Name: Methoden voor het bestuderen van de werkingsmechanismen van Antipsychotica in Caenorhabditis elegans (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-02-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 35 s
Description: Leer methoden om antipsychotica te testen in Caenorhabditis elegans voor neurofarmacologie. Deze technieken meten effecten op ontwikkeling en faryngeale pomprate om inzicht te geven in werkingsmechanismen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Het werk werd ondersteund door een NIH Clinical Scientist Development award K08NS002083, een Shervert Frazier Research Institute Grant, en een NARSAD Young Investigator Award aan Edgar A. Buttner.

1. Developmental Delay / Letaliteit Assay: The Wild-Type (N2) en Two Mutant (Mut1 en Mut2) stammen worden beproefd in drie Clozapine Concentraties in een 12-well plaat <ol><li> Op dag 1, pour 2 ml NGM 10 medium in elk putje van een 12-well plaat (elk putje met een 2 cm diameter) en een nacht laten uitharden de bank bij kamertemperatuur (RT). Op dezelfde dag, kies een kolonie van Escherichia coli OP50 bacteriën infecteren van een flesje van 50 ml LB-oplossing, en cultuur in een 37 ° C schudder bij 220 rpm draaien &#39;s nachts. </li><li> Op dag 2, overdracht 20 ul OP50 bacteriecultuur op het midden van elk NGM ook. Incubeer de platen in een 37 ° C incubator of laat ze bij kamertemperatuur geroerd om de bacteriedek dikker groeien. </li><li> Maak een 80 mm clozapine voorraad oplossing door het oplossen van clozapine in DMSO (dimethylsulfoxide) oplosmiddel. Maak dan een 80 ul werken oplossing met de stock-oplossing verdund in 1,7 mM azijnzuur based in tabel 1. Opmerking: De werkoplossing een bepaald geneesmiddel plaats moet worden bepaald door het doen van een reeks vooraf concentratie tests om de meest geschikte concentratie te vinden voor het onderscheiden van de wildtype van de mutanten. </li><li> Overdracht 80 ul clozapine werken oplossing op de geplaatste NGM plaat goed en draai de plaat zodat de oplossing gelijkmatig te verdelen over het oppervlak. Wacht tot de plaat te drogen. Gebruik de plaat voor de test op dezelfde dag en plaats deze in een 20 ° C incubator de volgende dag te gebruiken. Opmerking: De werkoplossing is een geneesmiddelsuspensie vanwege de lage oplosbaarheid van clozapine, vooral bij hogere concentraties. Daarom vortex de buis alvorens de oplossing van het geneesmiddel plaat om te garanderen dat de geneesmiddelconcentratie juist. </li><li> Wassen wormen uit een 3,5 cm plaat met veel zwangere volwassenen met M9 buffer en dan draaien ze in een 15 ml buisbij 2000 rpm gedurende 1 minuut. </li><li> Zuig de supernatant. Voeg 5 ml bleekwater-oplossing (NaOH: hypochloriet: DDH 2 O bij 4:01:05) en verstoren de nematoden door voorzichtig omkeren van de buizen. </li><li> Observeer de dieren tot de helft van hen zijn opgelost in ongeveer 5 minuten. Spin down de eieren bij 2.000 tpm gedurende 1 minuut. </li><li> Zuig het supernatant en voeg snel 14 ml M9 buffer. </li><li> Spin down de eieren bij 2.000 tpm gedurende 1 minuut en het supernatans aspireren, waardoor ongeveer 100 ul oplossing. Vortex om de eieren te schorten. </li><li> Transfer 2 pl eieren opgehangen in M9 op een regelmatige NGM plaat om te testen hoeveel eieren worden overgebracht. Pas het volume van de geschorste eieren om ervoor te zorgen dat er ongeveer 30-35 eieren per overschrijving. Overdracht 30-35 eieren aan elk putje van de testplaat, en dan geïncubeerd in een 20 ° C incubator gedurende 24 uur. </li><li> Op de eerste dag van de test, scoren het aantal eieren uitgekomen. Stel het totale aantal uitgekomen dieren 25/well door picking uit de extra wormen indien nodig. </li><li> Op de volgende dagen, observeren de dieren en scoren ze elke 24 uur. Ontwikkelingsstadium wordt gescoord gebaseerd op de grootte van het dier en de vorm van de vulva 11. Het experiment duurt 5-6 dagen met de meest robuuste effect meestal gezien op de derde of vierde dag. </li><li> Voer de gegevens in een Excel-bestand en bereken het percentage dieren in elk ontwikkelingsstadium voor elke dag van het experiment. Grafieken genereren met de functie &#39;100% gestapelde kolom &#39;in de &#39;2-D kolom&#39; menu. </li></ol> 2. Keelholte Pumping Assay: Young Adult Dieren voor de wild-type en mutante stammen worden gescoord op Clozapine assayplaten <ol><li> De assay plaat is gemaakt volgens dezelfde protocol dat wordt gebruikt voor de vertraging in de ontwikkeling / dodelijkheid assay. </li><li> Pick 50 L4 dieren van elke soort gezaaid om NGM platen 24 uur voor de test en incubeer de wormen bij 20 ° C. </li><li> Pick 10 dieren een ASSAy plaat ook. Kies dan 10 dieren om het volgende goed elke 15-20 minuten. </li><li> Nadat de dieren in de eerste putje werden blootgesteld aan drug voor 30 minuten, beginnen de test door het observeren pharyngeale pompen onder een dissectie microscoop en de score van de pompen voor 20 sec 9. Zodra keelholte pompen wordt gescoord, kies de worm van de plaat. </li></ol>

