Name: Snelle generatie van amyloïde uit native eiwitten in vitro (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-05T16:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 48 s
Description: Leer hoe je snel amyloïde vezels genereert uit native eiwitten in vitro met behulp van temperatuur en chemische cross-linking. Deze methode helpt onderzoekers bij het bestuderen van eiwitmisfolding en amyloïde vorming.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk wordt ondersteund door subsidies aan W.C. van National Institutes of Health Grant AI074809 en The University of Texas M. D. Anderson Cancer Center Institutioneel Onderzoekssubsidieprogramma.

1. Prepare MES Buffer
<ol>
	<li>Gebruik MES-buffer (0.1 M 2-(N-morpholino)ethaansulfonzuur en 0.9 M NaCl) om zowel eiwit-alleen amyloïde als gestabiliseerde oplosbare eiwit-oligomeren te bereiden. Weeg 1,95 g MES en 5,27 g NaCl. Voeg H2O toe en pas pH aan tot 4,7. Breng het eindvolume aan tot 100 ml. Bewaar tot 6 maanden bij 4º C.</li>
</ol>
2. Bereid Eiwit-alleen Amyloïde Direct uit Native Eiwitten
<ol>
	<li>Weeg eiwit naar keuze (elk natuurlijk eiwit of peptide) en reconstitueer tot 10 mg/ml in MES-buffer.</li>
	<li>Incubeer gedurende 4 uur in een waterbad op 65 ºC. Aan het einde van de periode is er een wit neerslag zichtbaar in de oplossing.</li>
	<li>Neutraliseer het monster met 10% (v/v) Tris-HCl (1 M, pH 10,5).</li>
	<li>Dialyseer het eiwit in een dialysecassette gedurende een nacht om het te wisselen naar de gewenste buffer voor verdere analyse.</li>
	<li>Een controlemonster van natuurlijk eiwit kan worden bereid door de stappen 2.1, 2.3 en 2.4 te volgen zonder hitteprecipitatie (stap 2.2).</li>
</ol>
3. Bereid Hybride Amyloïde uit Gestabiliseerde Oplosbare Oligomeren van Natuurlijke Eiwitten
<ol>
	<li>Bereid gestabiliseerde oplosbare eiwit-oligomeren
	<ol>
		<li>Weeg eiwit naar keuze en reconstitueer tot 10 mg/ml in MES-buffer. Laat 15 minuten op kamertemperatuur staan.</li>
		<li>Weeg 1-ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl]carbodiimide hydrochloride (EDC) en bereid een verse voorraad van 20 mg/ml in MES-buffer.</li>
		<li>Meng eiwit- en EDC-oplossingen in een verhouding van 2:5 (v/v), d.w.z. 2 mg eiwit voor elke 10 mg EDC.</li>
		<li>Incubeer op kamertemperatuur gedurende 2 uur.</li>
		<li>Neutraliseer het monster met 10% (v/v) Tris-HCl (1 M, pH 10,5).</li>
		<li>Dialyseer het eiwit in een dialysecassette gedurende een nacht om het te wisselen naar de gewenste buffer voor verdere analyse.</li>
		<li>Bewaar het gestabiliseerde oplosbare eiwit-oligomeer tot 4 weken bij 4 ºC.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Bereid hybride amyloïde uit gestabiliseerd oplosbaar eiwit-oligomeer.
	<ol>
		<li>Om DNA-bevattend amyloïde te bereiden, meng DNA en gestabiliseerd oplosbaar eiwit-oligomeer in een 1:1-verhouding (w/w). Laat minimaal 2 uur bij 4 ºC staan. Gedurende deze periode is er een onoplosbare neerslag zichtbaar in de oplossing wanneer de initiële eiwitconcentratie 0,5 mg/ml of hoger is.</li>
		<li>Om RNA-bevattend amyloïde te bereiden, meng RNA en gestabiliseerd oplosbaar eiwit-oligomeer in een 1:1-verhouding (w/w). Laat minimaal 2 uur bij 4 ºC staan. Gedurende deze periode is er een onoplosbare neerslag zichtbaar in de oplossing wanneer de initiële eiwitconcentratie 0,5 mg/ml of hoger is.</li>
		<li>Om heparine-bevattend amyloïde te bereiden, meng heparine en gestabiliseerd oplosbaar eiwit-oligomeer in een 1:1-verhouding (w/w). Laat minimaal 2 uur bij 4 ºC staan. Gedurende deze periode is er een onoplosbare neerslag zichtbaar in de oplossing wanneer de initiële eiwitconcentratie 0,5 mg/ml of hoger is.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Selkoe, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Folding+proteins+in+fatal+ways%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Folding proteins in fatal ways.</a> Nature. 426, 900-904 (2003).</li>
<li>Schnabel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+folding%3A+The+dark+side+of+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Protein folding: The dark side of proteins.</a> Nature. 464, 828-829 (2010).</li>
<li>Goldberg, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+degradation+and+protection+against+misfolded+or+damaged+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Protein degradation and protection against misfolded or damaged proteins.</a> Nature. 426, 895-899 (2003).</li>
