Name: Primaire orthotopische glioom xenograften recapituleren infiltratieve groei en isocitraat dehydrogenase I mutatie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-01-14T13:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 43 s
Description: Leer hoe je primaire orthotopische glioomxenograften genereert om infiltratieve groei en IDH-mutaties in immunocompromitteerde muizen te bestuderen. Dit model behoudt genetische kenmerken van menselijke hersentumoren.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

We zijn vooral patiënten van het Vanderbilt Universitair Medisch Centrum die onschatbaar onderzoeksmateriaal leverden voor de Molecular Neurosurgical Tissue Bank, bijzonder veel tegoed. We danken degenen die de Tissue Bank hebben opgericht en onderhouden, Reid C. Thompson MD (hoofdonderzoeker), Cherryl Kinnard RN (onderzoeksverpleegkundige) en Larry A. Pierce MS (manager). Histologische diensten werden gedeeltelijk uitgevoerd door het Translational Pathology Shared Resource van het Vanderbilt Universitair Medisch Centrum (VUMC) (ondersteund door toekenning 5P30 CA068485 aan het Vanderbilt-Ingram Cancer Center). Dit werk werd ondersteund door subsidies aan MKC van het NINDS (1R21NS070139), het Burroughs Wellcome Fund en VMC development funds. MKC wordt ondersteund door de afdeling Veteranenzaken, Veterans Health Administration, Office of Research and Development, Biomedical Laboratory Research and Development via subsidie 1 I01 BX000744-01. De inhoud vertegenwoordigt niet de standpunten van het Department of Veterans Affairs of de regering van de Verenigde Staten.