<ol><li>Donohoe, D. R., Jarvis, R. A., Weeks, K., Aamodt, E. J., Dwyer, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavioral+adaptation+in+C.+elegans+produced+by+antipsychotic+drugs+requires+serotonin+and+is+associated+with+calcium+signaling+and+calcineurin+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci.+Res%22%5BJournal%5D)">Behavioral adaptation in C. elegans produced by antipsychotic drugs requires serotonin and is associated with calcium signaling and calcineurin inhibition.</a> Neurosci. Res. 64, 280-289 (2009).</li>
<li>Karmacharya, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clozapine+interaction+with+phosphatidyl+inositol+3-kinase+%28PI3K%29%2Finsulin-signaling+pathway+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropsychopharmacology%22%5BJournal%5D)">Clozapine interaction with phosphatidyl inositol 3-kinase (PI3K)/insulin-signaling pathway in Caenorhabditis elegans.</a> Neuropsychopharmacology. 34, 1968-1978 (2009).</li>
<li>Rand, J. B., Johnson, C. D. Carnorhabditis elegans Modern Biological Analysis of an Organism. Estein, H. F., Shakes, D. C. 48, Academic Press, Inc.. 187-204 (1995).</li>
<li>Kwok, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+small-molecule+screen+in+C.+elegans+yields+a+new+calcium+channel+antagonist%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A small-molecule screen in C. elegans yields a new calcium channel antagonist.</a> Nature. 441, 91-95 (2006).</li>
<li>Wang, X., Sliwoski, G. R., Buttner, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+relevance+of+Caenorhabditis+elegans+genetics+for+understanding+human+psychiatric+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Harv.+Rev.+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">The relevance of Caenorhabditis elegans genetics for understanding human psychiatric disease.</a> Harv. Rev. Psychiatry. 19, 210-218 (2011).</li>
<li>Donohoe, D. R., Aamodt, E. J., Osborn, E., Dwyer, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antipsychotic+drugs+disrupt+normal+development+in+Caenorhabditis+elegans+via+additional+mechanisms+besides+dopamine+and+serotonin+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol.+Res%22%5BJournal%5D)">Antipsychotic drugs disrupt normal development in Caenorhabditis elegans via additional mechanisms besides dopamine and serotonin receptors.</a> Pharmacol. Res. 54, 361-372 (2006).</li>
<li>Karmacharya, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavioral+effects+of+clozapine%3A+involvement+of+trace+amine+pathways+in+C.+elegans+and+M.+musculus%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Behavioral effects of clozapine: involvement of trace amine pathways in C. elegans and M. musculus.</a> Brain Res. 1393, 91-99 (2011).</li>
<li>Saur, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Genome-Wide+RNAi+Screen+in+Caenorhabditis+elegans+Identifies+the+Nicotinic+Acetylcholine+Receptor+Subunit+ACR-7+as+an+Antipsychotic+Drug+Target%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">A Genome-Wide RNAi Screen in Caenorhabditis elegans Identifies the Nicotinic Acetylcholine Receptor Subunit ACR-7 as an Antipsychotic Drug Target.</a> PLoS Genet. 9, (2013).</li>
<li>Avery, L., You, Y. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAvery%2C+L+%22C.+elegans+feeding.+WormBook%2C+ed.+The+C.+elegans+Research+Community%2C+doi%3A10.1895%2Fwormbook.1.150.1%22">C. elegans feeding. WormBook, ed. The C. elegans Research Community, doi:10.1895/wormbook.1.150.1</a>. , Available from: 
 
