Name: Remote Magnetische Aansturing van Micrometrische Probes voor In situ 3D Mapping van bacteriële biofilm Fysische eigenschappen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 42 s
Description: Leer hoe je magnetische deeltjes gebruikt om de lokale visco-elastische eigenschappen van E. coli-biofilms in situ te meten zonder de structuur te verstoren. Deze methode biedt inzicht in de mechanische heterogeniteit van biofilms.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit werk werd mede ondersteund door subsidies van de Agence Nationale pour la Recherche, PIRIbio programma Dynabiofilm en van CNRS Interdisciplinair Risk programma. Wij danken Philippe Thomen voor zijn kritische lezing van het manuscript en Christophe Beloin voor het verstrekken van de E. coli stam gebruikt in dit werk.

1. Bacteriën Cultuur en Suspension Voorbereiding <ol><li> Kies een vers gekweekte kolonie uit lysogenie Broth (LB) agar plaat, inoculeren in 5 ml vloeibaar LB-medium dat 100 μ g / ml ampicilline en 7,5 μ g / ml tetracycline en incubeer voor 5 tot 6 uur bij 37 ° C op een trillende platform. </li><li> Voeg vervolgens 100 μ l van de bacteriecultuur in 5 ml minimaal medium (M63B1) aangevuld met 0,4% glucose en hetzelfde antibioticum concentraties. Incubeer dit vers verdund cultuur overnacht bij 37 ° C op een schuddend platform. </li><li> Na 16 uur incubatie, voeg 100 ul van de kweek van een nacht tot 5 ml M63B1, 0,4% glucose. Houd de buis bij 37 ° C om de schudtafel tot 0,5 OD wordt bereikt. De suspensie is dan gereed voor injectie in het experiment kanaal voor biofilmvorming. </li></ol> 2. Magnetic Particle Voorbereiding <ol><li> Neem 10 pi magnetische deeltjes -2.8 μ m in diameter - van de voorraad en was ze 3x in 190 ul minimaal medium met behulp van een magnetische monster rek. </li><li> Stel het deeltje concentratie 5 x 10 6 kralen / ml. Typically 50 pl van de gewassen korrel oplossing wordt gemengd met een verdere 950 μ l M63B1 0,4% glucose. </li></ol> 3. Channel Voorbereiding en biofilmgroei <ol><li> Kanaal Montage <ol><li> Snijd twee vierkante (800 μ m lengte) borosilicaatglas haarvaten 10 cm lang om twee 8 cm lange stukken te verkrijgen. </li><li> Lijm de twee capillaire stukken op twee glasplaatjes - gehalveerd eerste - 2 cm van elkaar met 1 cm overhang aan beide zijden zoals in figuur 1 met behulp van een snelwerkende cyanoacrylaat lijm (de zogenaamde super-lijm). </li><li> Autoclaaf de gehele installatie en de nodige slangen nodig voor de verdere kanaal aansluiting. </li><li> Verzamel alle steriele materialen ondereen laminaire stroming kap: i) de gemonteerde kanaal en val 1, ii) de slangen en aansluitingen, iii) de twee bubble vallen - de zeepbel filter vaak gebruikt om kinderen sondevoeding (trap 1) en de zelfgemaakte opvanginrichting beveiligen als een 4 cm lange buis met een grotere diameter (trap 2), iv) klemmen, v) 30 ml spuiten gevuld met M63B1, 0,4% glucose, en vi) de fles afval. </li><li> Sluit de hele setup met Luer Lock connectoren of kruispunten in de volgende volgorde: 50 ml M63B1 spuit gecontroleerd door de injectiepomp, pediatrische bubble filter, zelfgemaakte Waterventiel, capillair (Figuur 1, paneel B), en de buis om de fles afval. Vul dan de opstelling met steriele M63B1, 0,4% glucose, het inschakelen van de injectiespuit pomp met een snelheid van ongeveer 10 ml / uur, hoger dan de experimentele tarieven. Zorgvuldig volgen en elimineren alle bubbels in het circuit. </li><li> Stroming het medium door het systeem gedurende 10-15 min; gelijktijdig mix 1 ml van de bacterie suspensie bij OD 0.5 van Sectie1.3 met 1 ml van de gewassen kraal oplossing bereid in paragraaf 2.2. </li><li> Bevestig (maar niet sluiten) klemmen om de buis op twee posities: voor en na de haarvaten. Schakel de stroom uit. </li><li> Introduceer de bacteriële-kraal mengsel in de capillair achter de zelfgemaakte opvanginrichting met behulp van een 1 ml spuit, zorg te houden van de buis eindigt aan de lucht insleep te voorkomen. Terugplaatsen van de slang en sluit de klemmen. </li><li> Herhaal dezelfde procedure voor de tweede capillaire en laat U alle buizen voor bubbels. </li><li> Breng de inrichting aan de microscoop en laat het gedurende 15-20 minuten staan ​​om de bacteriën in staat te regelen en hechten aan het oppervlak van het capillair. Installeer het capillair op de microscoop podium met de afvalcontainer op een iets hoger niveau. Plaats de spuit pomp op het aanrecht naast de microscoop. Verhoog de opvanginrichting voordat de capillaire iets hoger dan de capillaire vliegtuig naar bubbels te vangen. </li></ol></li><li> Biofilm Growth <ol><li> Stel het debiet op de spuit pomp en start de stroom, zal de biofilm nu ontwikkelen op de capillaire