Name: High Throughput micro-injecties van Sea Urchin Zygotes (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-01-21T21:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 40 s
Description: Leer high-throughput micro-injecties van zee-egel zygoten voor ontwikkelingsbiologisch onderzoek. Deze methode maakt efficiënte levering van RNA en eiwitten mogelijk om genfunctie in embryo’s te bestuderen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij danken Santiago Suarez voor kritische lezing van het manuscript en Betty Cowgill voor de steun in de fotografie. We danken ook de anonieme reviewers voor hun kritische feedback. Dit werk wordt ondersteund door het Fonds voor onderzoek Universiteit van Delaware.

1. Voorbereiding van protaminesulfaat (PS) Coated Gerechten <ol><li> Bereid 1% oplossing van protamine sulfaat (PS) door toevoeging van 0,5 g PS 50 ml gedeïoniseerd, gedestilleerd water (DDH 2 O) in een 50 ml conische buis. Goed schudden op hoge snelheid op een bank shaker bij kamertemperatuur gedurende 1-2 uur tot volledige oplossing van PS waarborgen. Deze oplossing kan worden bewaard bij 4 ° C gedurende ten minste 3 maanden (zorg ervoor om volledig op te lossen gelachtige neerslag voor elk gebruik) 3. </li><li> Neem een ​​koker van 60 mm x 15 mm polystyreen petrischaaltjes en lay-out van beide deksels en bodems op de bank. </li><li> Giet 1% PS oplossing in elke schaal (zowel bodems en deksels kunnen worden) net genoeg om het oppervlak te bedekken, laat ten minste 2 minuten. De overgebleven PS oplossing kan vele malen hergebruikt worden binnen de 3 maanden indien bewaard bij 4 ° C. </li><li> Plaats PS-behandelde gerechten in een bekerglas gevuld met gedestilleerd water (dH 2 O). De beker onder stromend dH 2 O gedurende tenminste10 min.. </li><li> PS-gecoate gerechten kunnen direct of lucht droog worden gebruikt voor opslag. Dek ze af om stofophoping te voorkomen. Ze kunnen worden bewaard bij kamertemperatuur gedurende 1 maand 3. </li></ol> 2. Verkrijgen Sea Urchin gameten en Immobiliseer de eieren op een PS-gecoate Schotel voor Microinjection <ol><li> Spawn zee-egels door schudden of intracoelomic injectie tot 1 ml 0,5% KCl tot contractie van gladde spieren bewegen om gameten 3 (figuur 2) los. </li><li> Als het dier een mannelijk, zoals aangegeven door de witte kleur sperma, verzamel sperma droog van het oppervlak van een dier in een 1,5 ml buis. Droog sperma kan worden opgeslagen bij 4 ° C gedurende een week zonder significant verlies van biologische functie. </li><li> Als het dier een vrouwelijk, zoals aangegeven door de gele kleur door het gehalte aan eigeel, verzamel de gameten door onderdompeling van de gonopores in een beker vol zeewater. De eieren zullen worden vrijgegeven gonopores en settelen door de zwaartekracht. &lt;/ Li&gt; <li> Filter de eieren van puin zoals dierlijke stekels met behulp van 80 micrometer Nylon filter mesh. De beste resultaten worden bereikt als de eieren worden gebruikt binnen 5-7 uur na het kuitschieten. </li><li> Dejelly de eieren: <ol><li> Bereid 100 ml zure zeewater ongeveer 1 ml ei. Gebruik 0,5 M citroenzuur om de pH van het zeewater te passen van pH 8,0 tot 5,1-5,2. Een te lage pH zal bevruchting verminderen en een te hoge pH zal niet toestaan ​​dat eieren te hechten aan de PS-beklede platen. </li><li> Eieren (niet meer dan 1 ml) toe te voegen aan zure zeewater en laat de eieren om zich te vestigen op ijs gedurende 10 minuten. Als alternatief kan de verwijdering van de gelei coat worden vergemakkelijkt door voorzichtig zwenken van de eieren tijdens de behandeling. Men kan effectief dejelly S. purpuratus eieren in 3-4 min. op deze manier. </li><li> Giet voorzichtig zuur zeewater, voeg vers zeewater en laat de eieren af ​​te wikkelen weer op ijs naar beneden. Dejellied eieren kunnen worden opgeslagen op ijs gedurende maximaal 6 uur zonder bevruchting problemen </li></ol></li&gt; </ol> 3. Rij de eieren <ol><li> Bereid 1 M voorraadoplossing van 3-aminotriazool (3-AT, MW = 84,08) door het oplossen van 0,84 g 3-AT in 10 ml DDH 2 O. Deze oplossing kan worden bewaard bij 4 ° C tot 6 maanden. </li><li> Bereid 1 mM werkoplossing van 3-AT door toevoeging van 50 ui 1 M voorraadoplossing met 50 ml voorgekoeld zeewater. Bewaar de oplossing op ijs. </li><li> Bereid mond pipet (figuur 3) voor een zachte behandeling van de eieren: <ol><li> Pipet wordt handmatig getrokken uit glas micropipetten (100 x OD 1.09 mm). Houd de micropipet met beide handen boven het open vuur. Aangezien het glas begint te smelten, zorgvuldig de uiteinden van de pipet trekken in tegengestelde richtingen. </li><li> Sluit de ene trok pipet een plastic buis (ID 1,14 mm), verzegelen strak met Parafilm. De lengte van de buis moet ongeveer 50-70 cm. </li><li> Plaats een steriel gefiltreerd P20 of P200 tip aan het einde van de buis tegenover de glazen buis