 <a target="_blank" href="http://www.wormbook.org">http://www.wormbook.org</a> (2012).</li>
<li>Chaudhuri, J., Parihar, M., Pires-daSilva, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+introduction+to+worm+lab%3A+from+culturing+worms+to+mutagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">An introduction to worm lab: from culturing worms to mutagenesis.</a> J Vis Exp. 47, (2011).</li>
<li>Lewis, J. A., Fleming, J. T. Carnorhabditis elegans Modern Biological Analysis of an Organism. Estein, H. F., Shakes, D. C. 48, Academic Press, Inc.. 3-29 (1995).</li>
<li>Davis, J. R., Li, Y., Rankin, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+developmental+exposure+to+ethanol+on+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Alcohol+Clin.+Exp.+Res%22%5BJournal%5D)">Effects of developmental exposure to ethanol on Caenorhabditis elegans.</a> Alcohol Clin. Exp. Res. 32, 853-867 (2008).</li>
<li>Kage-Nakadai, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+very+long+chain+fatty+acid+acyl-CoA+synthetase+genes%2C+acs-20+and+acs-22%2C+have+roles+in+the+cuticle+surface+barrier+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Two very long chain fatty acid acyl-CoA synthetase genes, acs-20 and acs-22, have roles in the cuticle surface barrier in Caenorhabditis elegans.</a> PLoS One. 5, (2010).</li>
<li>Partridge, F. A., Tearle, A. W., Gravato-Nobre, M. J., Schafer, W. R., Hodgkin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+C.+elegans+glycosyltransferase+BUS-8+has+two+distinct+and+essential+roles+in+epidermal+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">The C. elegans glycosyltransferase BUS-8 has two distinct and essential roles in epidermal morphogenesis.</a> Dev. Biol. 317, 549-559 (2008).</li>
<li>Leung, C. K., Deonarine, A., Strange, K., Choe, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+screening+and+biosensing+with+fluorescent+C.+elegans+strains%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">High-throughput screening and biosensing with fluorescent C. elegans strains.</a> J. Vis. Exp. (51), (2011).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat er geen rente conflict betrokken.

We beschrijven hier werkwijzen voor het testen van de effecten van APD op de ontwikkeling en het gedrag van C. elegans. DMSO of ethanol wordt gebruikt clozapine lossen, omdat het geneesmiddel relatief onoplosbaar in water. Omdat oplosmiddelen gemeld beïnvloeden C. elegans biologie 12, DMSO-alleen of ethanol-alone controlegroepen essentieel. De hoogste concentratie van DMSO in onze testen is aan 3%, die geen duidelijk effect op C. heeft elegans ontwikkeling. DMSO kan worden ...

