Remote Magnetische Aansturing van Micrometrische Probes voor

Het algemene doel van het volgende experiment is om in C twee metingen uit te voeren van de lokale fysische eigenschappen van een bacteriële biofilm op micrometrische schaal. Om dit te bereiken, worden magnetische deeltjes in een groeiende biofilm geïntroduceerd om te dienen als probes die op afstand kunnen worden aangestuurd zonder de structurele eigenschappen van de biofilm te verstoren. Vervolgens worden speciale magnetische tweezers gebruikt om een gedefinieerde kracht uit te oefenen op elk deeltje.

Wanneer deze zijn ingebed in de biofilm, wordt de door magnetische trekking veroorzaakte verplaatsing van de deeltjes gemonitord met videomicroscopie om de lokale visco-elastische parameters af te leiden en de 3D-ruimtelijke distributie van de mechanische eigenschappen van de biofilm in kaart te brengen. De resultaten tonen de mechanische heterogeniteit van de E. coli-biofilm aan en geven aan welke biofilmcomponenten bijdragen aan de fysieke eigenschappen van de biofilm. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden zoals microscopie, reologie of analyse van de gehele biofilm is dat deze de ruimtelijke distributie van de mechanische eigenschappen in situ rapporteert zonder de oorspronkelijke structuur van het materiaal te verstoren.

Om de magnetische deeltjes voor dit protocol voor te bereiden, wordt het voorraadflesje met 2,8 micrometer deeltjes gevortext om ze opnieuw te suspenderen. Breng vervolgens 10 microliters over naar een microcentrifugebuisje. Om de deeltjes te wassen, worden 190 microliters minimaal medium toegevoegd en wordt het buisje gedraaid; plaats het buisje op een magnetisch monsterrek, wacht tot er een pellet is gevormd en aspireer de supernatante oplossing.

Herhaal deze wasstap nog twee keer en resuspendeer de beads in 190 µL minimum medium. Voeg vervolgens 950 µL M 63 B one met 0,4% glucose toe aan 50 µL van de gewassen bead-oplossing om de partikelconcentratie aan te passen naar ongeveer 5 miljoen beads per milliliter. Gebruik om het kanaal voor te bereiden een diamantglassnijder om twee vierkante borosilicaatglascapillairen van 10 centimeter te snijden, zodat twee stukken van acht centimeter lang worden verkregen.

Snijd met de glasnijper een objectglas doormidden. Bevestig vervolgens de twee capillaire stukken met een snelwerkende cyanoacrylaatlijm of secondelijm aan de twee stukken objectglas, zoals weergegeven in dit diagram. Plaats ze op twee centimeter afstand van elkaar met een oversteek van één centimeter aan beide uiteinden, en autoclaveer de volledige opstelling samen met de benodigde slang.

Verzamel voor de verdere aansluiting van het kanaal de volgende steriele materialen onder een laminaire flowkap: de gemonteerde kanaalslangen en connectoren, twee pediatrische luchtbellenfilters of vallen, twee klemmen, spuiten van 30 milliliter gevuld met M 63 B, 1,4%glucose en de afvalfles.

Sluit de twee capillairen op dezelfde manier aan. Gebruik hiervoor een van de buisjes. Verbind de afvalfles met het uiteinde van één capillair.

Gebruik vervolgens luer-lockconnectoren als koppelingen om het andere uiteinde van de capillair te verbinden met de zelfgemaakte beltenval, of val één met val twee. Verbind vervolgens de spuit van 30 milliliter met M 63 B1 met val twee. Vul daarna de opstelling met steriel M 63 B1 met 0,4% glucose.

Plaats de spuit in de spuitenpomp en zet de spuitenpomp aan op een snelheid van ongeveer vijf milliliter per uur hoger dan de experimentele snelheden. Volg zorgvuldig alle luchtbellen in het circuit en verwijder deze indien nodig. Koppel het circuit los en sluit het opnieuw aan tijdens het uitvoeren van deze procedure.