1. Voorbereiding van tumorcelsuspensie
Opmerking: Voor het vaststellen en onderhouden van primaire orthotopische glioom xenograften zijn passende institutionele goedkeuringen voor het gebruik van patiëntenmateriaal en dieren vereist. In het Vanderbilt Universitair Medisch Centrum wordt gereseceerd tumormateriaal verzameld dat hoger is dan het materiaal dat nodig is voor diagnostische doeleinden, met toestemming van de patiënt voor een onderzoeksweefselopslagplaats. Specimens worden gelabeld met een gerandomiseerd 5-cijferig REDcap-databasenummer en alle patiëntspecifieke id's worden verwijderd. De REDcap-database bevat gedeïdentificeerde klinische gegevens voor elk specimen in de weefselopslagplaats die geslacht, leeftijd (in jaren), ras, overlevingsstatus, pathologie, kankerbehandelingen, jaar van resectie en tijd tot progressie omvat. Om de steriliteit te behouden en het succes van de primaire xenograftmethode te optimaliseren, moeten alle reagentia, stoomautoclaved chirurgische instrumenten en de chirurgische site van tevoren worden geassembleerd of voorbereid.
Opmerking: Glioma-exemplaren bevatten vaak grote hoeveelheden myeline en puin. Afhankelijk van de grootte van het monster kan het nodig zijn om meer dan 4 discontinue gradiëntbuizen te gebruiken voor een adequate verwijdering van myeline en vuil.
Opmerking: Het proces wordt voltooid wanneer er geen of weinig duidelijk zichtbaar niet-gedissocieerd weefsel overblijft. Vermijd de introductie van bubbels tijdens het trituratieproces.
Opmerking: De levensvatbaarheid van cellen na dissociatie is meestal >90%. Lagere viabilities kunnen vele variabelen weerspiegelen met inbegrip van suboptimale weefselbehandeling of transporttijd van de werkende ruimte, cryopreservatiemethode, of papain dissociatietechniek. Lagere cellulaire viabilities kunnen echter nog steeds voldoende zijn, zolang een voldoende aantal levensvatbare in het juiste volume kan worden getransplanteerd. Voor elke muis worden 50.000-200.000 levensvatbare cellen geïmplanteerd in een volume van 2 μl. Vanwege de afgeschuinde punt van de spuitnaald moet een extra 5 μl celsuspensie in het uiteindelijke volume worden opgenomen om ervoor te zorgen dat voor elke injectie voldoende materiaal in de spuit kan worden getrokken. Om bijvoorbeeld 2 μl/muis voor 5 muizen te injecteren, moet het uiteindelijke volume 15 μl (15 μl = (5 x 2 μl) + 5 μl zijn.
<ol><li>Plaats vers ontleed, gedeïdentificeerd patiëntmateriaal in een steriele, afgedekte container op ijs voor transport naar het laboratorium. Verwerk het monster rechtstreeks voor transplantatie of cryopreserve het monster in vloeibare stikstof (zie hieronder) voor opslag in vloeibare stikstof en later gebruik.</li>
	<li>Bereid de papaïnedissociatieoplossingen (papaïneoplossing, was-/proteaseremmeroplossing en discontinue gradiëntoplossing) in een steriele kap met de door de fabrikant meegeleverde kitcomponenten en instructies. Etiketeer steriele 15 ml polystyreen conische buizen en verdeel de oplossingen als volgt:<ul>
<li>Tube 1: 5 ml papaïneoplossing</li>
			<li>Tube 2: 3 ml was/proteaseremmer oplossing</li>
			<li>Tubes 3-6: 5 ml elk van discontinue gradiëntoplossing</li>
		</ul>
</li>
	<li>Plaats het glioommonster in buis 1 met 5 ml papaïneoplossing en trituraat met een pipet van 5 ml gedurende een periode van 10-20 minuten.</li>
	<li>Pipetteer het materiaal 10 keer op en neer en incubeer het materiaal vervolgens gedurende 2-3 minuten bij kamertemperatuur voordat u de volgende cyclus van trituratie start.</li>
	<li>Plaats de punt van de pipet van 5 ml dichter bij de onderkant van de conische buis met elke trituratiecyclus zodanig dat de punt de laatste 2 cycli de onderkant van de buis raakt.</li>
	<li>Centrifugeer 5 min bij kamertemperatuur op 300 x g. Verwijder het supernatant en pipetteer de pellet 10x op en neer in 3 ml van de was-/proteaseremmeroplossing.</li>
	<li>Leg voorzichtig een gelijk volume van de suspensie over elk van de discontinue gradiëntoplossingen van 5 ml (buizen 3-6), met een pipettor ingesteld op de "zwaartekracht" doseersnelheid.</li>
	<li>Plaats de buizen in een centrifuge uitgerust met een zwenkbakrotor, waarbij de acceleratiesnelheid wordt verlaagd tot de laagste stand en de rem wordt uitgeschakeld. Centrifugeer 12 min bij kamertemperatuur op 76 x g. Als de rem is uitgeschakeld, wordt de centrifugeren over het algemeen na 20 minuten voltooid.</li>
	<li>Verwijder het supernatant, resuspend en combineer elke pellet in 5 ml steriele uitgebalanceerde zoutoplossing en plaats de cellen op ijs.</li>
	<li>Verwijder een deel (10-100 μl) van de celsuspensie en bepaal de dichtheid van levensvatbare cellen door trypanblauwe uitsluiting met een hemocytometer.</li>
	<li>Centrifugeer gedurende 5 min. op 300 x g. Verwijder het supernatant en resuspend de celkorrel met een dichtheid van 25.000-125.000 levensvatbare cellen per μl.</li>
	<li>Breng een voldoende volume van de celsuspensie over naar een microcentrifugebuis van 200 μl (PCR-buis) en plaats deze op ijs.</li>
</ol>2. Voorbereiding van chirurgische site en instrumenten
Opmerking: Steriele chirurgische handschoenen worden gedragen tijdens de procedure. Afhankelijk van de vereisten van elke instelling kunnen chirurgische toga's, petten en gezichtsbeschermers vereist zijn.
<ol><li>Bereid een gedesinfecteerde benchtop voor knaagdierchirurgie met gescheiden aangrenzende gebieden voor dierlijke voorbereiding, werkveld en dierherstel.</li>
	<li>Steriliseer chirurgische instrumenten in een stoomautoclaaf. Gebruik vervolgens een hete kraalsterilisator om instrumenten te flashsteriliseren bij de overgang van het ene dier naar het andere.</li>
</ol>3. Inductie, anesthesie en analgesie
Opmerking: Operaties van meer dan 15 minuten vanaf het moment dat de muizen worden verdoofd, vereisen een contactwarmtebron. Om onderkoeling te voorkomen, worden de muizen tijdens de pre- en postoperatieve periode voorzien van een warmtebron (circulerende warmwaterdeken). 
<ol><li>Bereid ketamine/xylazinecocktail voor inductie-anesthesie zodat elke muis ketamine 100 mg/kg en xylazine 10 mg/kg ontvangt door 10 μl van de cocktail per gram lichaamsgewicht te injecteren.</li>
	<li>
Tabel 1. Anesthesie cocktail.
		<table><tbody>
<tr>
<td rowspan="2"></td>
					<td rowspan="2">Voorraadconcentratie</td>
					<td colspan="3">Volume om voor te bereiden </td>
				</tr>
<tr>
<td>één muis</td>
					<td>vijf muizen</td>
					<td>tien muizen</td>
				</tr>
<tr>
<td>Ketamine</td>
					<td>100 mg/ml</td>
					<td>25 μl</td>
					<td>125 μl</td>
					<td>250 μl</td>
				</tr>
<tr>
<td>Xylazine</td>
					<td>100 mg/ml</td>
					<td>2,5 μl</td>
					<td>12,5 μl</td>
					<td>25 μl</td>
				</tr>
<tr>
<td>Isotone zoutoplossing</td>
					<td></td>
					<td>223 μl</td>
					<td>1.113 μl</td>
					<td>2.225 μl</td>
				</tr>
<tr>
<td colspan="2">totaal</td>
					<td>250 ul</td>
					<td>1.250 μl</td>
					<td>2.500 μl</td>
				</tr>
</tbody></table>
</li>
	<li>Bereid ketoprofenoplossing voor analgesie door de stamoplossing (10 mg/ml) 1:20 in steriel, pygeenvrij water te verdunnen, zodat elke muis een dosis van 5 mg/kg krijgt door 10 μl van de oplossing per gram lichaamsgewicht te injecteren.</li>
	<li>Weeg en noteer het prechirurgische gewicht. Individuele muisgewichten variëren, maar variëren over het algemeen van 18-22 g.</li>
	<li>Injecteer 10 μl ketamine/xylazinecocktail per gram lichaamsgewicht van de muis in de intraperitoneale ruimte met een insulinespuit. Injecteer bijvoorbeeld 200 μl voor een muis van 20 g.</li>