teworden gebruikt als het mondstuk. </li><li> Klem het uiteinde van de glazen micropipet met een schaar om de diameter van de tip passen. De optimale diameter enigszins groter dan de diameter van het ei (80 urn). </li></ol></li><li> Giet 4 ml van 1 mM 3-AT zeewater in elke PS-gecoate schaal (bodem of deksel). </li><li> Neem de mond pipet, zet de P20/P200 tip in de mond en zet hem vast met de tanden. Om eieren te zuigen, eerst zuigen een kleine hoeveelheid zeewater. Door het hebben van een kolom van de vloeistof alvorens het laden van de eieren, zal een maximale controle over de mond pipetteertechniek hebben. </li><li> Plaats de micropipet tip in de buurt van de eieren en Zuig voorzichtig in verscheidene honderden eieren in de pipet. Beperk de eieren in het glas micropipet. </li><li> Rij dejellied eieren in een rechte lijn op een schotel door hen waait zachtjes uit de mond pipet terwijl u de tip in een rechte lijn. Rij de eieren vlak voor de injectie, omdat bevruchting problemen kunnen optreden als gevolg van prolonged blootstelling aan 3-AT zeewater 3. Bovendien kunnen kationische hechtmiddelen zoals PS giftig eieren, en is het niet raadzaam om embryo bloot deze reagentia langdurig, vooral als de bevruchting enveloppen zijn verwijderd. </li><li> Maak een kras op de schotel in de buurt van de lijn van geroeid eieren met behulp van een glazen pipet. Deze scratch zal belangrijk zijn om de injectienaald te breken om de stroom van de oplossing aan te passen als dat nodig is. Als alternatief kan de kras worden gemaakt voor het storten 3-AT zeewater aan het gerecht. </li></ol> 4. Micro-injectie van de Sea Urchin Zygotes <ol><li> Zet micro-injectie station. Hier beschrijven we het gebruik van FemtoJet injectiesysteem. </li><li> Trek injectie haarvaten behulp van een naald trekker. Een voorbeeld van een goede naald is afgebeeld in figuur 4. Opmerking: Voor RNA-injecties, moet de injectie haarvaten worden voorbehandeld om RNAase besmetting 31 te voorkomen: <ol><li> Plaats injectie haarvaten in 50 ml conischebuizen en voeg 50 ml gefiltreerde methanol / HCl (9:1). Schud goed en laat het een nacht om niet langer dan 10 uur. </li><li> Giet het methanol / HCl en spoel de haarvaten 2x met gefilterd methanol in dezelfde buis. </li><li> Tap methanol zoveel mogelijk lyofiliseren de haarvaten nachts tot volledige verwijdering van methanol garanderen. </li></ol></li><li> Monteer voorzichtig de naald capillair op een naald laad-houder en laad het met &lt;0,5 ul van een monster oplossing met microloader tips. Monsteroplossingen bevatten gewoonlijk 20% glycerol, afhankelijk van het geïnjecteerde materiaal 3. </li><li> Zet de schaal met roeide eieren op de microscoop podium (eieren moeten verticaal worden uitgelijnd wanneer bekeken door ooglenzen) en focus op de eieren. </li><li> Monteer voorzichtig de geladen naald op de naald microinjecting houder en pas de positie van de naald om een ​​haarscherpe tip hebben in het midden van het veld. </li><li> Druk op de knop om de maximale druk fo toepassingr naald schoonmaken. Oplossing moet uit de naald komen. Stel de druk indien nodig: injectiedruk moet in het bereik van 90-360 hPa, de compensatie druk bij ongeveer 1/3 van de injectiedruk. </li><li> Pas de oplossing stroom door het injecteren in onbevruchte eicel. Met een joystick micromanipulator, richt de punt van de injectienaald aan de onbevruchte eicel. Om naald binnenkomen, het creëren van een lichte beving door zachtjes te tikken van het podium met een hard voorwerp, zoals een schroevendraaier. Een injectie bolus die in het ei moet worden gezien (figuur 5). </li><li> Als de injectie bolus niet zichtbaar is, lichtjes verhogen de punt van de naald boven de eieren, zoek de kras op de schotel en stel deze in het midden van het veld worden geplaatst. Tik voorzichtig de naald om de kras aan de punt van de injectienaald breken. Pas de injectie en compensatie druk dat de bolus injectie niet meer dan 1/5 tHij diameter van het ei (1-2 uur). </li><li> Zodra de injectie bolus is gekalibreerd, bevruchten de eieren door het toevoegen van verdund sperma (1:1000) of 1-2 ul van sperma. Meng goed zorgvuldig om te voorkomen dat loskomen van de rij van eieren. </li><li> Start injecties direct na de bevruchting envelop zichtbaar (figuur 5) wordt. Bewegen langs de lijn van roeiden eieren met behulp van het podium controller en injecteren zoveel zygoten mogelijk door prikken ze met de naald gecontroleerd door joystick micromanipulator. </li><li> Na 10-15 minuten, zal de bevruchte eitjes gehard worden en kan niet langer worden geïnjecteerd. Haal de schotel uit het podium en zorgvuldig aspireren uit sperma in 3-AT zeewater met behulp van een plastic Pasteur pipet. </li><li> Laat de zygotes droog. Voeg snel vers voorgekoeld zeewater om de schotel te dekken. Incubeer de embryo&#39;s bij 15 ° C. </li></ol>

