Name: Cytoplasmatisch stromen visualiseren tijdens wondgenezing van één cel in Stentor coeruleus (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-19T13:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 9 s
Description: Ontdek hoe je cytoplasmatisch stromen analyseert tijdens wondgenezing in Stentor coeruleus met behulp van particle image velocimetry-software. Deze methode onthult de actieve celrespons en helpt bij het begrijpen van wondhelingsmechanismen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit werk werd ondersteund door NIH-subsidie R01 GM090305 (WFM). De hier beschreven procedure werd ontwikkeld tijdens de Fysiologiecursus van het Marine Biological Laboratory in de zomer van 2012, en we danken de studenten, instructeurs en cursusdirecteuren voor veel nuttige en stimulerende discussies.

1. Cell Culture and Collection
<ol>
	<li>Verkrijg Stentor coeruleus cellen, hetzij uit natuurlijke vijvers zoals beschreven door Tartar7, of van een commerciële leverancier (zie Reagents).</li>
	<li>Houd culturen in stand door ze in het donker te laten groeien bij 20 ºC in gemodificeerd Stentor Medium (MSM), dat is aangepast van recepten beschreven door Tartar7 en De Terra12 en bevat 0,75 mM Na2CO3, 0,15 mM KHCO3, 0,15 mM NaNO3, 0,15 mM KH2PO4, 0,15 mM MgSO4, 0,5 mM CaCl2 en 1,47 mM NaCl.</li>
	<li>Suppleer het MSM medium met een koolstofbron door levende prooi toe te voegen aan het medium. Laat culturen van Chlamydomonas reinhardtii groeien in TAP medium met standaard kweekmethoden13. Voor het voeren, spoel Chlamydomonas cellen in MSM. Voer 300 ml Stentor culturen ongeveer 3 x 107 Chlamydomonas cellen 2-3x per week.</li>
	<li>Verzamel Stentor cellen voor chirurgie met behulp van een pipette. Stentor hechten zich meestal aan de bodem en zijkanten van de kweekschaal en dus, om cellen te verzamelen, agiteer de cultuur door lucht door een pipette tip te blazen tot de cellen loslaten en vrij zwemmen.</li>
	<li>Vangt zwemmende cellen met een pipette uitgerust met een wijdboring tip om scheur van de cellen te voorkomen.</li>
	<li>Was de verzamelde cellen in vers MSM.</li>
</ol>
2. Voorbereiding van gereedschap voor microchirurgie
<ol>
	<li>Houd twee glazen roerstokken boven een Bunsenbrander of andere vlam tot de uiteinden beginnen te smelten.</li>
	<li>Raak de uiteinden van de twee staven aan zodat het gesmolten glas fuseert.</li>
	<li>Na het maken van een kleine druppel gesmolten glas tussen de twee staven, verwijder ze uit de vlam, laat afkoelen gedurende 1-2 sec en trek ze dan uit elkaar om een schone breuk te maken. Ideaal is dat het glas uitrekt tot dunne draden en glad breekt terwijl het glas afkoelt, wat resulteert in een naald van ongeveer 1-2 cm lengte met een fijne punt aan het eind (Figuur 2).</li>
	<li>Als de resulterende naald suboptimaal is, kunnen de punten in glasafval worden gebroken en kunnen de staven opnieuw worden gebruikt.</li>
</ol>
3. Monteren van cellen voor microchirurgie en observatie (normale chirurgie)
<ol>
	<li>Bereid een vierkante Vaseline-wandkamer voor met behulp van een vierkante rubberen stempel bedekt met Vaseline en op een glazen deksel gedrukt.</li>
	<li>Voeg MSM met 2% Methylcellulose toe aan het Vaseline vierkant.</li>
	<li>Plaats het deksel in een plastic adapter, die het deksel laat plaatsen op een microscoop met een standaard slide houder (Figuur 3).</li>
	<li>Voeg gewassen cellen uit stap 1.6 toe aan de MSM plus methylcellulose om de beweeglijkheid van de Stentor cellen te belemmeren zodat ze tijdens de chirurgie op hun plaats blijven.</li>
	<li>Schik cellen in de methylcellulose zodat ze gelijkmatig verdeeld zijn en dicht genoeg bij het oppervlak van het deksel om in focus te blijven tijdens het beeldvormen.</li>
</ol>
4. Hoge resolutie beeldvorming van wondgenezing in levende Stentor
Om tegelijkertijd een Stentor cel met hoge resolutie te beeldvormen terwijl het chirurgisch onder lage vergroting wordt gesneden, bouw een "dubbeldekker" microscoop met een dissectiescoop bevestigd aan de oogstukkop van de omgekeerde scope zodat deze gericht is op de bovenkant van de slide terwijl de omgekeerde scope van onder de slide gericht is.
<ol>
	<li>Plaats een slide op de omgekeerde scope (gebruik ofwel een Zeiss Axiovert 200M of een Olympus IX80).</li>
	<li>Verwijder de dissectiemicroscoop van zijn standaard en bepaal de geschatte positie boven de oogstukkop van de omgekeerde microscoop voor het plaatsen van de dissectiescoop om de slide bij lage vergroting te visualiseren.</li>
	<li>Pas een kartonnen doos aan om dezelfde dikte te hebben als de gewenste afstand tussen de oogstukkop van de omgekeerde scope en de dissectiescope, en plak deze vervolgens in de omgekeerde scope met behulp van lab tape die gemakkelijk kan worden verwijderd wanneer het experiment is voltooid. Pas de dikte van de doos aan volgens de exacte configuratie van de oogstukkop van de omgekeerde microscoop en de grootte van de dissectiemicroscoop, zodat het monster in het gezichtsveld zal zijn zonder dat de dissectiescope na bevestiging hoeft te worden verplaatst.</li>
	<li>Houd de dissectiescope tegen de doos en beweeg deze tot de slide in focus is, en plak deze vervolgens opnieuw op de doos met behulp van lab tape. De uiteindelijke configuratie wordt getoond in Figuur 4.</li>
	<li>Beeld cellen af via de omgekeerde scope met behulp van DIC-optica en een 20X luchtobjectief. Gebruik een DIC-condensor met lange werkafstand om voldoende ruimte te bieden om de microchirurgie van bovenaf uit te voeren.</li>
	<li>Verkrijg beelden met een frame rate van 2 beelden/sec met behulp van een 512 x 512 CCD camera.</li>
	<li>Begin met de acquisitie voordat u begint met het snijden van de cellen om het aanvankelijke cytoplasmatische stromingspatroon vast te leggen en alle stadia van het wondproces en wondgenezing te observeren.</li>
	<li>Beëindig de acquisitie wanneer de cel het normale uiterlijk en/of actieve beweeglijkheid heeft hervat, om cytoplasmatische bewegingen gedurende het regenera