<li>Chiti, F., Dobson, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+misfolding%2C+functional+amyloid%2C+and+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Protein misfolding, functional amyloid, and human disease.</a> Annu. Rev. Biochem. 75, 333-366 (2006).</li>
<li>Goldschmidt, L., Teng, P. K., Riek, R., Eisenberg, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+the+amylome%2C+proteins+capable+of+forming+amyloid-like+fibrils%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Identifying the amylome, proteins capable of forming amyloid-like fibrils.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 3487-3492 (2010).</li>
<li>Fowler, D. M., Koulov, A. V., Balch, W. E., Kelly, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+amyloid+-+from+bacteria+to+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochem.+Sci%22%5BJournal%5D)">Functional amyloid - from bacteria to humans.</a> Trends Biochem. Sci. 32, 217-224 (2007).</li>
<li>Chapman, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+Escherichia+coli+Curli+Operons+in+Directing+Amyloid+Fiber+Formation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Role of Escherichia coli Curli Operons in Directing Amyloid Fiber Formation.</a> Science. 295, 851-855 (2002).</li>
<li>Barnhart, M. M., Chapman, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Curli+Biogenesis+and+Function%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Curli Biogenesis and Function.</a> Annu. Rev. Microbiol. 60, 131-147 (2006).</li>
<li>Claessen, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+n%09olved+in+aerial+hyphae+formation+in+Streptomyces+coelicolor+by+forming+amyloid-like+fibrils%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">A n	olved in aerial hyphae formation in Streptomyces coelicolor by forming amyloid-like fibrils.</a> Genes Dev. 17, 1714-1726 (2003).</li>
<li>Maji, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+Amyloids+As+Natural+Storage+of+Peptide+Hormones+in+Pituitary+Secretory+Granules%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Functional Amyloids As Natural Storage of Peptide Hormones in Pituitary Secretory Granules.</a> Science. 325, 328-332 (2009).</li>
<li>Badtke, M. P., Hammer, N. D., Chapman, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+Amyloids+Signal+Their+Arrival%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Signal%22%5BJournal%5D)">Functional Amyloids Signal Their Arrival.</a> Sci. Signal. 2, pe43(2009).</li>
<li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RIP1%2FRIP3+Necrosome+Forms+a+Functional+Amyloid+Signaling+Complex+Required+for+Programmed+Necrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The RIP1/RIP3 Necrosome Forms a Functional Amyloid Signaling Complex Required for Programmed Necrosis.</a> Cell. 150, 339-350 (2012).</li>
<li>Hou, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MAVS+forms+functional+prion-like+aggregates+to+activate+and+propagate+antiviral+innate+immune+response%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">MAVS forms functional prion-like aggregates to activate and propagate antiviral innate immune response.</a> Cell. 146, 448-461 (2011).</li>
<li>Stefani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+and+biophysical+features+of+both+oligomer%2Ffibril+and+cell+membrane+in+amyloid+cytotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+J%22%5BJournal%5D)">Biochemical and biophysical features of both oligomer/fibril and cell membrane in amyloid cytotoxicity.</a> FEBS J. 277, 4602-4613 (2010).</li>
<li>Glabe, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+classification+of+toxic+amyloid+oligomers%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Structural classification of toxic amyloid oligomers.</a> J. Biol. Chem. 283, 29639-29643 (1074).</li>
<li>Di Domizio, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Binding+with+nucleic+acids+or+glycosaminoglycans+converts+soluble+protein+oligomers+to+amyloid%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Binding with nucleic acids or glycosaminoglycans converts soluble protein oligomers to amyloid.</a> J. Biol. Chem. 287, 736-747 (2012).</li>
<li>Zhang, X., Li, J. -P., Lijuan, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heparan+sulfate+proteoglycans+in+amyloidosis%5BTitle%5D)+AND+%22Prog.+Mol.+Biol.+Transl.+Sci%22%5BJournal%5D)">Heparan sulfate proteoglycans in amyloidosis.</a> Prog. Mol. Biol. Transl. Sci. 93, 309-334 (2010).</li>