<ol><li>Muramatsu, T., Mizutani, Y., Ohmori, Y., Okumura, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+three+nonviral+transfection+methods+for+foreign+gene+expression+in+early+chicken+embryos+in+ovo%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">Comparison of three nonviral transfection methods for foreign gene expression in early chicken embryos in ovo.</a> Biochem. Biophys.Res. Commun. 230, 376-380 (1997).</li>
<li>Peng, H., Wu, Y. Y., Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+Delivery+of+DNA+and+Morpholinos+into+Mouse+Preimplantation+Embryos+by+Electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">Efficient Delivery of DNA and Morpholinos into Mouse Preimplantation Embryos by Electroporation.</a> Plos One. 7, 13 (2012).</li>
<li>Ettensohn, C. A., Wray, G. A., Wessel, G. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aEttensohn%2C+CA+%22eds.+Development+of+sea+urchins%2C+ascidians%2C+and+other+invertebrate+deuterostomes%3A+experimental+approaches%22">eds. Development of sea urchins, ascidians, and other invertebrate deuterostomes: experimental approaches</a>. 74, Elsevier Academic Press. (2004).</li>
<li>Franks, R. R., Houghevans, B. R., Britten, R. J., Davidson, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+introduction+of+cloned+DNA+into+the+sea+urchin+zygote+nucleus%2C+and+fate+of+injected+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Direct introduction of cloned DNA into the sea urchin zygote nucleus, and fate of injected DNA.</a> Development. 102, 287-299 (1988).</li>
<li>Kinsey, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+signaling+pathways+in+zebrafish+development+by+microinjection%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Analysis of signaling pathways in zebrafish development by microinjection.</a> Methods Mol. Biol. 518, 67-76 (2009).</li>
<li>Kola, I., Sumarsono, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microinjection+of+in+vitro+transcribed+RNA+and+antisense+oligonucleotides+in+mouse+oocytes+and+early+embryos+to+study+the+gain-+and+loss-of-function+of+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Microinjection of in vitro transcribed RNA and antisense oligonucleotides in mouse oocytes and early embryos to study the gain- and loss-of-function of genes.</a> Mol. Biotechnol. 6, 191-199 (1996).</li>
<li>Mishina, T., Fuchimukai, K., Igarashi, K., Tashiro, K., Shiokawa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modification+of+secondary+head-forming+activity+of+microinjected+a+dagger+beta-catenin+mRNA+by+co-injected+spermine+and+spermidine+in+Xenopus+early+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Amino+Acids%22%5BJournal%5D)">Modification of secondary head-forming activity of microinjected a dagger beta-catenin mRNA by co-injected spermine and spermidine in Xenopus early embryos.</a> Amino Acids. 42, 791-801 (2012).</li>
<li>O'Meara, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+silencing+in+bovine+zygotes%3A+siRNA+transfection+versus+microinjection%5BTitle%5D)+AND+%22Reprod.+Fertil.+Dev%22%5BJournal%5D)">Gene silencing in bovine zygotes: siRNA transfection versus microinjection.</a> Reprod. Fertil. Dev. 23, 534-543 (2011).</li>
<li>Dean, D. A., Gasiorowski, J. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonviral+gene+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Nonviral gene delivery.</a> Cold Spring Harb. Protoc. , (2011).</li>
<li>Hiramoto, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+division+without+mitotic+apparatus+in+sea+urchin+eggs%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Cell division without mitotic apparatus in sea urchin eggs.</a> Exp. Cell Res. 11, 630-636 (1956).</li>
<li>Wilson, L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWilson%2C+L+%22Methods+in+Cell+Biology%22">Methods in Cell Biology</a>. 25, Elsevier. (1982).</li>
<li>Gross, J. M., McClay, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+Brachyury+%28T%29+during+gastrulation+movements+in+the+sea+urchin+Lytechinus+variegatus%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">The role of Brachyury (T) during gastrulation movements in the sea urchin Lytechinus variegatus.</a> Dev. Biol. 239, 132-147 (2001).</li>
<li>Yajima M, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autonomy+in+specification+of+primordial+germ+cells+and+their+passive+translocation+in+the+sea+urchin%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Autonomy in specification of primordial germ cells and their passive translocation in the sea urchin.</a> Development. 139, 3786-3794 (2012).</li>
<li>Duboc, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nodal+and+BMP2%2F4+pattern+the+mesoderm+and+endoderm+during+development+of+the+sea+urchin+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Nodal and BMP2/4 pattern the mesoderm and endoderm during development of the sea urchin embryo.</a> Development. 137, 223-235 (2010).</li>
<li>Ernst, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Offerings+from+an+Urchin%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Offerings from an Urchin.</a> Dev. Biol. 358, 285-294 (2011).</li>