	<li>Bepaal of de muis volledig wordt verdoofd door teensnufje van het achterbeen. Het duurt over het algemeen 3-5 minuten voordat de muis zich niet meer terugtrekt uit de snuif.</li>
	<li>Injecteer 10 μl van de ketoprofen-oplossing per gram lichaamsgewicht van de muis subcutaan in de losse huid van de flank met een insulinespuit. Injecteer bijvoorbeeld 200 μl voor een muis van 20 g.</li>
	<li>Scheer haar over de schedel met tondeuses, schrob de blootgestelde hoofdhuid met povidon-jodium met behulp van een wattenstaafje applicator en veeg vervolgens een alcoholpad af. Herhaal deze stappen, povidone-jodium scrub en alcohol vegen, nog twee keer.</li>
	<li>Breng oogzalf aan op de ogen van de muis.</li>
	<li>Maak een 1 cm middellijnincisie die zich uitstrekt van achter de oren tot vlak voor de ogen met een steriel scalpelmesje.</li>
	<li>Plaats de muis onder een ontleedbereik en stel de schedel bloot om de hechtlijnen te identificeren. Centreer met behulp van cirkelvormige bewegingen met een boor een braamgat 2,5 mm zijdelings op de bregma en 1 mm achterste op de coronale hechting.</li>
</ol>4. Intracraniale transplantatie
Opmerking: Injectievolumes van meer dan 2,5 μl kunnen dodelijk zijn voor muizen.
<ol><li>Plaats de muis op een stereotactisch frame door de bovenste snijtanden over de snijtuitstang te haken en de neusklem aan te brengen, zodat de schedel stevig in een neutrale positie wordt gehouden.</li>
	<li>Trek 5-10 μl van de cellen in een microcentrifugebuis meerdere keren op en neer in een 10 μl Hamilton-spuit die in de sondehouder van de stereotactische manipulator is geklemd om de suspensie te mengen en bellen te elimineren. Druk de zuiger in zodat de spuit met 2 μl wordt geladen (het juiste volume om één dier te injecteren).</li>
	<li>Trek aan de laterale rand van de huidincisie om het braamgat bloot te leggen en introduceer met de micromanipulator de naald in het braamgat, zodat het afgeschuinde gedeelte zich net onder het schedeloppervlak bevindt.<ol>
<li>Schuif de naald 3 mm vooruit en trek vervolgens de naald 0,5 mm terug om een ruimte voor injectie te creëren.</li>
			<li>Schuif de zuiger langzaam op meer dan 30 sec en laat de naald vervolgens nog 2 minuten in de hersenen blijven. Trek de naald geleidelijk terug door 0,5 mm te stijgen en nog eens 30 seconden te wachten voordat u de naald uit de hersenen verwijdert.</li>
		</ol>
</li>
	<li>Verwijder de muis uit het stereotactische frame en sluit de wond met een autoclip.</li>
	<li>Plaats de muis op een warmhoudkussen om de lichaamstemperatuur te handhaven en controleer continu het ademhalingspatroon en de kleur van slijmvliezen en blootgestelde weefsels (voetzolen).</li>
	<li>Plaats de muis in een steriele microisolatorkooi zodra deze volledig herstelt van anesthesie (sternaal en ambulant) en breng hem terug naar de dierenverblijven.</li>
</ol>5. Na-implantatie Dierverzorging en Observatie
Opmerking: De meest betrouwbare indicatie van tumorengraftment en infiltratieve groei is geleidelijk, aanhoudend gewichtsverlies vergezeld van de ontwikkeling van een gebochelde houding en ruwe haarlaag. In zeldzame gevallen worden neurologische tekorten opgemerkt, waaronder ataxie, parese en aanvallen. Orthotopische primaire xenograften zijn zeer invasief en ontwikkelen zich over een lange periode. Muizen manifesteren meestal symptomen van tumorgroei 3-6 maanden na transplantatie.
<ol><li>Observeer muizen met orthotopische xenograften dagelijks voor voedsel- en waterinname, gedrag, verzorging en tekenen van infectie op de incisieplaats.</li>
	<li>Ketoprofen toedienen (5 mg/kg subcutaan, 1-2x per dag) als pijn of angst postoperatief wordt waargenomen.</li>
	<li>Verwijder autoclips 8-10 dagen na de operatie.</li>
	<li>Weeg muizen wekelijks.</li>
	<li>Controleer op tekenen en symptomen van tumorengraftment.</li>
</ol>6. Tumor oogsten
Opmerking: Door deze methode bevat de eerste coronale plak (#1) het achterste aspect van de olfactorische bollen en het voorste aspect van de frontale kwabben. Engrafted tumor is het meest overvloedig in de rechterhersenhelft van de daaropvolgende 3 coronale plakjes (plak #2, #3 en #4) en het zicht op de injectie is routinematig opgenomen in coronale plak #3. Afhankelijk van de experimentele behoeften kan het materiaal worden gebruikt voor tumorpassage, bevroren weefselsecties, formaline vaste paraffine ingebedde weefselsecties, flowcytometrie van gedissocieerd weefsel, celkweek of lysaten voor DNA-, RNA- of eiwitanalyse. Delen van de tumor kunnen cryopreserved voor toekomstige behoeften met cel levensvatbaarheid variërend van 80-95%.
<ol><li>Euthanaseer muizen door langdurige blootstelling aan kooldioxide gevolgd door cervicale dislocatie.</li>
	<li>Onthoofd geëuthanaseerde muizen aan de basis van de hersenen (foramen magnum-niveau) met een grotere chirurgische schaar en trek de huid van de incisie naar voren om de schedel volledig bloot te leggen.</li>
	<li>Verwijder de hersenen.<ol>
<li>Steek een punt van een fijne chirurgische schaar in het laterale aspect van het foramen magnum om het linker uitwendige auditieve meatus te egalen om het achterhoofdsbeen langs de linkerkant van de schedel te snijden. Voer dezelfde snede uit aan de rechterkant.</li>
			<li>Snijd het achterhoofdsbeen langs een coronaal vlak van het ene uitwendige gehoorvlees naar het andere en verwijder het bot om het cerebellum bloot te leggen.</li>
			<li>Snijd de neusbotplaten tussen de ogen.</li>
			<li>Snijd de sagittale hechting door achterstes langs de sagittale hechting van de neusbotplaten naar het bregma te snijden. Voltooi de middenlijnincisie langs de sagittale hechting door voorste van de lambda naar de bregma te snijden.</li>
			<li>Steek voorzichtig de punt van een fijne tang langs de sagittale opening aan elke kant om eventuele durale hechting van de schedel aan de hersenen te scheuren en pel vervolgens de twee schedelhelften lateraal om de hersenen en reukbollen dorsaal bloot te stellen.</li>
			<li>Schuif de tang tussen het ventrale aspect van de olfactorische bollen en de schedel om eventuele verklevingen te bevrijden.</li>
			<li>Kantel de schedel naar achteren zodat de hersenen kunnen worden ingetrokken, zodat de optische en andere hersenzenuwen worden blootgesteld. Snijd de hersenzenuwen door om de hersenen vrij te maken in een schaal met steriel PBS.</li>
		</ol>
</li>
	<li>Breng de hersenen over met een weegspatel naar een matrixsnijmachine en genereer 2 mm coronale plakjes met scheermesjes.</li>
	<li>Schik de coronale plakjes in een schaal met steriel PBS voor verdere visuele inspectie en verdere weefselverwerking.</li>
</ol>7. Tumor Cryopreservatie
<ol><li>Bereid een voorraadoplossing van cryopreservatiemedium voor.<ol>
<li>Voeg 50 ml proliferatiesupplement, 5 ml 100x penicilline en streptomycineoplossing en 450 μl 0,2% heparine toe aan 450 ml basaal medium.</li>
			<li>Bewaar de voorraadoplossing bij 4 °C beschermd tegen licht.</li>
		</ol>
</li>
	<li>Bereid een werkoplossing van cryopreservatiemedium voor.<ol>
<li>Combineer 47,5 ml cryopreservatiemedium en 2,5 ml steriel DMSO in een 50 ml polypropyleen conische buis en meng goed.</li>
			<li>Aliquot 1,0 ml werkoplossing voor elke cryoviale en bewaren bij 4 °C beschermd tegen licht.</li>
		</ol>
</li>
	<li>Plaats een 2 mm coronaal plakje xenografted hersenen in een cryovial bevattend cryopreservatiemedium op ijs.</li>
	<li>Sluit de flacon goed af en plaats deze in een vriescontainer bij -80 °C. Breng de cryovial de volgende dag over in een vloeibare stikstoftank voor langere opslag.</li>
</ol>