Caenorhabditis elegans is een eenvoudige genetische organisme vatbaar zijn voor grootschalige vooruit en achteruit genetische screens en chemische genetische screens. C. elegans is gevoelig voor een breed spectrum van bioactieve verbindingen en is derhalve met succes gebruikt om de werkingsmechanismen van een verscheidenheid van dergelijke verbindingen vast. Bijvoorbeeld, bioactieve verbindingen bestudeerd met behulp van worm farmacogenetica bevatten acetylcholine receptor agonisten (zoals levamisol, nicotine, morantel en pyrantel), anesthetica (bijv. halothaan), cafeïne, cholinesteraseremmers (bijv. aldicarb, Lannate en trichloorfon), fluoride, GABA-gerelateerde stoffen (bijv. GABA en muscimol), ivermectine, paraquat, forbolesters en serotonine verwante drugs (bijv. serotonine en imiprimine) 3. Bovendien C. elegans is gebruikt voor grootschalige klein molecuul schermen, waardoor ontdekking van nieuwe bioactieve verbindings en de identificatie van nieuwe genetische doelwitten 4. De C. elegans genoom omvat potentiële antipsychotische geneesmiddel (APD) doelen geconserveerd bij de mens, waaronder genen die coderen voor eiwitten die nodig zijn voor synthese van neurotransmitters en synaptische structuur en functie 5. Aldus C. elegans neurogenetica en neurobiologie aan de lezer methoden voor het ontdekken van nieuwe moleculaire werkingsmechanismen van APD. In nematoden, APD blootstelling vroeg in de ontwikkeling veroorzaakt vertraging in de ontwikkeling, en bij hogere concentraties, dodelijkheid 2,6. APD blootstelling tijdens de volwassenheid produceert gedragsproblemen fenotypes. Bijvoorbeeld, clozapine blootstelling remt motoriek en keelholte pompen en verbetert de eileg 1,2,7. APD-geïnduceerde vertraging in de ontwikkeling en dodelijkheid zijn krachtige fenotypes voor grootschalige chemische genetische screens. Deze fenotypes complex voorzover zij waarschijnlijk meer dan een cellulaire en genetische basis. Daarom worden dergelijke genetische screens wordt naar verschillende indirecte targets opleveren. Echter, heeft ons laboratorium kandidaat-gen schermen en een genoom-brede RNAi scherm onderdrukkers van APD-geïnduceerde vertraging in de ontwikkeling en dodelijkheid uitgevoerd en heeft met succes hersteld genen die waarschijnlijk coderen directe doelen, waaronder dopamine, insuline, en nicotine acetylcholine receptoren 2,8. Genetische screens op basis van APD-geïnduceerde gedrag in de volwassen hebben ook geleid tot de identificatie van nieuwe doelwitten APD, en we zijn nu valideren van targets van zowel ontwikkelings-en gedragsproblemen schermen in zoogdieren 7. Zo verschijnt er een ongewervelde chemisch genetische benadering van nieuwe moleculaire werkingsmechanismen van APD ontdekken haalbaar 5,8 te zijn. De C. elegans keelholte is een orgaan dat 20 neuronen, 20 spiercellen en 20 accessoire cellen, verpakt door een basaal membraan omvat. Net als de zoogdierhart, de keelholte autonoom eennd voortdurend pompen van voedsel in de externe omgeving 9. Remming van de keelholte pompsnelheid compromissen voedselopname, en dus mutaties of geneesmiddelen die de keelholte pompen oorzaak vertraging in de ontwikkeling te remmen of te stoppen 9. APD&#39;s remmen de keelholte pompsnelheid, goed voor een deel van hun effecten op de ontwikkeling en levensvatbaarheid 1,2. Hier gebruiken we de atypische APD clozapine als een voorbeeld voor drug testen voor nematode ontwikkeling en keelholte pompen demonstreren.

<table><tbody><tr><td>Clozapine</td><td>Sigma</td><td>C6305</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td><td>Sigma</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>Azijnzuur (HAC)</td><td>Fisher</td><td>BP2401</td><td></td></tr><tr><td>Natriumhydroxide (NaOH)</td><td>EMD</td><td>SX0590-13</td><td></td></tr><tr><td>Hypochloriet</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>425044</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge 5810</td><td>Eppendorf</td><td>5810 000.017</td><td></td></tr><tr><td>Incubator shaker</td><td>New Brunswick Scientific</td><td>M1246-0006</td><td></td></tr><tr><td>Koudtemperatuur incubator 815</td><td>Precision Scientific</td><td>J1790-1B</td><td></td></tr><tr><td>Stereomicroscoop</td><td>Olympus</td><td>SZX12</td><td></td></tr><tr><td>Petrischaal 35 x 10 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9434271</td><td></td></tr><tr><td>12-wells weefselkweekplaatje</td><td>BD Falcon</td><td>REF 353043</td><td></td></tr></tbody></table>

methoden voor het bestuderen van de werkingsmechanismen van antipsychotica in<em&gt; caenorhabditis elegans</em