Zorg ervoor dat alle luchtbellen worden verwijderd voordat en tijdens het introduceren van het cel-partikelmengsel in de slang; het helpt om het reservoir boven de capillairen te plaatsen, wat bijdraagt aan de continue groei van de biofilm. Laat het medium 10 tot 15 minuten door het systeem stromen. Meng in de tussentijd in een microcentrifugebuis één milliliter van de bacteriële suspensie bij een optische dichtheid van 0,5 met één milliliter van de eerder bereide gewassen krappeloplossing.

Zet de doorstroming uit, bevestig de slang opnieuw en sluit vervolgens de klemmen. Vul daarna een spuit van 1 mL met het mengsel van bacterie-beads en breng dit over in de capillair. Verplaats de opstelling na de zelfgemaakte bellenvanger naar de microscoop.

Installeer de capillair op de microscooptafel en plaats de afvalbak op een iets hoger niveau. Zet de spuitpomppomp op het aanrecht naast de microscoop. Laat de apparatus 15 tot 20 minuten staan zodat de bacteriën kunnen bezinken en zich aan het oppervlak van de capillair kunnen hechten.

Zodra de bacteriën zich aan de capillaire hebben gehecht, opent u de klemmen, stelt u de stroomsnelheid op de spuitpomp in en start u de stroming. Gedurende 24 tot 48 uur zal er een biofilm op het capillaire oppervlak ontstaan; focus op het bodemvlak van de capillaire en start de time-lapse opname van de monsterbeelden. Gewoonlijk is een acquisitiefrequentie van twee beelden per minuut voldoende om de biofilmgroei te rapporteren.

Deze video laat de beginfase van de biofilm zien vlak na de injectie van het mengsel van celdeeltjes. Bij de acquisitie in de haarbuis is de frequentie één beeld per seconde en de video wordt afgespeeld met 10 frames per seconde. Na vier uur groei raakten deeltjes geleidelijk los van het oppervlak om zich te verspreiden over het volume van de biofilm.

De blauwe pijlen markeren detachementgebeurtenissen. Hier is de acquisitiefrequentie twee beelden per minuut en wordt de film afgespeeld met 15 frames per seconde. Na 20 uur groei kunnen een dozijn gelijkmatig verdeelde deeltjes in een brandvlak worden gemonitord.

Deze film is opgenomen in een middenvlak, 20 micrometers boven de bodem van de capillair. Er werden twee beelden per minuut vastgelegd. De film wordt afgespeeld met 15 frames per seconde.

Zodra de biofilm die is gezaaid met magnetische deeltjes handmatig groeit, schroeft u de magnetische pincet op de microscooptafel. Om ervoor te zorgen dat de juiste magnetische veldgradiënten in de observatiezone worden gegenereerd, dient u erop te letten dat de pincet wordt geplaatst zoals getoond in dit diagram, waarbij het in rood aangegeven meetgebied zich op 300 micrometers van de randen van de linker- en rechterpolen van de pincet bevindt langs de Y-as. De bodem van de capillair wordt 200 micrometers onder de onderkant van de pincet geplaatst.

Om deze stap uit te voeren, gebruikt u de XY-bewegingscontrole van de microscooptafel om de rand van de linker magnetische pool en de linkerzijde van de haarbuis bij elkaar te brengen. Pas in hetzelfde gezichtsveld de positie van de pool aan tot deze zich op 300 micrometers van de rand van de haarbuis bevindt, met behulp van de x-draaiknop van de linker micromanipulator van de pincet. Voer dezelfde handeling uit aan de rechterzijde.

Pas vervolgens de positie van de pincet langs de Z-as aan ten opzichte van de onderkant van de capillair. Lijn eerst de onderkant van de polen uit met de onderkant van de capillair en verschuif de polen 200 micrometers omhoog.

Stel met de Z-draaischijf van de micromanipulator de parameters van de functiegenerator in op 24 seconden nulsignaal en 16 seconden vier ampère. Gelijkstroom met een trigger. Stuur dit na 20 seconden naar de sluiter van het helderveldlicht.

Sluit voor signaalsynchronisatie de pincet via de vermogensversterker aan op de functiegenerator. Let erop dat de polen correct in serie worden aangesloten om ruimtelijk verdeelde kruipcurven te verkrijgen. Bepaal een ruimtelijk nulpunt en stel de oorsprong van de Z-as in op de binnenzijde van de bodem van de capillair.

