Cytoplasmatisch stromen visualiseren tijdens wondgenezing van één cel in Stentor coeruleus
19 december 2013
De gigantische ciliaat Stentor coeruleus is een klassiek systeem voor het bestuderen van regeneratie en wondgenezing in enkele cellen. Door Stentor-cellen gelijktijdig bij lage en hoge vergroting te beeldhouwen, is het mogelijk om cytoplasmatische stromingen voor, tijdens en na verwonding te meten.
Het algemene doel van deze procedure is om de stroming van cytoplasma te meten tijdens wondgenezing in een enkele cel. Dit wordt bereikt door eerst levende stent of SEIU-cellen te verzamelen die als modelsysteem worden gebruikt voor cellulaire wondvorming. De tweede stap is het voorbereiden van de glazen gereedschappen voor het snijden van de cellen.
Vervolgens worden de stent sarius cellen opengesneden op een aangepaste microscoopopstelling die gelijktijdige chirurgie met lage vergroting en beeldvorming met hoge resolutie mogelijk maakt. De laatste stap is het uitvoeren van computationele analyse van de cytoplasmastroming met behulp van particle image velo symmetriesoftware. Uiteindelijk wordt beeldvorming met hoge resolutie van het cytoplasma gebruikt om de actieve reactie van cellen tijdens wondgenezing te tonen.
Deze methode kan worden gebruikt om belangrijke vragen over cellulaire wondgenezing te beantwoorden, zoals of het cytoplasma gel-achtig wordt rond de regio van een snede om lekkage in het omringende medium te voorkomen. Visuele demonstratie van deze methode is cruciaal, omdat de voorbereiding van het hulpmiddel voor het hanteren van cellen en de snijdstappen moeilijk te leren zijn omdat ze manuele behendigheid vereisen. Om te beginnen, verkrijg stent of Sirius cellen van natuurlijke pons zoals beschreven door tartar of van een commerciële leverancier, voeg 300 milliliter gemodificeerd stent of medium toe dat is aangepast aan recepten door tartar en deter zoals beschreven in het bijbehorende tekstprotocol.
Onderhoud de culturen door ze in het donker te laten groeien bij 20 graden Celsius. Vervolgens, laat culturen van chlamydomonas Rhine Hardy algen groeien in tris acetaat fosfaat medium. Gebruik standaard kweekmethoden voorafgaand aan het voeren, spoel de chlamydomonas cellen door ze voorzichtig rond te draaien, het supernatant te verwijderen en ze op te suspenderen in het gemodificeerde stent of medium.
Voed de 300 milliliter stent of sarius culturen met ongeveer 30 miljoen chm cellen twee of drie keer per week wanneer nodig. Verzamel stent of cellen voor chirurgie. Om te beginnen, schud de cultuur voorzichtig door lucht door een pipettetip te laten borrelen totdat de cellen loslaten en vrij zwemmen.
Vervolgens vangen de zwemmende cellen met behulp van een een milliliter pipettetip uitgerust met een brede buis om scheurbeschadiging van de cellen te voorkomen. Laat de cellen eenmaal verzameld zinken. Pipet dan langzaam het medium boven hen weg en voeg vers gemodificeerd stent of medium toe.
Bereid de glazen naalden voor die worden gebruikt om de stent cellen te snijden door twee glazen roerstokken over overvloed en brander te houden totdat de uiteinden beginnen te smelten. Raak vervolgens de uiteinden van de twee stokken aan totdat het gesmolten glas versmelt. Zodra ze zijn versmolten, haal ze uit de vlam en laat ze een tot twee seconden afkoelen.
Trek ze vervolgens langzaam uit elkaar om een schone breuk te maken. Idealiter zal dit een naald produceren die ongeveer een tot twee centimeter lang is met een fijne punt aan het einde. Als de resulterende naald suboptimaal is, breek de punt in de glazen taille en gebruik de staven opnieuw.
Gebruik vervolgens een vierkante rubberen stempel bedekt met vaseline om een vierkante vaselinewandige kamer voor te bereiden door deze in een glazen dekje te drukken. Voeg vervolgens 100 microliters gemodificeerd stent of medium toe dat 2% methylcellulose bevat aan het vaseline vierkant. Plaats het voorbereide dekje in een plastic adapter en voeg vervolgens de gewassen stent cellen toe aan het dekje.
Regel ten slotte cellen in de methylcellulose zodat ze gelijkmatig verdeeld zijn en dicht genoeg bij het oppervlak van het dekje worden geduwd om tijdens beeldvorming scherp te zijn. Om te beginnen, plaats het glaasje op het platform van de omgekeerde microscoop. Verwijder vervolgens het dissectiemicroscooplichaam uit zijn standaard en bepaal de geschatte positie waarin het moet worden geplaatst om het glaasje met lage vergroting van bovenaf te visualiseren.