Methods for Studying the Mechanisms of Action of Antipsychotic Drugs in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans is een eenvoudige genetische organisme vatbaar zijn voor grootschalige vooruit en achteruit genetische screens en chemische genetische screens. De C. elegans genoom omvat potentiële antipsychotische geneesmiddel (APD) doelen geconserveerd bij de mens, waaronder genen die coderen voor eiwitten die nodig zijn voor synthese van neurotransmitters en synaptische structuur en functie. APD blootstelling produceert ontwikkelingsvertraging en / of letaliteit bij nematoden in een concentratie-afhankelijke wijze. Deze fenotypes worden veroorzaakt, gedeeltelijk door APD-geïnduceerde remming van pharynx pompen 1,2. Aldus, de ontwikkeling fenotype een neuromusculaire basis, waardoor het nuttig farmacogenetische studies van neuroleptica. Hier laten we zien gedetailleerde procedures voor het testen van APD effecten op de nematode ontwikkeling en keelholte pompen. Voor de ontwikkelings-test worden gesynchroniseerd embryo&#39;s op nematode groeimedium (NGM) platen die APD, en de fasen van de ontwikkeling van ani geplaatstmals worden vervolgens dagelijks gescoord. Voor de keelholte pompsnelheid assay, geënsceneerd jonge volwassen dieren worden getest op NGM platen met APD. Het aantal keelholte pompen per tijdseenheid wordt opgenomen, en de pompsnelheid wordt berekend. Deze testen kunnen worden gebruikt voor het bestuderen van vele andere soorten kleine moleculen of zelfs grote moleculen.

1. Vertraging in de ontwikkeling / dodelijkheid testresultaat Een typisch resultaat voor ontwikkelingsvertraging / letaliteit test wordt aangetoond in figuren 1a en 1b. Wanneer wildtype dieren in de controlegroep zijn uitgegroeid tot de zwangere volwassen stadium (figuur 1a), wildtype dieren blootgesteld aan clozapine nog in de jonge larvale stadia of dood (Figuur 1b). Figuur 1c toont een representatief resultaat vergeleken een...

Benaderingen voor het testen van de effecten van antipsychotica (APD) in Caenorhabditis elegans worden gedemonstreerd. Assays zijn beschreven voor het testen van geneesmiddelen effecten op de ontwikkeling en de levensvatbaarheid en keelholte pompsnelheid. Deze methoden zijn ook van toepassing voor farmacogenetisch experimenten met andere dan APD drugklassen.

Methoden voor het bestuderen van de werkingsmechanismen van Antipsychotica in<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Caenorhabditis elegans is a simple genetic organism amenable to  large-scale forward and reverse genetic screens and chemical genetic screens. The C.  ...