<ol><li>Sonnemann, K. J., Bement, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wound+repair%3A+toward+understanding+and+integration+of+single-cell+and+multicellular+wound+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Cell+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Wound repair: toward understanding and integration of single-cell and multicellular wound responses.</a> Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 27, 237-264 (2011).</li>
<li>Idone, V., Tam, C., Andrews, N. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-way+traffic+on+the+road+to+plasma+membrane+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Two-way traffic on the road to plasma membrane repair.</a> Trends Cell Biol. 18 (11), 552-559 (2008).</li>
<li>Reddy, A., Caler, E. V., Andrews, N. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma+membrane+repair+is+mediated+by+Ca2%2B-regulated+exocytosis+of+lysosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Plasma membrane repair is mediated by Ca2+-regulated exocytosis of lysosomes.</a> Cell. 106 (2), 157-169 (2001).</li>
<li>Foissner, I., Wastenays, G. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+characean+internodal+cell+as+a+model+system+for+studying+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microsc%22%5BJournal%5D)">The characean internodal cell as a model system for studying wound healing.</a> J. Microsc. 247 (1), 10-12 (2012).</li>
<li>Bement, W. M., Mandato, C. A., Kirsch, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wound-induced+assembly+and+closure+of+an+actomyosin+purse+string+in+Xenopus+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Wound-induced assembly and closure of an actomyosin purse string in Xenopus oocytes.</a> Curr. Biol. 9 (11), 579-587 (1999).</li>
<li>Kim, H. G., Klotchkova, T. A., Kang, Y. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Life+without+a+cell+membrane%3A+regeneration+of+protoplasts+from+disintegrated+cells+of+the+marine+green+alga+Bryopsis+plumosa%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Life without a cell membrane: regeneration of protoplasts from disintegrated cells of the marine green alga Bryopsis plumosa.</a> J. Cell Sci. 114 (11), 2009-2014 (2001).</li>
<li>Tartar, V. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTartar%2C+V+%22The+Biology+of+Stentor%22">The Biology of Stentor</a>. , Pergamon Press. 434 (1961).</li>
<li>Morgan, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+of+proportionate+structures+in+Stentor%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Bull%22%5BJournal%5D)">Regeneration of proportionate structures in Stentor.</a> Biol. Bull. 2 (6), 311-328 (1901).</li>
<li>Heidemann, S. R., Wirtz, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+a+regional+approach+to+cell+mechanics%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Towards a regional approach to cell mechanics.</a> Trends Cell Biol. 14 (4), 160-166 (2004).</li>
<li>Kasza, K. E., Rowat, A. C., Liu, J., Angelini, T. E., Brangwynne, C. P., Koenderinck, G. H., Weitz, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cell+as+a+material%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The cell as a material.</a> Curr. Opin. Cell Biol. 19 (1), 101-107 (2007).</li>
<li>Mitchison, T. J., Charras, G. T., Mahadevan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implications+of+a+poroelastic+cytoplasm+for+the+dynamics+of+animal+cell+shape%5BTitle%5D)+AND+%22Sem.+Cell+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Implications of a poroelastic cytoplasm for the dynamics of animal cell shape.</a> Sem. Cell Dev. Biol. 19 (3), 215-223 (2008).</li>
<li>De Terra, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+of+Stentor+coeruleus+on+Colpidium+campylum%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Eukar.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Culture of Stentor coeruleus on Colpidium campylum.</a> J. Eukar. Microbiol. 13 (3), 491-492 (1966).</li>
<li>Harris, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Chlamydomonas+Sourcebok%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">The Chlamydomonas Sourcebok.</a> 1, (2009).</li>
<li>Vallotton, P., Ponti, A., Waterman-Storer, C. M., Salmon, E. D., Danuser, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recovery%2C+visualization%2C+and+analysis+of+actin+and+tubulin+polymer+flow+in+live+cells%3A+a+fluorescent+speckle+microscopy+study%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Recovery, visualization, and analysis of actin and tubulin polymer flow in live cells: a fluorescent speckle microscopy study.</a> Biophys. J. 85 (2), 1289-1306 (2003).</li>
<li>Miyake, A., Harumoto, T., Iio, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defence+function+of+pigment+granules+in+Stentor+coeruleus%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Protistol%22%5BJournal%5D)">Defence function of pigment granules in Stentor coeruleus.</a> Eur. J. Protistol. 37 (1), 7-88 (2001).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.