<ol><li>Johnson, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relationships+between+drug+activity+in+NCI+preclinical+in+vitro+and+in+vivo+models+and+early+clinical+trials%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J%22%5BJournal%5D)">Relationships between drug activity in NCI preclinical in vitro and in vivo models and early clinical trials.</a> Br. J. 84, 1424-1431 (2001).</li>
<li>Witt Hamer, D. e, C, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genomic+profile+of+human+malignant+glioma+is+altered+early+in+primary+cell+culture+and+preserved+in+spheroids%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">The genomic profile of human malignant glioma is altered early in primary cell culture and preserved in spheroids.</a> Oncogene. 27, 2091-2096 (2008).</li>
<li>Lee, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+stem+cells+derived+from+glioblastomas+cultured+in+bFGF+and+EGF+more+closely+mirror+the+phenotype+and+genotype+of+primary+tumors+than+do+serum-cultured+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Tumor stem cells derived from glioblastomas cultured in bFGF and EGF more closely mirror the phenotype and genotype of primary tumors than do serum-cultured cell lines.</a> Cancer Cell. 9, 391-403 (2006).</li>
<li>Pandita, A., Aldape, K. D., Zadeh, G., Guha, A., James, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contrasting+in+vivo+and+in+vitro+fates+of+glioblastoma+cell+subpopulations+with+amplified+EGFR%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Chromosomes+Cancer%22%5BJournal%5D)">Contrasting in vivo and in vitro fates of glioblastoma cell subpopulations with amplified EGFR.</a> Genes Chromosomes Cancer. 39, 29-36 (2004).</li>
<li>Daniel, V. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+primary+xenograft+model+of+small-cell+lung+cancer+reveals+irreversible+changes+in+gene+expression+imposed+by+culture+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">A primary xenograft model of small-cell lung cancer reveals irreversible changes in gene expression imposed by culture in vitro.</a> Cancer Res. 69, 3364-3373 (2009).</li>
<li>Piaskowski, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glioma+cells+showing+IDH1+mutation+cannot+be+propagated+in+standard+cell+culture+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Glioma cells showing IDH1 mutation cannot be propagated in standard cell culture conditions.</a> Br. J. Cancer. 104, 968-970 (2011).</li>
<li>Vescovi, A. L., Galli, R., Reynolds, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+tumour+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev%22%5BJournal%5D)">Brain tumour stem cells.</a> Nat. Rev. 6, 425-436 (2006).</li>
<li>Sasai, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shh+pathway+activity+is+down-regulated+in+cultured+medulloblastoma+cells%3A+implications+for+preclinical+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Shh pathway activity is down-regulated in cultured medulloblastoma cells: implications for preclinical studies.</a> Cancer Res. 66, 4215-4222 (2006).</li>
<li>Shu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+orthotopic+transplantation+of+fresh+surgical+specimen+preserves+CD133%2B+tumor+cells+in+clinically+relevant+mouse+models+of+medulloblastoma+and+glioma%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Direct orthotopic transplantation of fresh surgical specimen preserves CD133+ tumor cells in clinically relevant mouse models of medulloblastoma and glioma.</a> Stem Cells. 26, 1414-1424 (2008).</li>
<li>Suggitt, M., Bibby, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((50+years+of+preclinical+anticancer+drug+screening%3A+empirical+to+target-driven+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">50 years of preclinical anticancer drug screening: empirical to target-driven approaches.</a> Clin. Cancer Res. 11, 971-981 (2005).</li>
<li>Kerbel, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+tumor+xenografts+as+predictive+preclinical+models+for+anticancer+drug+activity+in+humans%3A+better+than+commonly+perceived-but+they+can+be+improved%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Biol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Human tumor xenografts as predictive preclinical models for anticancer drug activity in humans: better than commonly perceived-but they can be improved.</a> Cancer Biol. Ther. 2, 134-139 (2003).</li>
<li>Park, C. Y., Tseng, D., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+stem+cell-directed+therapies%3A+recent+data+from+the+laboratory+and+clinic%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Cancer stem cell-directed therapies: recent data from the laboratory and clinic.</a> Mol. Ther. 17, 219-230 (2009).</li>
<li>Carlson, B. L., Pokorny, J. L., Schroeder, M. A., Sarkaria, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment%2C+maintenance+and+in+vitro+and+in+vivo+applications+of+primary+human+glioblastoma+multiforme+%28GBM%29+xenograft+models+for+translational+biology+studies+and+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Protoc.+Pharmacol.+Chapter%22%5BJournal%5D)">Establishment, maintenance and in vitro and in vivo applications of primary human glioblastoma multiforme (GBM) xenograft models for translational biology studies and drug discovery.</a> Curr. Protoc. Pharmacol. Chapter. 14, (2011).</li>
<li>Hambardzumyan, D., Parada, L. F., Holland, E. C., Charest, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+modeling+of+gliomas+in+mice%3A+new+tools+to+tackle+old+problems%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Genetic modeling of gliomas in mice: new tools to tackle old problems.</a> Glia. 59, 1155-1168 (2011).</li>
<li>Sarangi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+inhibition+of+the+Hedgehog+pathway+in+established+malignant+glioma+xenografts+enhances+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Targeted inhibition of the Hedgehog pathway in established malignant glioma xenografts enhances survival.</a> Oncogene. 28, 3468-3476 (2009).</li>
<li>Valadez, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Hedgehog+pathway+responsive+glioblastomas+by+isocitrate+dehydrogenase+mutation%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Lett%22%5BJournal%5D)">Identification of Hedgehog pathway responsive glioblastomas by isocitrate dehydrogenase mutation.</a> Cancer Lett. 328, 297-306 (2013).</li>
<li>Bar, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclopamine-mediated+hedgehog+pathway+inhibition+depletes+stem-like+cancer+cells+in+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Cyclopamine-mediated hedgehog pathway inhibition depletes stem-like cancer cells in glioblastoma.</a> Stem Cells. 25, 2524-2533 (2007).</li>
<li>Ehtesham, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ligand-dependent+activation+of+the+hedgehog+pathway+in+glioma+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Ligand-dependent activation of the hedgehog pathway in glioma progenitor cells.</a> Oncogene. 26, 5752-5761 (2007).</li>
<li>Kelly, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oligodendroglioma+cell+lines+containing+t%281%3B19%29%28q10%3Bp10%5BTitle%5D)+AND+%22Neuro-oncology%22%5BJournal%5D)">Oligodendroglioma cell lines containing t(1;19)(q10;p10.</a> Neuro-oncology. 12, 745-755 (2010).</li>
<li>Quintana, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+tumour+formation+by+single+human+melanoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Efficient tumour formation by single human melanoma cells.</a> Nature. 456, 593-598 (2008).</li>
<li>Shultz, L. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+lymphoid+and+myeloid+cell+development+in+NOD%2FLtSz-scid+IL2R+gamma+null+mice+engrafted+with+mobilized+human+hemopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Human lymphoid and myeloid cell development in NOD/LtSz-scid IL2R gamma null mice engrafted with mobilized human hemopoietic stem cells.</a> J. Immunol. 174, 6477-6489 (2005).</li>
<li>Singh, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+human+brain+tumour+initiating+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Identification of human brain tumour initiating cells.</a> Nature. 432, 396-401 (2004).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.