oppervlak tijdens de vereiste periode - meestal 24 of 48 uur in deze experimenten. </li><li> Focus op de capillaire bodem vlak en start de time-lapse-opname van de voorbeeldfoto&#39;s - meestal een overname frequentie van 2 beelden / zal min adequaat de biofilm groei melden. Deze video monitoren biofilmgroei nacontrole (zie uittreksels in Video&#39;s 1, 2 en 3). </li></ol></li></ol> 4. Magnetisch pincet Installatie <ol><li> Schroef de magnetische pincet op handbediende XYZ micromanipulators en schroef de micromanipulators op de microscoop podium om de positie van de pincet passen ten opzichte van het capillair. Plaats de pincet zoals in figuur 2 te zorgen voor de juiste magnetische veldgradiënt wordt opgewekt in de waarneming zone. </li><li> Sluit de pincet to de functie generator via de eindversterker om een ​​40 sec periode van 24 sec nul signaal en 16 sec van 4 A gelijkstroom met een trekker naar het helder veld licht sluiter wordt na 20 seconden voor signaalsynchronisatie verstrekken van een reeks te genereren gebeurtenissen zoals in Figuur 3. NB: De twee bewerkingen kunnen op elk moment tussen capillaire installatie en meting begin bereikt. Zie experimenteren overzicht schets in figuur 4. </li></ol> 5. Creep Curve Acquisitie <ol><li> Gebruik de xy bewegingscontrole van de microscoop fase naar de rand van de linker magnetische pool en de linker rand van het capillair in de observatie hetzelfde veld brengen. Neem de oorsprong van de analyse referentiële op de kruising van x-en y-as gedefinieerd door de rand van het capillair en de rand van het poolstuk, respectievelijk (zie figuur 2). </li><li> Pas de verticale positie van het capillair met behulp van fijne Focus Controle knop van de microscoop positie. Typisch de eerste onderzochte vlak ligt tussen 4 tot 7 μ m boven het capillaire bodem. Video 1 correspondeert met het xy veld dat de linker hoek heeft aan de basis van de ruimtelijke referentiële. </li><li> Trigger de 40 sec opeenvolging van gebeurtenissen in punt 4.2 en figuur 3 beschreven door het inschakelen van de stroomgenerator en tegelijkertijd handmatig activeren de beeldacquisitie sequentie Video 1. </li><li> Verplaats de capillair naar rechts veld buurman een 250 μ m vertaling van de microscooptafel naar links en werken als in paragraaf 5.3 tot Video 2 van schijf 2 te genereren en zo verder tot de gewenste video verkrijgen. Typisch 3 tot 4 gebieden 250 x 250 μ m 2 verzameld langs de x-as alvorens de vliegtuig en herhalen dezelfde handelingen voor het nieuwe vliegtuig. </li></ol> 6. Kracht IJking <ol><li> Bereid een glycerol-oplossing door het mengen van 39,8 g glycerol met 190 μ l van bi-gedestilleerd water en 10 ul van magnetische deeltjes in een 2 x 10 9 deeltjes / ml en vul een experimenteel kanaal met dit mengsel en plaats het op de microscoop podium zoals beschreven voor de biofilm monster. </li><li> Na het installeren van de magnetische pincet als vermeld in paragraaf 4, gelden de magnetische kracht als vermeld in paragraaf 5.4 en maak time-lapse beelden telkens voor een enkele snelheid deeltje (v) en haar positie in de capillaire halen om de kalibratie-bestand af te leiden. Dit bestand moet de uitgeoefende kracht bevatten als functie van de positie in de zone van de analyse van de capillair volgens de wet van Stokes, F = 6πRηv (R: straal van het deeltje). </li></ol> 7. Analyse <ol><li> Gebruik een &quot;particle tracker&quot; software om tekstbestanden te verkrijgen met het deeltje posities in elk frame voor alle stapels van beelden verkregen als vermeld in paragraaf 5. Using het beeld stapel overname frequentie, bereken het deeltje verplaatsing als functie van de tijd (bijvoorbeeld Figuur 5 en video 4). </li><li> De kracht kalibratiebestand, zet de verplaatsingscurven naleving curves (totaal conformiteit van het materiaal - J (t) - als functie van de tijd) afhankelijk van de mate formule: <img alt="" fo:content-width="1in" src="/files/ftp_upload/50857/50857eq1.jpg" width="106" /> waarin de relatie tussen materiaalspanning geeft en toegepaste spanning voor een probe deeltje met straal R ingebed in een onsamendrukbare, homogeen viscoelastische medium zoals eerder vastgesteld Schnurr en medewerkers 19. </li><li> Pas de kruip compliantiecurven de algemene Burgers model voor visco-elastische materialen en ontlenen de visco-elastische parameters, J 0, J 1, η 0, η 1 voor elk deeltje ( <strong&gt; Figuur 6) volgens de formule van de Burgers &#39;: <img alt="" fo:content-width="2in" src="/files/ftp_upload/50857/50857eq2.jpg" width="169" /> Opmerking: Deze fenomenologische analyse is eerder toegepast voor uiteenlopende materialen zoals biologische materialen zoals biofilms macroscopische reologie interpreteren 20-22. </li></ol>

