Name: FtsZ polymerisatie Testen: Eenvoudige Protocollen en overwegingen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 4 s
Description: Leer FtsZ-polymerisatie testen voor microbiologisch onderzoek met sedimentatie- en lichtverstrooiingsassays. Deze protocollen helpen onderzoekers optimale buffercondities bepalen voor bacteriële celdeling.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Het werk in ons laboratorium wordt gefinancierd door een VIDI-subsidie van de Nederlandse Organisatie voor Wetenschappelijk Onderzoek (aan DJS). 
We danken Marc Stuart en de afdeling Elektronenmicroscopie aan onze universiteit, voor hun hulp en het verlenen van toegang tot de transmissie-elektronenmicroscoop.

FtsZ gelabeld eiwitten werden gezuiverd zoals eerder beschreven 11,15, gedialyseerd tegen 20 mM Tris / HCl (pH 7,9), 50 mM KCl, 1 mM EGTA, 2,5 mM MgAc en 10% glycerol en bewaard bij -80 ° C. Onder deze omstandigheden kan het eiwit worden bewaard dan 2 jaar zonder significant verlies van activiteit. Het eiwit moet worden bewaard in 100 ul aliquots ontdooien en bevriezen van het monster te voorkomen. Na ontdooien kan het monster bij 4 ° C worden bewaard maximaal een week. FtsZ oplosbaar is bij hoge concentraties en kan op 7-10 mg / ml worden opgeslagen. Het is belangrijk om de eiwitconcentratie hoog te houden om ongewenste effecten van opslagbuffer componenten in latere experimenten voorkomen. Daarom moet opslagconcentratie zorgen voor een verdunning FtsZ ten minste 10x glycerol concentratie lager dan 1% te brengen en de concentratie van de andere componenten van de dialyse buffer in het reactiemengsel minimaliseren. FtsZ polymerisatie kan ook worden beïnvloed door de aanwezigheid van hoge natrium 9 </sup&gt; of imidazol concentraties dus deze componenten dient te worden verwijderd uit de polymerisatie buffer. SepF werd gezuiverd zoals beschreven 7 en opgeslagen in elutiebuffer bij -80 ° C. Alternatieve gepubliceerde procedures voor zuivering van FtsZ van E. coli en B. subtilis en verwijzingen naar de procedures voor zuivering van FtsZ vanuit verschillende bronnen zijn samengevat in Tabel 1 (zie representatieve resultaten sectie). 1. Monstervoorbereiding <ol><li> Bereid polymerisatie buffers: <table border="1"><tbody><tr><td> 1 </td><td> 50 mM Hepes / NaOH, pH 7,5 </td></tr><tr><td> 2 </td><td> 25 mM PIPES / NaOH, pH 6,8 </td></tr><tr><td> 3 </td><td> 50 mM MES / NaOH, pH 6,5 </td></tr><tr><td> 4 </td><td> 50 mM Hepes / NaOH, pH 7,5, 50 mM KCl </td></tr><tr><td> 5 </td><td> 25 mM PIPES / NaOH, pH 6,8, 50 mM KCl </td></tr><tr><td> 6 </td><td> 50 mm MES / NaOH, pH 6,5, 50 mM KCl </td></tr><tr><td> 7 </td><td> 50 mM Hepes / NaOH, pH 7,5, 300 mM KCl </td></tr><tr><td> 8 </td><td> 25 mM PIPES / NaOH, pH 6,8, 300 mM KCl </td></tr><tr><td> 9 </td><td> 50 mM MES / NaOH, pH 6,5, 300 mM KCl </td></tr></tbody></table></li><li> Filter steriliseren alle buffers met behulp van een 22 micrometer membraan filter. </li><li> Bereid 100 mM GTP, BBP en MgCl2 voorraad oplossingen in elk polymerisatie buffer uit (1). </li><li> Preclear de eiwitten door spinnen bij 100.000 xg gedurende 20 min bij 4 ° C voor alle experimenten. </li></ol> 2. FtsZ Sedimentatie Assay <ol><li> Bereid het reactiemengsel door toevoeging van MgCl2 en FtsZ een van de polymerisatie buffers (zie monstervoorbereiding punt 1) in buizen geschikt centrifugatie bij hoge snelheid. Totale hoeveelheid moet 49 pi zijn met MgCl2 bij 10 mM en FtsZ bij 12 uM in 50 pl eindvolume. </li><li> Pkant de buis in een incubator onder schudden functie, incubeer gedurende 2 min bij 30 ° C bij 300 rpm (alternatief kan het monster worden voorzichtig aangetikt en kort microfuge gevolgd door voorverwarmen bij 30 ° C). </li><li> Begin polymerisatie door toevoeging van 1 pi van GTP of BBP voorraadoplossing in dezelfde buffer zoals gebruikt in het experiment (eindconcentratie van 2 mM). Incubeer gedurende 10 min of 2 (bij buffers met 50 mM KCl en 300 mM KCl, respectievelijk) bij 30 ° C bij 300 rpm (of in een incubator met schudden functie). </li><li> Breng de buizen een ultracentrifuge rotor en spin beneden voor 10 min bij 350.000 xg (89.700 rpm gedurende TLA 120.1 rotor) bij 25 ° C. </li><li> Na het spinnen, voorzichtig de buizen uit de rotor en onmiddellijk Breng de bovenste in een schone buis. Bereid monsters voor SDS-PAGE door het toevoegen van 20 pl supernatant aan 20 ui 2x monsterbuffer. Kook gedurende 10 minuten bij 98 ° C. </li><li> Voeg 50 ul van 2x monsterbuffer de pellet fractie bevattende FtsZ polymeren. Plaats de ultracentrifuge buis in een 2 ml buis. Resuspendeer de pellet door koken gedurende 10 minuten bij 98 ° C, voeg 50 pl gedemineraliseerd H2O het monster dezelfde 2x verdunning de supernatant monster maken. </li><li> Draai de ultracentrifuge buis ondersteboven in de 2 ml buis en spin down gedurende 5 minuten in een Eppendorf centrifuge bij 18.000 x g. Verwijder de ultracentrifuge buis van de 2 ml buis. </li><li> Belasting 10 pi van elke supernatant en pellet monster naast elkaar op een 10% SDS-PAGE gel. Voer de gel bij 150 V. </li><li> Vlekken op de gel met Coomassie Brilliant Blue G-250 en bewaar ze voor kwantificering. </li></ol> 3. FtsZ Sedimentatie Assay bij Slow Spin <ol><li> Bereid polymerisatie oplossing zoals in stap 2, voeg SepF en / of FtsZ (eindconcentratie 12 uM). Deze experimenten kunnen worden uitgevoerd in Beckman disposable 1,5 ml buizen in combinatie met een TLA-55 rotor. </li><li> Plaats de buis in een incubator met schudden functies en incubeer gedurende 2 min bij 30 ° C bij 300 rpm. </li><li> Begin polymerisatie door de toevoeging van 1 pi van GTP of BBP van een voorraadoplossing (eindconcentratie 2 mM), incubeer gedurende 20 minuten bij 30 ° C bij 300 rpm. </li><li> Spin down gedurende 15 min bij 24.600 xg (20.000 rpm voor TLA 55 rotor) bij 25 ° C. </li><li> Verwijder de bovenstaande vloeistof en breng in een schone buis worden 20 ul en breng in 20 ui 2x monsterbuffer. Kook gedurende 10 minuten bij 98 ° C. </li><li> Voeg 50 ul van 2x monsterbuffer om fractie pellet bevattende polymeren en resuspendeer door koken gedurende 10 minuten bij 98 ° C, voeg 50 pl gedemineraliseerd H2O </li><li> Belasting 10 pi van elke supernatant en pellet monster naast elkaar op een 10% SDS-PAGE gel. Voer de gel bij 150 V. </li><li> Vlekken op de gel met Coomassie Brilliant Blue G-250 en bewaar ze voor kwantificering. </li></ol> 4. Kwantificering van de FtsZ Sedimentatie Testen <ol><li> Maak een foto van de Coomassie stained gel met behulp van een gel-documentatiesysteem (bv. LAS-4000, Fujifilm). </li><li> Open het imago van de gel in een programma geschikt is voor densitometrische analyse van gels (bv. AIDA beeldanalysator programma (RAYTEST)) en beschrijf analyse in dit programma hieronder. </li><li> Klik op de &quot;Evaluatie&quot; knop in de werkbalk. </li><li> Selecteer de &quot;2D Densitometrie&quot; uit de lijst en klik op OK. </li><li> In het hoofdmenu, klik op &quot;Evaluatie&quot; en kies de &quot;Regio Bepaling&quot; entry. </li><li> Om een ​​regio op de gel maken, klikt u op het symbool van Auto-contour gereedschap in de regio Bepaling toolbox. </li><li> Klik in de linkerbovenhoek van het eiwit band op de gel, houd de muisknop ingedrukt en sleep het naar de gewenste rechter einde van de band en laat de muisknop los. </li><li> Mark elk FtsZ / SepF band op dezelfde manier. </li><li> Alle informatie over de evaluatie van de toegewezen regio&#39;s vindt u in de regio Report. Om de Regio verkrijgenn Report, klik op de &quot;Show regio Report&quot; knop in de regio Bepaling toolbox. </li><li> Om het rapport te exporteren, in het hoofdmenu, klik op Bestand en kies &quot;Exporteren à 2D Regio Report&quot; entry. </li><li> In de regio verslag, moet de intensiteit van ieder geschapen regio te vinden. Bereken het percentage eiwit (FtsZ, regulerend eiwit) in de pellet met de intensiteitswaarden van het verslag. </li></ol> 5. 