Gekweekte cellijnen, xenografts en genetisch gemanipuleerde muizen zijn de meest voorkomende methoden voor het modelleren van gliomen, en er zijn verschillende voordelen en beperkingen voor elk modelsysteem3,13,14. Relevante voordelen van primaire orthotopische glioom xenograften zijn infiltratieve groei die diffuse gliomen typeert en het behoud van genetische veranderingen en belangrijke signaleringsmechanismen die buitengewoon moeilijk te onderhouden kunnen zijn in gekweekte glioomcellen. Bijvoorbeeld, i...

Kwaadaardige gliomen zijn primaire gliatumoren van het centrale zenuwstelsel die voorkomen in de hersenen en af en toe het ruggenmerg. Gliomen worden door de Wereldgezondheidsorganisatie (WHO) geclassificeerd op basis van histologische gelijkenis met astrocyten, oligodendrocyten of ependymale cellen en vervolgens numeriek ingedeeld (I tot IV) voor pathologische kenmerken van maligniteit. De meest voorkomende histologische subtypes zijn astrocytomen, oligodendrogliomen en gemengde oligoastrocytomen. Kwaadaardige gliomen die WHO-klassen II tot IV omvatten, worden gekenmerkt door invasieve groei en recalcitrance voor de huidige therapieën. Elk jaar worden in de Verenigde Staten ongeveer 15.750 personen gediagnosticeerd met een kwaadaardig glioom en naar schatting 12.740 patiënten bezwijken aan deze ziekte. Deze statistieken benadrukken de bijzonder dodelijke aard van kwaadaardige gliomen en de belangrijke behoefte aan verbeterde therapeutische werkzaamheid.
Kankermodellen zijn essentieel voor het onderzoeken van tumorbiologie en therapieën. Menselijke kankercellijnen vormen een belangrijke eerste stap voor in vitro manipulaties en in vivo xenografting studies (secundaire xenograften)1. Standaard kankercelculturen ondergaan echter fenotypische en genotypische transformatie2-4 die mogelijk niet wordt hersteld in secundaire xenograften5. Bovendien kunnen genetische veranderingen zoals isocitraatdehydrogenase(IDH)mutaties6, verschillende stamcelpopulaties7 en afhankelijkheid van belangrijke signaleringsroutes8 verloren gaan in kankercelculturen. Genomische profielen kunnen in betere mate worden gehandhaafd in de kankersfeercultuur, maar weerspiegelen nog steeds niet volledig het genotype van primaire tumoren2,3. Directe orthotopische transplantatie ontkent de invloeden van in vitro kweek, zorgt voor een goede micro-omgeving en behoudt de integriteit van tumorinitiërende cellen9,10. Daarom vormen primaire xenograften een krachtig en relevant preklinisch model voor het rigoureus testen van doelgerichte middelen om te helpen bij het rationele ontwerp van toekomstige klinische proeven5,11,12.

