Methoden voor de modulatie en analyse van NF-kB-afhankelijke Adult Neurogenese
13 februari 2014
Werkwijzen voor de manipulatie en analyse van NF-kB-afhankelijke volwassen hippocampus neurogenese beschreven. Een gedetailleerd protocol wordt gepresenteerd voor een dentate gyrus-afhankelijke gedragstest (genoemd het ruimtelijk patroon scheiding-Barnes doolhof) voor het onderzoek naar cognitieve uitkomst bij muizen. Deze techniek moet ook helpen onderzoek mogelijk te maken in andere experimentele instellingen.
Het algemene doel van deze procedure is om de functie van de transcriptiefactor NF kappa B in de volwassen hersenen te onderzoeken. Dit wordt bereikt door eerst transgene muizen te fokken die specifiek de NF kappa B-activiteit in neuronen remmen. De tweede stap van de procedure is om de gedragsgevolgen van de NF kappa B-remming te testen met behulp van het ruimtelijke patroon, scheiding of barns, labyrint.
De derde stap is de zorgvuldige perfusieverwerking van de dieren, verwijdering van de hersenen en de juiste sectie daarvan. De laatste stap is het analyseren van histologische en structurele effecten, zoals het visualiseren van mossy fiber projecties door immunokleuring. Uiteindelijk kan het gebruik van het gedragstest gevolgd door histologie correlaties aantonen tussen veranderingen in dentate gyrus-afhankelijk leren en structurele veranderingen in geassocieerde weefsels.
Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden zoals Mars Vase is dat ruimtelijke patroonscheiding scheiding MA de mogelijkheid biedt om specifiek anti-kind afhankelijke leerprocessen evenals neurodegeneratie en regeneratie in dit hersengebied te meten. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van volwassen neurogenese, zoals leren als speciale patroonscheiding. Het demonstreren van het labyrint zal worden gedaan door Angela Kula, een technicus uit mijn lab.
De perfusieverwerking zal worden gepresenteerd door Peter Hyman, een onderzoeksmedewerker. Vervolgens zal de sectie van hersenen worden getoond door Ulrich KA technicus. En tenslotte zal de confocale scanmicroscopie worden gepresenteerd door Jeanine Muah, een promovendus van mijn lab. Uitvoeren van de ruimtelijke patroonscheiding.
Barnes Maze Gedragstest volgens internationale en lokale richtlijnen. Voor deze test is het belangrijk om alleen mannelijke muizen van minimaal zes maanden oud te gebruiken. Voor elke testreeks moeten de dieren binnen vier dagen van leeftijd zijn en dezelfde operator moet alle tests uitvoeren voorafgaand aan de test.
De muizen moeten een standaard dieet krijgen zodat ze gemotiveerd zijn door zoet voedsel. Om de test op te zetten, verkrijg eerst een witte plaat met een diameter van 120 centimeter gemaakt van hard plastic. De extra labyrintopdrachten kunnen van verschillende materialen zijn gemaakt en kunnen verschillende vormen hebben.
Belangrijk is dat ze een hoge contrast moeten hebben om duidelijk herkend te worden door het dier dat rondloopt. Ladders en tunnels zijn allemaal goede aanwijzingen. Plaats de plaat onder verschillende neon fluorescentielampen die matig intens zijn, zodat de muizen gemotiveerd zijn om uit het licht te komen.
De kamer moet luchtvochtigheid gecontroleerd zijn en op een constante temperatuur van 22 graden Celsius. Stel nu het videotrackingsysteem op. Plaats de camera 115 centimeter boven het centrum van de plaat.
Vervolgens bevestigt u meerkleurige extra labyrintopdrachten aan een wit gekleurd doek dat past op de plaat. Plaats ze in de buurt van het centrum van het doek, zodat ze gemakkelijk zichtbaar zijn voor de dieren. Reinig nu voorzichtig de plaat met de snelle desinfectiemiddel die elke geur van de experimentele opstelling kan verwijderen.
Plaats zeven identieke gele voedselhuizen op de witte plaat. Hun posities moeten ondubbelzinnig gemarkeerd worden één dag voor het starten van de tests, gewennen elke muis aan de schijf. Plaats zoete voedselpelletjes als beloning zoals een in ieder van de zeven voedselhuizen voor de gewenning proef.
Plaats elke muis op het startpunt van de plaat en geef hem 10 minuten om te verkennen. Neem deze verkenning tussen muizen op. Reinig de ronde plaat en de voedselhuizen met snel desinfectiemiddel.