90 ° lichtverstrooiing <ol><li> Zet een fluorescentie spectrometer (bijv. AMINCO-Bowman Series 2), zodat de lamp op te warmen gedurende enkele minuten om de thermische schommelingen te vermijden en zet een circulerend waterbad om de cuvet kamer temperatuur op 30 ° C te houden </li><li> Definieer de operationele parameters van de spectrometer: detector hoge spanning 300 V, emissie en excitatie golflengte: 350 nm, spleetbreedte: 4 nm. Merk op dat veel spectrometers het signaal automatisch aanpassen aan het begin van een experiment om een ​​certain percentage (bijvoorbeeld 60%) van de maximale. Dit veroorzaakt een scatter signaal om te gaan buiten bereik zodra GTP wordt toegevoegd aan polymeriseren FtsZ. Het is verstandig om eerst de juiste signaalversterking-detector hoogspanning-voor maximale polymerisatie tot stand brengen voordat het starten van een reeks experimenten. </li><li> Programmeer een data-acquisitie protocol. Kies op tijd gebaseerde overname, met een looptijd van 3600 sec. </li><li> Zorgvuldig schoonmaken een fluorescentie cuvet met water en ethanol, eventueel-ultrasone trillingen in een waterbad bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten. In dit protocol werden cuvetten met een weglengte van 1 cm en een volume van 200 ul gebruikt en opgeslagen opslagoplossing (0,5-1% Hellmanex). Als alternatief kan eenmalig gebruik UV-compatibel plastic cuvetten (UVette, Eppendorf) worden gebruikt. </li><li> Bereid 294 ul van een master mix van de polymerisatie buffer (zie monstervoorbereiding punt 1) met 10 mM MgCl2 en 12 uM FtsZ als uiteindelijke concentratie berekend voor 300 ul, en vortex. </li><li> Breng 196 pi van de polymerisatie buffer om de cuvet en plaats deze in spectrometer. Incubeer gedurende 2 minuten bij 30 ° C. </li><li> Start de data-acquisitie en wacht 90 seconden om te controleren of het signaal stabiel is. </li><li> Voeg 4 pi van 100 mM GTP of BNP (eindconcentratie 2 mM) tot een uiteindelijk reactievolume van 200 ul bereiken pipet op en neer met een groter volume pipet te mengen en opnieuw acquisitie. </li></ol> 6. Transmissie Elektronen Microscopie <ol><li> Bereid monsters voor de FtsZ sedimentatie assay (het volume kan worden verminderd tot 10 ui eindvolume materiaal slaan). </li><li> Na de incubatietijd dien 2 pl van het monster in een gloed ontladen 400 mesh met koolstof beklede koperen rooster, incubeer gedurende 15 sec. </li><li> Dep het net droog door voorzichtig aan te raken of te slepen het net parallel of loodrecht op een stuk filtreerpapier. </li><li> Vlekken op het rooster met 4 ui van een 2% uranyl-acetaat oplossing. Blot het net droog als beschreven in stap 6.3. </li><li> Bekijk het rooster in een Philips CM120 elektronenmicroscoop werkend bij 120 kV bij 39.200 X vergroting. </li></ol> 7. GTP hydrolyse Assay De opzet van het experiment is ontworpen zodanig dat GTP hydrolyse van FtsZ wordt na verscheidene reactietijden door mengen van het reactiemengsel met malachietgroen. Zo tijde van de kleurontwikkeling malachietgroen is hetzelfde voor elk monster. <ol><li> Bereid 1,5 ml 2 mM GTP in een van de polymerisatie buffers (zie monstervoorbereiding, punt 1). Bereid een 0-40 uM fosfaat standaard oplossing in een polymerisatie buffer en bereid malachietgroen be reagens zoals beschreven in de POMG-25H (bioassays) kit. Als alternatief kan de actieve reagentia worden bereid in eigen huis volgens de protocollen beschreven door Lanzetta et al.. 16 </li><li> Bereid mastermengsels in een totaal volume van 360 pi: <tableborder = &quot;1&quot;&gt; <tbody><tr><td> Ik </td><td> 24 uM FtsZ B, 20 mM MgCl2, polymerisatie buffer </td></tr><tr><td> II </td><td> 12 uM FtsZ Ec, 20 mM MgCl2, polymerisatie buffer </td></tr><tr><td> III (controle 1) </td><td> 24 uM FtsZ B, 2 mM EDTA, polymerisatie buffer </td></tr><tr><td> IV (controle 2) </td><td> 12 uM FtsZ Ec, 2 mM EDTA, polymerisatie buffer </td></tr></tbody></table></li><li> Pipetteer 20 ul aliquots van de mastermengsels, 100 ul fosfaat standaarden en 180 ul 2 mM GTP in een qPCR 96-wells plaat in de volgende volgorde: <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> Een </td><td> B </td><td> C </td><td> D </td><td> E </td><td> F </td><td> G </td><td> H </td></tr><tr><td> 1 </td><td> III </td><td> III </td><td> Ik </td><td> Ik </td><td> IV </td><td> IV </td&gt; <td> II </td><td> II </td></tr><tr><td> 2 </td><td> III </td><td> III </td><td> Ik </td><td> Ik </td><td> IV </td><td> IV </td><td> II </td><td> II </td></tr><tr><td> 3 </td><td> III </td><td> III </td><td> Ik </td><td> Ik </td><td> IV </td><td> IV </td><td> II </td><td> II </td></tr><tr><td> 4 </td><td> III </td><td> III </td><td> Ik </td><td> Ik </td><td> IV </td><td> IV </td><td> II </td><td> II </td></tr><tr><td> 5 </td><td> III </td><td> III </td><td> Ik </td><td> Ik </td><td> IV </td><td> IV </td><td> II </td><td> II </td></tr><tr><td> 6 </td><td> III </td><td> III </td><td> Ik </td><td> Ik </td><td> IV </td><td> IV </td><td> II </td><td> II </td></tr><tr><td> 7 </td><td> III </td><td> III </td><td> Ik </td><td> Ik </td><td> IV </td><td> IV </td><td> II </td><td> II </td> &lt;/ Tr&gt; <tr><td> 8 </td><td> III </td><td> III </td><td> Ik </td><td> Ik </td><td> IV </td><td> IV </td><td> II </td><td> II </td></tr><tr><td> 9 </td><td> PS </td><td> PS </td><td> PS </td><td> PS </td><td> PS </td><td> PS </td><td> PS </td><td> PS </td></tr><tr><td> 10 </td><td> PS </td><td> PS </td><td> PS </td><td> PS </td><td> PS </td><td> PS </td><td> PS </td><td> PS </td></tr><tr><td> 11 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 12 </td><td> GTP </td><td> GTP </td><td> GTP </td><td> GTP </td><td> GTP </td><td> GTP </td><td> GTP </td><td> GTP </td></tr></tbody></table> PS - fosfaat standaard </li><li> Plaats de qPCR plaat in een PCR-machine met de ingesteld op 40 min cyclus bij 30 ° C programma </li><li> Bereid 20 pi aliquots van malachite groene werken reagens in een 96-wells plaat. Voeg 60 ul van de buffer polymerisatie van het experiment lanen 1&#39;-8 &#39;. Het monster wordt verdund 4x vergeleken met de fosfaat-standaard, kunt u overwegen dit feit tijdens de laatste berekeningen. <table border="1" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td></td><td> Een </td><td> B </td><td> C </td><td> D </td><td> E </td><td> F </td><td> G </td><td> H </td></tr><tr><td> 1 &#39; </td><td> III </td><td> III </td><td> Ik </td><td> Ik </td><td> IV </td><td> IV </td><td> II </td><td> II </td></tr><tr><td> 2 &#39; </td><td> III </td><td> III </td><td> Ik </td><td> Ik </td><td> IV </td><td> IV </td><td> II </td><td> II </td></tr><tr><td> 3 &#39; </td><td> III </td><td> III </td><td> Ik </td><td> Ik </td><td> IV </td><td> IV </td><td> II </td><td> II </td></tr><tr><td> 4 &#39; </td> &lt;td&gt; III </td><td> III </td><td> Ik </td><td> Ik </td><td> IV </td><td> IV </td><td> II </td><td> II </td></tr><tr><td> 5 &#39; </td><td> III </td><td> III </td><td> Ik </td><td> Ik </td><td> IV </td><td> IV </td><td> II </td><td> II </td></tr><tr><td> 6 &#39; </td><td> III </td><td> III </td><td> Ik </td><td> Ik </td><td> IV </td><td> IV </td><td> II </td><td> II </td></tr><tr><td> 7 &#39; </td><td> III </td><td> III </td><td> Ik </td><td> Ik </td><td> IV </td><td> IV </td><td> II </td><td> II </td></tr><tr><td> 8 &#39; </td><td> III </td><td> III </td><td> Ik </td><td> Ik </td><td> IV </td><td> IV </td><td> II </td><td> II </td></tr><tr><td> 9 &#39; </td><td> PS </td><td> PS </td><td> PS </td><td> PS </td><td> PS </td><td> PS </td><td> PS </td><td> PS </td></tr><tr><td> 10 &#39; </td><td> PS </td&gt; <td> PS </td><td> PS </td><td> PS </td><td> PS </td><td> PS </td><td> PS </td><td> PS </td></tr></tbody></table></li><li> Voeg 20 ul van GTP naar baan 1, pipet op en neer te mengen, start timer (dit is de starttijd punt voor de 30 min reactie). </li><li> Na 10 min, 30 sec toevoegen GTP naar baan 2, pipet op en neer te mengen (20 min reactie). </li><li> Na 16 min toevoegen GTP naar baan 3, pipet op en neer te mengen (15 min reactie). </li><li> Na 21 min, 30 sec toevoegen GTP naar baan 4, pipet op en neer om te mengen (10 min reactie). </li><li> Na 25 min toevoegen GTP naar baan 5, pipet op en neer te mengen (7 min reactie). </li><li> Na 27 min, 30 sec toevoegen GTP naar baan 6, pipet op en neer te mengen (5 min reactie). </li><li> Na 29 min toevoegen GTP naar baan 7, pipet op en neer te mengen (4 min reactie) .. </li><li> Na 30 min overdracht 20 ul van baan 1 naar baan 1 &#39;, pipet op en neer te mengen (beginpunt van malachietgroen kleur ontwikkeling voor de 30 min reactie). </li><li> Na 30 min, 30 sec overdracht 20 ul van rijstrook 2-2 &#39;, pipet op en neer te mengen (beginpunt van malachietgroen kleur ontwikkeling voor de 20 min reactie). </li><li> Herhaal deze stap voor de lanen 3-7 om de 30 sec. </li><li> Na 33 min, 30 sec voeg 20 ul van GTP naar baan 8, pipet op en neer om te mixen en te dragen 20 pl naar baan 8 &#39;, pipet op en neer te mengen (0 min reactie en starttijd punt voor malachietgroen kleur ontwikkeling voor de reactie). </li><li> Na 34 min toe 80 ul van rijstrook 9-9 &#39;, pipet op en neer te mengen (de starttijd punt voor malachietgroen kleur ontwikkeling voor de fosfaat standaard 1). </li><li> Na 34 min 30 sec overdracht 80 ul van rijstrook 10 tot 10 &#39;, pipet op en neer te mengen (de starttijd punt voor malachietgroen kleur ontwikkeling voor de fosfaat standaard 2). </li><li> Verwijder alle luchtbellen uit de monsters en incubeer de plaat bij kamertemperatuur gedurende nogmaals 25 min30 sec. </li><li> Plaats de plaat in 96-well plaatlezer. </li><li> Na 60 min meten de plaat 10x elke 30 sec bij golflengte 630 nm (malachietgroen kleur ontwikkeling is nu 30 minuten voor de eerste reactie). Elke meting komt overeen met elke tijdstip van stappen 7,6-7,12 en 7,16 en moet apart worden berekend tijdens een data-analyse. </li><li> Bereken het vrije fosfaat in elk monster met behulp van de fosfaat standaardijkkromme. </li><li> Plot de gegevens als fosfaat vrijkomen in de tijd, en bereken de FtsZ GTP hydrolyse activiteit van het lineaire bereik van de curve. </li></ol>