<li>McClay, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolutionary+crossroads+in+developmental+biology%3A+sea+urchins%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Evolutionary crossroads in developmental biology: sea urchins.</a> Development. 138, 2639-2648 (2011).</li>
<li>Sodergren, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Research+article+-+The+genome+of+the+sea+urchin+Strongylocentrotus+purpuratus%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Research article - The genome of the sea urchin Strongylocentrotus purpuratus.</a> Science. 314, 941-952 (2006).</li>
<li>Roux, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+functional+genomic+and+proteomic+perspective+of+sea+urchin+calcium+signaling+and+egg+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">A functional genomic and proteomic perspective of sea urchin calcium signaling and egg activation.</a> Dev. Biol. 300, 416-433 (2006).</li>
<li>Turner, P. R., Sheetz, M. P., Jaffe, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fertilization+increases+the+polyphosphoinositide+content+of+sea+urchin+eggs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Fertilization increases the polyphosphoinositide content of sea urchin eggs.</a> Nature. 310, 414-415 (1984).</li>
<li>Voronina, E., Marzluff, W. F., Wessel, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclin+B+synthesis+is+required+for+sea+urchin+oocyte+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Cyclin B synthesis is required for sea urchin oocyte maturation.</a> Dev. Biol. 256, 258-275 (2003).</li>
<li>Wong, J. L., Wessel, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+matrix+modifications+at+fertilization%3A+regulation+of+dityrosine+crosslinking+by+transamidation%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Extracellular matrix modifications at fertilization: regulation of dityrosine crosslinking by transamidation.</a> Development. 136, 1835-1847 (2009).</li>
<li>Shuster, C. B., Burgess, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transitions+regulating+the+timing+of+cytokinesis+in+embryonic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Transitions regulating the timing of cytokinesis in embryonic cells.</a> Curr. Biol. 12, 854-858 (2002).</li>
<li>Morris, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+cytoskeletal+and+motility+proteins+in+the+sea+urchin+genome+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Analysis of cytoskeletal and motility proteins in the sea urchin genome assembly.</a> Dev. Biol. 300, 219-237 (2006).</li>
<li>Minc, N., Burgess, D., Chang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+Cell+Geometry+on+Division-Plane+Positioning%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Influence of Cell Geometry on Division-Plane Positioning.</a> Cell. 144, 414-426 (2011).</li>
<li>Davidson, E. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genomic+regulatory+network+for+development%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A genomic regulatory network for development.</a> Science. 295, 1669-1678 (2002).</li>
<li>Oliveri, P., Tu, Q., Davidson, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+regulatory+logic+for+specification+of+an+embryonic+cell+lineage%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Global regulatory logic for specification of an embryonic cell lineage.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 5955-5962 (2008).</li>
<li>Peter, I. S., Davidson, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+gene+regulatory+network+controlling+the+embryonic+specification+of+endoderm%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A gene regulatory network controlling the embryonic specification of endoderm.</a> Nature. 474, (2011).</li>
<li>Nam, J. M., Dong, P., Tarpine, R., Istrail, S., Davidson, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+cis-regulatory+genomics+for+systems+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Functional cis-regulatory genomics for systems biology.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 3930-3935 (2010).</li>
<li>Showman, R. M., Foerder, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Removal+of+the+fertilization+membrane+of+sea-urchin+embryos+employing+aminotriazole%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Removal of the fertilization membrane of sea-urchin embryos employing aminotriazole.</a> Exp. Cell Res. 120, 253-255 (1979).</li>
<li>Lepage, T., Sardet, C., Gache, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+expression+of+the+hatching+enzyme+gene+in+the+sea-urchin+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Spatial expression of the hatching enzyme gene in the sea-urchin embryo.</a> Dev. Biol. 150, 23-32 (1992).</li>
<li>Jaffe, L. A., Terasaki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+microinjection+of+oocytes%2C+eggs%2C+and+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Development+of+Sea+Urchins%2C+Ascidians%2C+and+Other+Invertebrate+Deuterostomes%3A+Experimental+Approaches%22%5BJournal%5D)">Quantitative microinjection of oocytes, eggs, and embryos.</a> Development of Sea Urchins, Ascidians, and Other Invertebrate Deuterostomes: Experimental Approaches. 74, 219-242 (2004).</li>
</ol>