<li>Jiménez, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein-DNA+Interaction+at+the+Origin+of+Neurological+Diseases%3A+A+Hypothesis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Alzheimer%27s+Dis%22%5BJournal%5D)">Protein-DNA Interaction at the Origin of Neurological Diseases: A Hypothesis.</a> J. Alzheimer's Dis. 22, 375-391 (2010).</li>
<li>Bhattacharya, M., Jain, N., Mukhopadhyay, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+into+the+Mechanism+of+Aggregation+and+Fibril+Formation+from+Bovine+Serum+Albumin%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Phys.+Chem.+B%22%5BJournal%5D)">Insights into the Mechanism of Aggregation and Fibril Formation from Bovine Serum Albumin.</a> J. Phys. Chem. B. 115, 4195-4205 (2011).</li>
<li>Vetri, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bovine+Serum+Albumin+protofibril-like+aggregates+formation%3A+Solo+but+not+simple+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Biochem.+Biophysics%22%5BJournal%5D)">Bovine Serum Albumin protofibril-like aggregates formation: Solo but not simple mechanism.</a> Arch. Biochem. Biophysics. 508, 13-24 (2011).</li>
<li>Bucciantini, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inherent+toxicity+of+aggregates+implies+a+common+mechanism+for+protein+misfolding+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Inherent toxicity of aggregates implies a common mechanism for protein misfolding diseases.</a> Nature. 416, 507-511 (2002).</li>
<li>McParland, V. J., Kalverda, A. P., Homans, S. W., Radford, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+properties+of+an+amyloid+precursor+of+b2-microglobulin%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Struct.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Structural properties of an amyloid precursor of b2-microglobulin.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 9, 326-331 (2002).</li>
<li>Chiti, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Designing+conditions+for+in+vitro+formation+of+amyloid+protofilaments+and+fibrils%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Designing conditions for in vitro formation of amyloid protofilaments and fibrils.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 3590-3594 (1999).</li>
<li>McParland, V. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Partially+Unfolded+States+of+b2-Microglobulin+and+Amyloid+Formation+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Partially Unfolded States of b2-Microglobulin and Amyloid Formation in vitro.</a> Biochemistry. 39, 8735-8746 (2000).</li>
<li>Liu, K., Cho, H. S., Lashuel, H. A., Kelly, J. W., Wemmer, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+glimpse+of+a+possible+amyloidogenic+intermediate+of+transthyretin%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Struct.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">A glimpse of a possible amyloidogenic intermediate of transthyretin.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 7, 754-757 (2000).</li>
<li>Pfefferkorn, C. M., McGlinchey, R. P., Lee, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+pH+on+aggregation+kinetics+of+the+repeat+domain+of+a+functional+amyloid%5BTitle%5D)+AND+%22Pmel17.+Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Effects of pH on aggregation kinetics of the repeat domain of a functional amyloid.</a> Pmel17. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 21447-21452 (2010).</li>
<li>Di Domizio, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleic+acid-containing+amyloid+fibrils+potently+induce+type+I+interferon+and+stimulate+systemic+autoimmunity%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Nucleic acid-containing amyloid fibrils potently induce type I interferon and stimulate systemic autoimmunity.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 14550-14555 (2012).</li>
<li>Halle, A., Hornung, V., Petzold, G. C., Stewart, C. R., Monks, B. G., Reinheckel, T., Fitzgerald, K. A., Latz, E., Moore, K. J., Golenbock, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+NALP3+inflammasome+is+involved+in+the+innate+immune+response+to+amyloid-%CE%B2%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">The NALP3 inflammasome is involved in the innate immune response to amyloid-β.</a> Nat. Immunol. 9, 857(2008).</li>
<li>Masters, S. L., O'Neill, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disease-associated+amyloid+and+misfolded+protein+aggregates+activate+the+inflammasome%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Mol.+Med%22%5BJournal%5D)">Disease-associated amyloid and misfolded protein aggregates activate the inflammasome.</a> Trends Mol. Med. 17, 276-282 (2011).</li>
</ol>

