>Chymotrypsin</td><td>Sigma</td><td>C4129-250MG</td></tr><tr><td>Thermo-resistance</td><td>SYTOX Orange</td><td>Invitrogen</td><td>S11368</td></tr><tr><td>Cholesterol</td><td>Amaresco</td><td>0433-250G</td><td></td></tr><tr><td>EQUIPMENT</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>M165 FC fluorescent stereoscope</td><td>Leica</td><td></td><td>TXR filter</td></tr><tr><td>EXi Blue Fluorescence Microscopy Camera</td><td>QImaging</td><td>EXI-BLU-R-F-M-14-C</td><td></td></tr><tr><td>ConfoCor 3/510 META confocal microscope</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pellet pestles</td><td>Sigma</td><td>Z359947-100EA</td><td></td></tr><tr><td>Pellet Pestle Cordless Motor</td><td>Kontes</td><td>K749540-0000</td><td></td></tr><tr><td>MicroCL 17 Microcentrifuge Series</td><td>Thermo</td><td>75002455</td><td>Gekoeld,, 230 V 50/60 Hz, inclusief 24x 1.5/2.0 ml rotor met ClickSeal Biocontainment Lid</td></tr></tbody></table>

gebruik caenorhabditis elegans als een modelsysteem voor de protein homeostase studeren in een meercellige

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

Het vouwen en samenstellen van eiwitten is essentieel voor de eiwitfunctie, de langetermijngezondheid van de cel en de levensduur van het organisme. Historisch werd de functie en regulatie van eiwitvouwing in vitro bestudeerd, in geïsoleerde weefselkweekcellen en in eencellige organismen. Recente studies hebben verbanden ontdekt tussen eiwithomeostase (proteostase), metabolisme, ontwikkeling, veroudering en temperatuurwaarneming. Deze bevindingen hebben geleid tot de ontwikkeling van nieuwe hulpmiddelen voor het monitoren van eiwitvouwing in het modelmetazoënorganisme Caenorhabditis elegans. In ons laboratorium combineren we gedragsanalyses, beeldvorming en biochemische benaderingen met behulp van temperatuurgevoelige of natuurlijk voorkomende metastabiele eiwitten als sensoren van de vouwomgeving om eiwitmisvouwing te monitoren. Gedragsanalyses die geassocieerd zijn met het misvouwen van een specifiek eiwit, bieden een eenvoudige en krachtige uitlezing voor eiwitvouwing, waardoor genen en omstandigheden die de vouwing moduleren snel kunnen worden gescreend. Evenzo kan een dergelijk misvouwen worden geassocieerd met eiwitmislokalisatie in de cel. Het monitoren van eiwitlokalisatie kan daarom veranderingen in de cellulaire vouwcapaciteit benadrukken die optreden in verschillende weefsels, in verschillende ontwikkelingsstadia en bij veranderende omstandigheden. Ten slotte kunnen we met behulp van biochemische hulpmiddelen ex vivo de eiwitstabiliteit en -conformatie direct monitoren. Dus door gedragsanalyses, beeldvorming en biochemische technieken te combineren, kunnen we eiwitmisvouwing monitoren met de resolutie van het organisme, de cel en het eiwit, respectievelijk.

Een aangetaste vouwingsomgeving kan leiden tot verkeerde eiwitvouwing en aggregatie. Verkeerde eiwitvouwing is geassocieerd met een gewijzigde conformatie en resulteert in een verlies van eiwitfunctie. Wij maken gebruik van complementaire benaderingen om de eiwitvouwing en -functie te monitoren in intacte dieren, specifieke cellen en eiwitextracten. Een intelligente keuze voor een vouwingssensor, gebaseerd op sterke gedragsmatige en cellulaire fenotypen die geassocieerd zijn met een bekende destabiliserende mutatie, kan ...

Om de relatie tussen eiwithomeostase, stress en veroudering te bestuderen, hebben we veranderingen in eiwitvouwing gemonitord door eiwitdisfunctie, eiwitlocalisatie in de cel en eiwitstabiliteit op organismisch, cellulair en eiwitniveau te volgen, met behulp van de genetisch hanteerbare metazoa Caenorhabditis elegans als modelsysteem.

Gebruik Caenorhabditis elegans Als een modelsysteem voor de Protein Homeostase studeren in een meercellige