De belangrijkste toepassing van deze methode zal zijn om het te gebruiken om de moleculaire routes te bepalen die de cytoplasmatische stroming reguleren tijdens wondgenezing in Stentor. Er is een breed scala aan chemische remmer die motoreiwitten en componenten van het cytoskelet targeten. Remmers van calciumsignalering zouden ook waarschijnlijke kandidaten zijn. Het zou ook interessant zijn om de pigmentkorrels (extrusomen) die het blauwe pigment Stentorin bevatten, te verwijderen of te reduceren, waarvan de afgifte uit de cel onder stress wordt geactiveerd, en te vragen hoe de exocytotische afgifte van Stentorin de stroming van het nabijgelegen cytoplasma kan beïnvloeden. Het pigment kan worden afgebroken met behulp van een eenvoudige blekingsbehandeling15 die net voor het snijden kan worden gedaan. Er lijkt geen eenvoudige manier te zijn om de wondgenezingstest parallel uit te voeren, omdat de cellen een voor een moeten worden gesneden en geïmager. Met behulp van een enkele microscoop zou het dus mogelijk zijn om cellen te behandelen en te meten met een snelheid van ongeveer 1 per 0,5 uur, zodat het tijdens een enkele werkdag mogelijk zou moeten zijn om genoeg datapunten voor een enkele verbinding te verkrijgen om te bepalen of deze een statistisch significant effect op het proces heeft. Hoewel de methode dus in geen enkele zin hoogdoorvoerig is, zal het absoluut haalbaar zijn om een geselecteerde set kandidaatverbindingen te screenen die specifiek zijn voor een paar zorgvuldig gekozen doelroutes.
Een belangrijke beperking van de huidige aanpak is de relatief grove methode voor het samenstellen van de dubbeldeksmicroscoop. Ervan uitgaande dat de gebruikte geïnverteerde microscoop een algemeen gebruiksinstrument is dat andere onderzoekers voor andere doeleinden moeten gebruiken, is een belangrijke overweging de gemak waarmee het apparaat kan worden gedemonteerd en weer in elkaar gezet. Hoewel de huidige methode met labtape inderdaad snel en eenvoudig te demonteren is, vereist deze zorgvuldige uitlijning door de gebruiker tijdens het samenstellen elke keer. Een belangrijke wijziging zou daarom zijn om een aangepaste verwijderbare houder te construeren met slots voor de oogoplashoed van de geïnverteerde scope en het lichaam van de disserperende scope. Dit zou gemakkelijk te fabriceren zijn met moderne 3D-printertechnologie.
Een tweede beperking van de aanpak is de afhankelijkheid van DIC-beeldvorming van intracellulaire organellen als markers voor stroming. Omdat de identiteit van deze organellen die in de microscoop worden waargenomen momenteel niet bekend is, is het niet mogelijk om hun grootte of mogelijke interacties met andere cellulaire componenten te kennen. Het zou daarom voordelig kunnen zijn om extrinsieke tracers zoals fluorescente kralen te injecteren en deze te gebruiken om de stroming te volgen. Dit zou echter een extra stap - micro-injectie - vereisen voordat het experiment zou kunnen worden gedaan, waardoor de test verder zou worden vertraagd.
De laatste belangrijke beperking is de afhankelijkheid van een enkel beeldvlak voor data-acquisitie. Het primaire belang van deze test is dat het verder gaat dan alleen vragen of een wond geneest of niet, en het mogelijk maakt om een gedetailleerde analyse van het stromingspatroon te verkrijgen. In dit opzicht zal het uitermate belangrijk zijn om de beeldvorming uit te breiden naar driedimensionale beeldvorming. De huidige methode beeldt een enkel brandpuntsvlak af en dus wanneer de PIV-analyse wordt uitgevoerd, is het resultaat een doorsnede door het volledige driedimensionale stromingsveld. Dit is informatief maar onvolledig. Door 3D-beelden te verkrijgen bij elke tijdstap, zou het mogelijk moeten zijn om een volledig driedimensionale stromingsveld te verkrijgen. Dit zal vooral van cruciaal belang zijn om precies waar te nemen hoe het cytoplasma in de onmiddellijke omgeving van de wondplaats beweegt.