<table><tbody><tr><td>Fosfaat gebufferde zoutoplossing</td><td>Life Technologies</td><td>14040-133</td><td></td></tr><tr><td>Papaine dissociatiesysteem</td><td>Worthington Biochemical Corp.</td><td>LK003150</td><td></td></tr><tr><td>Trypan blauwe oplossing 0,4%</td><td>Life Technologies</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>Ketamine HCl</td><td>Verkregen bij de institutionele apotheek of lokale diergeneesmiddelen leverancier</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Xylazine HCl</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ketoprofen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Oftalmische zalf </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Povidon-jodium </td><td>Fisher Scientific</td><td>190061617</td><td> </td></tr><tr><td> Cryoconserveringsmedium en proliferatiesupplement </td><td>StemCell Technologies</td><td>05751</td><td> </td></tr><tr><td> 0,2% Heparine natriumzout in PBS </td><td>StemCell Technologies</td><td>07980</td><td> </td></tr><tr><td> Penicilline-streptomycine </td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td> </td></tr><tr><td> Dimethylsulfoxide </td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6250-5X10ML</td><td> </td></tr><tr><td> NOD.Cg-Prkdcscid I/2rgtm1Wjl/SzJ muizen </td><td>The Jackson Laboratory</td><td>005557</td><td> NSG muizen </td></tr><tr><td> Anti-humaan vimentine antilichaam </td><td>Dako</td><td>M7020</td><td> Gebruik 1:200 tot 1:800 </td></tr><tr><td> Anti-humaan IDH1 R132H antilichaam </td><td>Dianova</td><td>DIA-H09</td><td> Gebruik 1:100 tot 1:400 </td></tr><tr><td> Centrifuge met draaiende emmer rotor </td><td></td><td></td><td> </td></tr><tr><td> Pipet met snelheidsregeling voor het doseren </td><td></td><td></td><td> </td></tr><tr><td> Disposible hemocytometers </td><td>Fisher Scientific</td><td>22-600-100</td><td> </td></tr><tr><td> Steriele chirurgische handschoenen </td><td>Fisher Scientific</td><td>11-388128</td><td> </td></tr><tr><td> Wegwerpschort </td><td>Fisher Scientific</td><td>18-567</td><td> </td></tr><tr><td> Chirurgisch masker </td><td>Fisher Scientific</td><td>19-120-1256</td><td> </td></tr><tr><td> Tuberculin spuit </td><td>BD</td><td>305620</td><td> </td></tr><tr><td> Alcohol pads </td><td>Fisher Scientific</td><td>22-246-073</td><td> </td></tr><tr><td> Draagbare elektronische weegschaal </td><td>Fisher Scientific</td><td>01-919-33</td><td> </td></tr><tr><td> Zoom stereomicroscoop </td><td></td><td></td><td> </td></tr><tr><td> Chirurgisch haarschaar </td><td>Stoelting</td><td>51465</td><td> </td></tr><tr><td> Scalpatel handvat </td><td>Fine Science Tools</td><td>10003-12</td><td> </td></tr><tr><td> Scalpatel mesjes, #10 </td><td></td><td></td><td> </td></tr><tr><td> Stereotactisch instrument </td><td>Stoelting</td><td>51730</td><td> </td></tr><tr><td> Hogesnelheidsboor </td><td>Stoelting</td><td>51449</td><td> </td></tr><tr><td>Boortje, 0,6 mm</td><td>Stoelting</td><td>514552</td><td></td></tr><tr><td> Hamilton spuit </td><td>Hamilton</td><td>80336</td><td> </td></tr><tr><td> Autoclip, 9 mm </td><td>BD</td><td>427630</td><td> </td></tr><tr><td> Circulerende waterverwarmde pad </td><td>Kent Scientific</td><td>TP-700 TP-1215EA</td><td> </td></tr><tr><td> Hete kraal droge sterilisator </td><td>Kent Scientific</td><td>INS300850</td><td> </td></tr><tr><td> Chirurgische schaar </td><td>Fine Science Tools</td><td>14101-14</td><td> </td></tr><tr><td> Fijne schaar </td><td>Fine Science Tools</td><td>14094-11</td><td> </td></tr><tr><td> Veer schaar </td><td>Fine Science Tools</td><td>15018-10</td><td> </td></tr><tr><td> Dumont pincet </td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-30</td><td> </td></tr><tr><td> Semimicro spatulas </td><td>Fisher Scientific</td><td>14374</td><td> </td></tr><tr><td> Muisbrein snijder matrix </td><td>Zivic Instruments</td><td>BSMAS002-1</td><td> </td></tr><tr>

