Gebruik Caenorhabditis elegans Als een modelsysteem voor de Protein Homeostase studeren in een meercellige

Het algemene doel van de volgende experimenten in de genetisch hanteerbare metazoan CENO R elegance is om eiwitmisvouwing te bewaken op drie niveaus, het organisme, de cellen en de eiwitten. Gedragsfenotypen zoals beweeglijkheid of temperatuurresistentie, functioneren als uitlezingen van veranderingen in eiwithomeostase op het niveau van het organisme, temperatuurgevoelig, of van nature voorkomend. Metastabiele eiwitten worden gebruikt om eiwitmislokalisatie te volgen, die kan worden geassocieerd met eiwitmisvouwing.

Een ex vivo gedeeltelijke verteringstest bewaakt de eiwitstabiliteit direct. Resultaten kunnen veranderingen in de proteostasecapaciteit bij verschillende kweektemperaturen laten zien op basis van de test op thermoresistentie, immunofluorescentiemicroscopie en westerse bloedanalyse. Deze procedures zullen worden gedemonstreerd door afgestudeerde studenten in mijn laboratorium.

De gedragstest zal worden gedemonstreerd door ish ido en Shai zal de immunokleuring en ANA flunking demonstreren en sheron zal de gedeeltelijke vertering demonstreren. Dit protocol voor het meten van temperatuurtolerantie gaat vergezeld van voorbereidende stappen voor het synchroniseren van de dieren en een bewegingstest. Beide worden beschreven in de tekst. Begin met het verzamelen van replica's die minimaal 20 gesynchroniseerde dieren bevatten.

In 24 goed gespeelde putjes met 450 microliter hitteschokbuffer. Voeg aan elke putje negen microliter cytoxin toe. Breng de plaat nu over naar een verwarmd bad.

De hitteschok, temperatuur en duur hangen sterk af van de groeiomstandigheden. In het bijzonder, de kweektemperatuur scoort de overleving van het dier door hun dieopname te monitoren. Met behulp van een fluorescente stereoscoop met een TXR-filter zijn de dieren die de die opnemen dood.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek van bestaande methoden zoals kine, de tolerantie door handmatige scoring is het gebruik van visuele uitlezing van dierdood, wat dit essay veel sneller en beter reproduceerbaar maakt. In het vereiste stadium, breng minimaal 30 dieren over in een microcentrifugebuisje met M negen buffer. Was de dieren een paar keer met M negen door korte, lage snelheid centrifugatiestapjes uit te voeren en schortel ze op in M negen.

Plaats de buisjes vervolgens een paar minuten op ijs om af te koelen. Eenmaal afgekoeld, verwijder het overtollige vocht en incubeer de buisjes. In 500 microliter ijskoud, 4% PARAFORM aldehyde.

De incubatietijd moet voor elk onderzochte eiwit worden gekalibreerd en moet ongeveer vijf tot 30 minuten bij kamertemperatuur zijn. Was de gefixeerde dieren vervolgens drie keer met PBS tween bij pH 7.2 door centrifugatie. Centrifugaties worden altijd uitgevoerd bij 3000 RPM gedurende een of twee minuten, tenzij anders gespecificeerd.

In de kap, verwijder het meeste supernatant en schortel het pellet op in een milliliter beam mercaptoethanoloplossing. Incubeer vervolgens de dieren gedurende een nacht op 37 graden Celsius met zachtjes wiegen in de kap. Was de dieren vervolgens drie keer met PBST door centrifugatie en Resus.

Voltooi de was met 50 tot 100 microliter PBST en verwijder het meeste van deze PBST na nog een centrifugatie. Voeg vervolgens 100 tot 150 microliter collageenaseoplossing toe en incubeer de dieren gedurende een nacht op 37 graden Celsius met sterke agitatie. Gebruik een thermomixer of een schudende incubator.

Na vijf minuten, begin met periodiek controleren onder een stereomicroscoop. Wanneer een vijfde van de dieren gebroken is, stop de reactie door de buis op ijs te plaatsen. Deze stap is zeer gevoelig.

De duur van de behandeling hangt af van de fixatievoorwaarden en kan sterk variëren tussen stammen. Een langdurige incubatie zou kunnen resulteren in de volledige degradatie van de dieren. De omstandigheden moeten voor elke enzymbatch worden gekalibreerd en de degradatie moet zorgvuldig worden gemonitord.

Was vervolgens de dieren twee keer in PBST. Verzamel de dieren door centrifugatie en verwijder het meeste PBST. Voeg vervolgens een milliliter van een BA-oplossing toe gevolgd door incubatie met zachtjes wiegen gedurende een uur bij kamertemperatuur, verzamel de dieren door centrifugatie en schortel ze op in 200 microliter van een b, A.Voeg nu het primaire antilichaam toe en begin met een overnachtelijke incubatie met zachtjes wiegen bij kamertemperatuur.

Deze parameters moeten worden gekalibreerd. Was vervolgens de dieren door centrifugatie. Schortel ze op in een milliliter van een b, A en incubeer ze met zachtjes mengen gedurende 15 minuten tot een uur bij kamertemperatuur.

Op dit punt kan een optionele toevoeging van fluorescente kleurstof worden toegevoegd. Herhaal vervolgens de was met BA-buffer nog drie keer en voltooi de wassen door Resus te schortel op in 100 microliter van een BA met de juiste fluorescent gelabelde secundaire antilichaam bij een verdunning van één op honderd. Incubeer de monsters met wiebelen gedurende enkele uren bij kamertemperatuur beschermd tegen licht om de secundaire te verwijderen.

Voer drie wasbeurten uit met a, b, a. Monteer vervolgens dieren op glazen plaatjes door ze eerst Resus te schortel op in 10 microliter van een b, a en vervolgens een brede buis te gebruiken om een of twee microliter van het monster naar elk plaatje over te brengen, voeg een gelijk volume montagemedium toe en dek het plaatje af. Verzegeld de plaatjes voorzichtig met nagellak.

De plaatjes kunnen gedurende langere tijd worden bewaard bij min twintig graden Celsius. Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met dit protocol worstelen omdat het protocol lang is en veel stappen bevat die de efficiëntie ervan kunnen beïnvloeden, waardoor het oplossen van problemen moeilijk wordt. Begin met het verzamelen van de dieren van ongeveer 1560 millimeter platen in een of twee milliliter M negen buffer.

De dieren mogen niet overbevolkt zijn. Was de dieren een paar keer met M negen buffer door centrifugatie en opnieuw op te schortel. Na de laatste centrifugatie, schortel de dieren op in 100 microliter M negen buffer.

Vries vervolgens de dieren snel in en maal het monster met een gekoeld stampertje en boor op ijs. Pauzeer regelmatig om te controleren of de dieren voldoende zijn vermalen. Zodra de dieren volledig zijn