De auteurs verklaren geen concurrerende financiële belangen of andere belangenconflicten.

Microinjectie is een krachtige techniek voor het leveren van verschillende behandelingen zoals DNA, mRNA, recombinante eiwitten, functieverlies en overexpressie-reagentia, kleurstoffen en combinaties in eieren, embryo&#39;s en cellen van verschillende organismen 1-7. Er moet echter een aantal overwegingen in gedachten worden gehouden bij het ontwerpen van een micro-injectie experiment. Het is uiterst belangrijk om de oplosbaarheid van de geleverde behandeling en het injectievolume...

Efficiënte en reproduceerbare behandeling levering is een van de belangrijkste methodologische uitdagingen voor onderzoekers. Verscheidene methoden zijn vastgesteld om behandelingsoplossingen tijdelijk te leveren in de eieren, embryo&#39;s en cellen. Deze methoden omvatten elektroporatie (gebaseerd op het genereren van tijdelijke poriën in het membraan met behulp van korte elektrische pulsen) 1,2, lipofectie (leverbaar door de fusie van behandeling met liposomen met het membraan) 1, bombardement met microdeeltjes 1 (DNA wordt geprecipiteerd op het micron -sized metalen deeltjes die vervolgens worden gebruikt om de cellen bij hoge snelheid doordringen) en transductie (virus wordt gebruikt als transportmiddel van transgenen). Momenteel, micro-injectie is de enige benadering die het voordeel biedt dat iedere oplossing met 100% rendement met minimale reagentia bezit. Bovendien kan een enkele injectie oplossing bestaat uit een complexe cocktail van behandelingen. Deze techniek is gebruikt om succesvollely microinject de eieren en embryo&#39;s uit tal van soorten, zoals zee-egels 3,4, zebravis 5, 6 muis, kikker 7, en runderen 8, alsmede enkele cellen in het weefsel cultuur 9. Single blastomeren injecties in latere ontwikkelingsstadia zijn ook uitgevoerd 10-12. De huidige werkwijzen voor micro-injecties zijn gebaseerd op de druk-injectiemethode de aanvankelijk beschreven door Hiramoto 10, maar heeft grote vooruitgang geboekt optimalisatie van dit proces. Uitstekende micro-injectie technieken zijn elders 11 beschreven, en hier beschrijven we een van de specifieke methoden die momenteel gebruikt wordt om zee-egel (Strongylocentrotus purpuratus) nieuw bevruchte eieren microinject. Al meer dan een eeuw, hebben zee-egels een waardevol experimenteel model 15,16 geweest. Zee-egels zijn evolutionair nauw verwant aan chordates (waaronder wij) en analyse vanhun genoom onthulde dat ze alle belangrijke gen families als de menselijke 17 bevatten. Ze produceren een groot aantal synchroon ontwikkelen transparante embryo dat gemakkelijk kan worden gemanipuleerd. Het gebruik van zee-egel als modelorganisme, heeft de zee-egel gemeenschap bijgedragen aan ons begrip van de bevruchting proces 18-21, celbiologische processen 22-24, en het gen regulerende netwerken (GRNs) 25-28. Micro-injectie in zee-egel zygotes vereist een aantal stappen. Ten eerste moeten de eieren worden geïmmobiliseerd voor injecties (hieronder beschreven). Micro-injectie gerechten worden bekleed met protamine sulfaat (PS), dat een positief geladen oppervlak waarop de negatief geladen eieren kan hechten 3 ontstaat. De eieren worden dejellied door incubatie in zure zeewater (pH 5.15) gedurende 10 minuten, gevolgd door twee wassingen in natuurlijk zeewater of kunstmatig zeewater (pH 8,0). De dejellied eieren worden zorgvuldig geroeid in een rechte lijnin het midden van PS-gecoate schaal in aanwezigheid van 1 mM 3-aminotriazool (3-AT), die nodig is om de activiteit van ovoperoxidase dat wordt afgescheiden uit de corticale korrels van het ei als gevolg van bevruchting remmen 29. Deze stap is belangrijk om verharding van de bevruchting envelop voorkomen en micro-injectie naald toetreding bewerkstelligen. Als alternatief voor 1 mM 3-AT, kan 10 mM paraminobenzoic zuur (PABA) worden gebruikt. De injectie-oplossing wordt in een micro-injectie naald met behulp van gespecialiseerde microloading pipettip geladen en gemonteerd op een houder bevestigd aan micromanipulator en druk unit (figuur 1). Elke naald kan worden gebruikt om individuele zygoten microinject in meerdere experimenten op verschillende dagen. Micro-injectie kan worden uitgevoerd gedurende 10-15 min tot de zygoten harden. De zygoten worden vervolgens met het zeewater en gekweekte gewassen bij 15 ° C. Wanneer het embryo bereiken uitkomen blastula stadium, geven ze uitbroeden enzym dat onderdelen van de fer verteerttilization envelop 30 en hen in staat stellen om op natuurlijke wijze los te maken van de PS-gecoate schaal. Indien nodig kan de embryo voorzichtig worden losgemaakt van de schaal met een mond pipet of Pasteur pipet zachtjes blazen zeewater op het embryo. De beschreven werkwijze maakt een efficiënte en betrouwbare micro-injectie van 100-400 bevruchte eieren op een schotel, die een high-throughput werkwijze voor downstream analyses.