Ververs ook de voedselbeloningen. Op de volgende zeven opeenvolgende dagen voert u de testproeven uit voor de tests. Alle huizen behalve één zijn gesloten met doorzichtig plakband voor de hele proef.
Het is altijd hetzelfde huis. Elk huis is nog steeds geladen met een beloning en de proef wordt uitgevoerd zoals de gewenningproef. Voer de proeven uit op hetzelfde tijdstip van de dag voor elk dier om circadiane variaties te vermijden.
Analyseer later de latentie, afgelegde afstand en fouten met behulp van geschikte statistiek. Software definieert fouten als het naderen van het verkeerde voedselhuis of contact maken met de juiste doos, maar het niet binnengaan en ophalen van de beloning. Om de groepen te vergelijken, gebruikt u een tweeweg ANOVA met een bon fer post hoc test.
Nadat het dier is verdoofd met een intraperitoneale injectie van vertin, perfuseert u het voorzichtig transkardiaal met PBS dat heparine en propaan bevat. Maak een gat in het linker ventrikel met een 26 gauge naald. Maak ook een snede in het rechter atrium om het bloed en de perfusievloeistof te laten stromen.
Breng de perfusienaad in het linker ventrikel in het gat met een rechte hoek en tot een diepte van één tot twee millimeter. Gebruik 1,2 tot 1,4 meter hydrostatische druk en perfuseer de muis gedurende twee tot vier minuten. Volg de heparine en propaan met 4% paraldehyde in PBS gedurende 10 tot 15 minuten.
De perfusieverwerking moet een snelheid van 15 milliliter per minuut hebben. Verwijder nu de hersenen. Het moet bleekwit zijn zonder zichtbare rode bloedvaten.
Fixeer alle verzamelde hersenen in 4% para formaldehyde bij vier graden Celsius gedurende 24 uur. De volgende dag. Cryobescherm de hersenen in 30% sucrose in PBS, bewaar ze bij vier graden Celsius gedurende ten minste 24 uur later.
De hersenen worden bevroren op een cryotone-schijf en gesneden in 40 micron dikke horizontale secties. Na het kleuren van de secties met een antilichaam voor neurofilament M, kunnen de mossy fiber projecties worden gevisualiseerd met behulp van een confocale laserscanningmicroscoop op de juiste golflengte voor het fluorescerende antilichaam. Begin het scannen met lage vergroting en oriënteer naar de hippocampus en mossy fiber projecties.
Verzamel vervolgens bij hogere vergroting hoge resolutie C-secties van de mossy fiber voor analyse om de expressie van de I kappa B alfa AA een transgeen te onderzoeken. In de dubbel transgene muizenhersenen werden geïsoleerd, cryo-gesneden en gekleurd met behul
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel beschrijft methoden voor het manipuleren en analyseren van NF-κB-afhankelijke neurogenese in de hippocampus bij volwassenen. Een gedetailleerd protocol voor een dentate gyrus-afhankelijke gedragstest, de ruimtelijke patroonscheiding-Barnes labyrint, wordt gepresenteerd om cognitieve resultaten bij muizen te onderzoeken.
Belangrijkste onderzoekscomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Gedragsanalyse
- Neurogenese
Achtergrond
- NF-κB is een transcriptiefactor die betrokken is bij verschillende hersenfuncties.
- Neurogenese bij volwassenen is cruciaal voor leren en geheugen.
- Gedragstests kunnen cognitieve resultaten onthullen die verband houden met neurogenese.
- De ruimtelijke patroonscheiding-Barnes labyrint is een specifieke test voor het beoordelen van cognitieve functies bij muizen.
Doel van het onderzoek
- Om de functie van NF-κB in de volwassen hersenen te onderzoeken.
- Om de gedragsconsequenties van NF-κB-remming te beoordelen.
- Om gedragsveranderingen te correleren met structurele veranderingen in de dentate gyrus.
Gebruikte methoden
- Kruisen van transgene muizen om NF-κB-activiteit in neuronen te remmen.
- Uitvoeren van gedragstests met behulp van de ruimtelijke patroonscheiding-Barnes labyrint.
- Het perfunderen van dieren en verwijderen van hersenen voor analyse.
- Analyseren van histologische effecten, inclusief immunokleuring van mossy fiberprojecties.