<ol><li>Haydon, D. J., Stokes, N. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+inhibitor+of+FtsZ+with+potent+and+selective+anti-staphylococcal+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">An inhibitor of FtsZ with potent and selective anti-staphylococcal activity.</a> Science. 321 (5896), 1673-1675 (2008).</li>
<li>Adams, D. W., Errington, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+cell+division%3A+assembly%2C+maintenance+and+disassembly+of+the+Z+ring%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Bacterial cell division: assembly, maintenance and disassembly of the Z ring.</a> Nat. Rev. Microbiol. 7 (9), 642-653 (2009).</li>
<li>Erickson, H. P., Anderson, D. E., Osawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FtsZ+in+bacterial+cytokinesis%3A+cytoskeleton+and+force+generator+all+in+one%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol.+Mol.+Biol.+Rev%22%5BJournal%5D)">FtsZ in bacterial cytokinesis: cytoskeleton and force generator all in one.</a> Microbiol. Mol. Biol. Rev. 74 (4), 504-528 (2010).</li>
<li>Li, Z., Trimble, M. J., Brun, Y. V., Jensen, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structure+of+FtsZ+filaments+in+vivo+suggests+a+force-generating+role+in+cell+division%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">The structure of FtsZ filaments in vivo suggests a force-generating role in cell division.</a> EMBO J. 26 (22), 4694-4708 (2007).</li>
<li>Król, E., van Kessel, S. P., van Bezouwen, L. S., Kumar, N., Boekema, E. J., Scheffers, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacillus+subtilis+SepF+binds+to+the+C-terminus+of+FtsZ%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Bacillus subtilis SepF binds to the C-terminus of FtsZ.</a> PLoS One. 7 (8), e43293(2012).</li>
<li>Singh, J. K., Makde, R. D., Kumar, V., Panda, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SepF+increases+the+assembly+and+bundling+of+FtsZ+polymers+and+stabilizes+FtsZ+protofilaments+by+binding+along+its+length%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">SepF increases the assembly and bundling of FtsZ polymers and stabilizes FtsZ protofilaments by binding along its length.</a> J. Biol. Chem. 283 (45), 31116-31124 (2008).</li>
<li>Gündoğdu, M. E., Kawai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large+ring+polymers+align+FtsZ+polymers+for+normal+septum+formation%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Large ring polymers align FtsZ polymers for normal septum formation.</a> EMBO J. 30 (3), 617-626 (2011).</li>
<li>Pacheco-Gomez, R., Roper, D. I., Dafforn, T. R., Rodger, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pH+dependence+of+polymerization+and+bundling+by+the+essential+bacterial+cytoskeletal+protein+FtsZ%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The pH dependence of polymerization and bundling by the essential bacterial cytoskeletal protein FtsZ.</a> PLoS One. 6 (6), e19369(2011).</li>
<li>Mendieta, J., Rico, A. I., Lopez-Vinas, E., Vicente, M., Mingorance, J., Gomez-Puertas, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+functional+model+for+ionic+%28K%28%2B%29%2FNa%28%2B%29%29+and+pH+dependence+of+GTPase+activity+and+polymerization+of+FtsZ%2C+the+prokaryotic+ortholog+of+tubulin%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Structural and functional model for ionic (K(+)/Na(+)) and pH dependence of GTPase activity and polymerization of FtsZ, the prokaryotic ortholog of tubulin.</a> J. Mol. Biol. 390 (1), 17-25 (2009).</li>
<li>Tadros, M., Gonzalez, J. M., Rivas, G., Vicente, M., Mingorance, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+the+Escherichia+coli+cell+division+protein+FtsZ+by+a+low-affinity+interaction+with+monovalent+cations%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Activation of the Escherichia coli cell division protein FtsZ by a low-affinity interaction with monovalent cations.</a> FEBS Lett. 580 (20), 4941-4946 (2006).</li>
<li>Scheffers, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+MinC+on+FtsZ+polymerization+is+pH+dependent+and+can+be+counteracted+by+ZapA%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">The effect of MinC on FtsZ polymerization is pH dependent and can be counteracted by ZapA.</a> FEBS Lett. 582 (17), 2601-2608 (2008).</li>
<li>Mukherjee, A., Lutkenhaus, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+FtsZ+assembly+by+light+scattering+and+determination+of+the+role+of+divalent+metal+cations%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Analysis of FtsZ assembly by light scattering and determination of the role of divalent metal cations.</a> J. Bacteriol. 181 (3), 823-832 (1999).</li>
<li>Chen, Y., Erickson, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+in+vitro+assembly+dynamics+and+subunit+turnover+of+FtsZ+demonstrated+by+fluorescence+resonance+energy+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Rapid in vitro assembly dynamics and subunit turnover of FtsZ demonstrated by fluorescence resonance energy transfer.</a> J. Biol. Chem. 280 (23), 22549-22554 (2005).</li>
<li>Hou, S., Wieczorek, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+Caulobacter+crescentus+FtsZ+protein+using+dynamic+light+scattering%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Characterization of Caulobacter crescentus FtsZ protein using dynamic light scattering.</a> J. Biol. Chem. 287 (28), 23878-23886 (2012).</li>
<li>Mukherjee, A., Lutkenhaus, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+assembly+of+FtsZ+regulated+by+GTP+hydrolysis%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Dynamic assembly of FtsZ regulated by GTP hydrolysis.</a> EMBO J. 17 (2), 462-469 (1998).</li>
<li>Lanzetta, P. A., Alvarez, L. J., Reinach, P. S., Candia, O. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+assay+for+nanomole+amounts+of+inorganic+phosphate%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">An improved assay for nanomole amounts of inorganic phosphate.</a> Anal. Biochem. 100 (1), 95-97 (1979).</li>
<li>Ray, S., Kumar, A., Panda, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GTP+regulates+the+interaction+between+MciZ+and+FtsZ%3A+a+possible+role+of+MciZ+in+bacterial+cell+division%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">GTP regulates the interaction between MciZ and FtsZ: a possible role of MciZ in bacterial cell division.</a> Biochemistry. 52 (2), 392-401 (2013).</li>
<li>Rivas, G., Lopez, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnesium-induced+linear+self-association+of+the+FtsZ+bacterial+cell+division+protein+monomer.+The+primary+steps+for+FtsZ+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Magnesium-induced linear self-association of the FtsZ bacterial cell division protein monomer. The primary steps for FtsZ assembly.</a> J. Biol. Chem. 275 (16), 11740-11749 (2000).</li>
<li>Oliva, M. A., Cordell, S. C., Lowe, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+insights+into+FtsZ+protofilament+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Struct.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Structural insights into FtsZ protofilament formation.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 11 (12), 1243-1250 (2004).</li>
<li>Lowe, J., Amos, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+the+bacterial+cell-division+protein+FtsZ%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of the bacterial cell-division protein FtsZ.</a> Nature. 391 (6663), 203-206 (1998).</li>
<li>Cordell, S. C., Robinson, E. J., Lowe, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+the+SOS+cell+division+inhibitor+SulA+and+in+complex+with+FtsZ%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of the SOS cell division inhibitor SulA and in complex with FtsZ.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100 (13), 7889-7894 (2003).</li>
<li>Chen, Y., Anderson, D. E., Rajagopalan, M., Erickson, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+dynamics+of+Mycobacterium+tuberculosis+FtsZ%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Assembly dynamics of Mycobacterium tuberculosis FtsZ.</a> J. Biol. Chem. 282 (38), 27736-27743 (2007).</li>
<li>White, E. L., Ross, L. J., Reynolds, R. C., Seitz, L. E., Moore, G. D., Borhani, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Slow+polymerization+of+Mycobacterium+tuberculosis+FtsZ%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Slow polymerization of Mycobacterium tuberculosis FtsZ.</a> J. Bacteriol. 182 (14), 4028-4034 (2000).</li>
<li>Oliva, M. A., Trambaiolo, D., Lowe, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+insights+into+the+conformational+variability+of+FtsZ%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Structural insights into the conformational variability of FtsZ.</a> J. Mol. Biol. 373 (5), 1229-1242 (2007).</li>
<li>Thanbichler, M., Shapiro, L. M. ipZ. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((a+spatial+regulator+coordinating+chromosome+segregation+with+cell+division+in+Caulobacter%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">a spatial regulator coordinating chromosome segregation with cell division in Caulobacter.</a> Cell. 126 (1), 147-162 (2006).</li>
<li>Buske, P. J., Levin, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extreme+C+terminus+of+bacterial+cytoskeletal+protein+FtsZ+plays+fundamental+role+in+assembly+independent+of+modulatory+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Extreme C terminus of bacterial cytoskeletal protein FtsZ plays fundamental role in assembly independent of modulatory proteins.</a> J. Biol. Chem. 287 (14), 10945-10957 (2012).</li>
<li>Mukherjee, A., Lutkenhaus, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+FtsZ+assembly+by+light+scattering+and+determination+of+the+role+of+divalent+metal+cations%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Analysis of FtsZ assembly by light scattering and determination of the role of divalent metal cations.</a> J. Bacteriol. 181 (3), 823-832 (1999).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten zijn verklaard.