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

Het algemene doel van de volgende experimenten in de genetisch hanteerbare metazoan CENO R elegance is om eiwitmisvouwing te bewaken op drie niveaus, het organisme, de cellen en de eiwitten. Gedragsfenotypen zoals beweeglijkheid of temperatuurresistentie, functioneren als uitlezingen van veranderingen in eiwithomeostase op het niveau van het organisme, temperatuurgevoelig, of van nature voorkomend. Metastabiele eiwitten worden gebruikt om eiwitmislokalisatie te volgen, die kan worden geassocieerd met eiwitmisvouwing.Een ex vivo gedeeltelijke verteringstest bewaakt de eiwitstabiliteit direct. Resultaten kunnen veranderingen in de proteostasecapaciteit bij verschillende kweektemperaturen laten zien op basis van de test op thermoresistentie, immunofluorescentiemicroscopie en westerse bloedanalyse. Deze procedures zullen worden gedemonstreerd door afgestudeerde studenten in mijn laboratorium.De gedragstest zal worden gedemonstreerd door ish ido en Shai zal de immunokleuring en ANA flunking demonstreren en sheron zal de gedeeltelijke vertering demonstreren. Dit protocol voor het meten van temperatuurtolerantie gaat vergezeld van voorbereidende stappen voor het synchroniseren van de dieren en een bewegingstest. Beide worden beschreven in de tekst. Begin met het verzamelen van replica's die minimaal 20 gesynchroniseerde dieren bevatten.In 24 goed gespeelde putjes met 450 microliter hitteschokbuffer. Voeg aan elke putje negen microliter cytoxin toe. Breng de plaat nu over naar een verwarmd bad.De hitteschok, temperatuur en duur hangen sterk af van de groeiomstandigheden. In het bijzonder, de kweektemperatuur scoort de overleving van het dier door hun dieopname te monitoren. Met behulp van een fluorescente stereoscoop met een TXR-filter zijn de dieren die de die opnemen dood.Het belangrijkste voordeel van deze techniek van bestaande methoden zoals kine, de tolerantie door handmatige scoring is het gebruik van visuele uitlezing van dierdood, wat dit essay veel sneller en beter reproduceerbaar maakt. In het vereiste stadium, breng minimaal 30 dieren over in een microcentrifugebuisje met M negen buffer. Was de dieren een paar keer met M negen door korte, lage snelheid centrifugatiestapjes uit te voeren en schortel ze op in M negen.Plaats de buisjes vervolgens een paar minuten op ijs om af te koelen. Eenmaal afgekoeld, verwijder het overtollige vocht en incubeer de buisjes. In 500 microliter ijskoud, 4% PARAFORM aldehyde.De incubatietijd moet voor elk onderzochte eiwit worden gekalibreerd en moet ongeveer vijf tot 30 minuten bij kamertemperatuur zijn. Was de gefixeerde dieren vervolgens drie keer met PBS tween bij pH 7.2 door centrifugatie. Centrifugaties worden altijd uitgevoerd bij 3000 RPM gedurende een of twee minuten, tenzij anders gespecificeerd.In de kap, verwijder het meeste supernatant en schortel het pellet op in een milliliter beam mercaptoethanoloplossing. Incubeer vervolgens de dieren gedurende een nacht op 37 graden Celsius met zachtjes wiegen in de kap. Was de dieren vervolgens drie keer met PBST door centrifugatie en Resus.Voltooi de was met 50 tot 100 microliter PBST en verwijder het meeste van deze PBST na nog een centrifugatie. Voeg vervolgens 100 tot 150 microliter collageenaseoplossing toe en incubeer de dieren gedurende een nacht op 37 graden Celsius met sterke agitatie. Gebruik een thermomixer of een schudende incubator.Na vijf minuten, begin met periodiek controleren onder een stereomicroscoop. Wanneer een vijfde van de dieren gebroken is, stop de reactie door de buis op ijs te plaatsen. Deze stap is zeer gevoelig.De duur van de behandeling hangt af van de fixatievoorwaarden en kan sterk variëren tussen stammen. Een langdurige incubatie zou kunnen resulteren in de volledige degradatie van de dieren. De omstandigheden moeten voor elke enzymbatch worden gekalibreerd en de degradatie moet zorgvuldig worden gemonitord.Was vervolgens de dieren twee keer in PBST. Verzamel de dieren door centrifugatie en verwijder het meeste PBST. Voeg vervolgens een milliliter van een BA-oplossing toe gevolgd door incubatie met zachtjes wiegen gedurende een uur bij kamertemperatuur, verzamel de dieren door centrifugatie en schortel ze op in 200 microliter van een b, A.Voeg nu het primaire antilichaam toe en begin met een overnachtelijke incubatie met zachtjes wiegen bij kamertemperatuur.Deze parameters moeten worden gekalibreerd. Was vervolgens de dieren door centrifugatie. Schortel ze op in een milliliter van een b, A en incubeer ze met zachtjes mengen gedurende 15 minuten tot een uur bij kamertemperatuur.Op dit punt kan een optionele toevoeging van fluorescente kleurstof worden toegevoegd. Herhaal vervolgens de was met BA-buffer nog drie keer en voltooi de wassen door Resus te schortel op in 100 microliter van een BA met de juiste fluorescent gelabelde secundaire antilichaam bij een verdunning van één op honderd. Incubeer de monsters met wiebelen gedurende enkele uren bij kamertemperatuur beschermd tegen licht om de secundaire te verwijderen.Voer drie wasbeurten uit met a, b, a. Monteer vervolgens dieren op glazen plaatjes door ze eerst Resus te schortel op in 10 microliter van een b, a en vervolgens een brede buis te gebruiken om een of twee microliter van het monster naar elk plaatje over te brengen, voeg een gelijk volume montagemedium toe en dek het plaatje af. Verzegeld de plaatjes voorzichtig met nagellak.De plaatjes kunnen gedurende langere tijd worden bewaard bij min twintig graden Celsius. Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met dit protocol worstelen omdat het protocol lang is en veel stappen bevat die de efficiëntie ervan kunnen beïnvloeden, waardoor het oplossen van problemen moeilijk wordt. Begin met het verzamelen van de dieren van ongeveer 1560 millimeter platen in een of twee milliliter M negen buffer.De dieren mogen niet overbevolkt zijn. Was de dieren een paar keer met M negen buffer door centrifugatie en opnieuw op te schortel. Na de laatste centrifugatie, schortel de dieren op in 100 microliter M negen buffer.Vries vervolgens de dieren snel in en maal het monster met een gekoeld stampertje en boor op ijs. Pauzeer regelmatig om te controleren of de dieren voldoende zijn vermalen. Zodra de dieren volledig zijn