primaire orthotopische glioom xenograften recapituleren infiltratieve groei en isocitraat dehydrogenase i mutatie

Primary Orthotopic Glioma Xenografts Recapitulate Infiltrative Growth and Isocitrate Dehydrogenase I Mutation

Kwaadaardige gliomen vormen een heterogene groep van zeer infiltratieve gliane neoplasmata met duidelijke klinische en moleculaire kenmerken. Primaire orthotopische xenograften heroveren de histopathologische en moleculaire kenmerken van kwaadaardige glioomsubtypes in preklinische diermodellen. Om who-graad III en IV kwaadaardige gliomen te modelleren in transplantatietesten, worden menselijke tumorcellen ge xenografeerd in een orthotopische plaats, de hersenen, van immuungecompromitteerde muizen. In tegenstelling tot secundaire xenograften die gekweekte tumorcellen gebruiken, worden menselijke glioomcellen gescheiden van gereseceerde monsters en getransplanteerd zonder voorafgaande passage in weefselkweek om primaire xenograften te genereren. De procedure in dit rapport beschrijft de voorbereiding van tumormonsters, intracraniële transplantatie in immuungecompromitteerde muizen, monitoring op tumorengraftment en tumoroogst voor latere passage in ontvangende dieren of analyse. Tumorcelvoorbereiding vereist 2 uur en chirurgische procedure vereist 20 minuten / dier.

Gedissocieerde glioomcellen worden rechtstreeks in de hersenen van immuungecompromitteerde muizen getransplanteerd om primaire orthotopische xenograftlijnen te verkrijgen. Elk tumormonster krijgt voorafgaand aan de transplantatie een gerandomiseerd nummer toegewezen, als onderdeel van het deidentificatieproces om beschermde gezondheidsinformatie te verwijderen. Hiervoor gebruiken we een 5-cijferig REDcap databasenummer. Figuur 1 illustreert het proces en de nomenclatuur voor het vaststellen van een xenog...

Kwaadaardige gliomen vormen een heterogene groep van zeer infiltratieve gliane neoplasmata met duidelijke klinische en moleculaire kenmerken. Primaire orthotopische xenograften heroveren de histopathologische en moleculaire kenmerken van kwaadaardige glioomsubtypes in preklinische diermodellen.

Primaire orthotopische glioom xenograften recapituleren infiltratieve groei en isocitraat dehydrogenase I mutatie

Malignant gliomas constitute a heterogeneous group of highly infiltrative glial neoplasms with distinct clinical and molecular features. Primary ...

Het algemene doel van deze procedure is om primaire orthotopische glioom-, xenograften te genereren om de histopathologische en moleculaire kenmerken van kwaadaardige glioomsubtypen na te bootsen in preklinische diermodellen. Dit wordt bereikt door eerst humane hersentumorspecimens te verkrijgen voor directe transplantatie. De tweede stap is het bereiden van een celsuspensie uit het specimen.Vervolgens worden de tumorcellen getransplanteerd in de hersenen van een immuungecompromitteerde muis. De ontvangende muis wordt vervolgens gecontroleerd op tekenen van tumor, aanplanting en groei, en vervolgens geoogst voor analyse of seriële transplantatie. Uiteindelijk worden histologie, DNA-sequencing en andere moleculaire analyses gebruikt om infiltratieve tumorgroei en behoud van genetische veranderingen te tonen, zoals ISO-citraatdehydrogenasemutaties.Preklinische diermodellen van kanker zijn essentieel voor het onderzoeken van tumorbiologie en therapieën. Het belangrijkste voordeel van primaire glioomxenograften boven bestaande methoden zoals secundaire GLI-xenograften is dat glioomcellen genotype en fenotype veranderingen ondergaan in cultuur die niet kunnen worden hersteld wanneer gek

primary-orthotopic-glioma-xenografts-recapitulate-infiltrative-growth

Research

JoVE Journal

Medicine

Geneeskunde

Luciferase-gemodificeerd menselijk brein tumor xenotransplantaten kan intracranially worden vastgesteld athymische muizen, met de daaropvolgende controle van de tumorgroei en de respons op de therapie met behulp van bioluminescentie beeldvorming. In combinatie met survival analyse, bioluminescentie monitoring is een essentieel onderzoeksinstrument voor pre-klinisch testen van therapieën worden overwogen voor de behandeling van hersentumoren.