We hebben niets te onthullen.

De hier beschreven methode biedt een snel en flexibel middel om amyoïde fibrillen in vitro te bereiden van vrijwel elk eiwit of peptide naar keuze. Verschillende soorten amyoïde kunnen betrouwbaar worden bereid - alleen eiwitfibrilles of hybride aggregaten die DNA, RNA of glycosaminoglycanen bevatten. De betrokken procedures zijn eenvoudig, duidelijk en vereisen geen geavanceerde technische opleiding. Het amyoïde dat met deze methode is bereid, is vrij stabiel en kan veilig worden bewaard bij 4 °C of worden inge...

Eiwitten zijn de meest voorkomende biologische macromoleculen die in alle soorten cellen voorkomen. Ze komen voor in een grote verscheidenheid aan maten, structuren en post-translationele modificaties en vervullen een enorm scala aan belangrijke biologische functies in hun natuurlijke vorm. Meer dan twee dozijn abnormale polypeptiden zijn betrokken geweest bij talrijke menselijke pathologische aandoeningen, zoals de ziekte van Alzheimer, de ziekte van Parkinson en type 2 diabetes1-4. De misgevouwen terminale eiwitten accumuleren als amyloïde fibrillen, de onoplosbare stabiele aggregaten die extracellulair of intracellulair voorkomen.
Ondanks de implicatie van specifieke eiwitten bij bepaalde ziekten, ondersteunt toenemend bewijs de opvatting dat alle polypeptiden intrinsieke eigenschappen hebben die amyloïde transformatie mogelijk maken. Een genomisch sequentieonderzoek identificeerde het "amyloom", waarbij amyloïde-neigende fragmenten ongeveer 15% van alle coderende peptidesegmenten uit E. coli tot mensen uitmaken5. Dienovereenkomstig is in de afgelopen jaren een toenemend aantal functionele amyloïden ontdekt, die deelnemen aan verschillende belangrijke cellulaire processen. Bijvoorbeeld, bacteriën assembleren amyloïden om biofilms en sporenstructuren te vormen die cruciaal zijn voor hun overleving en pathogenese6-9. Peptidhormonen vormen amyloïde afzettingen tijdens opslag in secretoire korrels van zoogdieren voordat ze worden vrijgegeven, wat verder impliceert dat de eiwit-amyloïde vorm gunstige biologische functies kan dienen6,10,11. Bovendien kunnen eiwitten zich ook samenvoegen tot amyloïde fibrillen om cruciale cellulaire signalen over te brengen12,13.
Jarenlang zijn de meest bestudeerde amyloïden bereid uit individuele peptiden die worden geassocieerd met menselijke ziekten, zoals amyloïde beta of prionpeptide. Deze peptiden hebben meestal geen goed gedefinieerde structuur en vormen spontaan amyloïde in oplossing na verloop van tijd, een proces dat wordt gemedieerd door een gedeeltelijk misgevouwen intermediair dat dient als voorloper van onoplosbaar amyloïde. De voorloper van amyloïde wordt ook wel oplosbaar eiwit-oligomeer genoemd, wat zeldzaam en onstabiel is wanneer het wordt gegenereerd uit natuurlijke peptiden14,15. Echter, zoals eerder beschreven, kan in principe bijna elk eiwit een amyloïde-conformatie aannemen onder de juiste omstandigheden. We hebben onlangs een methode ontwikkeld om gestabiliseerde oplosbare oligomeren van natuurlijke eiwitten te bereiden, die gemakkelijk amyloïde vormen in aanwezigheid van verschillende cofactoren16. De resulterende amyloïde fibrillen weerspiegelen de complexe aard van de terminale eiwit-misvouwingsaggregaten17,18. Hier gebruiken we de term eiwit-alleen-amyloïde om te verwijzen naar de eiwit-fibrillen zonder cofactoren en hybride amyloïde voor de fibrillen die niet-eiwit componenten bevatten.
Eerder zijn verschillende methoden ontwikkeld om amyloïde in vitro te genereren door omstandigheden toe te passen die bekend zijn om eiwit-misvouwing te bevorderen, zoals hoge temperatuur, hydrofobe omgeving en pH-variaties19-23. Echter, ze worden geassocieerd met verschillende problemen, zoals lage efficiëntie, omkeerbare vouwing, grote batchvariaties of langzame kinetiek. De hier beschreven aanpak is reproduceerbaar, gemakkelijk op te schalen en stelt iemand in staat om het tijdstip en de voorwaarden van amyloïde-conversie precies te bepalen.

