Remote Magnetische Aansturing van Micrometrische Probes voor In situ 3D Mapping van bacteriële biofilm Fysische eigenschappen

Het algemene doel van het volgende experiment is om in C twee metingen uit te voeren van de lokale fysische eigenschappen van een bacteriële biofilm op micrometrische schaal. Om dit te doen, worden magnetische deeltjes in een groeiende biofilm geïntroduceerd om als sondes te dienen die op afstand kunnen worden aangestuurd zonder de structurele eigenschappen van de biofilm te verstoren. Vervolgens worden speciale magnetische pincetten gebruikt om een gedefinieerde kracht op elk deeltje uit te oefenen.

Ingebed in de biofilmfilm wordt de door de magnetische trek geïnduceerde verplaatsing van het deeltje gecontroleerd met behulp van videomicroscopie om de lokale visco-elastische parameters af te leiden en de 3D ruimtelijke verdeling van de mechanische eigenschappen van de biofilm te geven. Er worden resultaten verkregen die de mechanische heterogeniteit van de e coli-biofilm tonen en aanwijzingen geven over welke biofilmcomponenten de fysische eigenschappen van de biofilm ondersteunen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden zoals microscopie, ecologie of volledige biovegetatie, is dat deze de ruimtelijke verdeling van de mechanische eigenschappen in situ rapporteert zonder de oorspronkelijke structuur van het materiaal te verstoren.

Om magnetische deeltjes voor dit protocol voor te bereiden, moet de voorraadvial van vortex met 2,8 micrometer deeltjes worden gevormd om ze opnieuw te suspenderen. Breng vervolgens 10 microliter over naar een microcentrifugebuisje. Om de deeltjes te wassen, voegt u 190 microliter minimummedium toe en draait u het buisje, plaatst u het op een magnetische monsterrek, wacht u op de vorming van een pellet en zuigt u de supernatantoplossing af.

Herhaal deze wasstap nog twee keer en suspendeer de kralen in 190 microliter minimummedium. Voeg vervolgens 950 microliter M 63 B een met 0,4% glucose toe aan 50 microliter van de gewassen kralenoplossing om de deeltjesconcentratie aan te passen tot ongeveer 5 miljoen kralen per milliliter. Gebruik een diamantglasmes om twee vierkante borosilicaat glasbuisjes van 10 centimeter lang te snijden om twee acht centimeter lange stukken te verkrijgen.

Gebruik de glasmes om een glasplaat in tweeën te snijden. Gebruik vervolgens een snelwerkende cyanoacrylaatlijm of superlijm om de twee capillaire stukken aan twee glasplaatstukken te hechten zoals in dit diagram wordt getoond. Twee centimeter uit elkaar met een centimeter overhang aan beide uiteinden autoclaveer de hele setup en de benodigde buis die vereist is.

Voor verdere kanaalverbinding, verzamel de volgende steriele materialen onder een lanar stroomkap. De gemonteerde kanaalbuis en connectoren, twee pediatrische bubbelfilters of -vallen. Twee klemmen, 30 milliliter spuiten gevuld met M 63 B, 1,4% glucose en de afvalfles.

Verbind de twee capillairen op dezelfde manier. Gebruik een van de buizen. Verbind de afvalfles met een capillaire uiteind.

Verbind vervolgens het andere uiteinde van het capillair met de zelfgemaakte bubbelval of val één en val één tot val twee. Verbind vervolgens de 30 milliliter M 63 B een spuit met de val twee. Vul vervolgens de setup met steriele M 63 B een met 0,4% glucose.

Installeer de spuit op de spuitpomp en zet de spuitpomp aan met een snelheid van ongeveer vijf milliliter per uur hoger dan de experimentele snelheden. Volg zorgvuldig en elimineer indien nodig alle bellen in de circuit. Ontkoppel en herkoppel het circuit tijdens het uitvoeren van deze procedure.

Zorg ervoor dat u alle luchtbellen verwijdert voor en wanneer u het celdeeltjesmengsel in de buis introduceert, het helpt om de prullenbak boven de capillairen te plaatsen, en dit zal helpen voor de continue groei van de biofilm. Laat het medium 10 tot 15 minuten door het systeem stromen. Ondertussen, in een microcentrifugebuisje, meng één milliliter van de bacteriële suspensie bij optische dichtheid 0,5 met één milliliter van de eerder bereide gewassen kralenoplossing.

Schakel de flow uit, bevestig de buis opnieuw en sluit vervolgens de klemmen. Vul vervolgens een spuit van één milliliter met het bacterie-kralenmengsel en breng het in de capillair. Na de zelfgemaakte bubbelval brengt u het apparaat naar de microscoop daar.

Installeer de capillair op de microscooptafel en plaats de afvalinische op een iets hoger niveau. Plaats de spuitpomp op de aanrecht boven de microscoop. Laat het apparaat 15 tot 20 minuten staan om de bacteriën te laten bezinken en zich te hechten aan het oppervlak van de capillair.

Zodra de bacteriën zich aan de capillair hebben gehecht, opent u de klemmen en past u de stroomsnelheid op de spuitpomp aan en start u de stroom. In de loop van 24 tot 48 uur zal zich een biofilm ontwikkelen op het oppervlak van de capillair, focus op het capillaire bodemvlak en start de time-lapse opname van de monsterbeelden. Gewoonlijk zal een acquisitiefrequentie van twee beelden per minuut de groei van de biofilm voldoende rapporteren.

Deze film toont het beginstadium van de biofilm net na injectie van het celdeeltjesmengsel. In de capillaire acquisitie is de frequentie één beeld per seconde en de film wordt afgespeeld met 10 frames per seconde. Na vier uur groei, loslaten deeltjes zich progressief van het oppervlak om zich te verspreiden in het biofilmvolume.

De blauwe pijlen markeren loslatingsevenementen. Hier is de acquisitiefrequentie twee beelden per minuut en de film wordt afgespeeld met 15 frames per seconde. Na 20 uur groei kan een dozijn gelijkmatig verdeelde deeltjes worden gecontroleerd in een focusvlak.

Deze film is genomen in een middelste vlak, 20 micrometer boven de capillaire bodem. Twee beelden werden per minuut verkregen. De film wordt afgespeeld met 15 frames per seconde.

Zodra de met magnetische deeltjes gezaaide biofilm handmatig groeit, schroef de magnetische pincetten op de microscooptafel. Om ervoor te zorgen dat de geschikte magnetische veldgradiënten worden gegenereerd in de observatiezone, zorg ervoor dat de pincetten worden geplaatst zoals in dit diagram, waarin het meetgebied in rood is weergegeven, dat zich op 300 micrometer van