Het algemene doel van deze procedure is om de effecten van antipsychotica op de ontwikkeling en faryngeale pompfunctie van zee-elgen te onderzoeken. Dit wordt bereikt door eerst een populatie van volwassen nematoden te kweken en daaruit een gesynchroniseerde populatie dieren te genereren. De volgende stap is het overbrengen van gesynchroniseerde eieren of volwassenen naar met drugs gevulde testplaten.De laatste stap is het observeren en scoren van de effecten van de geneesmiddelen op de wormen. Uiteindelijk kunnen de resultaten laten zien dat antipsychotica de ontwikkeling vertragen en de faryngeale pompfunctie remmen in met geneesmiddelen blootgestelde dieren. Hoewel deze methode inzicht kan geven in de werkingsmechanismen van antipsychotica, kan deze ook worden toegepast om andere kleine moleculen en zelfs grote moleculen zoals lipiden te bestuderen. Maak een geïnteresseerde drug met een bekende werkconcentratie klaar.Begin met het laden van een 12-well plate met twee milliliter NGM-medium per well. Zet de plaat opzij om uit te harden op kamertemperatuur. Kies vervolgens een kolonie OP 50-bacteriën en breng deze over naar een 50 milliliter fles LB-cultuur.Laat de bacteriën een nacht op 37 graden Celsius overnachten met schudbewegingen bij 220 RPM. Breng de volgende dag 20 microliters van de bacteriecultuur in elk putje van de voorbereide plaat. Zet de plaat incubatie overnacht op 37 graden Celsius. Laad elke gevulde put met 80 microliters van de geïnteresseerde drug in de werkconcentratie.In dit geval is de drug C Clozapine. Zorg ervoor dat u de oplossing voor gebruik roert. Zwaai de oplossing om het gelijkmatig in de put te verdelen en laat het absorberen op kamertemperatuur met het deksel van de plaat eraf.Ga vervolgens door met de test of bewaar de plaat een nacht op 20 graden Celsius en start de test de volgende dag. Begin met het verzamelen van eieren van het genoom van belang. Begin met een populatie wormen met veel GR-volwassenen.Was de wormen af op een 3,5 centimeter plaat met M negen buffer. Draai ze vervolgens in een 15 milliliter buis bij 2000 RPM gedurende één minuut. Verwijder het supernatant via aspiratie en vervang het met vijf milliliter bleekmiddel.Vervolgens verstoren u de volwassenen voorzichtig door de buis te kantelen en wacht tot de dieren beginnen voortdurend op te lossen. Observeer de oplossende wormen onder de microscoop. Wanneer ongeveer de helft van de wormen is opgelost.Na ongeveer vijf minuten, draai de buis om het eiwit te verzamelen, aspireer het supernatant en vervang het snel met M negen buffer. Draai vervolgens de buis weer naar beneden zoals voorheen en verwijder alles behalve ongeveer 100 microliter van het M negen supernatant. Om de eieren op te schorsen, roert u de buis.Breng vervolgens twee microliters van de suspensie over naar een NGM-plaat en tel het aantal overgedragen eieren. Laad vervolgens de met geneesmiddelen behandelde plaat met 30 tot 35 eieren per put en incubeer de plaat gedurende 24 uur op 20 graden Celsius. Score na 24 uur het aantal uitgekomen eieren.Als er meer dan 25 wormen in een put aanwezig zijn, verwijdert u de overtollige wormen. Breng de wormen op de plaat terug in de incubator voor latere observatie met tussenpozen van 24 uur, score de ontwikkelingsstadium van de wormen in de putten op basis van de grootte van de wormen en de vorm van hun vulva's. Robuuste effecten worden meestal gezien op de derde en vierde dag.Het experiment zou ongeveer een week moeten duren. Bereid voor dit protocol de dag ervoor de geneesmiddeltestplaten voor zoals eerder beschreven, en start de test. Kies 50 L vierfase-dieren voor elk genotype in het experiment.Breng ze over naar NGM-platen en incubeer de platen gedurende 24 uur bij 20 graden Celsius. Laad de volgende dag, elke 15 tot 20 minuten, een testput met 10 dieren nadat een groep een half uur blootgesteld is geweest aan het geneesmiddel. Begin met het observeren van hun faryngeale pompfunctie onder een dissectiemicroscoop.Zoek eerst een worm en tel vervolgens 20 seconden lang zijn faryngeale pompen. Tel eenmaal geteld, neem de worm van de plaat. Score alle wormen in de put op dezelfde manier.De verwachte resultaten van het uitvoeren van de experimentele vertraging. Letaliteitstest met wildtype controles zou moeten laten zien dat in tegenstelling tot de typische groeisnelheid tot aan de dood, volwassen dieren die zijn blootgesteld aan c clozapine zich nog in de jonge larvale stadia bevinden of dood zijn. Het testen van mutanten op verschillende clozapine-concentraties onthulde suppressor-mutanten zoals mute een en enhancer-mutanten zoals MU twee. Universeel was de letaliteit van mute een lager dan wildtype, en de letaliteit van MU twee was hoger dan verwacht in vergelijking met de controle. Overlevende mute een dieren zijn beter in staat zich te ontwikkelen, terwijl mute twee overlevenden meer vertraging vertonen.Verdere onderzoeken hebben aangetoond dat Clozapine-blootstelling de faryngeale pompsnelheid verminderde op een concentratieafhankelijke manier. De verminderde snelheid van mute een was echter minder dan die van wildtype, terwijl de verminderde snelheid van mute twee groter was dan die van wildtype. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u op kleine schaal een antipsychoticatest kunt uitvoeren.De boodschap kan ook worden opgeschaald om een grootschalige genetische screening uit te voeren.

methods-for-studying-mechanisms-action-antipsychotic-drugs

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Deze video laat zien hoe twee neurale stimulerende middelen, aldicarb en pentyleentetrazol (PTZ), tewerkstellen in complementaire manieren om de synaptische functie in de nematode C. elegans te bestuderen. Deze complementaire aanpak kan ook gebruikt worden om licht te werpen op evolutionair geconserveerd mechanismen voor het moduleren van neuronale synchroon en heeft gevolgen voor epilepsie en aanvallen.

Paradigma&#39;s voor farmacologische karakterisering van C. elegans synaptische transmissie Mutants

Een ei-in-worm (EIW) test is een handige methode om eierleggende gedrag te kwantificeren. Veranderingen in eileg kan een gedragsmatige reactie van het modelorganisme...