Regeneratie en wondgenezing zijn belangrijke biologische processen waarvan de mechanismen nog steeds onderwerp van actieve onderzoek zijn. Inderdaad, het vermogen om wonden te helen en beschadigde delen te regenereren, is een van de kenmerken die levende wezens onderscheidt van niet-levende objecten. Normaal gesproken wordt aangenomen dat regeneratie wordt bemiddeld door differentiatie van stamcellen in verschillende celtypen die nodig zijn om een beschadigd of afgesneden deel van een dier opnieuw op te bouwen, terwijl wondgenezing wordt gezien in termen van nieuwe cellen die een wond binnendringen om een intact epitheel opnieuw op te bouwen. Beide processen lijken dus te worden bemiddeld door collectieven van individuele cellen, en lijken daarom typische meercellige processen te zijn. Het is daarom mogelijk verrassend dat individuele cellen in sommige gevallen in staat zijn om wonden te repareren en verloren componenten te regenereren1. Wondgenezing binnen enkele cellen kan meerdere routes omvatten, waaronder actine-myosine-kettingcontractie rond de wond en membraanpatching door snelle fusie van exocytotische vesicles1-3. Hoewel veel celtypen in staat zijn tot een zekere mate van wondgenezing4-6, is misschien het meest dramatische voorbeeld de gigantische ciliaat Stentor coeruelus7, getoond in Figuur 1. Individuele Stentor-cellen zijn 1 mm lang en zijn bedekt met rijen cilia. Stentor-cellen zijn kegelvormig met een oraal apparaat, bestaande uit duizenden cilia, aan het ene uiteinde, en een smalle houd-vaststructuur aan het andere uiteinde. Stentor was een klassiek modelorganisme voor het bestuderen van regeneratie omdat als een deel van de cel werd afgesneden, het zich kon regenereren7. Bijvoorbeeld, in een klassieke reeks experimenten, toonde Thomas Hunt Morgan8 aan dat een Stentor-cel in tweeën kon worden gesneden en dat elke helft binnen enkele uren een normaal proportioneel cel zou regenereren8. De moleculaire routes die verantwoordelijk zijn voor regeneratie in Stentor zijn volledig onbekend.
Het vermogen van Stentor-cellen om als regeneratiemodelsysteem te dienen, is gebaseerd op het verbazingwekkende vermogen van deze cellen om zichzelf te genezen na het snijden. Waarom lekt het cytoplasma van een Stentor-cel niet uit wanneer de cel wordt gesneden? Wondgenezing is niet te wijten aan onmiddellijke contractie van de celcortex, omdat het mogelijk is om twee Stentor-cellen te nemen, deze te snijden en vervolgens de twee gesneden cellen in verschillende configuraties samen te voegen7. Tijdens dergelijke graftexperimenten moet het cytoplasma van de twee cellen blootgesteld blijven, omdat het fuseert wanneer de cellen tegen elkaar worden geduwd. Op de een of andere manier is het cytoplasma voldoende blootgesteld aan de omringende media om graften mogelijk te maken, maar toch stroomt het niet uit de cel. Is het cytoplasma van Stentor voldoende elastisch dat het zelfs niet kan stromen wanneer er een groot gat in het plasmamembraan wordt gemaakt? Verhogen cellen de viscositeit van cytoplasma lokaal rond een wond om te voorkomen dat het cytoplasma stroomt? Cytoplasma is een zeer complex actief materiaal9-11, en de Stentor-wondgenezingsreactie vormt een unieke gelegenheid om cytoplasmastromingen en mechanica tijdens wondgenezing van enkele cellen te bestuderen. Het gebruik van chirurgische methoden om wonden in Stentor te induceren, vormt echter een technische uitdaging. Om een 1 mm lange cel met glazen naalden te snijden, het conventionele chirurgische paradigma, is het noodzakelijk om te werken met een lage vergroting en lange werkafstand. Onder deze beeldvormingscondities is het niet mogelijk om de stroom van cytoplasma te volgen, en alles wat men kan bepalen is of het cytoplasma binnen de cel blijft of niet. De echte vraag die we willen stellen is hoe de beweging en viscositeit van cytoplasma kunnen veranderen tijdens het snijden en genezen. Dit vereist beeldvorming met hoge resolutie. Hier presenteren we een aanpassing van Tartar's protocol voor het snijden van Stentor7 die het mogelijk maakt om het snijden uit te voeren onder lagere vergrotingsoptiek om de hele cel te zien terwijl tegelijkertijd het cytoplasmastroom met hoge resolutie wordt waargenomen, waardoor dit systeem kan worden gebruikt als een platform voor het verkennen van de mechanismen van wondgenezing van enkele cellen.