<table><tbody><tr><td>Glass Pasteur pipettes</td><td>VWR</td><td>14673-043</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Inverted microscope&nbsp; Axiovert 40 &deg;C</td><td>Zeiss</td><td>4109431007990000</td><td>Injectiemicroscoop</td></tr><tr><td>Microloader tips</td><td>Eppendorf</td><td>5242 956.003</td><td>Injectieoplossing laden</td></tr><tr><td>Nylon filter mesh 80&nbsp;&mu;m</td><td>Amazon.com</td><td>03-80-37</td><td>Eieren filteren om puin te verwijderen</td></tr><tr><td>P20 of P200 Aerosol Barrier Pipette Tips</td><td>Fisher Scientific</td><td>02707432 of 02707430</td><td>Onderdeel van een mondpijp</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Fisher Scientific</td><td>13 374 12</td><td>Onderdeel van een mondpijp</td></tr><tr><td>Polyethyleen buis</td><td>Intramedic</td><td>PE-160</td><td>Onderdeel van een mondpijp</td></tr><tr><td>Protamine sulfaat</td><td>MP Biomedicals, LLC</td><td>194729</td><td>Ontkalkte eieren aan injectiekommen bevestigen</td></tr><tr><td>Zee-egels S. purpuratus</td><td>Pt. Loma Marine Invertebrate Lab</td><td>N/A</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Zeewater</td><td>elke dierenwinkel</td><td>Instant Ocean</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Steriele 60 mm x 15 mm polystyreen petrischaal</td><td>Fisher Scientific</td><td>0875713A</td><td>Injectiekommen</td></tr><tr><td>Drie-as grove positionering micromanipulator MMN-1</td><td>Narishige</td><td>9124</td><td>Injectienaald manipuleren</td></tr><tr><td>Drie-as joystick type oliehydraulische fijne micromanipulator MMO-202ND</td><td>Narishige</td><td>9212</td><td>Injectienaald manipuleren</td></tr><tr><td>Transfer pipettes</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-711-9AM</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Verticale&nbsp; naaldtrekker&nbsp;</td><td>Narishige</td><td>PC-10</td><td>Injectienaalden trekken</td></tr></tbody></table>

high throughput micro-injecties van sea urchin zygotes

High Throughput Microinjections of Sea Urchin Zygotes

Micro-injectie in cellen en embryo is een veelgebruikte techniek die wordt gebruikt om een ​​groot aantal biologische processen te bestuderen. Bij deze werkwijze wordt een kleine hoeveelheid behandelingsoplossing in een micro-injectie naald die wordt gebruikt fysiek afzonderlijke injecteren geïmmobiliseerde cellen of embryo geladen. Ondanks de behoefte aan initiatieopleiding deze procedure voor high-throughput levering, microinjectie biedt maximale efficiëntie en reproduceerbare levering van een breed scala van behandelende oplossingen (waaronder complexe mengsels van monsters) in cellen, eicellen of embryo&#39;s. Toepassingen op micro-injecties bevatten aflevering van DNA-constructen, mRNA, recombinante eiwitten, gain of function, en functieverlies reagentia. Fluorescente of colorimetrische kleurstof wordt toegevoegd aan de geïnjecteerde oplossing directe visualisatie van efficiënte levering en een instrument voor betrouwbare normalisatie van de hoeveelheid van de geleverde oplossing mogelijk. De beschreven methode maakt micro-injectie van 100-400 zee-egel zygotes binnen 10-15 minuten.

GFP en mCherry reporter constructen werden in vitro getranscribeerd en micro-injectie in de bevruchte eieren. Embryo&#39;s werden geïncubeerd bij 15 ° C gedurende 24 uur (tot het blastula stadium) en afgebeeld met Zeiss Observer Z1 microscoop. Injectie van reporter constructen leidde niet tot enige defecten in de ontwikkeling (Figuur 6). Voor de kwantificering van fluorescerende signalen, werd beeldaanwinst uitgevoerd bij een lage vergroting (100X) maximaal te vangen fluorescerende pixels <stro...

Microinjectie is een veelgebruikte techniek gebruikt om DNA constructen mRNA, morfolino antisense oligonucleotiden of andere behandelingen te leveren in eieren, embryo&#39;s en cellen van verschillende soorten.

High Throughput micro-injecties van Sea Urchin Zygotes

Microinjection into cells and embryos is a common technique that is used to study a wide range of biological processes. In this method a small amount of ...