Het meten van de effecten van bacteriën op<em&gt; C. Elegans</em&gt; Gedrag Met behulp van een Ei Retention Assay

Hier presenteren we een Caenorhabditis elegans -specifieke test die is ontworpen om veranderingen in het koperen aversiegedrag te evalueren en het vermogen om een ​​gemeenschappelijke voedingsbron te lokaliseren, als het organisme zich voortbrengt van een goed gevoed aan hongerige voedingswaarde.

EEN<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Voedingsstatus gebaseerde Koper Aversion Assay

We presenteren een gedragsopname-opstelling en protocol waarmee geautomatiseerde analyse van de nematode, Caenorhabditis elegans , de voorkeur geeft aan oplosbare verbindingen in een populatie gebaseerde assay. Dit artikel beschrijft de constructie van een gedragskamer, het gedragsprotocol en het gebruik van videoanalyse software.

Geautomatiseerde Analyse van een Chemische Sensorische Preference Assay van een Nematodebevolking

Het gebruik van een aangepast "olfactorische chip" voor de efficiënte calcium beeldvorming van C. elegans mannetjes wordt hier beschreven. Studies van mannelijke Gasbedwelming met behulp van glycerol en een feromoon worden ook weergegeven.

Met behulp van een aangepast Microfluidic olfactorische Chip voor de beeldvorming van neuronale activiteit in reactie op de feromonen in mannelijke C. Elegans hoofd neuronen

We beschrijven de protocollen voor het gebruik van het brede veld-of-view nematode tracking platform (WF-NTP), waarmee de fenotypische karakterisering van de high-throughput van grote populaties van Caenorhabditis elegans. Deze protocollen kunnen worden gebruikt voor subtiele gedragsveranderingen in gemuteerde stammen of in reactie op farmacologische behandeling in een uiterst schaalbaar mode karakteriseren.

Geautomatiseerde Behavioral analyse van grote C. elegans populaties met behulp van een breed veld-of-view Tracking Platform

Deze studie presenteert protocollen voor twee semi-geautomatiseerde locomotorische activiteitsanalysebenaderingen in C. elegans complex I ziekte gas-1(fc21) wormen, namelijk ZebraLab (een medium-throughput assay) en WormScan (een high-throughput assay) en biedt vergelijkende analyse tussen een breed scala aan onderzoeksmethoden om het gedrag van nematoden en de geïntegreerde neuromusculaire functie te kwantificeren.

Vergelijkende analyse van experimentele methoden om dierlijke activiteit in Caenorhabditis elegans-modellen van mitochondriale ziekte te kwantificeren

Hier presenteren we een protocol om de neuroprotectieve activiteiten van testverbindingen in Caenorhabditis elegans te beoordelen, inclusief polyglutamineaggregatie, neuronale dood en chemoavoidancegedrag, evenals een voorbeeldige integratie van meerdere fenotypen.

Caenorhabditis elegans als een modelsysteem voor het ontdekken van bioactieve verbindingen tegen polyglutamine-gemedieerde neurotoxiciteit

Dit artikel beschrijft een eenvoudige, goedkope methode voor het registreren van het gazonvermijdingsgedrag van Caenorhabditis elegans, met behulp van direct beschikbare items zoals een smartphone en een lichtbak (light emitting diode). We bieden ook een Python-script om het videobestand te verwerken in een formaat dat meer geschikt is om te tellen.

Een smartphone-gebaseerde beeldvormingsmethode voor C. elegans gazonvermijdingstest

Een genoverdracht methode in de zich ontwikkelende hersenen van muizen wordt beschreven door middel van een unieke chirurgische methode en de speciale vorm van de elektroden. Deze unieke techniek maakt het mogelijk transfectie van plasmide DNA tijdelijk en ruimtelijk, die veel neurowetenschappers zullen helpen bij het bestuderen van ontwikkeling van de hersenen.

Muis In Utero Elektroporatie: Gecontroleerde spatiotemporele Gene Transfectie

Leer methoden om antipsychotica te testen in Caenorhabditis elegans voor neurofarmacologie. Deze technieken meten effecten op ontwikkeling en faryngeale pomprate om inzicht te geven in werkingsmechanismen.

Methoden voor het bestuderen van de werkingsmechanismen van Antipsychotica in

Meer video's verkennen