<table><tbody><tr><td>Stentor coeruleus levend cultuur</td><td>Carolina Biological</td><td>131598</td><td></td></tr><tr><td>Methyl Cellulose, 1.500 cP</td><td>Sigma</td><td>M0387</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">EQUIPMENT:</td></tr><tr><td>Materiaalnaam</td><td>Bedrijf</td><td>Catalogusnummer</td><td></td></tr><tr><td>Zachte glazen roerstaaf 5 inch lang</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-380A</td><td></td></tr><tr><td>Kweekschaal 4,5 inch 250 ml glas</td><td>Carolina Biological</td><td>741004</td><td></td></tr><tr><td>IX81 omgekeerd microscoop</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Axiovert 200M omgekeerd microscoop</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stemi 2000 Stereo Microscoop</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Evolve 512 x 512 EMCCD camera</td><td>Photometrics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plan Apo 20X objectief</td><td>Olympus</td><td>UPLSAPO</td><td></td></tr></tbody></table>

cytoplasmatisch stromen visualiseren tijdens wondgenezing van één cel in stentor coeruleus

Visualizing Cytoplasmic Flow During Single-cell Wound Healing in Stentor coeruleus

Hoewel wondgenezing vaak wordt aangepakt op het niveau van hele weefsels, zijn in veel gevallen individuele cellen in staat om wonden binnen zichzelf te helen, waarbij ze een beschadigd celmembraan repareren voordat de celinhoud eruit lekt. Het gigantische eencellige organisme Stentor coeruleus, waarin cellen meer dan een millimeter groot kunnen zijn, is een klassiek modelorganisme geweest voor het bestuderen van wondgenezing in enkele cellen. Stentor-cellen kunnen in tweeën worden gesneden zonder verlies van levensvatbaarheid, en kunnen zelfs worden gesneden en getransplanteerd. Maar deze hoge tolerantie voor snijden roept de vraag op waarom het cytoplasma niet eenvoudigweg uit de grootte van de snede stroomt. Hier presenteren we een methode voor het snijden van Stentor-cellen terwijl we tegelijkertijd de beweging van cytoplasma in de nabijheid van de snede met hoge ruimtelijke en temporele resolutie bekijken. De sleutel tot onze methode is om een ​​'dubbeldekker' microscoopconfiguratie te gebruiken waarbij de operatie wordt uitgevoerd onder een dissectiemicroscoop die gefocust is op een kamer die tegelijkertijd van onderen met hoge resolutie wordt bekeken met behulp van een omgekeerde microscoop met een hoge NA-lens. Deze opstelling biedt een hoog niveau van controle over de chirurgische procedure terwijl nog steeds hoge resolutietracking van cytoplasma mogelijk is.