Het algemene doel van deze procedure is om micro-injecties met hoge doorvoer van zee-egels-zygoten uit te voeren. Om dit te doen wordt er een kuitwerping geïnduceerd bij de zee-egels en worden mannelijke en vrouwelijke gameten verzameld. De eieren worden vervolgens gezuiverd met behulp van zuur zeewater en geïmmobiliseerd in een rij op petrischalen.Sperma wordt vervolgens toegevoegd aan de eieren om ze te bevruchten en micro-injectie van de gewenste Mr.N.A verlies van functie, reagentia of eiwitten wordt uitgevoerd na micro-injectie. De drie A T water bevattende sperma worden vervangen door vers zeewater. Deze embryo's kunnen worden onderzocht op hun morfologie en de temporele en ruimtelijke expressie van specifiek RNA en eiwitten.Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden zoals elektroporatie, lip perfectie, microdeeltjes, bombardement en transductie, is dat het de levering van elke oplossing met 100% efficiëntie mogelijk maakt met behulp van minimale reagentia. Deze methode maakt efficiënte en betrouwbare micro-injectie van 100 tot 400 x mogelijk op een enkele schotel van duizenden X per experiment, wat een hoogdoorvoermethode biedt voor downstream-analyse. Voordat u dit experiment uitvoert, bereidt u alle benodigde stockoplossingen en apparatuur voor.Zie het bijbehorende document voor recepten, een mondpijp is nodig voor het voorzichtig hanteren van de eieren. Om een ​​glas micropipet voor te bereiden, houdt u deze met beide handen boven een open vlam terwijl het glas begint te smelten, trekt u voorzichtig de uiteinden van de pipet in tegengestelde richtingen tot de pipet in twee delen uiteenvalt. Verbind vervolgens één getrokken pipet met plastic buis van 50 tot 70 centimeter lang.Breng paraform aan om een strakke afdichting te creëren. Plaats een steriele P 20 of P 200 gefilterde tip in het andere uiteinde van de buis voor gebruik als mondstuk, knip ten slotte het uiteinde van de glasmicropipet af met een schaar om de diameter van de tip aan te passen, de optimale diameter zal iets groter zijn dan de diameter van het ei, dat ongeveer 80 micrometer is. Bereid vervolgens protaminesulfaat gecoate schalen voor.Leg 20 60 millimeter bij 15 millimeter polystyreen petrischalen op de werktafel en verwijder de schaaldeksels. Deze zullen ook worden gebruikt als schalen om 1% protaminesulfaat oplossing, hierna PS-oplossing genoemd, in elke schaal te gieten. Voeg net genoeg toe om het oppervlak te bedekken en incubeer gedurende ten minste twee minuten na de incubatie.Verwijder de PS-oplossing en bewaar deze voor later gebruik. De overgebleven PS-oplossing kan vele malen worden hergebruikt binnen drie maanden wanneer deze bij vier graden Celsius wordt bewaard. Plaats de PS-behandelde schalen in een beker gevuld met gedistilleerd water.Plaats vervolgens de beker onder stromend gedistilleerd water gedurende ten minste 10 minuten. De PS-gecoate schalen kunnen onmiddellijk worden gebruikt of worden gedroogd voor opslag. Bedek ze om stofophoping te voorkomen.Ze kunnen maximaal één maand op kamertemperatuur worden bewaard. Gebruik een naaldtrekker om injectiecapillairen te maken. De instellingen van de naaldtrekker moeten empirisch worden bepaald zoals vermeld in het manuscript.Om een zee-egel te laten kuiten, verwijdert u een dier uit het aquarium met een net en plaatst u het op een papieren handdoek. Pak vervolgens het dier op en houd het stevig vast. Schud het.Alternatief, voer een emmic-injectie uit zoals hieronder beschreven. Nadat u een dier uit het aquarium hebt verwijderd, houdt u het dier in één hand en gebruikt u een 20 gauge naald verbonden met een 10 milliliter spuit om één milliliter 0,5 molair kaliumchloride in het perial-membraan te injecteren, het enige zachte deel van het dier. Na een tot 10 minuten zal het geslacht van het dier duidelijk worden.Mannelijke exemplaren beginnen witte sperma vrij te laten en vrouwelijke exemplaren beginnen geel eieren vrij te laten. Als het dier mannelijk is, verzamelt u het sperma droog van het oppervlak van het dier met behulp van een pipet om het over te brengen naar een 1,5 milliliter buis. Droog sperma kan gedurende een week worden bewaard bij vier graden Celsius zonder significant verlies van biologische functie.Als het dier vrouwelijk is, dompelt u de gno-poriën onder in een beker gevuld met zeewater om de ga-mensen te verzamelen. De eieren die vrijkomen uit de gno-poriën zullen zich door de zwaartekracht neerzetten. Na het kuiten filtert u de eieren van puin zoals dierlijke stekels door het zeewater dat de eieren bevat te gieten.Door een 80 micron nylon filtergaas in een schone beker op ijs. Om de eieren te deje, brengt u maximaal één milliliter eieren over naar 100 milliliter zuur zeewater in een plastic beker, draait u de eieren voorzichtig en laat u ze 10 minuten op ijs bezinken. Na de behandeling giet u het zure zeewater voorzichtig af.Voeg vervolgens vers zeewater toe en laat de eieren op ijs bezinken. Opnieuw. De dejelled-eieren kunnen maximaal zes uur op ijs worden bewaard zonder dat de bevruchting wordt beïnvloed. Direct voordat u micro-injecties uitvoert, giet u drie tot vier milliliter van één millimolair, drie a TC water in elke PS-gecoate schaal.De X moeten allemaal zijn voordat de injectie wordt gehospitaliseerd. Er kan een probleem ontstaan ​​bij verlengde blootstelling aan drie 80 c water of ionische lijmen, zoals proteïnesulfaat, dat toxisch kan zijn voor de X. De blootstellingstijd moet daarom worden beperkt, vooral als het bevruchte dier is verwijderd. Zet de punt van de mondpijp vast met de tanden en zuig een kleine hoeveelheid zeewater op. Dit zal de controle over de eieren verhogen wanneer ze worden afgezogen.Positioneer vervolgens de punt van de micropijp dichtbij de eieren en zuig voorzichtig enkele honderden eieren op, waarbij ze binnen de glasmicropijp worden opgesloten. Vervolgens, terwijl u de punt in een rechte lijn beweegt, bla