Bouw vervolgens een dubbeldeksmicroscoop door een kartonnen doos toe te voegen met de gewenste afstand tussen het oogstuk van de omgekeerde microscoop en de dissectiescoop. Plak de doos op zijn plaats met laboratoriumtape zodat deze gemakkelijk kan worden verwijderd. Zorg ervoor dat het monster in het gezichtsveld en scherp staat wanneer het experiment is voltooid, zonder dat de dissectiescoop hoeft te worden verplaatst. Nadat het is bevestigd, houdt u de dissectiescoop tegen de doos en plakt u deze op de doos met laboratoriumtape. Stel vervolgens de omgekeerde microscoop in met behulp van DIC-optica door een 20 x luchtobjectief op zijn plaats te zetten.
Zorg er ook voor dat u een DIC-condensor met lange werkafstand gebruikt om voldoende ruimte te bieden om de microchirurgie van bovenaf uit te voeren. Breng vervolgens de cellen scherp met de omgekeerde microscoop met alles voorbereid en scherp van beide kanten. Begin met het verzamelen van beelden met een framesnelheid van twee beelden per seconde, met behulp van een vijf 12 bij vijf 12 CCD-camera.
Snijd vervolgens de cel met behulp van de glazen naald. Vang het initiële cytoplasmastromingspatroon en observeer alle stadia van het wondvormings- en wondgenezingsproces. Beëindig de acquisitie wanneer de cel een normale verschijning heeft hervat of opnieuw actieve beweeglijkheid heeft hervat.
Om te beginnen, download PIV lab, een MATLAB-pakket om cytoplasmastroming te meten met behulp van particle image velo symmetrie. Laad vervolgens de TIFF-beeldstapel voor elke videosequentie in het particle image velo symmetrie programma binnen MATLAB handmatig. Genereer handmatig een masker voor elke beeldstapel om gebieden van de ruwe gegevens buiten het lichaam van de stent te maskeren.
Stel vervolgens PIV lab in om de snelle Fourier-transformatie-instelling en een bingrootte van 64 bij 64 pixels te gebruiken, die de pixels in elk frame in grotere vierkante pixels zal binning. Voer vervolgens PIV lab uit om kruiscorrelaties te berekenen tussen de pixels in elk frame met nabije pixels. In het volgende frame zal dit een tijdsafhankelijke stromingsvector opleveren die is gecentreerd bij elk buigpixel, die dezelfde
Overzicht
Deze studie onderzoekt de cytoplasmatische stroming tijdens wondheling bij de reuzencilieaat Stentor coeruleus. Door gebruik te maken van een aangepaste microscoopopstelling kunnen onderzoekers zowel beelden met een lage als een hoge vergroting vastleggen van de cellen voor, tijdens en na het toebrengen van een wond.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk vakgebied
- Cellulaire biologie
- Regeneratie
- Wondgenezing
Achtergrond
- Stentor coeruleus dient als modelorganisme voor het bestuderen van cellulaire processen.
- Inzicht in de cytoplasmatische stroming is essentieel voor het begrijpen van wondgenezingsmechanismen.
- Eerdere studies hebben het belang van beeldvormingstechnieken in het cellulair onderzoek benadrukt.
- Handvaardigheid is vereist voor de chirurgische procedures die bij deze studie horen.
Doel van de studie
- Om de cytoplasmatische stroom tijdens het wondgenezingsproces bij Stentor coeruleus te meten.
- Om te onderzoeken of het cytoplasma gelachtig wordt om lekkage na verwonding te voorkomen.
- Om een visuele demonstratie te geven van de chirurgische technieken die worden gebruikt bij cellulaire verwonding.
Gebruikte methoden
- Verzameling van levende Stentor coeruleus-cellen voor experimenten.
- Voorbereiding van glazen instrumenten voor nauwkeurige cellulaire insnijdingen.
- Gelijktijdige chirurgie bij lage vergroting en beeldvorming met een hoge resolutie.
- Computationele analyse van de cytoplasmatische stroming met behulp van software voor particle image velocimetry.
Belangrijkste Resultaten
- Succesvolle beeldvorming van cytoplasmatische stroompatronen tijdens wondgenezing.
- Inzichten in de actieve respons van cellen na verwonding.
- Demonstratie van de effectiviteit van de chirurgische techniek in een laboratoriumomgeving.
- Data-analyse die stroomfluctuaties en veranderingen in snelheid over de tijd onthult.
Conclusies
- De studie biedt een uitgebreide methode voor het analyseren van cytoplasmatische stroming in individuele cellen.
- De bevindingen dragen bij aan het begrip van cellulaire wondgenezingsmechanismen.