Met behulp van de bovenstaande protocollen werd vastgesteld dat het cytoplasma van Stentor zeer dynamisch is, zowel voor als na het doorsnijden. Video 1 toont de uitgebreide cytoplasmastroom die aanwezig is in ongesneden cellen. Ondanks onze oorspronkelijke verwachting dat het vermogen van Stentor om het doorsnijden te overleven gepaard zou gaan met een verstijving of gelvorming van het cytoplasma, bleek dat wanneer Stentor-cellen met voldoende kracht worden doorgesneden waardoor het cytoplasma uit de cel wordt getrokken, het cytoplasma zeer dynamisch blijft en erin slaagt om op een sterk gerichte wijze terug in de cel te stromen (Video 2).
Naast het aantonen van een voorheen onvermoede mate van cytoplasmatische beweging tijdens wondgenezing, kan de hoge resolutie van de beeldvorming in de assay worden gebruikt om de stroomsnelheden te kwantificeren middels particle image velocimetry. De mogelijkheid om dergelijke metingen te verrichten, maakt het mogelijk om het effect van chemische inhibitoren rigoureus te testen.
<img alt="Microscoopopname van fytoplankton met groene cellulaire structuur, onderzoek naar mariene biologie." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50848/50848fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50848/50848fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figuur 1"> 
Figuur 1. Morfologie van een levende Stentor-cel. Donkerveldopname van een levende Stentor-cel die is gevoed met Chlamydomonas zoals beschreven in procedure 1.3, zichtbaar als groen materiaal binnenin voedingsvacuoles. Het orale apparaat waarlangs de cel eet is zichtbaar als een rand van cilia aan de bovenzijde van de afbeelding.
<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50848/50848fig1highres.jpg" target="_blank">Klik hier om de afbeelding in een groter formaat te bekijken</a>.
<img alt="Microscopie van micropipetpunt; precisie-microfabricage; schaalbalk 500μm; optisch onderzoek." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50848/50848fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50848/50848fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Afbeelding 2"> 
Afbeelding 2. Preparatie van glazen naald voor chirurgie. (A) De naald wordt getrokken uit het uiteinde van een massieve glazen staaf. (B) Vergroting van de naaldpunt die de lengte en scherpte aangeeft die nodig zijn voor chirurgie.
<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50848/50848fig2highres.jpg" target="_blank">Klik hier om de afbeelding in een groter formaat te bekijken</a>.
<img alt="Microscoopglaashouder voor optische excitatie in spectroscopie-experimenten." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50848/50848fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50848/50848fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figuur 3"> 
Figuur 3. Op maat gemaakte dekglashouder voor microchirurgie. Om open toegang voor chirurgie mogelijk te maken en tegelijkertijd optimale beeldvormingscondities te behouden, worden cellen op een dekglas gemonteerd in plaats van op een dik glazen objectglas. Om het dekglas op de microscooptafel te laten passen, kan een plastic houder worden gefabriceerd met een 3D-printer. De houder heeft dezelfde afmetingen als een standaard objectglas, terwijl de uitsparing in het midden overeenkomt met de afmetingen van het dekglas. Een gat in één hoek maakt het mogelijk om het dekglas uit de houder te drukken.
<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50848/50848fig3highres.jpg" target="_blank">Klik hier om de afbeelding in een groter formaat te bekijken</a>.
<img alt="Opstelling van confocale microscoop; fluorescentie-imaging; optische excitatie; microscopieapparatuur." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50848/50848fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50848/50848fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figuur 4"> 
Figuur 4. Dubbeldekker-microscoopconfiguratie. De kop van een dissectiemicroscoop is gemonteerd bovenop de oculairkop van een omgekeerde microscoop. Met laboratoriumtape kan de apparatus snel worden gemonteerd en gedemonteerd zodra het experiment is voltooid.
<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50848/50848fig4highres.jpg" target="_blank">Klik hier om de afbeelding in een groter formaat te bekijken</a>.
Video 1. Voorbeeld van cytoplasmatische stroming waargenomen in een levende Stentor-cel. Cel afgebeeld met een 10X objectief met donkerveldoptiek met een snelheid van 2 frames/sec.
Video 2. Ikbeeldvorming van een Stentor cel terwijl deze wordt doorgesneden en opengebroken met een glazen naald. Na het snijden is een aanzienlijke hoeveelheid cytoplasma uit het hoofdcellichaam getrokken, maar dit stroomt snel terug de cel in.

De gigantische ciliaat Stentor coeruleus is een klassiek systeem voor het bestuderen van regeneratie en wondgenezing in enkele cellen. Door Stentor-cellen gelijktijdig bij lage en hoge vergroting te beeldhouwen, is het mogelijk om cytoplasmatische stromingen voor, tijdens en na verwonding te meten.

Cytoplasmatisch stromen visualiseren tijdens wondgenezing van één cel in Stentor coeruleus

Although wound-healing is often addressed at the level of whole tissues, in many cases individual cells are able to heal wounds within themselves, ...