<ol><li>Hall-Stoodley, L., Costerton, J. W., Stoodley, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+biofilms%3A+from+the+natural+environment+to+infectious+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Bacterial biofilms: from the natural environment to infectious diseases.</a> Nat Rev Microbiol. 2, 95-108 (2004).</li>
<li>Donlan, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilms%3A+microbial+life+on+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Emerg+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Biofilms: microbial life on surfaces.</a> Emerg Infect Dis. 8, 881-890 (2002).</li>
<li>Costerton, J. W., Stewart, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Battling+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+American%22%5BJournal%5D)">Battling biofilms.</a> Scientific American. 285, 74-81 (2001).</li>
<li>Branda, S. S., Vik, S., Friedman, L., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilms%3A+the+matrix+revisited%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Biofilms: the matrix revisited.</a> Trends Microbiol. 13, 20-26 (2005).</li>
<li>Flemming, H. C., Wingender, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biofilm+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The biofilm matrix.</a> Nat Rev Microbiol. 8, 623-633 (2010).</li>
<li>Costerton, J. W., Stewart, P. S., Greenberg, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+biofilms%3A+a+common+cause+of+persistent+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Bacterial biofilms: a common cause of persistent infections.</a> Science. 284, 1318-1322 (1999).</li>
<li>Stewart, P. S., Franklin, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+heterogeneity+in+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Physiological heterogeneity in biofilms.</a> Nat Rev Microbiol. 6, 199-210 (2008).</li>
<li>Stoodley, P., Lewandowski, Z., Boyle, J. D., Lappin-Scott, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+deformation+of+bacterial+biofilms+caused+by+short-term+fluctuations+in+fluid+shear%3A+an+in+situ+investigation+of+biofilm+rheology%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+bioengineering%22%5BJournal%5D)">Structural deformation of bacterial biofilms caused by short-term fluctuations in fluid shear: an in situ investigation of biofilm rheology.</a> Biotechnology and bioengineering. 65, 83-92 (1999).</li>
<li>Klapper, I., Rupp, C. J., Cargo, R., Purvedorj, B., Stoodley, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viscoelastic+fluid+description+of+bacterial+biofilm+material+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Viscoelastic fluid description of bacterial biofilm material properties.</a> Biotechnol Bioeng. 80, 289-296 (2002).</li>
<li>Korstgens, V., Flemming, H. C., Wingender, J., Borchard, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uniaxial+compression+measurement+device+for+investigation+of+the+mechanical+stability+of+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+microbiological%22%5BJournal%5D)">Uniaxial compression measurement device for investigation of the mechanical stability of biofilms.</a> Journal of microbiological. 46, 9-17 (2001).</li>
<li>Cense, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+properties+and+failure+of+Streptococcus+mutans+biofilms%2C+studied+using+a+microindentation+device%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+microbiological+methods%22%5BJournal%5D)">Mechanical properties and failure of Streptococcus mutans biofilms, studied using a microindentation device.</a> Journal of microbiological methods. 67, 463-472 (2006).</li>
<li>Shaw, T., Winston, M., Rupp, C. J., Klapper, I., Stoodley, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Commonality+of+elastic+relaxation+times+in+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Review+Letters%22%5BJournal%5D)">Commonality of elastic relaxation times in biofilms.</a> Physical Review Letters. 93, (2004).</li>
<li>Towler, B. W., Rupp, C. J., Cunningham, A. B., Stoodley, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viscoelastic+properties+of+a+mixed+culture+biofilm+from+rheometer+creep+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Biofouling%22%5BJournal%5D)">Viscoelastic properties of a mixed culture biofilm from rheometer creep analysis.</a> Biofouling. 19, 279-285 (2003).</li>
