Inductie van Invasieve Transitional Cell blaascarcinoom in Immune Intact Human MUC1 transgene muizen: Een model voor Immunotherapie Ontwikkeling

Het algemene doel van het volgende experiment is om effectief een cytotoxische T-lymfocytrespons te induceren die zich richt op een tumor-geassocieerd antigeen bij blaaskanker. Dit wordt bereikt door blaaskanker te induceren bij muizen die het menselijke tumor-geassocieerde antigeen mach een expresseren. Vervolgens wordt een peptidevaccin in de muizen geïnjecteerd en wordt een mach een specifieke cytotoxische T-lymfocytrespons gegenereerd.

Vervolgens worden het serum, de tumor en de milt geïsoleerd en worden de weefsels geanalyseerd op cytokines, antigenen en immuunrespons. Door gebruik te maken van western blot multiplex, fluorimetrische microbead, immunoassay immunohistochemie en een live spot-analyse kunnen we de werkzaamheid van een peptidevaccin tegen blaaskanker testen. Hallo, ik ben Dr. Gregory Wetz, een onderzoekswetenschapper bij het University of California Davis Health System in Sacramento, Californië.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek in vergelijking met bestaande methoden zoals xenografts, is dat xenografts immuungecompromitteerde gastheren vereisen, terwijl ons model gebruikmaakt van een immuun intact transgene muis die een humaan tumor-geassocieerd antigeen expresseert dat het doelwit is van het peptidevaccin. De technieken worden gedemonstreerd door Daniel V en de doktoren Chaga en Audrey Gutierrez, allen mede-onderzoekswetenschappers, en het laboratorium van Dr. Michael de Gregorio en het UC Davis Health System. Voordat de eerste dosis van N-butyl-N-(4-hydroxy-butyl)nitrosamine, of O-H-B-B-N, wordt toegediend om blaaskanker te induceren, voer een submandibulaire bloeding uit op elke muis om volbloed te verzamelen en bloedstollingsbuisjes en geef 30 minuten de tijd voor het stollen van het bloed.

Beginnend op 8-weken leeftijd, gebruikend roestvrijstalen 20 gauge gavage naalden, toedien het O-H-V-B-N oraal vijf dagen per week gedurende 12 weken. In week 20, gebruik 600 microliters van 0,9% steriele zoutoplossing om elke flacon gelyofiliseerd peptidevaccin te reconstitueren en hersuspensieer deze volledig door de oplossing zes keer door een 0,5 inch 27 gauge naald te trekken met behulp van zoutoplossing. Pas de concentratie aan zodat de gewenste dosis wordt afgegeven in een volume van 100 microliters na de laatste dosis van O-H-B-B-N en toedien het vaccin wekelijks gedurende een achtwekencyclus door 100 microliters van het vaccin te injecteren acht weken na de laatste dosis van O-H-B-B-N met behulp van een 25 gauge naald.

Na alle muizen te hebben geëuthanaseerd door kooldioxide asfyxie, plaats elke muis op een dissectiebord en prik alle vier de ledematen vast. Maak vervolgens met behulp van een pincet en schaar een horizontale incisie in het bovenste buikgebied. Breng de schaar in de incisie tussen de epidermale laag en de buikwand en scheid met behulp van een pincet voorzichtig de huid van het onderliggende weefsel.

Maak vanaf de horizontale incisie een verticale incisie volgens de middelste as richting het voorste uiteinde van de muis. Scheid vervolgens de huid van het ribbenkast en puncteer het hart met behulp van een 1 milliliter spuit en een 22 gauge naald en verzamel bloed met een soepele en gelijkmatige trek met behulp van pincet en schaar. Snijd en verwijder de rest van de epidermale laag binnen een biologische veiligheidskast.

Snij door de buikwand en het buikvlies en verwijder asseptisch de blaastumor voor immunohistochemie of IHC en Western blot voor IHC. Plaats het blaastumormonster in een weefselcassette en fixeer het gedurende een nacht in gekoeld formineermiddel.

Verzamel de milt bij kamertemperatuur voor celviabiliteitsanalyse en een lie spot om de multiplex fluorimetrische microbe immunoassay uit te voeren. Gebruik 200 microliters van het assay buffer om te voorbevochtigen. Een 96 wel filterbodemplaat, waarbij het filter volledig doorweekt.

Gebruik vervolgens een 96 wel plaat vacuüm apparaat om de filter voorzichtig te drainen en gebruik papieren handdoeken om de bodem van de plaat droog te deppen met behulp van een multikanaals pipet. Pipetteer 25 microliters van serum matrix in de putjes toegewezen voor de blanco's en standaarden en pipetteer 25 microliters van het assay buffer in de putjes toegewezen voor de controles en onbekenden. Pipetteer vervolgens 25 microliters van de blanco's, controles en onbekenden naar de respectieve toegewezen putjes. Vorm de kralenmix gedurende 20 seconden en breng de kralen over naar een reservoir.

Pipetteer vervolgens 25 microliters van de kralenmix in elke. Dek de plaat af om het te beschermen tegen licht en schud de plaat op een schudtafel bij 500 RPM gedurende twee uur bij kamertemperatuur, draineer de plaat en gebruik 200 microliters van PBST om deze twee keer te wassen voordat je het draineert en droog deplaat. Om de detectieantilichaamoplossing voor te bereiden, combineer de vereiste hoeveelheid 0,1%PBST en detectieantilichaam in een 15 milliliter buis en vortex gedurende 10 seconden.

Pipetteer vervolgens 25 microliters in elke. Schud de plaat bij 500 RPM gedurende een uur bij kamertemperatuur. Draineer en was de plaat met 200 microliters van 0,1%PBST twee keer, draineer en droog deplaat, pipetteer 25 microliters van de vers bereide strep, AVID en FICO eryn of SAPE in elke, plaats de plaat op de plaat schudtafel en incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur bij 500 RPM.

Draineer en was twee keer met PBST. Om de kralen op te schorsen, voeg 100 microliters van 0,1%PBST toe aan elke put en schud gedurende ten minste twee minuten bij 500 RPM. Gebruik Luminex LX 200 machine om de plaat te lezen en te analyseren in een biologische veiligheidskast.

Verwerk de muizenmilten door 100 micrometer nylon weefsel zeef in vijf milliliter steriele PBS in steriele petrischalen. Laag de PLE aytes op drie milliliter lymfocytenscheidingsmedium in steriele 15 milliliter buizen. Centrifugeer de buizen gedurende 15 minuten bij 600 GS.

Om de lymfocyten van de rode bloedcellen te scheiden, draag de gelaagde ly