using-caenorhabditis-elegans-as-model-system-to-study-protein

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Het gemak van het behoud en het uitdragen van de...

Basis-<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Methoden: Synchronisatie-en-

Beschrijven we methoden om aspecten van amylopathies in de worm te...

Een<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Model Systeem voor Amylopathy Study

We beschrijven hier een herziene protocol voor grootschalige kweek van embryonale C. elegans cellen. Embryonale C. elegans cellen gekweekt in vitro gebruik van deze methode, blijken differentiëren en herhalen de expressie van genen in een celspecifieke wijze. Technieken die directe toegang tot de cellen of isolatie van specifieke celtypen van andere weefsels vereisen, kunnen worden toegepast C. elegans gekweekte cellen.

Een methode voor het kweken van embryonale<em&gt; C. elegans</em&gt; Cellen

Hier presenteren we de nematode Caenorhabditis elegans als een veelzijdig hostmodel aan de studie van microbiële interactie.

De Nematode Caenorhabditis Elegans - een veelzijdig In Vivo -Model om te studeren van Host-microbe interacties

Deze studie schetst kwantitatieve metingen van synaptische grootte en lokalisatie, spier morfologie, en mitochondriale vorm in C. elegans met behulp van vrij beschikbare beeldverwerkings hulpmiddelen. Deze aanpak maakt het mogelijk toekomstige studies in C. elegans te kwantificatief vergelijken de omvang van weefsel en organel structurele veranderingen als gevolg van genetische mutaties.

Kwantitatieve benaderingen voor de studie van cellulaire structuren en organelle morfologie in Caenorhabditis elegans

Hier presenteren we een protocol voor eenvoudige isolatie van specifieke groepen van levende neuronale cellen die groen fluorescerende eiwitten uit transgene Caenorhabditis elegans lijnen uitdrukken. Deze methode maakt een verscheidenheid van ex vivo studies gericht op specifieke neuronen en heeft de capaciteit om cellen te isoleren voor verdere korte termijn culturing.

Isolatie van specifieke neuron populaties van Roundworm Caenorhabditis elegans

Hier karakteriseren we cellulaire proteotoxische stressreacties in de nematode C. elegans door het meten van de activering van fluorescerende transcriptieverslaggevers en assaying gevoeligheid voor fysiologische stress.

Metingen van fysiologische stressreacties in C. Elegans

Proteostatische achteruitgang is een kenmerk van veroudering en vergemakkelijkt het begin van neurodegeneratieve ziekten. We schetsen een protocol om proteostase kwantificeerbaar te meten in twee verschillende Caenorhabditis elegans-weefsels door heterologe expressie van polyglutamine-herhalingen gefuseerd met een fluorescerende verslaggever. Dit model maakt een snelle in vivo genetische analyse van proteostase mogelijk.

Kwantificering van weefselspecifieke proteostatische achteruitgang van Caenorhabditis elegans

Hier geven we instructies voor het effectief gebruik van SegElegans, een deep learning-systeem dat we hebben ontwikkeld voor de geautomatiseerde segmentatie van individuele wormen in breedveldmicroscopiebeelden, voor later gebruik in beeldanalysesoftware zoals ImageJ. We bieden manieren om het systeem zowel online als offline te gebruiken.

Geautomatiseerde analyse van C. elegans fluorescentiebeelden met behulp van SegElegans

Vibrio cholerae: modelorganisme Bacteriële Pathogenese Study - Interview

Leer proteostase bestuderen in een meercellig organisme met Caenorhabditis elegans. Gedragsassays en immunofluorescentie onthullen hoe eiwitmisfolding verband houdt met stress en veroudering.

Gebruik Caenorhabditis elegans Als een modelsysteem voor de Protein Homeostase studeren in een meercellige

Meer video's verkennen