- Toekomstig onderzoek kan voortbouwen op deze methoden om andere cellulaire reacties te onderzoeken.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de Industrie
Het begrijpen van cytoplasmatische dynamiek tijdens wondheling op single-cell niveau biedt mechanistische inzichten in membraanherstel en cellulaire veerkracht, wat relevant is voor targetvalidatie in de regeneratieve biologie. De methode maakt een kwantitatieve beoordeling van intracellulaire responsen op fysieke perturbatie mogelijk, wat screeningbenaderingen voor fenotypes van cytoskelet- of transportmodulatoren ondersteunt. Deze assay met single-cell resolutie draagt bij aan de ontwikkeling van preklinische modellen door een ziekte-relevant systeem te bieden voor het onderzoeken van subcellulaire herstelmechanismen.
Strategische Toepassingen in Biopharma R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het mogelijk om therapeutische hypothesen met betrekking tot cytoskeletregulatie en membratenherstelpaden te onderzoeken.
- Operationele waarde: Ondersteunt biologische risicoreductie door functionele reacties op subcellulaire beschadiging in een gecontroleerd systeem te visualiseren.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Bereidt gevalideerde biologische systemen voor op downstream-workflows door baseline-metrieken voor cytoplasmatische stroming vast te stellen.
- Operationele waarde: Pakt assay-standaardisatie en reproduceerbaarheid aan via hoge-resolutie beeldvorming en particle image velocimetry-analyse.
- Operationele waarde: Benadrukt screening-gereedheid en schaalbaarheid via kwantificeerbare metingen van de cytoplasmatische flux.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Bespreekt de relevantie voor ziekten en de afstemming van translationele biomarkers via actieve cytoplasmatische responsen na wondvorming.
- Operationele waarde: Beschrijft de continuïteit van ontdekking tot preklinische validatie door subcellulaire reparatie te koppelen aan resultaten van cellulaire levensvatbaarheid.
Integratie van pijplijn en workflow
De methode integreert in vroege discovery-workflows door hypothese-testen mogelijk te maken van cytoskeletale bijdragers aan wondgenezing, met directe bruikbaarheid bij de identificatie van lead-verbindingen via modulatie van de dynamiek van de cytoplasmatische stroom.
- Discovery Biology: Legt uit hoe de methode hypothesetoetsing, pathway-verduidelijking of biologische risicoreductie ondersteunt via real-time visualisatie van intracellulaire reacties op membraanrupture.
- Screening: Beschrijft de assay-gereedheid, reproduceerbaarheid of kwantitatieve outputs via flow-vectorvelden en snelheidshistogrammen afgeleid van particle image velocimetry.
- Analytics: Benadrukt metingen, read-outs of statistische outputs die teams helpen bij het vergelijken van condities, inclusief tijdgemiddelde flow-vectoren en berekeningen van de cytoplasmatische flux.
- Translational Research: Verbindt de methode met preklinische continuïteit of biomarker-afstemming door cytoplasmatische resealing-kinetiek te koppelen aan cellulaire herstel-fenotypes.
- Enterprise Reuse: Presenteert de methode als een herbruikbare capaciteit in plaats van een eenmalige techniek via gestandaardiseerde glazen naaldpreparatie en een double-decker microscopieconfiguratie.
Operationele en bedrijfsmatige impact
- Wetenschappelijke waarde: Voorspellende betrouwbaarheid, targetvalidatie, vermindering van mechanistische ambiguïteit.
- Operationele waarde: Standaardisatie, reproduceerbaarheid en schaalbaarheid.
- Strategische waarde: Betere go/no-go beslissingen, kapitaalefficiëntie en verminderd biologisch risico in een laat stadium.
- Impact op portfolio: Risico-gecorrigeerde prioritering en beslissingen over verdere ontwikkeling.
Overwegingen bij de implementatie
- Vereiste wetenschappelijke expertise in microschirurgie en live-cell imaging.
- Behoeften aan instrumentatie en analytische infrastructuur, waaronder omgekeerde microscopen en dissectiemicroscopen, lenzen met een hoge NA en PIV-software.
- Eisen voor standaardisatie tussen teams voor de voorbereiding van de kamer en de positionering van cellen.
- Overwegingen voor aanpassing tussen modelsystemen vanwege de specifieke grootte en regeneratiekenmerken van Stentor coeruleus.
- Praktische beperkingen ondersteund door bronmateriaal, waaronder eisen aan handvaardigheid voor de bereiding van glazen instrumenten en de hantering van cellen.
Veelgestelde vragen over Biofarmacie
Chapters in this video
0:05
Title
1:12
Cell Culture and Collection
2:32
Preparation of Tools and Cells for Microsurgery
3:43
High Resolution Imaging of Wound Healing in Live Stentor Cells
5:19
Analyzing Cytoplasmic Flow During Wound Healing
7:13
Results: Live Imaging of Stentor Cells Following Disruption
7:33
Conclusion