<li>Lau, P. C., Dutcher, J. R., Beveridge, T. J., Lam, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Absolute+quantitation+of+bacterial+biofilm+adhesion+and+viscoelasticity+by+microbead+force+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+journal%22%5BJournal%5D)">Absolute quantitation of bacterial biofilm adhesion and viscoelasticity by microbead force spectroscopy.</a> Biophysical journal. 96, 2935-2948 (2009).</li>
<li>Poppele, E. H., Hozalski, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micro-cantilever+method+for+measuring+the+tensile+strength+of+biofilms+and+microbial+flocs%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+microbiological+methods%22%5BJournal%5D)">Micro-cantilever method for measuring the tensile strength of biofilms and microbial flocs.</a> Journal of microbiological methods. 55, 607-615 (2003).</li>
<li>Aggarwal, S., Poppele, E. H., Hozalski, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+testing+of+a+novel+microcantilever+technique+for+measuring+the+cohesive+strength+of+intact+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+bioengineering%22%5BJournal%5D)">Development and testing of a novel microcantilever technique for measuring the cohesive strength of intact biofilms.</a> Biotechnology and bioengineering. 105, 924-934 (2010).</li>
<li>Guélon, T., Mathias, J. -D., Stoodley, P. Biofilm Highlights. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGu%C3%A9lon%2C+T+%22Series+on+Biofilms+%28eds+Hans-Curt+Flemming%2C+Jost+Wingender%2C+%26+Ulrich+Szewzyk%29%22">Series on Biofilms (eds Hans-Curt Flemming, Jost Wingender, & Ulrich Szewzyk)</a>. 5, Springer. Berlin Heidelberg. (2011).</li>
<li>Galy, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+of+Bacterial+Biofilm+Local+Mechanics+by+Magnetic+Microparticle+Actuation%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+journal%22%5BJournal%5D)">Mapping of Bacterial Biofilm Local Mechanics by Magnetic Microparticle Actuation.</a> Biophysical journal. 103, 1-9 (2012).</li>
<li>Schnurr, B., Gittes, F., MacKintosh, F. C., Schmidt, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determining+Microscopic+Viscoelasticity+in+Flexible+and+Semiflexible+Polymer+Networks+from+Thermal+Fluctuations%5BTitle%5D)+AND+%22Macromolecules%22%5BJournal%5D)">Determining Microscopic Viscoelasticity in Flexible and Semiflexible Polymer Networks from Thermal Fluctuations.</a> Macromolecules. 30, 7781-7792 (1997).</li>
<li>Aggarwal, S., Hozalski, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+Strain+Rate+on+the+Mechanical+Properties+of+Staphylococcus+epidermidis+Biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Effect of Strain Rate on the Mechanical Properties of Staphylococcus epidermidis Biofilms.</a> Langmuir. 28, 2812-2816 (2012).</li>
<li>Towler, B. W., Cunningham, A., Stoodley, P., McKittrick, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+model+of+fluid-biofilm+interaction+using+a+Burger+material+law%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Bioeng%22%5BJournal%5D)">A model of fluid-biofilm interaction using a Burger material law.</a> Biotechnol Bioeng. 96, 259-271 (2007).</li>
<li>Jones, W. L., Sutton, M. P., McKittrick, L., Stewart, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+and+antimicrobial+treatments+change+the+viscoelastic+properties+of+bacterial+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Biofouling%22%5BJournal%5D)">Chemical and antimicrobial treatments change the viscoelastic properties of bacterial biofilms.</a> Biofouling. 27, 207-215 (2011).</li>
<li>Apgar, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple-particle+tracking+measurements+of+heterogeneities+in+solutions+of+actin+filaments+and+actin+bundles%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+journal%22%5BJournal%5D)">Multiple-particle tracking measurements of heterogeneities in solutions of actin filaments and actin bundles.</a> Biophysical journal. 79, 1095-1106 (2000).</li>
</ol>