Het algemene doel van deze procedure is om de stroming van cytoplasma te meten tijdens wondgenezing in een enkele cel. Dit wordt bereikt door eerst levende stent of SEIU-cellen te verzamelen die als modelsysteem worden gebruikt voor cellulaire wondvorming. De tweede stap is het voorbereiden van de glazen gereedschappen voor het snijden van de cellen.Vervolgens worden de stent sarius cellen opengesneden op een aangepaste microscoopopstelling die gelijktijdige chirurgie met lage vergroting en beeldvorming met hoge resolutie mogelijk maakt. De laatste stap is het uitvoeren van computationele analyse van de cytoplasmastroming met behulp van particle image velo symmetriesoftware. Uiteindelijk wordt beeldvorming met hoge resolutie van het cytoplasma gebruikt om de actieve reactie van cellen tijdens wondgenezing te tonen.Deze methode kan worden gebruikt om belangrijke vragen over cellulaire wondgenezing te beantwoorden, zoals of het cytoplasma gel-achtig wordt rond de regio van een snede om lekkage in het omringende medium te voorkomen. Visuele demonstratie van deze methode is cruciaal, omdat de voorbereiding van het hulpmiddel voor het hanteren van cellen en de snijdstappen moeilijk te leren zijn omdat ze manuele behendigheid vereisen. Om te beginnen, verkrijg stent of Sirius cellen van natuurlijke pons zoals beschreven door tartar of van een commerciële leverancier, voeg 300 milliliter gemodificeerd stent of medium toe dat is aangepast aan recepten door tartar en deter zoals beschreven in het bijbehorende tekstprotocol.Onderhoud de culturen door ze in het donker te laten groeien bij 20 graden Celsius. Vervolgens, laat culturen van chlamydomonas Rhine Hardy algen groeien in tris acetaat fosfaat medium. Gebruik standaard kweekmethoden voorafgaand aan het voeren, spoel de chlamydomonas cellen door ze voorzichtig rond te draaien, het supernatant te verwijderen en ze op te suspenderen in het gemodificeerde stent of medium.Voed de 300 milliliter stent of sarius culturen met ongeveer 30 miljoen chm cellen twee of drie keer per week wanneer nodig. Verzamel stent of cellen voor chirurgie. Om te beginnen, schud de cultuur voorzichtig door lucht door een pipettetip te laten borrelen totdat de cellen loslaten en vrij zwemmen.Vervolgens vangen de zwemmende cellen met behulp van een een milliliter pipettetip uitgerust met een brede buis om scheurbeschadiging van de cellen te voorkomen. Laat de cellen eenmaal verzameld zinken. Pipet dan langzaam het medium boven hen weg en voeg vers gemodificeerd stent of medium toe.Bereid de glazen naalden voor die worden gebruikt om de stent cellen te snijden door twee glazen roerstokken over overvloed en brander te houden totdat de uiteinden beginnen te smelten. Raak vervolgens de uiteinden van de twee stokken aan totdat het gesmolten glas versmelt. Zodra ze zijn versmolten, haal ze uit de vlam en laat ze een tot twee seconden afkoelen.Trek ze vervolgens langzaam uit elkaar om een schone breuk te maken. Idealiter zal dit een naald produceren die ongeveer een tot twee centimeter lang is met een fijne punt aan het einde. Als de resulterende naald suboptimaal is, breek de punt in de glazen taille en gebruik de staven opnieuw.Gebruik vervolgens een vierkante rubberen stempel bedekt met vaseline om een vierkante vaselinewandige kamer voor te bereiden door deze in een glazen dekje te drukken. Voeg vervolgens 100 microliters gemodificeerd stent of medium toe dat 2% methylcellulose bevat aan het vaseline vierkant. Plaats het voorbereide dekje in een plastic adapter en voeg vervolgens de gewassen stent cellen toe aan het dekje.Regel ten slotte cellen in de methylcellulose zodat ze gelijkmatig verdeeld zijn en dicht genoeg bij het oppervlak van het dekje worden geduwd om tijdens beeldvorming scherp te zijn. Om te beginnen, plaats het glaasje op het platform van de omgekeerde microscoop. Verwijder vervolgens het dissectiemicroscooplichaam uit zijn standaard en bepaal de geschatte positie waarin het moet worden geplaatst om het glaasje met lage vergroting van bovenaf te visualiseren.Bouw vervolgens een dubbeldeksmicroscoop door een kartonnen doos toe te voegen met de gewenste afstand tussen het oogstuk van de omgekeerde microscoop en de dissectiescoop. Plak de doos op zijn plaats met laboratoriumtape zodat deze gemakkelijk kan worden verwijderd. Zorg ervoor dat het monster in het gezichtsveld en scherp staat wanneer het experiment is voltooid, zonder dat de dissectiescoop hoeft te worden verplaatst. Nadat het is bevestigd, houdt u de dissectiescoop tegen de doos en plakt u deze op de doos met laboratoriumtape. Stel vervolgens de omgekeerde microscoop in met behulp van DIC-optica door een 20 x luchtobjectief op zijn plaats te zetten.Zorg er ook voor dat u een DIC-condensor met lange werkafstand gebruikt om voldoende ruimte te bieden om de microchirurgie van bovenaf uit te voeren. Breng vervolgens de cellen scherp met de omgekeerde microscoop met alles voorbereid en scherp van beide kanten. Begin met het verzamelen van beelden met een framesnelheid van twee beelden per seconde, met behulp van een vijf 12 bij vijf 12 CCD-camera.Snijd vervolgens de cel met behulp van de glazen naald. Vang het initiële cytoplasmastromingspatroon en observeer alle stadia van het wondvormings- en wondgenezingsproces. Beëindig de acquisitie wanneer de cel een normale verschijning heeft hervat of opnieuw actieve beweeglijkheid heeft hervat.Om te beginnen, download PIV lab, een MATLAB-pakket om cytoplasmastroming te meten met behulp van particle image velo symmetrie. Laad vervolgens de TIFF-beeldstapel voor elke videosequentie in het particle image velo symmetrie programma binnen MATLAB handmatig. Genereer handmatig een masker voor elke beeldstapel om gebieden van de ruwe gegevens buiten het lichaam van de stent te maskeren.Stel vervolgens PIV lab in om de snelle Fourier-transformatie-instelling en een bingrootte van 64 bij 64 pixels te gebruiken, die de pixels in elk frame in grotere vierkante pixels zal binning. Voer vervolgens PIV lab uit om kruiscorrelaties te berekenen tussen de pixels in elk frame met nabije pixels. In het volgende frame zal dit een tijdsafhankelijke stromingsvector opleveren die is gecentreerd bij elk buigpixel, die dezelfde

visualizing-cytoplasmic-flow-during-single-cell-wound-healing-stentor

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Microscopische beeldvorming van levende endotheliale cellen die GFP-actine maakt karakterisering van dynamische veranderingen in het cytoskelet structuren. In tegenstelling tot technieken die vaste exemplaren te gebruiken, deze methode geeft een gedetailleerde evaluatie van de tijdelijke veranderingen in het actine cytoskelet in dezelfde cellen voor, tijdens en na de diverse fysieke, farmacologische of inflammatoire stimuli.

