Vaststelling van de minimale bacteriedodende concentratie van een antimicrobieel middel voor planktonische cellen (MBC-P) en biofilmcellen (MBC-B)

Deze procedure vergelijkt direct de weerstand van planktonisch en biofilm voor een bacteriestam die een biofilm kan vormen. Eerst een biofilm aanleggen, de media aanvullen en een seriële verdunning van het antimicrobiële middel van keuze toepassen. Laat vervolgens de cellen herstellen in vers, medium.

Nu de levensvatbaarheid van de cellen testen door te plateren op LB auger. Uiteindelijk wordt de minimale bacteriedodende concentratie van planktonische en biofilmcellen bepaald om de toename van weerstand te tonen die het resultaat is van groei in een biofilm. Over het algemeen zullen mensen die nieuw zijn in deze methode worstelen omdat ze aangrenzende putjes verontreinigen, of ze laten de prongs van het apparaat met meerdere punten niet voldoende afkoelen, zodat ze de bacteriën niet doden.

De wilde type en mutante bacteriestam gedurende 16 uur kweken in een rijk medium bij 37 graden Celsius, verdunnen de verzadigde overnachtculturen in een vers medium zoals M 63, minimaal medium, aangevuld met magnesium, sulfaat en arginine. Dan Eloqua. 100 microliter per putje.

Voor elke stam 24 putjes toewijzen, 24 uur incuberen bij 37 graden Celsius. Bereid vervolgens 10 x stamoplossingen van een verdunningsreeks van antibioticum voor zeven putjes voor en bewaar op ijs. Gebruik een multikanaals pipet om het uitgeputte supernatant dat planktonische cellen bevat te verwijderen.

Voeg vervolgens 90 microliter M 63 toe aan alle putjes en voeg 10 microliter van de juiste antibioticumstamoplossing toe aan de controle zonder antibioticum. Wel, voor elke replica en stam, voeg 10 microliter water toe. Incubeer de micro titer plaat gedurende 24 uur bij 37 graden Celsius.

Gebruik een multikanaals pipet om het uitgeputte supernatant dat planktonische cellen bevat te verwijderen. Voeg 115 microliter M 63 toe aan alle putjes en laat de culturen nog 24 uur groeien. Bij 37 graden Celsius.

Label een lb auger plaat per een half 96. Wel micro titer plaat om het apparaat met meerdere punten te steriliseren, dompel het in 100%ethanol en haal de prongs over de open vlam van een bunsenbrander. Laat de prongs iets afkoelen.

Gebruik de uiteinden van de prongs. Breng planktonische cultuur over van elk putje van de micro titer plaat naar het oppervlak van een LB auger plaat. Plaats de LB auger platen gedurende 16 uur bij 37 graden Celsius.

Bepaal vervolgens visueel de grens voor bacteriegroei als de minimale bacteriedodende concentratie van de antibioticumcultuur, de wilde type en mutante bacteriestam gedurende 16 uur in een rijk medium bij 37 graden Celsius, verdunnen de verzadigde overnachtculturen een op 100 in vers medium voor antibioticumresistentietests naar elk putje van een 96-wel micro titer schaal. Voeg 90 microliter van de bacterie-verdunning toe. Nu om de planktonische cellen bloot te stellen aan een concentratiegradiënt van antibioticum.

Begin met 10 x stamoplossingen van een verdunningsreeks van antibioticum zoals tobramycine mycine. Voeg 10 microliter van de antibioticumstam toe volgens het experimentele ontwerp. Voeg vervolgens 10 microliter water toe aan de controleputjes zonder antibioticum voor elke replica en stam.

Incubeer de micro titer plaat gedurende 24 uur bij 37 graden Celsius om levende cellen te testen. Begin met het labelen van een LB auger plaat voor elke helft van een 96-wel micro titer plaat. Steriliseer het apparaat met meerdere punten door het te ontvlammen met 100%ethanol.

Herhaal eenmaal. Gebruik vervolgens het apparaat met meerdere punten om ongeveer drie microliter planktonische cultuur over te brengen van elk putje van de micro titer plaat naar het oppervlak van een LB auger plaat. Incubeer de platen gedurende 16 uur bij 37 graden Celsius.

Bepaal vervolgens de minimale bacteriedodende concentratie van het antibioticum door de grens voor bacteriegroei met het oog te identificeren. In dit experiment werden de twee verschillende minimale BACTERICIDALE concentratietests gebruikt om de gevoeligheid van PA 14 wild type te vergelijken met een mutante stam die het antibioticumresistentiegen NDVB mist.

Hier werden de minimale bacteriedodende concentraties van het antibioticum tobramycine gemeten voor de biofilm. De MBCB voor PA 14 is 100 microgram per milliliter vergeleken met 12,5 microgram per milliliter voor de mutant. Daarentegen was de minimale bacteriedodende concentratie van tobramycine voor de planktonische cellen acht microgram per milliliter voor zowel PA 14 wild type als mutant.

Eenmaal onder de knie, kan de NBCB in ongeveer een uur worden gedaan, verdeeld over vijf dagen.