We hebben niets te onthullen.

Deze magnetische deeltjes zaaien en trekken experiment geactiveerd in situ 3D-kaarten van de visco-elastische parameters van een groeiende biofilm in de oorspronkelijke staat. Deze benadering bleek de mechanische heterogeniteit van de E. coli biofilm hier gegroeid en gaf aanwijzingen te wijzen op de biofilm componenten ondersteunen van de biofilm fysische eigenschappen, sterk suggereert een fundamentele implicatie van de extracellulaire matrix en meer bepaald de mate van cross-linking. <p class="jo...

Bacteriële biofilms zijn gemeenschappen van bacteriën in verband met biologische of kunstmatige oppervlakken 1-3. Ze vormen van een adhesie-groeimechanisme gekoppeld aan de productie van polysaccharide-rijke extracellulaire matrix die het bouwwerk 4,5 beschermt en stabiliseert. Deze biofilms zijn niet alleen passief assemblages van cellen vast aan oppervlakken, maar georganiseerd en dynamische complexe biologische systemen. Wanneer bacteriën schakelen van plankton tot biofilm levensstijl, worden veranderingen in genexpressie en cel fysiologie en waargenomen als een stijging antibioticaresistentie en gastheer immuunsysteem aan de oorsprong van vele hardnekkige en chronische infecties 6. Echter, de gecontroleerde ontwikkeling van deze levende structuren bieden ook kansen voor de industrie en milieu-toepassingen, zoals het saneren van locaties met gevaarlijk afval, bio-filtratie van industrieel water of vorming van bio-belemmeringen voor de bodem en het grondwater te beschermen tegen Contaminatie. Terwijl de moleculaire kenmerken die specifiek zijn voor biofilm manier van leven in toenemende mate worden beschreven, de mechanismen achter de ontwikkeling van de gemeenschap en doorzettingsvermogen blijven onduidelijk. De recente ontwikkelingen op microschaal metingen met scanning elektrochemische of fluorescentiemicroscopie hebben deze levende organisaties is aangetoond dat aanzienlijke structurele, chemische en biologische heterogeniteit 7. Maar, tot nu toe, biofilm monteurs zijn vooral macroscopisch onderzocht. Zo waarneming van biofilm streamers vervorming als gevolg van variaties in fluïdumstroomsnelheden 8,9, uniaxiale druk van biofilm stukken heffen van agar medium of gegroeid op hoes schuift 10,11, dwarskracht biofilm vanuit het milieu en vervolgens overgebracht naar een parallelle plaat reometer 12,13, atomic force-spectroscopie met een glazen kraal en gecoat met een bacteriële biofilm bevestigd aan een AFM cantilever 14 of een speciale MICRocantilever methode voor het meten van de treksterkte van vrijstaande biofilm fragmenten 15,16 zijn uitgevoerd gedurende de laatste tien jaar, het verstrekken van nuttige informatie over de visco-elastische aard van het materiaal 17. Toch lijkt het waarschijnlijk dat gegevens over in situ biofilm mechanische eigenschappen verloren wanneer het materiaal wordt verwijderd uit zijn natuurlijke omgeving, die vaak in deze benaderingen was. Bovendien is de behandeling van de biofilm als een homogeen materiaal mist de gegevens over de mogelijke heterogeniteit van de fysische eigenschappen binnen de gemeenschap. Daarom is de exacte implicaties van de structuur mechaniek in de biofilmvorming en biologische eigenschappen, zoals genexpressie patroon of chemische gradiënten nauwelijks worden herkend. De overgang naar een microschaal beschrijving van de biofilm fysische eigenschappen, zijn nieuwe speciale gereedschappen nodig. Deze paper Gegevens een originele aanpak bedacht te bereikenmeting van lokale mechanische parameters in situ zonder de biofilm en waardoor tekening van de ruimtelijke verdeling van de microschaal materiaaleigenschappen en de mechanische heterogeniteit. Het principe van het experiment berust op de dotering van een groeiende biofilm met magnetische microdeeltjes gevolgd door hun afgelegen inladen met magnetische pincet in het rijpe biofilm. Deeltje verplaatsing onder gecontroleerde magnetische kracht toepassing afgebeeld onder de microscoop stelt lokale visco-elastische parameter afleiding, elk deeltje de rapportering van haar eigen lokale omgeving. Uit deze gegevens kan de 3D-mechanische profiel van de biofilm worden getrokken, onthullende ruimtelijke en milieuconditie afhankelijkheden. De hele experiment wordt hier getoond een E. coli biofilm die door een genetisch gemanipuleerde stam die een gederepresseerde F-achtige plasmide. De beschreven in een recent artikel 18 resultaten geven een unieke visie op het interieur van intacte biofilm mechanica.