Tot vaststelling van Intracraniële hersentumor xenotransplantaten Met verdere analyse van de tumorgroei en de respons op de therapie met behulp van bioluminescentie Imaging

We beschrijven een geïntegreerde methode voor de exacte, stereotactische implantatie van menselijke glioblastoma multiforme cellen in de hersenen van muizen en vervolgens naakt...

Stereotactische Intracraniale Implantatie en<em&gt; In vivo</em&gt; Bioluminescent Imaging van tumorxenograften in een Muis Model Systeem van glioblastoma multiforme

We hebben een corticaal orthotope glioblastoom model vastgesteld muizen intravitale twee-foton microscopie dat de biofysische beperkingen recapituleert beginsel zullen spelen tijdens de groei van de tumor. Een chronische glazen venster vervangen van de schedel boven de tumor kan de follow-up van de progressie van de tumor na verloop van tijd door twee-foton microscopie.

Een orthotope Glioblastoma Muis Model Handhaving Brain Parenchymale fysieke beperkingen en geschikt voor intravitale twee-foton microscopie

Fenotypisch wild-type astrocyten en neurale stamcellen die zijn geoogst uit muizen die zijn gemodificeerd met gefloxte, conditionele oncogeen allelen en getransformeerd via virale Cre-gemedieerde recombinatie, kunnen worden gebruikt om de pathogenese van astrocytomen in vitro en in vivo te modelleren door orthotopische injectie van getransformeerde cellen in hersenen van syngene, immuuncompetente nestgenoten.

Modeling Astrocytoom Pathogenese In Vitro En In Vivo Met behulp van corticale Astrocyten of neurale stamcellen uit Conditional, genetisch gemanipuleerde muizen

De hersenen is een unieke site met eigenschappen die niet goed weergegeven door in vitro of ectopische analyses. Orthotopische muismodellen met reproduceerbare ligging en groei-eigenschappen op betrouwbare wijze kan worden gemaakt met intracraniële injecties met een stereotaxisch fixatie instrument en een lage druk spuit pomp.

Creëren Anatomisch nauwkeurige en reproduceerbare Intracranial Xenograften van Human hersentumoren

GL261-glioomcellen bieden een bruikbaar immunocompetent diermodel van glioblastoom. De doelen van dit protocol zijn om de juiste technieken te demonstreren voor het monitoren van intracraniële tumorgroei met behulp van in vivo bioluminescentie-beeldvorming, en om de bruikbaarheid van luciferase-gemodificeerde GL261-cellen te verifiëren voor het bestuderen van tumorimmunologie en immunotherapeutische benaderingen voor de behandeling van glioblastoom.

Bioluminescentie beeldvorming van een Immunocompetente diermodel voor Glioblastoma

Neurospheres gegroeid als 3D culturen vormen een krachtig hulpmiddel om te studeren glioma biologie. Hier presenteren we een protocol voor het uitvoeren van immunohistochemistry met behoud van de 3D structuur van glioma neurospheres via paraffine insluiten. Deze methode kan de karakterisatie van glioma neurosphere eigenschappen zoals stemness en Neurale differentiatie.

Evaluatie van Biomarkers in Glioma door Immunohistochemistry op 3D Glioma paraffine-ingebedde Neurosphere culturen

Hier beschrijven we een preklinisch orthotopisch muismodel voor GBM, vastgesteld door intracraniële injectie van cellen afgeleid van genetisch gemanipuleerde muismodeltumoren. Dit model toont de ziektekenmerken van menselijke GBM. Voor translationele studies wordt de hersentumor van de muis gevolgd door in vivo MRI en histopathologie.

Translationele orthotopische modellen van glioblastoom multiforme

IDH1-mutant diffuse laaghangstroomgliomen zijn zeldzame tumoren die moeilijk te kweken zijn. We introduceren een eenvoudige, niet-enzymatische explant-methode die de expressie van IDH1-mutante eiwitten behoudt en culturen maandenlang in stand houdt. Belangrijk is dat deze techniek werkt met diepvriesgeconserveerde tumoren en een waardevolle bron biedt voor glioomonderzoek.

Een protocol voor explantaatculturen van IDH1-mutant diffuse laaggradige gliomen

De ontwikkeling van orthotope pediatrische hersentumormodellen vereist nauwgezette precisie, waarbij een stereotactisch apparaat wordt gebruikt om kankercellen nauwkeurig te implanteren. De hier gepresenteerde methodologie schetst de stappen die betrokken zijn bij het voorbereiden van hersentumorcellen, het uitvoeren van intracraniële injecties en het implementeren van een postoperatief monitoringsysteem om implantatie van hersentumoren te beoordelen.

Opstelling van orthotope patiënt-afgeleide xenotransplantaatmodellen voor hersentumoren met behulp van een stereotactisch apparaat

Het doel van dit protocol is om onderzoekers een zeer reproduceerbare techniek te bieden voor intracraniële implantaties.

Stereotactische intracraniële implantatie van door de patiënt afgeleide xenograftcellijnen van de glioblastoom bij muizen

Leer hoe je primaire orthotopische glioomxenograften genereert om infiltratieve groei en IDH-mutaties in immunocompromitteerde muizen te bestuderen. Dit model behoudt genetische kenmerken van menselijke hersentumoren.

Primaire orthotopische glioom xenograften recapituleren infiltratieve groei en isocitraat dehydrogenase I mutatie

Meer video's verkennen