<table><tbody><tr><td>2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid (MES)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8250</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher</td><td>BP358-10</td><td></td></tr><tr><td>1-ethyl-3-[3-dimethyl-aminopropyl] carbodiimide hydrochloride (EDC)</td><td>Thermo/Pierce</td><td>22980</td><td></td></tr><tr><td>DNA van zalmzaad</td><td>Sigma</td><td>D1626</td><td></td></tr><tr><td>RNA van torula gist</td><td>Sigma</td><td>R6625</td><td></td></tr><tr><td>Heparine uit varkensdarmmucosa</td><td>Sigma</td><td>H3149</td><td></td></tr><tr><td>Tris-basis</td><td>Fisher</td><td>BP152-1</td><td></td></tr><tr><td>Apparatuur:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Waterbad</td><td>Fisher Science</td><td>Isotemp 210</td><td></td></tr><tr><td>Slide-A-Lyzer dialysecassette</td><td>Thermo/Pierce</td><td>66380</td><td></td></tr></tbody></table>

snelle generatie van amyloïde uit native eiwitten in vitro

Rapid Generation of Amyloid from Native Proteins In vitro

Eiwitten voeren cruciale taken uit in organismen door functies uit te oefenen die voortvloeien uit hun specifieke driedimensionale vouwen. Hoewel de native structuren van polypeptiden veel doeleinden dienen, wordt nu erkend dat de meeste eiwitten een alternatieve samenstelling van bèta-sheet rijke amyloïde kunnen aannemen. Onoplosbare amyloïde fibrillen worden aanvankelijk geassocieerd met meerdere menselijke aandoeningen, maar ze worden steeds vaker gezien als functionele spelers die deelnemen aan verschillende belangrijke cellulaire processen. Bovendien bevat amyloïde dat in patiëntenweefsels wordt afgezet niet-eiwitachtige componenten, zoals nucleïnezuren en glycosaminoglycanen (GAG's). Deze cofactoren kunnen de vorming van amyloïde faciliteren, wat resulteert in de generatie van verschillende soorten onoplosbare neerslagen. Door gebruik te maken van ons begrip van hoe eiwitten verkeerd vouwen via een intermediaire fase van oplosbare amyloïde precursor, hebben we een methode ontwikkeld om native eiwitten om te zetten in amyloïde fibrillen in vitro. Deze aanpak stelt iemand in staat om amyloïde in grote hoeveelheden te bereiden, de eigenschappen van amyloïde te onderzoeken dat is gegenereerd uit specifieke eiwitten, en de structurele veranderingen te evalueren die gepaard gaan met de omzetting.