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Tabel 1: Reagentia en cellen</td></tr><tr><td>Magnetische deeltjes</td><td>Life technologies</td><td>14307D</td><td>Micrometrische magnetische deeltjes, 2,8 &micro;m diameter</td></tr><tr><td>Ampicilline (antibioticum)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9518</td><td></td></tr><tr><td>Tetracycline (antibioticum)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>87128</td><td></td></tr><tr><td>Bacterie-stam MG1655gfpF</td><td>UGB, Institut Pasteur, Frankrijk</td><td></td><td>Produceert F pili op het oppervlak, resistent tegen Ampicilline en tetracycline.</td></tr><tr><td colspan="4">Tabel 2: Capillairen en slangen</td></tr><tr><td>Filters voor kinderperfusie</td><td>Prodimed-Plastimed</td><td>6932002</td><td></td></tr><tr><td>Vierkante holle capillairen</td><td>Composite Metal Scientific</td><td>8280-100</td><td>Vervaardigd in borosilicaatglas. Vierkant 0,8 mm x 0,8 mm</td></tr><tr><td>Slang siliconenperoxide</td><td>VWR International</td><td>228-0512</td><td>Diameter 1 mm</td></tr><tr><td>Slang siliconenperoxide</td><td>VWR International</td><td>228-0700</td><td>Diameter 3 mm</td></tr><tr><td colspan="4">Tabel 3: Biofilmgroei</td></tr><tr><td>Lysogeny Broth (LB) oplossing</td><td>Amresco-VWR</td><td>J106-10PK</td><td>Standaard medium gebruikt om bacteriën te kweken.</td></tr><tr><td>M63B1 oplossing</td><td>Zelfgemaakt</td><td></td><td>Standaard minimaal medium gebruikt om bacteriën te kweken.</td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td>Gebruikt om M63B1 medium met 0,4% glucose te maken.</td></tr><tr><td colspan="4">Tabel 4: Elektronica</td></tr><tr><td>Camera EMCCD&nbsp;&nbsp;</td><td>Hamamatsu</td><td>C9100-02</td><td></td></tr><tr><td>Verwarmingsregelaar</td><td>World Precision Instruments</td><td>300354</td><td></td></tr><tr><td>Functiegenerator</td><td>Agilent Technologies</td><td>33210A</td><td></td></tr><tr><td>Vermogensversterker</td><td>Zelfgemaakt</td><td></td><td>Geeft een stroom signaal met amplituden tot 4 A.</td></tr><tr><td>Spuitpompen</td><td>Kd Scientific</td><td>KDS-220</td><td></td></tr><tr><td>Shutter</td><td>Vincent Associates</td><td>Uniblitz T132</td><td></td></tr><tr><td>Magneettang</td><td>Zelfgemaakt</td><td></td><td>Twee elektromagnetische polen, elk gemaakt van een koperen spoel met 2.120 windingen van 0,56 mm diameter koperen draad en zachte magnetische kernen (Supra50-Arcelor Mittal, Frankrijk) vierkant gevormd volgens de blauwdruk getoond in Figuur 10. De twee kernen zijn gemonteerd met de noordpool tegen de zuidpool, om een magnetische kracht in één richting langs de lengte van de capillair te genereren. Zie draadgegevens spoel in Figuur 11.</td></tr><tr><td colspan="4">Tabel 5: Optica</td></tr><tr><td>Omgekeerde microscoop&nbsp;</td><td>Nikon</td><td>TE-300</td><td></td></tr><tr><td>S Fluor x40 Objectief (NA 0,9, WD0,3)</td><td>Nikon</td><td></td><td>Dit is een objectief met een lange werkafstand die het mogelijk maakt om de biofilm in de diepte te observeren.</td></tr><tr><td>Epifluorescentiefilters: 1) voor groene fluorescentie: Exc 480/20 nm; DM 495; Em 510/20&nbsp; 2) voor rode fluorescentie: Exc 540/25 nm; DM 565; Em 605/55</td><td>Chroma</td><td>1)#49020 2)#31002</td><td>Deeltjesverplaatsing bij krachttoepassing wordt geregistreerd met behulp van de rode fluorescentiefilterblok.</td></tr><tr><td colspan="4">Tabel 6: Beeldanalyse</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH - deeltjesvolgplug-in</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