Belangrijkste resultaten
- Gedragstests wezen op cognitieve resultaten gerelateerd aan NF-κB-remming.
- Histologische analyse onthulde structurele veranderingen in de dentate gyrus.
- Er werden correlaties gevonden tussen gedragsprestaties en structurele integriteit.
- De methoden bieden een raamwerk voor toekomstige onderzoeken naar neurogenese.
Conclusies
- Het onderzoek toont succesvol de impact van NF-κB op volwassen neurogenese.
- Gedrags- en structurele analyses kunnen worden geïntegreerd om cognitieve functies te begrijpen.
- Deze aanpak kan worden toegepast op andere experimentele instellingen voor verder onderzoek.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Understanding NF-κB's role in adult hippocampal neurogenesis provides mechanistic insights into learning and memory pathways relevant to cognitive disorder target validation. The spatial pattern separation-Barnes maze enables quantitative assessment of dentate gyrus-dependent cognition, supporting phenotypic screening of genetic or pharmacological modulators. This integrated behavioral-histological approach facilitates preclinical model validation and translational biomarker alignment for neurogenic pathways.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates NF-κB as a transcriptional regulator in adult neurogenesis to validate mechanistic hypotheses in cognitive pathways.
- Operational Value: Enables functional target validation through inducible neuronal inhibition models in adult mice.
- Predictive Value: Supports target de-risking by linking NF-κB modulation to structural and functional hippocampal outcomes.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Spatial pattern separation-Barnes maze provides a standardized, quantifiable output for dentate gyrus-dependent learning.
- Reproducibility: Protocol includes controlled environmental conditions, operator consistency, and defined error metrics for cross-lab reliability.
- Scalability: Adaptable to other transgenic models or pharmacological interventions targeting hippocampal neurogenesis.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Connects NF-κB signaling to dentate gyrus structural integrity and cognitive performance in aging or neurodegenerative contexts.
- Translational Continuity: Correlates behavioral deficits with histological markers (e.g., mossy fiber projections, DCX+ progenitors) for mechanistic de-risking.
- Preclinical Validation: Supports risk-adjusted advancement by identifying dissociation between proliferation and differentiation in neurogenic cascades.
Pipeline & Workflow Integration
This method bridges early target validation (NF-κB modulation) to phenotypic screening (behavioral testing) and preclinical analysis (histological quantification), enabling iterative de-risking of neurogenic targets.
- Discovery Biology: Tests therapeutic hypotheses by inhibiting NF-κB in forebrain neurons to assess impact on adult hippocampal plasticity.
- Screening: Spatial pattern separation-Barnes maze delivers latency, distance, and error metrics as quantitative dependent variables for compound or genotype comparison.
- Analytics: Two-way ANOVA with Bonferroni post hoc enables statistical comparison of behavioral groups, supporting data-driven go/no-go decisions.
- Translational Research: Links behavioral performance to structural outcomes (DG volume, mossy fiber organization, neurogenesis markers) for biomarker alignment.
- Enterprise Reuse: Protocol is adaptable to other transgenic models or pharmacological agents investigating dentate gyrus-dependent learning.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by correlating NF-κB activity with neurogenic proliferation, differentiation, and structural integrity.
- Operational Value: Standardized perfusion, sectioning, staining, and imaging workflows ensure reproducible histological and behavioral datasets.
- Strategic Value: Informs portfolio prioritization by identifying targets with strong preclinical phenotypic concordance.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted decisions through dual validation of behavior and histology in disease-relevant systems.
Implementation Considerations
- Requires expertise in transgenic mouse handling, behavioral neuroscience, and histological processing.
- Dependent on fluorescence microscopy, cryostat sectioning, and perfusion equipment for tissue preservation and antigen detection.
- Necessitates cross-team standardization between behavior, histology, and imaging teams for correlated analysis.
- Adaptation to other models requires validation of promoter specificity and transgene expression patterns in neurogenic niches.
- Limited to endpoints supported by source: behavioral performance, progenitor proliferation (BrdU+/DCX+), differentiation, and structural histology.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
2:19
Preparing the Spatial Pattern Separation-Barnes Maze
4:27
Running the Spatial Pattern Separation-Barnes Maze
6:15
Sectioning the Perfused Animals and Investing the Mossy Fiber Projections
8:41
Neurodegeneration and Behavioral Defects from IκBα Expression via CAMKIIα Promoter Control
14:22
Conclusion