We beschrijven een reeks methoden die een snelle analyse van FtsZ-activiteit en de interactie ervan met andere eiwitten mogelijk maakt. Lichtverstrooiing, sedimentatie en GTPase-assays evenals elektronenmicroscopie zijn op grote schaal gebruikt om FtsZ-polymerisatie te bestuderen. We hebben enkele verbeteringen aangebracht aan bestaande protocollen, we toonden de invloed van verschillende omstandigheden op FtsZ-assemblage aan, en we stellen controles voor die in FtsZ-studies zouden moeten worden opgenomen.
We introduceren lage snelheid centrifugatie om grote structuren te onderscheiden die worden gevormd door de associatie tussen FtsZ en zijn interacterende eiwitten van FtsZ-polymeren. Deze methode heeft twee voordelen ten opzichte van de standaard sedimentatie-assay. Ten eerste wordt er geen achtergrond gevormd door de FtsZ-polymeren in de pelletfractie omdat ze niet worden afgescheiden bij 24.600 x g. Ten tweede kan de hoeveelheid FtsZ die aanwezig is in de structuur die wordt gevormd met een interacterend eiwit worden berekend vanuit het gel. Twee kritieke stappen in deze methode zijn de incubatietijd en de GTP-concentratie. Het is belangrijk om de grote eiwitstructuur te centrifugeren wanneer deze compleet is, maar voordat deze demonteert wanneer al het GTP is gehydrolyseerd. De beste controle voor deze studie is polymerisatie van FtsZ met GDP. Er is één potentiële beperking van de assay. FtsZ vormt een stabiel complex met SepF, dat gemakkelijk kan worden afgescheiden bij 24.600 x g. Als de sedimentatie met een andere activator of een drug die FtsZ-polymeren bundelingt wordt uitgevoerd, kan het nodig zijn om de assay aan te passen. Dit kan worden gedaan door de incubatietijd te veranderen of de centrifugatiesnelheid te verhogen.
Juiste voorbereiding van het monster is het belangrijkst voor lichtverstrooiingsexperimenten. Eiwitten moeten worden voorafgezuiverd door te centrifugeren en alle buffers moeten worden gefilterd voor gebruik. Als er aggregaten in het monster aanwezig zijn, zullen ze een stabiel signaal verstoren dat wordt verkregen van FtsZ-polymeren. Voor de analyse van de FtsZ-structuren door elektronenmicroscopie is de voorbereiding van een raster de belangrijkste stap. De tijd van monsterincubatie op het raster zal het effect hebben van het produceren van meer of minder gecompacteerde polymeren. Voor bundels van FtsZBs moet de incubatietijd korter zijn dan voor FtsZEc en FtsZBs bij hoge KCl-concentratie. We gebruikten een concentratie van 12 µM voor elk monster om de resultaten te kunnen vergelijken. Voor FtsZBs bij 50 mM KCl moet een lagere FtsZ-concentratie worden gebruikt, aangezien 12 µM resulteerde in een volledige verzadiging van het raster. Dit maakt de polymeren zeer gecompacteerd en moeilijk te detecteren. Minder gecompacteerde polymeren zijn beter te detecteren op EM.
De GTPase-assay is het enige experiment dat wordt gebruikt om de activiteit te bestuderen in plaats van de structuren van FtsZ. Mg2+ is noodzakelijk voor GTP-omzet in FtsZ-polymeren. Dus, in afwezigheid van Mg2+, hydrolyseert FtsZ geen GTP. Daarom is een monster zonder Mg2+ de juiste controle in deze assay, maar kationen van Mg zijn aanwezig in de FtsZ-opslagoplossing. Ze kunnen worden verwijderd door toevoeging van 1 mM EDTA aan het controlemonster. De kritieke stap in deze assay is de incubatietijd. Het is belangrijk om de activiteit van FtsZ na een bepaalde tijd te stoppen. Dit wordt bereikt door het FtsZ-monster over te brengen naar een malachietgroene oplossing in een 96-wells plaat. De ontwikkeling van de malachietgroene kleur is echter een continu proces. Dus de metingen moeten op hetzelfde tijdstip worden genomen voor elk monster. Met behulp van een goed gepland GTP-toevoegprotocol met metingen die elk 30 seconden uit elkaar worden genomen in een vastgestelde volgorde, is het mogelijk om dezelfde incubatie- en monsterverwerkingstijd te verkrijgen voor elk tijdstip. Een andere kritieke stap is het kiezen van de concentratie van het eiwit voor het experiment. In het experiment gebruikten we twee verschillende concentraties voor FtsZEc en FtsZBs. GTP-hydrolyse is veel sneller voor FtsZEc in vergelijking met FtsZBs. De GTPase-activiteit van FtsZEc onder gekozen omstandigheden en bij 12 µM is lineair voor maximaal 5 min en na die tijd plateaus de hydrolysesnelheid. Daarom is het moeilijk om gegevens uit het experiment te interpreteren wanneer het onder deze omstandigheden wordt uitgevoerd. In dit geval moet FtsZEc worden gebruikt bij een lagere concentratie dan FtsZBs om de activiteiten van beide eiwitten te kunnen vergelijken. De GTPase-activiteit van FtsZ's uit verschillende bronnen kan variëren. Dus moet de juiste concentratie worden gekozen. De concentratie voor FtsZ-polymerisatie moet wel boven de kritische concentratie liggen (in het algemeen van 2,5-10 µM). De dynamica van FtsZ-assemblage en demontage is ook belangrijk. Sommige eiwitten vertonen een significante vertraging in polymerisatie na toevoeging van GTP, zoals getoond voor FtsZBs bij 50 mM KCl. Het is nuttig om de lichtverstrooiingsassay uit te voeren vóór de GTPase-assay om de tijd van assemblage en demontage van FtsZ-polymeren te benaderen. Daarna kunnen de incubatietijd en de concentratie van eiwit worden gekozen. Aangezien de gekozen omstandigheden voor FtsZ-polymerisatie cruciaal zijn, is het belangrijk om de juiste pH en KCl-concentratie in elke methode te gebruiken. In dit werk bestudeerden we 9 verschillende buffers met een pH variërend van 6,5-7,5 en KCl-concentraties van 0 M tot 300 mM. We merkten op dat de beste omstandigheid om FtsZ's van B. subtilis en E.coli en hun biologische activiteit te analyseren is bij een pH die dicht bij het fysiologische niveau ligt (7,5) samen met een hoge KCl-concentratie. Bij een hog