remote magnetische aansturing van micrometrische probes voor<em&gt; in situ</em&gt; 3d mapping van bacteriële biofilm fysische eigenschappen

Remote Magnetic Actuation of Micrometric Probes for in situ 3D Mapping of Bacterial Biofilm Physical Properties

Bacteriële hechting en groei interfaces tot de vorming van driedimensionale structuren heterogeen zogenaamde biofilms. De cellen woning in deze structuren worden samengehouden door fysische interacties gemedieerd door een netwerk van extracellulaire polymere stoffen. Bacteriële biofilms beïnvloeden vele menselijke activiteiten en het begrip van hun eigenschappen is cruciaal voor een betere controle van hun ontwikkeling - onderhoud of uitroeiing - afhankelijk van hun ongunstig, hetzij gunstig resultaat. Dit document beschrijft een nieuwe methode gericht op het meten in situ lokale fysische eigenschappen van de biofilm die was tot nu uitsluitend getoetst op een macroscopisch homogeen materiaal perspectief. De hier beschreven experiment omvat de invoering van magnetische deeltjes in een groeiende biofilm aan lokale sondes die op afstand worden bediend kan zonder verstoring van de structurele eigenschappen van de biofilm zaad. Dedicated magnetische pincet waren devekeld om een ​​bepaalde kracht uit te oefenen op elk deeltje ingebed in de biofilm. De setup is gemonteerd op het podium van een microscoop om de opname van time-lapse beelden van de deeltjes trekken kunnen ontstaan. De deeltjestrajecten wordt geëxtraheerd uit het trekken sequentie en de lokale visco-elastische parameters afgeleid uit elk deeltje verplaatsing curve, waardoor de 3D-ruimtelijke verdeling van de parameters. Het verkrijgen van inzicht in de biofilm mechanische profiel is van essentieel belang vanuit het oogpunt van een ingenieur van mening voor biofilm controle doeleinden, maar ook vanuit een fundamenteel perspectief op de relatie tussen de architectonische eigenschappen en de specifieke biologie van deze structuren te verduidelijken.

Een typische analyse zal de ruimtelijke verdeling van de visco-elastische parameters te leveren tegen de micron schaal op een levend biofilm zonder zijn oorspronkelijke schikking te verstoren. Typische resultaten worden getoond in figuur 7 waarin de waarden J 0 - de elastische uitvoering - gegeven als functie van de z-as langs de diepte en de y-as langs een dwarsafmeting van de biofilm. Elk punt komt overeen met een kraal die kruip curve analyse heeft gegeven van een J 0 waarde. De...

Dit document toont een originele methode gebaseerd op de afstandsbedieningsinrichting van magnetische deeltjes geënt in een bacteriële biofilm en de ontwikkeling van specifieke magnetische pincet meten in situ lokale mechanische eigenschappen van het complex levend materiaal gebouwd door micro-organismen aan grensvlakken.

Remote Magnetische Aansturing van Micrometrische Probes voor<em&gt; In situ</em&gt; 3D Mapping van bacteriële biofilm Fysische eigenschappen

Bacterial adhesion and growth on interfaces lead to the formation of three-dimensional heterogeneous structures so-called biofilms. The cells dwelling in ...

Het algemene doel van het volgende experiment is om in C twee metingen uit te voeren van de lokale fysische eigenschappen van een bacteriële biofilm op micrometrische schaal. Om dit te bereiken, worden magnetische deeltjes in een groeiende biofilm geïntroduceerd om te dienen als probes die op afstand kunnen worden aangestuurd zonder de structurele eigenschappen van de biofilm te verstoren. Vervolgens worden speciale magnetische tweezers gebruikt om een gedefinieerde kracht uit te oefenen op elk deeltje.Wanneer deze zijn ingebed in de biofilm, wordt de door magnetische trekking veroorzaakte verplaatsing van de deeltjes gemonitord met videomicroscopie om de lokale visco-elastische parameters af te leiden en de 3D-ruimtelijke distributie van de mechanische eigenschappen van de biofilm in kaart te brengen. De resultaten tonen de mechanische heterogeniteit van de E. coli-biofilm aan en geven aan welke biofilmcomponenten bijdragen aan de fysieke eigenschappen van de biofilm. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden zoals microscopie, reologie of analyse van de gehele biofilm is dat deze de ruimtelijke distributie van de mechanische eigenschappen in

remote-magnetic-actuation-micrometric-probes-for-situ-3d-mapping

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

Hier presenteren we een protocol dat het gebruik van Kelvin sonde krachtmicroscopie uitlegt als een hulpmiddel voor het genereren van hoge resolutie nano-schaal oppervlaktepotentiaal kaarten. Dit hulpmiddel werd toegepast om de rol van oppervlaktepotentiaal op de bindingscapaciteit van micro-organismen aan substraatoppervlakken te beoordelen.