high-throughput-microinjections-of-sea-urchin-zygotes

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Micro-injectie is een gevestigde en effectieve methode voor het introduceren van vreemde stoffen in bevruchte zebravis embryo's. Hier tonen we een robuuste micro-injectie techniek voor het uitvoeren van mRNA overexpressie en morfolino oligonucleotide-gen knock-down studies in de zebravis.

Micro-injectie van mRNA en morfolino antisense oligonucleotiden in zebravis embryo&#39;s.

Deze video laat zien hoe morfolino of mRNA kan worden geïnjecteerd in zebravis embryo's in het een-cellig stadium te verlagen of te verhogen van het niveau van specifieke gen-producten tijdens de verdere ontwikkeling.

Micro-injectie van de zebravis embryo&#39;s Gene functie analyseren

We tonen onze aanpak voor het vinden van potentiële enhancer elementen uit de op ontwikkelingsgebied gereguleerde genen en evalueren van hun functie door middel van mozaïek zebravis transgenese.

Mozaïek zebravis Transgenese voor het evalueren van Enhancer Sequences

Deze video beschrijft een techniek van Embryo microinjection om verbindingen in Zebrafish dooierzak te leveren.

Embryo Microinjection: Een techniek om een verbinding in de Zebrafish Yolk te leveren

Source: Shi, J., et al., Screening and Identification of RNA Silencing Suppressors from Secreted Effectors of Plant Pathogens. J. Vis. Exp. (2020)This video demonstrates the procedure for preparing an Agrobacterium tumefaciens culture by inducing virulence gene expression with acetosyringone, followed by antibiotic removal through washing and resuspension, to generate a transformation-ready suspension for gene delivery into plant tissues.

Microinjection of Bacteria into the Caudal Vein of Zebrafish Embryos

Methoden die morphant embryo's zijn essentieel voor ontwikkelingsstoornissen mechanismen en gen-regulatorische netwerken te bestuderen. De zee ster Patiria miniata is een opkomende modelsysteem voor deze studies. Hier presenteren we een protocol voor het verkrijgen van gameten, producerende culturen van embryo's, en snelle micro-injectie van zygoten van deze soort.

Een methode voor micro-injectie van Patiria Minata Zygotes

Live volgen van individuele WT retinale voorlopers in verschillende genetische achtergronden maakt voor de beoordeling van de bijdrage van de cel niet-zelfstandige signalering tijdens de neurogenese. Hier, een combinatie van gen knockdown, chimeer generatie via embryo transplantatie en in vivo time-lapse confocale beeldvorming werd gebruikt voor dit doel.

In vivo beeldvorming van transgene Gene Expression Individuele retinale voorouders in chimère zebravis embryo&#39;s to Cell Nonautonomous Invloeden Studie

Microinjection van zebravis embryo's en larven is een essentieel maar uitdagende techniek gebruikt in vele zebrafish modellen. Hier presenteren we een scala van microscale instrumenten om te helpen bij de stabilisatie en de oriëntatie van de zebravis voor zowel microinjection en beeldbewerking.

Microstructured apparaten voor geoptimaliseerde Microinjection en beeldvorming van zebravis larven

Hier presenteren we een protocol om de intracellulaire mechanische eigenschappen van geïsoleerde embryonale zebraviscellen in driedimensionale opsluiting te onderzoeken met directe krachtmeting door een optische val.

Directe krachtmetingen van subcellulaire mechanica in opsluiting met behulp van optische pincetten

Om te modelleren hoe ontstekingssignalen de neuroontwikkeling beïnvloeden bij genetisch gevoelige organismen, presenteren we een protocol voor het microinjecteren van IL-6 in het kanaal van Cuvier (de algemene kardinaalader) van zebravislarven, waardoor gecontroleerde inductie van ontsteking en beoordeling van de ontwikkelingsimpact in de context van tubereuze sclerosecomplex (TSC) mogelijk is.

Micro-injectie van interleukine-6 in de bloedbaan van TSC-zebravislarven om neuropsychiatrische aandoeningsachtige gedragingen te bestuderen

Leer high-throughput micro-injecties van zee-egel zygoten voor ontwikkelingsbiologisch onderzoek. Deze methode maakt efficiënte levering van RNA en eiwitten mogelijk om genfunctie in embryo’s te bestuderen.

High Throughput micro-injecties van Sea Urchin Zygotes

Meer video's verkennen