FtsZ polymerisatie Testen: Eenvoudige Protocollen en overwegingen

Het algemene doel van het volgende experiment is om geschikte omstandigheden te bepalen om FTSZ, polymerisatie en activiteit te bestuderen met behulp van eenvoudige tests en apparatuur. Dit wordt bereikt door FDSC-polymeersedimentatietests uit te voeren onder verschillende omstandigheden om geschikte omstandigheden te vinden waarbij FDSZ polymeriseert. Als tweede stap voeren we lichtverstrooiingstests uit om FDSZ-polymerisatie in real time te bestuderen.

Vervolgens voeren we GTP-hydrolysetests uit om de polymerisatie-geassocieerde g gtpa-activiteit van FT SC te bepalen. Er worden resultaten verkregen die laten zien welke omstandigheden het meest geschikt zijn voor de studie van FTSC van een specifieke bacteriële bron op basis van sedimentatie, lichtverstrooiing en GTP-hydrolyse. De hier getoonde technieken zijn gemakkelijk uit te voeren in elk laboratorium en zullen een snel idee geven van de polymerisatiecapaciteiten van specifieke FT a z. We ontdekken dat de keuze van de juiste buffer vooral belangrijk is bij het werken met FTAZ in aanwezigheid van andere eiwitten die aantonen dat de techniek EVA crawl zal zijn, een afgestudeerde student uit mijn laboratorium.

Om te beginnen voegt u vijf microliter 100 millimolair magnesiumchloride en 12 micromolair van de bacteriële eiwitten, FDSC en/of SEP F toe aan een van de gekozen polymerisatiebuffers die verschillende pH-waarden en samenstellingen hebben zoals beschreven in het bijbehorende tekstprotocol. Plaats vervolgens de buisjes in een incubator met een schudfunctie en incubeer de monsters gedurende twee minuten bij 30 graden Celsius en 300 RPM. Zodra de buisjes grondig zijn gemengd, begint u met polymerisatie door één microliter van een GTP- of GDP-mengsel toe te voegen uit een 100 millimolair voorraadoplossing, zodat de uiteindelijke concentratie twee millimolair is.

Plaats vervolgens de monsters terug in de schudende incubator voor een extra 20 minuten. Spin vervolgens de buisjes bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten bij 20.000 RPM met behulp van een TLA 55 rotor of een gelijkwaardige 24.600 Gs als u iets anders gebruikt. Zodra de centrifuge klaar is, brengt u de supernatanten over in schone buisjes en bewaart u de pellets voor later.

Neem 20 microliter van de overgebrachte supernatanten en meng ze in een aparte buis met 20 microliter twee keer geconcentreerde monsterbuffer. Zet de doppen vast en kook de monsters gedurende 10 minuten bij 98 graden Celsius. Voeg vervolgens 50 microliter twee keer geconcentreerde monsterbuffer toe aan elk pelletfractie dat eerder is achtergelaten en suspendeer de polymeren door de monsters gedurende 10 minuten bij 98 graden Celsius te koken.

Zodra de monsters klaar zijn met koken, voegt u een extra 50 microliter gedemineraliseerd water toe aan de buisjes met de pellets. Laad vervolgens 10 microliter van zowel de supernatanten als de pellets van elk monster zij aan zij op een 10%SDS-paginagel en laat de gel draaien bij 150 volt. Zodra de gel klaar is, verwijdert u de gel en kleur hem met kumasi briljant blauw G twee 50.

Beeld vervolgens de gel af en kwantificeer het eiwit met behulp van cytometrie zoals beschreven in het bijbehorende tekstprotocol. Schakel eerst een fluorescente spectrometer in en laat de lamp enkele minuten opwarmen om thermische schommelingen te voorkomen. Schakel ook een circu lerende waterbad in en stel de watertemperatuur in op 30 graden Celsius om de vete-kamer op een constante temperatuur te houden.

Terwijl het systeem opwarmt, definieert u de werkparameters van de spectrometer. Stel de detectorhoge spanning in op 300 volt en de emissie- en excitatiegolflengten op 350 nanometer met een spleetbreedte van vier nanometer. Programmeer vervolgens het gegevensverwervingsprotocol door een tijdgebaseerde verwerving te kiezen met een duur van 3.600 seconden.

Reinig voorzichtig een 200 microliter fluorescentie vete met een padlengte van een centimeter door deze vijf minuten in een reinigingsoplossing in een waterbad te laten zitten. Bereid vervolgens 294 microliters van een mastermix voor elk van de negen polymerisatiebuffers beschreven in het bijbehorende tekstprotocol, elk met 10 millimolair magnesiumchloride en 12 micromolair FDSE als de uiteindelijke concentraties berekend voor 300 microliter. Vortxx de mengsels kort en breng 196 microliter van de eerste polymerisatiebuffer over naar de vet.

Plaats het in de spectrometer en incubeer gedurende twee minuten om de temperatuur van het monster op 30 graden Celsius te brengen. Begin na twee minuten met de gegevensverwerving en wacht 90 seconden om te verifiëren dat het signaal stabiel is. Voeg vervolgens vier microliter 100 millimolair GTP of GDP toe.

Meng het monster en ga door met gegevensverwerving gedurende een volledige uur. Herhaal deze stappen voor elke buffer die wordt vermeld. Bereid 1,5 milliliter twee millimolair GTP in een gekozen polymerisatiebuffer voor.

Bereid ook een fosfaatstandaardverdunning voor in het bereik van nul tot 40 micromolair in dezelfde buffer. Bereid vervolgens malachietgroen werkreagens voor zoals beschreven in het bioassayskit. Maak vervolgens vier mastermixes met een totaal volume van elk 360 microliters. Mastermix één bevat FDSZ afgeleid van B subtilis en mastermix twee bevat FDSE afgeleid van e coli.

Mastermixes drie en vier worden gebruikt als controles en bevatten EDTA in plaats van magnesiumchloride. Pipet vervolgens 20 microliter aliquots van de mastermixes en fosfaatstandaarden. In A-Q-P-C-R 96-wellplaat zodat er 16 wells zijn voor elke mastermix en de fosfaatstandaarden gerangschikt zoals hier getoond.

Pipet 180 microliter twee millimolair GTP-voorraadoplossing naar de laatste rij van de plaat. Plaats vervolgens de plaat in een PCR-machine. Voer een programma uit met een enkele cyclus ingesteld op 30 graden Celsius gedurende 40 minuten.

Pipet in een tweede 96-wellplaat 20 microliter aliquots van het malachietgroene werkreagens in putjes, A een tot H 10. Voeg vervolgens 60 microliter van de polymerisatiebuffer uit het experiment toe aan claims A een tot H acht