De essentiële bacteriële eiwit FtsZ is de best gekarakteriseerde eiwitten van de bacteriële celdeling machines. FtsZ is de prokaryote homoloog van tubuline en polymeriseert in vitro in een GTP-afhankelijke wijze. FtsZ is een zeer aantrekkelijk doelwit voor nieuwe antibiotica vanwege de geconserveerde aard en uniciteit aan bacteriën 1,2. Begin celdeling FtsZ vormt een cytokinetische ring midcell, dat als matrix voor de assemblage van andere celdeling proteïnes. Vorming van de Z-ring is van cruciaal belang voor een correcte lokalisatie van de divisie vlak. De assemblage dynamiek van FtsZ worden gereguleerd door verschillende accessoire eiwitten, zoals (afhankelijk van de bacteriesoort) MinC, SepF, ZapA, UgtP en EzrA 2. FtsZ polymerisatie is intensief bestudeerd in vitro en veel verschillende structuren, waaronder rechte protofilamenten, gebogen protofilamenten, bladen van filamenten, filamentenbundels en pijpen van filamenten des geweestcribed afhankelijk van het samenstel buffer, nucleotide en bijkomende eiwitten opgenomen in de test 3. De architectuur van FtsZ protofilamenten in vivo is nog niet volledig begrepen, hoewel elektronen cryotomography experimenten Caulobacter crescentus suggereren dat de Z-ring is samengesteld uit relatief korte, niet-continue enkele protofilamenten zonder uitgebreide bundeling 4. In vitro, de polymerisatie eigenschappen van FtsZ en de interactie van FtsZ met de eiwitten zijn gevoelig voor de samenstelling van de reactiebuffer. Zo Recent beschreven wij de interactie site SepF de FtsZ C-terminus en toonde dat een FtsZ B Δ16 C-eindstandige afknotting niet langer bindt aan SepF 5. In een eerdere studie over de SepF-FtsZ B interactie, afkappen een soortgelijke FtsZ B Δ16 nog cosedimented met SepF, die suggereerde dat SepF bindt aan een tweede locatie op FtsZ <sup&gt; 6. Het verschil tussen deze studies was de samenstelling van de reactie buffers-bij pH 7.5 was er geen cosedimentation van SepF met de FtsZ afkappen, terwijl bij een pH van 6,5 was er cosedimentation. Gündoğdu et al.. opgemerkt dat SepF niet functioneel en neerslaat bij pH 6,5 7, waaruit blijkt dat de waargenomen cosedimentation bij pH 6,5 wordt waarschijnlijk veroorzaakt door precipitatie van SepF plaats van interactie met de FtsZ B Δ16 C-terminale afgeknotte. De invloed van pH en KCl concentratie op de polymerisatie van FtsZ eerder onderzocht. Polymeren van E. coli FtsZ (FtsZ Ec) bij pH 6,5 zijn langer en overvloediger dan gevormd bij neutrale pH 8,9. Tadros et al.. de polymerisatie van FtsZ Ec bestudeerd in aanwezigheid van monovalente kationen merken dat K + binding wordt gelinkt aan FtsZ Ec polymerisatie en is cruciaal voor FtsZ activiteit 10. De pH is meer critical wanneer de interactie van FtsZ met andere eiwitten bestudeerd, zoals blijkt uit het voorgaande voorbeeld van SepF en de pH afhankelijkheid van het remmende effect van MinC op FtsZ 11. Aangezien zowel pH en zoutconcentratie de interactie van FtsZ invloed kunnen met andere eiwitten, is het belangrijk om de juiste voorwaarden en controles voor de FtsZ polymerisatie studies kiezen. Hier beschrijven we protocollen FtsZ polymerisatie en GTPase activiteit te bestuderen door lichtverstrooiing, elektronenmicroscopie, sedimentatie, en GTPase assays. Rechte hoek lichtverstrooiing is een standaard methode om FtsZ polymerisatie studeren in real time 12. We introduceerden een aantal verbeteringen aan de sedimentatie en GTPase test. We presenteren in detail hoe de monsters voor te bereiden op lichtverstrooiing en elektronenmicroscopie. Verschillende buffers die in de literatuur FtsZ polymerisatie studie werden getest en beschrijven we de beste voorwaarden voor elk experiment. We laten ook zien welke controles moeten wordengeïntroduceerd om de beste gegevens te verkrijgen. Deze methoden maken een snelle studie van FtsZ polymerisatie, activiteit en interactie met andere eiwitten met behulp van eenvoudige methoden en apparatuur die beschikbaar is in de meeste laboratoria. Meer geavanceerde methoden om FtsZ polymerisatie studeren bestaan, maar vaak toegang tot meer gespecialiseerde apparatuur en / of wijzigen van FtsZ met fluorescerende labels 8,13,14 vereisen. De eenvoudige methoden beschreven in dit document worden geïllustreerd aan de hand FtsZ van B. subtilis en E. coli, de meest voorkomende Gram + en Gram-model organismen. De protocollen kunnen worden aangepast aan andere FtsZ eiwit. Gebaseerd op inleidende tests met deze nieuwe FtsZs, kleine veranderingen over tijd, buffer of incubatietemperatuur nodig zijn voor een optimaal resultaat. De hier beschreven experimenten moeten helpen bij het vinden van deze optimale omstandigheden.

<table><tbody><tr><td>GTP</td><td>Roche</td><td>10106399001</td><td>Part 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7</td></tr><tr><td>Thickwall Polycarbonate Tubes</td><td>Beckman Coulter</td><td>343776</td><td>Part 2</td></tr><tr><td>Optima MAX-XP Ultracentrifuge</td><td>Beckman Coulter</td><td>393315</td><td>Part 2, 3</td></tr><tr><td>Polyallomer Tube with Snap-on Cap</td><td>Beckman Coulter</td><td>357448</td><td>Part 3</td></tr><tr><td>AIDA Bio-package, 1D, 2D, FL</td><td>Raytest Isotopenmessger&auml;te GmbH</td><td>15000001</td><td>Part 4</td></tr><tr><td>Luminescence Image Analyzer LAS-4000</td><td>Fujifilm</td><td></td><td>Part 4</td></tr><tr><td>Thermo Spectronic AMINCO-Bowman Luminescence Spectrometer</td><td>Spectronic Instruments</td><td></td><td>Part 5</td></tr><tr><td>Fluorescence Cell</td><td>Hellma Analytics</td><td>105-250-15-40</td><td>Part 5</td></tr><tr><td>Square 400 Mesh, Copper, 100/vial</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>G400-Cu</td><td>Part 6</td></tr><tr><td>CM120 Electron Microscope Operating at 120 kV</td><td>Philips</td><td></td><td>Part 6</td></tr><tr><td>96 ml x 0.2 ml Plate</td><td>BIOplastics</td><td>B70501</td><td>Part 7</td></tr><tr><td>Malachite Green Phosphate Assay Kit</td><td>BioAssay System</td><td>POMG-25H</td><td>Part 7</td></tr><tr><td>PowerWave HT Microplate Spectrophotometer</td><td>BioTek</td><td></td><td>Part 7</td></tr></tbody></table>

ftsz polymerisatie testen: eenvoudige protocollen en overwegingen

FtsZ Polymerization Assays: Simple Protocols and Considerations

Tijdens bacteriële celdeling, het essentiële eiwit FtsZ assembleert in het midden van de cel naar het zogenaamde Z-ring. FtsZ polymeriseert in lange filamenten in aanwezigheid van GTP in vitro, en de polymerisatie wordt geregeld door verscheidene accessoire eiwitten. FtsZ polymerisatie is uitgebreid bestudeerd in vitro middels basistechnieken zoals lichtverstrooiing, sedimentatie, GTP hydrolyse assays en elektronenmicroscopie. Bufferomstandigheden invloed zowel de polymerisatie eigenschappen van FtsZ, en het vermogen van FtsZ om te interageren met regulerende eiwitten. We beschrijven hier protocollen voor FtsZ polymerisatie studies en voorwaarden en controles te valideren met behulp van Escherichia coli en Bacillus subtilis FtsZ als model eiwitten. Een lage snelheid sedimentatie test wordt ingevoerd dat de studie van de interactie van FtsZ maakt met eiwitten die bundelen of buisvormig maken FtsZ polymeren. Een verbeterde GTPase assay protocol wordt beschreven dat het testen mogelijk maaktGTP hydrolyse van de tijd met verschillende omstandigheden in een 96-well plaat opstart, met gestandaardiseerde incubatietijden dat variatie in kleurontwikkeling in de fosfaat detectiereactie schaffen. De voorbereiding van de monsters voor lichtverstrooiing studies en elektronenmicroscopie wordt beschreven. Verscheidene buffers worden gebruikt om geschikte pH en zoutconcentratie voor FtsZ polymerisatie studies stellen. Een hoge concentratie van KCl is het beste voor de meeste experimenten. Onze methoden bieden een uitgangspunt voor de in vitro karakterisatie van FtsZ, niet alleen van E. coli en B. subtilis maar van andere bacterie. Als zodanig kunnen de werkwijzen worden gebruikt voor onderzoek naar de interactie van FtsZ met regulerende proteïnen of het testen van antibacteriële geneesmiddelen die FtsZ polymerisatie kan beïnvloeden.