De mogelijkheid om natuurlijke eiwitten direct om te zetten in amyloïd is afhankelijk van de conformationele verandering die optreedt bij een hoge temperatuur in de MES-buffer. Neerslag in de oplossing is een goede indicatie van eiwitaggregatie en mogelijk amyloïdvorming. Aan de andere kant wordt EDC gebruikt om de eiwitten te crosslinken, zodat oplosbare eiwitoligomeren kunnen stabiliseren en de in MES-buffer geïnduceerde oligomere conformatie kan worden vastgelegd. Hierdoor zijn de gestabiliseerde eiwitoligomeren multi...

Eiwitten kunnen ofwel een natuurlijke structuur aannemen ofwel verkeerd vouwen in onoplosbare amyloyde. Omstandigheden die de verkeerd vouwende route bevorderen, leiden tot de vorming van verschillende soorten amyloyde fibrillen. De hier beschreven methoden maken een snelle omzetting van natuurlijke eiwitten in amyloyde in vitro mogelijk.

Snelle generatie van amyloïde uit native eiwitten in vitro

Proteins carry out crucial tasks in organisms by exerting functions elicited from their specific three dimensional folds. Although the native structures ...

Het algemene doel van het volgende experiment is om snel amyloïde fis van elk eiwit in vitro te verkrijgen. Dit wordt bereikt door het eiwit van keuze op te lossen in MES-buffer om structuurmisvorming te induceren. Het eiwit kan vervolgens worden geïncubeerd bij hoge temperatuur, wat de vorming van amyloïde bevordert in afwezigheid van andere co-factoren.Alternatief kan het eiwit worden gekruist door EDC om gestabiliseerde oplosbare eiwitligamenten te genereren, de voorloper van amyloïde. Ten slotte worden niet-eiwit co-factoren gemengd met gestabiliseerde oplosbare eiwit-oligomeren om de vorming van hybride amyloïde mogelijk te maken. Er worden resultaten verkregen die aantonen dat native eiwitten gemakkelijk kunnen worden omgezet in amyloïde bevestiging wanneer dit wordt vergemakkelijkt door gunstige omstandigheden. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in eiwitmisvormingsziekten, zoals hoe precies amyloïde zich vormt uit oplosbare eiwit-oligomeren, en of verschillende soorten amyloïde verschillende biologische en pathologische functies hebben.Om te beginnen, bereid MES-buffer voor zoals beschreven in het tekstprotocol voor zowel eiwit-alleen-amyloïde als gestabiliseerd oplosbaar eiwit. Weeg vervolgens alle ligamenten het eiwit van keuze en reconstitueer het tot 10 milligram per milliliter in MES-buffer. In deze demonstratie wordt humaan serumalbumine of HSA gebruikt, incubeer de oplossing gedurende vier uur in een waterbad op 65 graden Celsius.Tegen het einde van de periode is een wit neerslag zichtbaar in de oplossing. Neutraliseer het monster met 10% volume per volume. T tris, HCL dialyseer het eiwit in een dialysecassette een nacht lang om uit te wisselen naar de gewenste buffer.Voor verdere analyse, bereid een controlemonster van natuurlijk eiwit voor door deze stappen te volgen zonder hitteprecipitatie. Om gestabiliseerd oplosbaar eiwit te bereiden, weeg alle ligamenten het eiwit van keuze en reconstitueer het tot 10 milligram per milliliter. Laat de eiwitoplossing in MES-buffer 15 minuten op kamertemperatuur staan.Bereid een verse voorraad van 20 milligram per milliliter EDC in MES-buffer. Meng de eiwit- en EDC-oplossingen in een verhouding van twee tot vijf, en incubeer vervolgens gedurende twee uur bij kamertemperatuur. Neutraliseer het monster met 10% volume per volume van tris HCL dialyseer het eiwit in een dialysecassette een nacht lang voor uitwisseling naar de gewenste buffer.Voor