Oppervlakte Potentieel Meting van Bacteriën Met behulp Kelvin Probe Force Microscopy

Deeltjesvolg-microreologie onderzoekt de viscoëlasticiteit van materialen. Hier wordt de techniek gebruikt om de viscoëlasticiteit, creep-compliantie en effectieve crosslinking-rollen van verschillende matrixcomponenten van een bacteriële biofilm te bepalen. De matrix bestaat uit polymere stoffen die door de bacteriën worden uitgescheiden en de componenten bepalen de structuur en mechanische eigenschappen van de biofilm.

In Situ Mapping van de mechanische eigenschappen van Biofilms per Particle volgen Microreologie

Dit protocol beschrijft een nieuwe methode te groeien en kwalitatief analyseren bacteriële biofilms op schimmeldraden door confocale en elektronenmicroscopie.

Een nieuwe methode voor Kwalitatieve Multi-schaal analyse van bacteriële biofilms op draadschimmelcel Koloniën met behulp van confocale en Electron Microscopy

Deze studie presenteert een nieuw protocol om direct mechanische kracht uit te oefenen op de celkern door middel van magnetische microbeads die in het cytoplasma worden afgeleverd en om gelijktijdige live-cell fluorescerende beeldvorming uit te voeren.

Combinatie van 3D Magnetic Force Actuator en multifunctionele fluorescentie beeldvorming om Nucleus Mechanobiology te bestuderen

Magnetische krachtmicroscopie (MFM) maakt gebruik van een verticaal gemagnetiseerde atomaire krachtmicroscopiesonde om monstertopografie en lokale magnetische veldsterkte met nanoschaalresolutie te meten. Het optimaliseren van de ruimtelijke resolutie en gevoeligheid van MFM vereist het balanceren van de afnemende hefhoogte tegen toenemende amplitude van de aandrijving (oscillatie) en profiteert van het werken in een dashboardkastje met inerte atmosfeer.

Magnetische krachtmicroscopieresolutie en -gevoeligheid optimaliseren om magnetische domeinen op nanoschaal te visualiseren

Hier beschrijven we een snelle magnetische pincetopstelling die nanomechanische metingen uitvoert op krachtgevoelige biomoleculen met de maximale snelheid van 1,2 kHz. We introduceren de toepassing ervan op DNA-haarspelden en SNARE-complexen als modelsystemen, maar het zal ook van toepassing zijn op andere moleculen die betrokken zijn bij mechanobiologische gebeurtenissen.

High-speed magnetisch pincet voor nanomechanische metingen aan krachtgevoelige elementen

Dit artikel presenteert een uitgebreid protocol voor PmbExM, een expansiemicroscopietechniek die speciaal is ontworpen voor Proteus mirabilis-biofilms . PmbExM maakt gebruik van een stapsgewijze enzymatische behandeling van biofilmmonsters om een isotrope, 4,3-voudige expansie te bereiken, waardoor superresolutieanalyse van de ruimtelijke organisatie van cellulaire en subcellulaire structuren binnen deze sessiele microbiële gemeenschappen mogelijk is.

Superresolutiebeeldvorming van Proteus mirabilis Biofilm door uitbreidingsmicroscopie

Er wordt een methode gepresenteerd voor het opleggen van oppervlaktetopografie van lichtabsorberende composietpolymeermaterialen, met name magnetoactieve elastomeren (MAE's), door gebruik te maken van lasermicrobewerking. Deze methode maakt een grote flexibiliteit mogelijk in topografische ontwerpen en rapid prototyping. Een voorbeeld van het structureren van MAE-oppervlakken, karakterisering en hun reactie op het externe magnetische veld wordt gedemonstreerd.

Lasermicrobewerking voor het ontwerp van de topografie van polymeeroppervlakken

Dit artikel beschrijft de basisprocedures voor het uitvoeren van optische in kaart brengen van experimenten in de Langendorff-geperfuseerde konijn hart met behulp van het panoramische imaging systeem, en de dubbele (spanning en calcium) beeldvormende modaliteit.

Multiparametrische Optische kaart brengen van de Langendorff-geperfuseerde Rabbit Heart

Dit document beschrijft de dissectie procedure, instrumentale setup, en de experimentele omstandigheden tijdens de optische in kaart brengen van de transmembraan potentiaal (Vm) en intracellulair calcium van voorbijgaande aard (CAT) in intacte geïsoleerde Langendorff doorbloed muis harten.

Optische kaart brengen van actiepotentialen en Calcium Transiënten in de muis Hart

Leer hoe je magnetische deeltjes gebruikt om de lokale visco-elastische eigenschappen van E. coli-biofilms in situ te meten zonder de structuur te verstoren. Deze methode biedt inzicht in de mechanische heterogeniteit van biofilms.

Remote Magnetische Aansturing van Micrometrische Probes voor

Meer video's verkennen