De zuivering van FtsZ uit verschillende bacteriële bronnen is beschreven in de literatuur en wordt samengevat in Tabel 1.
<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>[Geen brontekst verstrekt. Voer a.u.b. de brontekst in die vertaald moet worden.]</td>
			<td>Methode</td>
			<td>Modificatie</td>
			<td>verkregen opbrengst [mg/L kweek]&gt;</td>
			<td>Referenties</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B. subtilis</td>
			<td>1) Ammoniumsulfaatprecipitatie/ionenuitwisselingschromatografie</td>
			<td>nee</td>
			<td>40</td>
			<td>Dit werk, 11,15</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2) Affiniteitschromatografie</td>
			<td>His-tag</td>
			<td>Niet bepaald</td>
			<td>17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli</td>
			<td>1) Ammoniumsulfaatprecipitatie/ionenuitwisselingschromatografie</td>
			<td>nee</td>
			<td>35</td>
			<td>Dit werk, 11,15</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2) Calciumprecipitatie, ionenuitwisselingschromatografie</td>
			<td>nee</td>
			<td>40</td>
			<td>18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanococcus jannaschii</td>
			<td>1) Affiniteitschromatografie onder denaturerende omstandigheden/refolding/ammoniumsulfaatneerslag/gelfiltratie</td>
			<td>His-tag</td>
			<td>1.3</td>
			<td>19</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2) Affiniteitschromatografie/gelfiltratie</td>
			<td>His-tag</td>
			<td>ND</td>
			<td>20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermotoga maritima</td>
			<td>Ionenuitwisselingschromatografie/gelfiltratie</td>
			<td>nee</td>
			<td>6.7</td>
			<td>19</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pseudomonas aeruginosa</td>
			<td>Affiniteitschromatografie/gelfiltratie</td>
			<td>Strep-tag, His-tag</td>
			<td>ND</td>
			<td>21</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mycobacterium tuberculosis</td>
			<td>1) Affiniteits-/ionenuitwisselingschromatografie</td>
			<td>nee</td>
			<td>Niet Bepaald</td>
			<td>22</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2) Affiniteitschromatografie/gelfiltratie</td>
			<td>nee</td>
			<td>30</td>
			<td>23</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aquifex aeolicus</td>
			<td>Affiniteitschromatografie/gelfiltratie</td>
			<td>His-tag, C-terminale truncatie (331-367)</td>
			<td>ND</td>
			<td>24</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caulobacter crescentus</td>
			<td>Ionenuitwisselingschromatografie/ammoniumsulfaatprecipitatie/gelfiltratie</td>
			<td>nee</td>
			<td>ND</td>
			<td>25</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabel 1. Beschreven FtsZ-zuiveringsprotocollen. ND: niet bepaald.
Sedimentatie van FtsZ-polymeren
Aanvankelijk hebben we twee verschillende snelheden gebruikt om FtsZ-polymeren neer te centrifugeren. We stelden vast dat alleen bij een snelheid van 350.000 x g enkelvoudige polymeren van FtsZEc worden neergecentrifugeerd (Figuur 1), terwijl bij 190.000 x g alleen bundels van FtsZBs aanwezig zijn in de pelletfractie (gegevens niet getoond). Daarom is 350.000 x g gebruikt in onze verdere experimenten. Het percentage gepolymeriseerd FtsZEc en FtsZBs is vergelijkbaar bij 50 mM KCl, hoewel de lichtverstrooiingsexperimenten een veel hoger verstrooiingssignaal voor FtsZBs aan toonden. Dit is te wijten aan de door FtsZBs gevormde bundels, die meer licht verstrooien dan enkelvoudige polymeren van FtsZEc. In het experiment met 300 mM KCl was het niet mogelijk om een grote hoeveelheid FtsZ-polymeren in de pelletfractie te verkrijgen voor zowel FtsZEc als FtsZBs (Figuur 1). Wij schrijven dit toe aan een combinatie van een snelle desassemblage van de FtsZ-structuren en een verminderde bundeling van de filamenten.
Sedimentatie van FtsZ-SepF tubuli
Om de interactie van FtsZ met bepaalde activatoren te analyseren, kunnen sedimentatieproeven worden uitgevoerd bij lagere centrifugatiesnelheden. Bij deze snelheid kunnen alleen grote structuren van FtsZ worden neergeslagen, bijv. de grote tubuli gevormd door SepF-ringen en FtsZBs-filamenten5, of de bundels gevormd door FtsZ en ZapA. We hebben gebruikgemaakt van een lagere centrifugatie (24.600 x g) om de haalbaarheid van deze aanpak aan te tonen voor de tubuli gevormd door FtsZ en SepF. FtsZ werd alleen boven de achtergrondwaarden in het pellet teruggevonden wanneer zowel SepF als GTP in het monster aanwezig waren (Figuur 2), en de aanwezigheid van SepF beïnvloedt de GTPase-activiteit van FtsZ niet7, wat aantoont dat FtsZ volledig actief is in de aanwezigheid van SepF. De specifieke sedimentatie van SepF en FtsZ is ongeveer 45% van het totale SepF en 15% van het totale FtsZ (vergeleken met het materiaal dat sedimenteert wanneer GDP wordt toegevoegd). Dit laat zien dat de SepF-FtsZ-tubuli meer SepF bevatten dan FtsZ. Dit kan komen doordat veel SepF-ringen de FtsZ-SepF-tubuli organiseren5,7. De exacte stoichiometrie van SepF-FtsZ in deze tubuli is niet bekend, maar onze resultaten suggereren dat er meer SepF aanwezig is dan FtsZ.
Polymerisatie- en bundelingseigenschappen van FtsZEc en FtsZBs
Om de polymerisatie-efficiëntie van FtsZBs en FtsZEc in verschillende buffers te karakteriseren, hebben we beide eiwitten geanalyseerd middels lichtverstrooiing onder een hoek van 90°. Bij 50 mM KCl geeft FtsZBs een 20-40 keer hoger lichtverstrooiingssignaal dan FtsZEc, afhankelijk van de pH van de buffer (Figuren 3A en B), wat de resultaten van Buske et al. bevestigt.26 Het verhogen van de KCl-concentratie in de buffer had geen significante invloed op het lichtverstrooiingssignaal van FtsZEc (Figuur 3D), maar het signaal van FtsZBs nam ~80 keer af bij pH 7,5, ~30 keer bij pH 6,8 en ~45 keer bij pH 6,5 in 300 mM KCl (Figuur 3C) vergeleken met buffers met 50 mM KCl (Figuur 3A). De dissociatie van FtsZ-polymeren verloopt sneller bij een hogere KCl-concentratie voor beide eiwitten (Figuren 3C en D). Studies van Pacheco-Gómez et al. tonen aan dat de polymerisatie en bundling van E. coli FtsZ pH-afhankelijk is. Deze auteurs stelden vast dat in een buffer met 50 mM KCl het lichtverstrooiingssignaal van FtsZ-polymerisatie hoger was, en de dissociatie van FtsZ langer duurde bij pH 6,0 vergeleken met pH 7,0 8. Deze resultaten komen niet overeen met onze gegevens van de polymerisatie van FtsZEc bij 50 mM KCl (Figuur 3B), maar er moet worden opgemerkt dat wij drie verschillende buffers hebben gebruikt (HEPES, MES en PIPES), terwijl Pacheco-Gómez et al. alleen MES gebruikten. Bijgevolg beïnvloeden niet alleen de pH, maar ook de buffersamenstelling (ionsterkte) de kinetiek van FtsZ-polymeren bij 50 mM KCl. Echter, bij 300 mM KCl beïnvloedden noch de buffersamenstelling noch de pH de assemblage van FtsZEc op een detecteerbare manier.
Een lichtverstrooiingsexperiment van FtsZBs in buffers zonder KCl was niet mogelijk vanwege neerslag van het eiwit onder deze omstandigheden. Wanneer de concentratie van FtsZBs werd verlaagd naar 3 µM, trad er geen neerslag op. Echter is 3 µM niet de fysiologische concentratie van FtsZ in de cel. In plastic cuvetten sloeg FtsZBs bij 12 µM niet neer bij pH 7.5, maar bij pH 6.8 en 6.5 sloeg FtsZ nog steeds neer in afwezigheid van KCl.