verdere analyse. Bewaar het gestabiliseerde oplosbare eiwit alle ligamenten gedurende maximaal vier weken op vier graden Celsius. Deze suspensie zal worden gebruikt om hybride amyloïden te bereiden voor de voorbereiding van zowel het DNA-bevattende amyloïde als het RNA-bevattende amyloïde.Meng, het nucleïnezuur en gestabiliseerde oplosbare eiwit alle ligamenten in een een-op-een-verhouding. Laat het mengsel gedurende ten minste twee uur op vier graden Celsius staan gedurende deze periode. Onoplosbaar neerslag is zichtbaar in oplossing wanneer de initiële eiwitconcentratie 0,5 milligram per milliliter of hoger is.Om het heparine-bevattende amyloïde te bereiden, meng heparine en gestabiliseerd oplosbaar eiwit, alle ligamenten in een een-op-een-verhouding voordat u het gedurende ten minste twee uur op vier graden Celsius incubeert. Net als bij de nucleïnezuurbevattende amyloïden is in oplossing een onoplosbaar neerslag zichtbaar. Wanneer de initiële eiwitconcentratie 0,5 milligram per milliliter of hoger is, hangt de mogelijkheid om native eiwitten direct om te zetten in amyloïde af van de conformationele verandering die bij hoge temperatuur optreedt.In de MES-buffer is precipitatie in de oplossing een goede indicatie van eiwitaggregatie en mogelijke amyloïdevorming om oplosbare eiwit-oligomeren te stabiliseren. EDC wordt gebruikt om de eiwitten te kruisen om de oligomere bevestiging geïnduceerd in MES-buffer te verstevigen. Als resultaat zijn de gestabiliseerde eiwitligamenten multimere eiwitten die verschillen van monomere native eiwitten of door hitte geïnduceerde aggregaten.Wanneer gescheiden door SDS-pagina gestabiliseerd oplosbaar eiwit, kunnen alle ligamenten gemakkelijk binden aan nucleïnezuren, inclusief zowel DNA als RNA op een sequentie-onafhankelijke manier. Daarom kan een gel-shift-assay worden uitgevoerd om de directe interactie tussen het gestabiliseerde oplosbare eiwit, alle ligamenten en DNA te visualiseren, wat zou resulteren in de vertraagde migratie van DNA op een AROS-gel. Cytotoxiciteit is een archetypeel kenmerk van oplosbaar eiwit.Alle ligamenten gestabiliseerd oplosbaar eiwit, alle ligamenten induceerden dosisafhankelijk celdood die detecteerbaar is door fluorescentie-geactiveerde celsortering. Zoals hier getoond, zijn RP I 8 2 2 6-cellen uiterst gevoelig voor oplosbaar eiwit, alle ligamenten geïnduceerde dood die wordt gemeten door propidiumjodide-kleuring. Na het bekijken van deze video, zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u verschillende soorten amyloïde kunt bereiden van elk eiwit van uw keuze in vitro.

rapid-generation-of-amyloid-from-native-proteins-in-vitro

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Snelle generatie van amyloïde uit native eiwitten In vitro

SDD-AGE is een nuttige techniek voor de detectie en karakterisering van amyloid-achtige polymeren in de cellen. Hier laten we zien een aanpassing dat maakt deze techniek vatbaar is voor grootschalige toepassingen.

Screening op Amyloid Aggregation door semi-denaturerende Detergent-agarosegelelektroforese

Source: Balczon, R., et al. Methods for Detecting Cytotoxic Amyloids Following Infection of Pulmonary Endothelial Cells by Pseudomonas aeruginosa. J. Vis. Exp. (2018)This video demonstrates the procedure for generating cytotoxic supernatant from pulmonary endothelial cells following infection with Pseudomonas aeruginosa. It outlines how bacterial effector proteins disrupt host cell structure and induce the release of cytotoxic amyloid oligomers into the supernatant.