Noteer de Z-controlepositie van de microscoop. Bepaal vervolgens het snijpunt van de x- en Y-as, die respectievelijk worden gedefinieerd door de rand van de capillair en de rand van het poolstuk. Dit is het nulpunt van de analyse.

Noteer de coördinaten. Alle coördinaten in het vervolg worden bepaald ten opzichte van deze oorsprong. Zodra de biofilm is gegroeid, wordt de verticale positie van de capillair met de fijninstelknop aangepast, zodat het eerste vlak zich 4 tot 7 µm boven de bodem van de capillair bevindt.

Deze doorsnede komt overeen met de biofilmdoorsnede waarin de oorsprong van het ruimtelijke referentiekader zich in de linkerbovenhoek bevindt. Schakel vervolgens de stroomgenerator in en start handmatig de beeldacquisitiesequentie. Om de 42ste reeks gebeurtenissen te initiëren, komt de hier verkregen beeldstroom overeen met een bepaald vlak en XY-veld.

Nadat de sequentie is vastgelegd, verplaatst u de capillaire om een video van het nieuwe veld op te nemen. Herhaal dit proces tot alle benodigde video's voor de data-analyse zijn verkregen. Open de afbeeldingen in ImageJ of een gelijkwaardige particle tracking-software voor alle acquisitiebestanden van alle deeltjes.

Zet de afbeeldingen om in tekstbestanden door de verplaatsing van deeltjes te volgen. Gebruik vervolgens een softwareprogramma voor gegevensverwerking om de verplaatsingscurven te tekenen en zet deze verplaatsingscurven om in compliantiecurven, waarin de totale compliantie van het materiaal JFT wordt berekend als functie van de tijd volgens de hier getoonde compliantieformule. Deze formule beschrijft de relatie tussen de uitgeoefende spanning en de rek van het materiaal voor een historisch deeltje van reds, of ingebed in het viscoelastische en onsamendrukbare medium zoals eerder vastgesteld door zijn medewerkers. Leid uit de aanpassing van de kruipcompliantiecurve aan het algemene Burgers-model voor viscoelastische materialen de viscoelastische parameters J zero J one at the zero at the one prime af om de ruimtelijke distributie van de viscoelastische eigenschappen van de biofilm te verkrijgen. Kruipcurven werden verzameld op verschillende dieptes in een biofilmmicrovolume van ongeveer 200 by 200 by 40 cubic micrometers. Typische resultaten worden hier getoond.

De waarden van J nul, de elastische compliantie, worden weergegeven als een functie van de Z-as langs de diepte en de y-as langs een laterale dimensie van de biofilm. Elk punt komt overeen met een bolletje waarvoor creepcurve-analyse een J nul-waarde heeft opgeleverd. De gegevens laten zien dat de lokale compliantie langs de diepte van de biofilm varieert over bijna drie grootteordes.

Bovendien was er sprake van een sterke laterale heterogeniteit op alle biofilmhoogtes. De gegevens geven daarnaast de distributie van de compliantiewaarden weer, die een wijdverspreide en asymmetrische vorm vertonen. Een vergelijking van deze resultaten met die welke eerder zijn verkregen bij andere biologische polymeren suggereert dat de mechanische eigenschappen van de biofilm worden ondersteund door sterk vertakte polymeergels.

In C werden ook twee metingen van de lokale eigenschappen van de biofilm uitgevoerd onder verschillende omgevingsomstandigheden, zoals een lagere stroomsnelheid, zoals hier te zien is. De compliantiewaarden van een biofilm die is gegroeid bij 0,1 milliliter per uur vertonen nog steeds een zeer heterogeen mechanisch profiel. De duidelijke Z-diepteafhankelijkheid van de stijfheid van de biofilm, die werd waargenomen bij de biofilm gegroeid bij één milliliter per uur, is echter verdwenen.

Deze resultaten tonen de significante impact van de externe condities op de organisatie van de biofilm aan. Na het bekijken van de video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe de visco-eigenschappen van de biofilm in kaart worden gebracht onder volledig gecontroleerde groeicondities.