Morfologieën van FtsZ-structuren uit E. coli en B. subtilis
De structuren die door FtsZ werden gevormd, werden geïnspecteerd met TEM. FtsZBs assembleerde tot dicht gecompacteerde polymeren die het gehele raster bedekten in alle buffers bij een laag zoutgehalte (Figuren 4A-C). FtsZEc vormde lange filamenten, kabels en bundels in alle buffers bij een laag zoutgehalte (Figuren 4D-F). De waarneembare hoeveelheid polymeren gevormd door FtsZEc was echter lager dan de hoeveelheid gevormd door FtsZBs. In buffers met een hoog zoutgehalte vormde FtsZBs langere enkelstrengse protofilamenten die niet associeerden tot bundels (Figuren 4G-I). Terwijl de protofilamenten van FtsZBs van structuur veranderden bij een hogere zoutconcentratie, vormde FtsZEc structuren die niet te onderscheiden waren van die in buffer met een laag zoutgehalte (Figuren 4J-L). Er was geen waarneembare pH-invloed op de polymerisatie van FtsZEc, maar FtsZBs vormt meer bundels bij pH 6,5, die zichtbaar zijn als dicht gecompacteerde polymeren en vellen (Figuur 4B). Deze resultaten zijn in overeenstemming met onze lichtverstrooiingsexperimenten en eerder gepubliceerde TEM-studies8,11,26.
De GTPase-activiteit van FtsZ bij hoge en lage KCl-concentraties
De GTP-hydrolyseactiviteit van FtsZ werd onder verschillende omstandigheden gemeten met behulp van een colorimetrische assay voor vrij fosfaat. Zoals eerder gerapporteerd15 nam de GTPase-activiteit van FtsZ toe bij een stijgende KCl-concentratie: afhankelijk van de gebruikte buffer vertoonde FtsZBs een 3-7 voudige toename, en FtsZEc een 1,5-2,5 voudige toename in GTPase-activiteit bij 300 mM KCl vergeleken met 50 mM KCl. De verminderde GTPase-activiteit bij 50 mM KCl is te wijten aan bundling van FtsZBs-filamenten. Bij 50 mM KCl had FtsZEc een 3-6 maal hogere GTPase-activiteit dan FtsZBs vanwege een snellere demontage van de FtsZEc-polymeren. Het verschil in GTP-hydrolyseactiviteit tussen FtsZBs en FtsZEc was verminderd bij 300 mM KCl, mogelijk door een verminderde bundling van FtsZBs-filamenten (Figuur 5).
<img alt="FtsZ-polymerisatie, % pellet-analyse, staafdiagram, gelelektroforese, GTP/GDP-effectvergelijking." fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50844/50844fig1.jpg" width="600px" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figuur 1"> 
Figuur 1. Kwantificering van FtsZ-polymerisatie door sedimentatie. (A) 12 µM FtsZ werd gepolymeriseerd in de aanwezigheid van 2 mM GTP of GDP bij pH 7,5 (zwarte staven), 6,8 (grijze staven) of 6,5 (witte staven). De hoeveelheid neergeslagen eiwit werd bepaald door densitometrische analyse van met Coomassie gekleurde gels. GDP diende als controle voor specifieke sedimentatie en het percentage van het met GDP gesedimenteerde FtsZ werd afgetrokken van het percentage van het met GTP gesedimenteerde FtsZ om de in de grafiek uitgezette waarden te verkrijgen. Links: FtsZ gesedimenteerd bij 50 mM KCl, rechts: FtsZ gesedimenteerd bij 300 mM KCl. (B) Representatieve resultaten van met Coomassie gekleurde gels. Polymerisatie van FtsZBs (bovenste gel) en FtsZEc (onderste gel) bij 50 mM KCl. (S) supernatant, (P) pelletfracties uit het experiment. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50844/50844fig1highres.jpg" target="_blank">Klik hier om de afbeelding in een groter formaat te bekijken</a>.
<img alt="Interactiegrafiek van FtsZ en SepF en gel die de invloed van GTP/GDP op het percentage eiwitprecipitaat laat zien." fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50844/50844fig2.jpg" width="600px" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figuur 2"> 
Figuur 2. Sedimentatie van SepF/FtsZ-tubuli bij lage snelheid. (A) 12 µM FtsZBs werd gepolymeriseerd met 2 mM GDP (witte balken) of GTP (zwarte balken). De hoeveelheid neergeslagen eiwit werd bepaald door densitometrische analyse van Coomassie-gekleurde gels. De + en - tekens onder de x-as geven de aanwezigheid of afwezigheid van FtsZ en SepF in de reactie aan. (B) Representatieve resultaten van een Coomassie-gekleurde gel. Polymerisatie van FtsZBs in aanwezigheid en afwezigheid van SepF. Als controle werd SepF zonder FtsZ gebruikt. De polymerisatie werd uitgevoerd met GTP en GDP. (S) supernatant, (P) pellet-fracties uit het experiment. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50844/50844fig2highres.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken</a>.
<img alt="Lichtverstrooiingsgrafieken van FtsZ bij verschillende KCl-concentraties; effecten van pH 6,5, 6,8 en 7,5 weergegeven." fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50844/50844fig3.jpg" width="600px" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figuur 3"> 
Figuur 3. Lichtverstrooiing van 12 μM FtsZEc en 12 μM FtsZBs. FtsZ's werden geassembleerd in aanwezigheid van 2 mM GTP en de polymerisatie werd gemonitord via lichtverstrooiing onder een hoek van 90°. Polymerisatie van FtsZBs (A) en FtsZEc (B) bij 50 mM KCl bij pH 7,5, pH 6,8 en pH 6,5. Polymerisatie van FtsZBs (C) en FtsZEc (D) bij 300 mM KCl bij pH 7,5, pH 6,8 en pH 6,5. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50844/50844fig3highres.jpg" target="_blank">Klik hier om de afbeelding in een groter formaat te bekijken</a>.
<img alt="Elektronenmicroscopie van FtsZ-polymeren bij variërende pH- en KCl-concentraties; structurele analyse." fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50844/50844fig4.jpg" width="600px" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figuur 4"> 
Figuur 4. Structuren van FtsZBs- en FtsZEc-polymeren gevisualiseerd via elektronenmicroscopie. (A-L) Beelden van 12 µM FtsZBs (A-C en G-I) en FtsZEc (D-F) en (J-L) gepolymeriseerd met 2 mM GTP. (A-C) FtsZBs in buffer met 50 mM KCl en respectievelijk pH 7.5, 6.8 en 6.5. (D-F) FtsZEc in buffer met 50 mM KCl en respectievelijk pH 7.5, 6.8 en 6.5. (G-I) FtsZBs in buffer met 300 mM KCl en respectievelijk pH 7.5, 6.8 en 6.5. (J-L) FtsZEc in buffer met 300 mM KCl en respectievelijk pH 7.5, 6.8 en 6.5. Schaalbalk: 100 nm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50844/50844fig4highres.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken</a>.
<img alt="Grafiek van GTPase-activiteit; staafdiagram van FtsZ bij 50mM vs 300mM KCl, pH-variaties 7,5, 6,8, 6,5." fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50844/50844fig5.jpg" width="600px" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figuur 5"> 
Figuur 5. GTP-hydrolyse tijdens FtsZ-polymerisatie in 6 verschillende buffers. In alle experimenten werd 2 mM GTP gebruikt. Als controle werd een monster zonder MgCl2 gebruikt. De activiteit van FtsZ zonder MgCl2 werd afgetrokken van de activiteit van FtsZ in aanwezigheid van MgCl2. Links: GTPase-activiteit van FtsZ bij 50 mM KCl, rechts: GTPase-activiteit van FtsZ bij 300 mM KCl. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50844/50844fig5highres.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken</a>.