Obtaining Cytotoxic Amyloids Following Bacterial Infection of Rat Pulmonary Endothelial Cells

Beschrijven we methoden om aspecten van amylopathies in de worm te...

Een<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Model Systeem voor Amylopathy Study

Een tweedelige chromatografische methode wordt beschreven voor de zuivering van recombinant Shadoo-eiwit dat tot expressie wordt gebracht als inclusielichamen in Escherichia coli, evenals een protocol om gezuiverd Shadoo in fibrillaire amyloide structuren te laten overgaan.

Zuivering en het opnieuw vouwen tot amyloïdefibrillen van (His)<sub&gt; 6</sub&gt; gemerkte Recombinant Shadoo Eiwit Uitgedrukt Inclusion Bodies in<em&gt; E. coli</em

Een gebruiksvriendelijk, celvrij expressieprotocol voor de residurespecifieke incorporatie van niet-canonieke aminozuuranalogen in eiwitten, inclusief downstream-analyse, wordt gepresenteerd voor medisch, farmaceutisch, structureel en functioneel onderzoek.

Residu-specifieke Opneming van noncanonical aminozuren in Eiwitten Model behulp van een<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Cell-free transcriptie-vertaalsysteem

Er is een vraag om preklinische testen voor een nieuwe klasse van "Wees" drugs genoemd farmacologische chaperones reproduceerbaar, snel en efficiënt. Voor patiënten die in aanmerking komen, alsmede nieuwe farmacologische chaperone drugs ontwikkelden we een eenvoudige, sterk gestandaardiseerde en veelzijdig cel cultuur gebaseerde bepaling naar het scherm.

In Vitro Enzym meting aan Test farmacologische Chaperone responsiviteit in Fabry en de ziekte van Pompe

Eenvoudige methoden beschreven voor het aantonen van de productie van cytotoxische amyloids na infectie van pulmonaire endotheel door Pseudomonas aeruginosa.

Methoden voor het opsporen van cytotoxische Amyloids volgende infectie van pulmonaire endotheliale cellen door Pseudomonas aeruginosa

Hier presenteren we een protocol om Aspergillus flavus groei en productie van aflatoxine in maïs kernels uiting van een antischimmel eiwit te analyseren.  Met behulp van een stam GFP-uiten A. flavus bewaakt we de infectie en de verspreiding van de schimmel in volwassen kernels in real-time. De bepaling is snel, betrouwbaar en reproduceerbaar.

Remming van de groei van de Aspergillus flavus en aflatoxine productie in transgene maïs uiten van de α-amylase Inhibitor van Lablab purpureus L.

Hier is een protocol voor het onderzoek van de interacties tussen inheemse vorm, prefibrillar, en volwassen amyloïde fibrillen van verschillende peptiden en eiwitten met mitochondriën geïsoleerd uit verschillende weefsels en verschillende gebieden van de hersenen.

Interacties met en membraan Permeabilization van de mitochondriën van de hersenen door amyloid fibrils

Hier beschrijven we een gistsysteem dat menselijke γ-secretase reconstrueert. Dit systeem maakt het mogelijk om mutaties die de activiteit beïnvloeden te identificeren en te bestuderen en om γ-secretaseremmers (GSI's) te screenen. Door gebruik te maken van het functieverlies van familiale mutanten voor de ziekte van Alzheimer, is het mogelijk om te screenen op γ-secretasemodulatoren (GSM's).

Saccharomyces cerevisiae Modellen van de ziekte van Alzheimer om genen, mutaties en chemicaliën te screenen die de productie van amyloïde bèta beïnvloeden door γ-secretase

Leer hoe je snel amyloïde vezels genereert uit native eiwitten in vitro met behulp van temperatuur en chemische cross-linking. Deze methode helpt onderzoekers bij het bestuderen van eiwitmisfolding en amyloïde vorming.

Snelle generatie van amyloïde uit native eiwitten in vitro

Meer video's verkennen