Studie van het actine cytoskelet in Live endotheliale cellen die GFP-actine

Stamceltransplantatie in een In vitro Gesimuleerde ischemie / reperfusie model

Cellulaire processen zoals celmigratie van oudsher bestudeerd op twee-dimensionale, stijve kunststof oppervlakken. Dit rapport beschrijft een techniek voor het direct visualiseren eiwit lokalisatie en het analyseren van eiwitten dynamiek in cellen migreren in een meer fysiologisch relevante, drie-dimensionale matrix.

Live-cell imaging van het migreren van cellen die fluorescent-gemerkte eiwitten in een drie-dimensionale Matrix

Leukocyten steken de endotheelcellen monolaag met behulp van de paracellulaire of de transcellulaire route. We ontwikkelden een eenvoudige test om te volgen de verdeling van endogene junctionele VE-cadherine en PECAM-1 tijdens de migratie van leukocyten onder fysiologische stroom te maken tussen de twee transmigratie routes.

Real-time beeldvorming van endotheelcellen-cel Junctions Tijdens Neutrophil Transmigration onder fysiologische Flow

Om stromingssnelheden en directionaliteit van filamenteus-actine bij de T-cel immunologische synaps te onderzoeken, wordt live-cell superresolutie beeldvorming gecombineerd met totale interne reflectiefluorescentie en gekwantificeerd met behulp van ruimte-tijdelijke beeldcorrelatiespectroscopie.

Corticale actine Flow in T-cellen gekwantificeerd door ruimte en tijd Afbeelding Correlatie Spectroscopie van Structured Verlichting Microscopie Gegevens

Hier presenteren we een protocol voor live-imaging wond reparatie en de geassocieerde inflammatoire respons bij hoge spatio-temporele resolutie in vivo. Deze methode maakt gebruik van de popstadium van Drosophila ontwikkeling om op lange termijn beeldvormings- en na verloop van tijd het volgen van specifieke cel populaties en is compatibel met efficiënte RNAi-gemedieerde gene inactivatie.

Op lange termijn In Vivo Tracking van inflammatoire cel dynamiek binnen Drosophila poppen

Hier beschrijven we protocollen voor het uitvoeren van live beeldvorming en kwantitatieve analyse van chemoattractante receptordynamiek bij...

Live imaging van chemokinereceptoren bij zebravisneutrofielen tijdens wondreacties

We presenteren een protocol voor isolatie en kweek van primaire muisembryogene palatale mesenchymale cellen voor time-lapse beeldvorming van tweedimensionale (2D) groei- en wondhersteltests. We bieden ook de methodologie voor de analyse van de time-lapse beeldvormingsgegevens om de vorming van celstromen en directionele beweeglijkheid te bepalen.

Isolatie en time-lapse beeldvorming van primaire muisembryo's van palatale mesenchymcellen om collectieve bewegingskenmerken te analyseren

We presenteren een protocol voor de karakterisering van beweeglijkheid en gedrag van een populatie van honderd micron- tot millimetergrote cellen met behulp van brightfield-microscopie en celtracking. Deze test onthult dat Stentor coeruleus door vier gedragsmatig verschillende fasen gaat bij het regenereren van een verloren oraal apparaat.

Analyse van motiliteitspatronen van stentor tijdens en na orale apparaatregeneratie met behulp van celtracking

Dit artikel beschrijft een methode om wonden te creëren in het epitheel van een levende Clytia hemisphaerica medusa en wondgenezing in beeld te brengen met een hoge resolutie in vivo. Daarnaast wordt een techniek gepresenteerd om kleurstoffen en medicijnen te introduceren om signaalprocessen in de epitheelcellen en extracellulaire matrix tijdens wondgenezing te verstoren.

Karakterisering van epitheliale wondgenezing in vivo met behulp van het Cnidarische modelorganisme Clytia hemisphaerica

Ontdek hoe je cytoplasmatisch stromen analyseert tijdens wondgenezing in Stentor coeruleus met behulp van particle image velocimetry-software. Deze methode onthult de actieve celrespons en helpt bij het begrijpen van wondhelingsmechanismen.

Cytoplasmatisch stromen visualiseren tijdens wondgenezing van één cel in Stentor coeruleus

Meer video's verkennen