Polymerisatie van FtsZ is essentieel voor bacteriële celdeling. In dit rapport beschrijven we eenvoudige protocollen om de polymerisatieactiviteit van FtsZ te monitoren en bespreken we de invloed van de buffersamenstelling. De protocollen kunnen worden gebruikt om de interactie van FtsZ met regulerende eiwitten of antibacteriële geneesmiddelen die de polymerisatie van FtsZ beïnvloeden, te bestuderen.

FtsZ polymerisatie Testen: Eenvoudige Protocollen en overwegingen

During bacterial cell division, the essential protein FtsZ assembles in the middle of the cell to form the so-called Z-ring. FtsZ polymerizes into long ...

Het algemene doel van het volgende experiment is om geschikte omstandigheden te bepalen om FTSZ, polymerisatie en activiteit te bestuderen met behulp van eenvoudige tests en apparatuur. Dit wordt bereikt door FDSC-polymeersedimentatietests uit te voeren onder verschillende omstandigheden om geschikte omstandigheden te vinden waarbij FDSZ polymeriseert. Als tweede stap voeren we lichtverstrooiingstests uit om FDSZ-polymerisatie in real time te bestuderen.Vervolgens voeren we GTP-hydrolysetests uit om de polymerisatie-geassocieerde g gtpa-activiteit van FT SC te bepalen. Er worden resultaten verkregen die laten zien welke omstandigheden het meest geschikt zijn voor de studie van FTSC van een specifieke bacteriële bron op basis van sedimentatie, lichtverstrooiing en GTP-hydrolyse. De hier getoonde technieken zijn gemakkelijk uit te voeren in elk laboratorium en zullen een snel idee geven van de polymerisatiecapaciteiten van specifieke FT a z. We ontdekken dat de keuze van de juiste buffer vooral belangrijk is bij het werken met FTAZ in aanwezigheid van andere eiwitten die aantonen dat de techniek EVA crawl zal zijn, een afgestudeerde student uit mijn laboratorium.Om te beginnen voegt u vijf microliter 100 millimolair magnesiumchloride en 12 micromolair van de bacteriële eiwitten, FDSC en/of SEP F toe aan een van de gekozen polymerisatiebuffers die verschillende pH-waarden en samenstellingen hebben zoals beschreven in het bijbehorende tekstprotocol. Plaats vervolgens de buisjes in een incubator met een schudfunctie en incubeer de monsters gedurende twee minuten bij 30 graden Celsius en 300 RPM. Zodra de buisjes grondig zijn gemengd, begint u met polymerisatie door één microliter van een GTP- of GDP-mengsel toe te voegen uit een 100 millimolair voorraadoplossing, zodat de uiteindelijke concentratie twee millimolair is.Plaats vervolgens de monsters terug in de schudende incubator voor een extra 20 minuten. Spin vervolgens de buisjes bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten bij 20.000 RPM met behulp van een TLA 55 rotor of een gelijkwaardige 24.600 Gs als u iets anders gebruikt. Zodra de centrifuge klaar is, brengt u de supernatanten over in schone buisjes en bewaart u de pellets voor later.Neem 20 microliter van de overgebrachte supernatanten en meng ze in een aparte buis met 20 microliter twee keer geconcentreerde monsterbuffer. Zet de doppen vast en kook de monsters gedurende 10 minuten bij 98 graden Celsius. Voeg vervolgens 50 microliter twee keer geconcentreerde monsterbuffer toe aan elk pelletfractie dat eerder is achtergelaten en suspendeer de polymeren door de monsters gedurende 10 minuten bij 98 graden Celsius te koken.Zodra de monsters klaar zijn met koken, voegt u een extra 50 microliter gedemineraliseerd water toe aan de buisjes met de pellets. Laad vervolgens 10 microliter van zowel de supernatanten als de pellets van elk monster zij aan zij op een 10%SDS-paginagel en laat de gel draaien bij 150 volt. Zodra de gel klaar is, verwijdert u de gel en kleur hem met kumasi briljant blauw G twee 50.Beeld vervolgens de gel af en kwantificeer het eiwit met behulp van cytometrie zoals beschreven in het bijbehorende tekstprotocol. Schakel eerst een fluorescente spectrometer in en laat de lamp enkele minuten opwarmen om thermische schommelingen te voorkomen. Schakel ook een circu lerende waterbad in en stel de watertemperatuur in op 30 graden Celsius om de vete-kamer op een constante temperatuur te houden.Terwijl het systeem opwarmt, definieert u de werkparameters van de spectrometer. Stel de detectorhoge spanning in op 300 volt en de emissie- en excitatiegolflengten op 350 nanometer met een spleetbreedte van vier nanometer. Programmeer vervolgens het gegevensverwervingsprotocol door een tijdgebaseerde verwerving te kiezen met een duur van 3.600 seconden.Reinig voorzichtig een 200 microliter fluorescentie vete met een padlengte van een centimeter door deze vijf minuten in een reinigingsoplossing in een waterbad te laten zitten. Bereid vervolgens 294 microliters van een mastermix voor elk van de negen polymerisatiebuffers beschreven in het bijbehorende tekstprotocol, elk met 10 millimolair magnesiumchloride en 12 micromolair FDSE als de uiteindelijke concentraties berekend voor 300 microliter. Vortxx de mengsels kort en breng 196 microliter van de eerste polymerisatiebuffer over naar de vet.Plaats het in de spectrometer en incubeer gedurende twee minuten om de temperatuur van het monster op 30 graden Celsius te brengen. Begin na twee minuten met de gegevensverwerving en wacht 90 seconden om te verifiëren dat het signaal stabiel is. Voeg vervolgens vier microliter 100 millimolair GTP of GDP toe.Meng het monster en ga door met gegevensverwerving gedurende een volledige uur. Herhaal deze stappen voor elke buffer die wordt vermeld. Bereid 1,5 milliliter twee millimolair GTP in een gekozen polymerisatiebuffer voor.Bereid ook een fosfaatstandaardverdunning voor in het bereik van nul tot 40 micromolair in dezelfde buffer. Bereid vervolgens malachietgroen werkreagens voor zoals beschreven in het bioassayskit. Maak vervolgens vier mastermixes met een totaal volume van elk 360 microliters. Mastermix één bevat FDSZ afgeleid van B subtilis en mastermix twee bevat FDSE afgeleid van e coli.Mastermixes drie en vier worden gebruikt als controles en bevatten EDTA in plaats van magnesiumchloride. Pipet vervolgens 20 microliter aliquots van de mastermixes en fosfaatstandaarden. In A-Q-P-C-R 96-wellplaat zodat er 16 wells zijn voor elke mastermix en de fosfaatstandaarden gerangschikt zoals hier getoond.Pipet 180 microliter twee millimolair GTP-voorraadoplossing naar de laatste rij van de plaat. Plaats vervolgens de plaat in een PCR-machine. Voer een programma uit met een enkele cyclus ingesteld op 30 graden Celsius gedurende 40 minuten.Pipet in een tweede 96-wellplaat 20 microliter aliquots van het malachietgroene werkreagens in putjes, A een tot H 10. Voeg vervolgens 60 microliter van de polymerisatiebuffer uit het experiment toe aan claims A een tot H acht

ftsz-polymerization-assays-simple-protocols-and-considerations

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

We beschrijven een multiplex methode voor de detectie van micro-organismen in een monster met behulp van oligonucleotide-coupled fluorescerende kralen. Amplicon van alle organismen in een monster is gehybridiseerd met een panel van probe-gekoppelde kralen. Een Luminex of Bio-Plex instrument wordt gebruikt om elke kraal voor kraal type en hybridisatie-signaal zoekopdracht.

Multiplex detectie van bacteriën in complexe klinische en Milieu monsters met behulp van oligonucleotide-coupled Fluorescent Microsferen

Een beschrijving van de vorming van een polymeer met een microarray on-chip fotopolymerisatie techniek. De high throughput oppervlaktekarakterisering behulp van atomic force microscopy, water contacthoekmetingen, X-ray foto-elektron spectroscopie en vluchttijden secundaire ionen massaspectrometrie en celhechting assay wordt ook beschreven.

Polymeer Microarrays voor High Throughput Ontdekking van biomaterialen

PCR heeft zich ontpopt als een veelgebruikte techniek in veel moleculair-biologische laboratoria. Mits hier is een kort overzicht van enkele conventionele PCR-protocollen. Omdat elk reactie is een uniek experiment optimale voorwaarden te genereren product variëren. Begrijpen van de variabelen in een reactie, zal ook problemen efficiency, waardoor de kans op het gewenste resultaat.

Polymerase Chain Reaction: Basis Protocol Plus Problemen oplossen en Optimalisatie Strategieën

De hierin beschreven protocol heeft tot doel uit te leggen en verkorten de vele obstakels in de weg van de ingewikkelde route die leidt tot gewijzigde nucleosidetrifosfaten. Bijgevolg Dit protocol maakt zowel de synthese van deze geactiveerde bouwstenen en hun beschikbaarheid voor praktische toepassingen.

Nucleosidetrifosfaten - Van Synthese tot biochemische karakterisering

Dit protocol beschrijft de karakterisatie van de polymerase van DNA synthese van gemodificeerd DNA door middel van observatie van wijzigingen in het nabij-infraroodspectrum fluorescently geëtiketteerde DNA met behulp van de Elektroforese van het gel en gel beeldvorming. Acrylamide gels worden gebruikt voor hoge resolutie beeldvorming van de scheiding van korte nucleic zuren, die op verschillende tarieven afhankelijk van grootte migreren.

DNA-Polymerase activiteit Assay gebruikend nabij-infrarood fluorescerende gelabelde DNA gevisualiseerd door Acrylamide Gel elektroforese

Een nauwkeurige en robuuste polymerase kettinggebaseerde assay test voor het kwantificeren van Cytosine-guanine-guanine trinucleotide herhalingen in het fragiele X mentale retardatie-1 gen vergemakkelijkt de moleculaire diagnose en screening van fragiel X-syndroom en fragiele X-gerelateerde aandoeningen met kortere turn-around tijd en investering in apparatuur.

Een robuuste polymerase kettingreactie op basis van Cytosine-guanine-guanine Trinucleotide herhalingen in fragiele X mentale retardatie-1 gen

Epigenetische markers worden gebruikt voor witte bloedcellen (WBC) subtypering door de kwantificering van DNA-methylatiepatronen. Dit protocol presenteert een multiplex druppelpolymeerkettingreactie (mdPCR) methode met behulp van een thermoplastische elastomer (TPE) gebaseerd microfluïde apparaat voor druppelgeneratie waardoor nauwkeurige en multiplex methylatie-specifieke doelkwantificering van WBC differentiële telt.

Methylatiespecifieke Multiplex Droplet PCR met polymeerdruppelgenerator voor hematologische diagnostiek

Goed gekarakteriseerde genetische delen zijn noodzakelijk voor het ontwerp van nieuwe genetische circuits. Hier beschrijven we een kosteneffectieve, high-throughput methode voor het snel karakteriseren van genetische delen. Onze methode vermindert kosten en tijd door celvrije lysaten, lineair DNA om klonen te voorkomen en akoestische vloeistofverwerking te combineren om de doorvoer te verhogen en reactievolumes te verminderen.

Snelle karakterisering van genetische delen met celvrije systemen

Oligonucleotide 5′-trifosfaten zijn alomtegenwoordige componenten in essentiële biologische routes en worden steeds vaker gebruikt in biotechnologische toepassingen. Hier beschrijven we technieken voor de routinematige synthese en zuivering van oligonucleotide-5′-trifosfaten, uitgaande van oligonucleotiden bereid door standaard geautomatiseerde synthesetechnieken.

Chemische trifosforylering van oligonucleotiden

Dit protocol schetst een op fluorescentiemicroscopie gebaseerde DNA-replicatietest met één molecuul, waardoor real-time visualisatie van interacties tussen DNA-polymerasen en obstakels zoals G-quadruplex-structuren mogelijk is.

Fluorescentievisualisatie met één molecuul van DNA-polymerasedynamiek bij G-quadruplexen

Dit protocol introduceert een fluorometrische screeningsmethodologie die geoptimaliseerd is voor het identificeren van natuurlijke product- of kleinmolecuulremmers van eiwitsynthese. De praktische bruikbaarheid maakt het geschikt voor zowel bacheloronderwijs in geneesmiddelenontdekkingstechnieken als voor implementatie in medicinale chemiecampagnes.

Een op fluorescentie gebaseerd protocol voor voorlopige screening van eiwitsyntheseremmers uit natuurlijke bronnen

Leer FtsZ-polymerisatie testen voor microbiologisch onderzoek met sedimentatie- en lichtverstrooiingsassays. Deze protocollen helpen onderzoekers optimale buffercondities bepalen voor bacteriële celdeling.

FtsZ polymerisatie Testen: Eenvoudige Protocollen en overwegingen

Meer video's verkennen