Name: Methoden voor de modulatie en analyse van NF-kB-afhankelijke Adult Neurogenese (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-02-13T23:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 58 s
Description: Leer methoden voor NF-κB-afhankelijke neurogenese in de volwassen hersenen met behulp van transgene muizen en het Barnes-maze gedragstest. Deze techniek helpt onderzoekers om cognitieve uitkomsten te correleren met structurele veranderingen in de dentate gyrus.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Wij danken Angela Kralemann-Köhler voor een uitstekende technische ondersteuning. Experimenteel werk hierin beschreven werd uitgevoerd in ons laboratorium en werd ondersteund door subsidies van de Duitse Raad voor Onderzoek (DFG) CK en BK en een subsidie ​​van het Duitse ministerie van Onderzoek en Onderwijs (BMBF) aan BK.

Ethiek verklaring Dit onderzoek is uitgevoerd in strikte overeenstemming met de voorschriften van de overheid dier en zorggebruik commissie, LANUV van de staat Noord-Rijnland-Westfalen (Düsseldorf, Duitsland) uitgevoerd. Alle dierproeven werden goedgekeurd door LANUV, Düsseldorf onder licentie nummer 8.87-51.04.20.09.317 (LANUV, NRW). Alle inspanningen werden gedaan om nood en het aantal dieren dat nodig is voor de studie zoveel mogelijk te beperken. 1. Animal Care en Huisvesting <ol><li> Alle dieren die in de hierin beschreven protocollen moeten onder specifieke pathogeen-vrije omstandigheden worden gehouden, zoals bepaald door de Federatie Europese Laboratory Animal Science Association (FELASA). </li><li> Muizen moeten in standaard kooien worden gehouden in een temperatuur-en vochtigheid gecontroleerde (22 ° C) ruimte onder dagelijkse omstandigheden (12 uur licht / donker cyclus) met HEPA gefilterde lucht. </li><li> Gestandaardiseerd voedsel en water moet worden ad libitum. &lt;/ Li&gt; <li> Als IKB / tTA en IKB / - controle muizen worden gebruikt, moeten PCR-gebaseerde genotypering uitgevoerd worden voor elk dier, zoals beschreven in 7, 18. </li><li> Mannelijke dieren met een leeftijd verschil van minder dan vier dagen dienen te worden gebruikt om de variabiliteit te verminderen. </li><li> (Optioneel): Voor de NF-kB reactivering experimenten, doxycycline moet worden toegediend in het drinkwater (2 mg / ml met 2,5% sucrose) gedurende ten minste 14 dagen. </li></ol> 2. Ruimtelijk patroon Scheiding-Barnes Maze (SPS-BM) <ol><li> Alle gedrags tests moeten worden uitgevoerd in overeenstemming met internationale en lokale richtlijnen. </li><li> BELANGRIJK! Gebruik alleen mannelijke muizen met een leeftijd van zes maanden of ouder. Het leeftijdsverschil tussen de dieren van een testreeks moet minder dan vier dagen. De test moet worden uitgevoerd door dezelfde exploitant voor elke serie. De muizen moeten een standaard dieet ontvangen voorafgaand aan de test om verder te verhogen de motivatie gedeeltelijk gedreven door alsWeet voedsel beloning. </li><li> Het opzetten van een witte cirkelvormige plaat gemaakt van hard plastic (diameter 120 cm, zie figuur 5A) in een vochtige-en temperatuur gecontroleerde ruimte (22 ° C), verlicht met ten minste 4 x 80 W en 3 x 215 W fluorescerende lampen . BELANGRIJK! Zorgen voor de juiste verlichting wordt gebruikt, zoals de motivatie van de muizen om het voedsel de huizen betreedt wordt gedeeltelijk gedreven door hun afkeer van heldere, zichtbare plaatsen. </li><li> Stel de video-tracking systeem. De camera moet 115 cm boven het midden van de plaat (zie figuur 5A) worden geplaatst. </li><li> Bevestig veelkleurige extra-doolhof cues (EMC) om een wit-gekleurde doek in posities gemakkelijk toegankelijk voor de dieren, ongeveer 100 cm van de rand van de plaat (zie figuur 5A). </li><li> Reinig de plaat voorzichtig met een snelle ontsmettingsmiddel dat een geur uit de experimentele set-up kan verwijderen. </li><li> Plaats zeven identieke gele voedsel huizen (12 cm x 7 cm x 8 cm, zie figuur 5A </strong&gt;) op de witte plaat. De posities moeten ondubbelzinnig aangegeven (zie figuur 5A). </li><li> Plaats zoet voedsel pellet beloningen (een kwart van een Kellogs `s Froot Loop / food huis) binnen alle levensmiddelen huizen op welbepaalde plaatsen (zie figuur 5A) met slechts een bepaald voedsel huis zijn vrij toegankelijk voor het dier (locatie F, zie figuur 5A ). Sluit de nontarget voedsel huizen met transparante folie. </li><li> Voorafgaand aan de test uitvoeren gewenning (een dag voor aanvang van de opdracht). Maak alle voedsel huizen vrij toegankelijk en laat de muizen om het doolhof vrij te verkennen en om een ​​levensmiddel pellet beloning (10 min / dier) te halen. </li><li> Schakel de computer en de camera aan en start de video-tracking systeem software. </li><li> Start de opname. </li><li> Plaats het dier in de gedefinieerde startpunt op de ronde plaat (figuur 5A, S: startpositie) en laat de muizen om te zoeken naar het doel voedsel voor 10 minuten. </li><li> Stop de video-tracking. </li><li> BELANGRIJK! Reinig de cirkelvormige plaat en het eten huizen na elke proef met snelle ontsmettingsmiddel. </li><li> Herhaal de test dagelijks gedurende zeven opeenvolgende dagen (per dier). </li><li> Analyseer de resultaten (latency, de afgelegde afstand en fouten) met behulp van geschikte statistische software. Fouten te definiëren als het naderen van het verkeerde voedsel huis en / of contact met de juiste doos zonder het invoeren van en het ophalen van de voedsel pellet beloning. Voor gegroepeerde analyse gebruik van twee-weg ANOVA met Bonferroni post-hoc test. </li><li> (OPTIE) Offer de muizen en de hippocampus zoals hieronder beschreven te analyseren. </li></ol> 3. BrdU Labeling <ol><li> Intraperitoneaal injecteren 50 mg / kg ip BrdU eenmaal daags gedurende 3 dagen (analyse van differentiatie en integratie) of 200 mg / kg ip een enkele injectie (analyse van de proliferatie). </li><li> Offer de dieren, ontleden de hippocampus en bereid 40 urn zoals hieronder beschreven. </li><li> Denatureren desecties met 2 M HCl gedurende 10 minuten en incubeer in 0,1 M boraatbuffer gedurende 10 minuten. </li><li> Label een in twaalf reeks van 40 urn (240 urn van elkaar) van elk dier immunohistochemisch, zoals hieronder beschreven met behulp van antilichamen tegen BrdU. </li><li> Kwantificeer de gelabelde cellen met confocale microscopie analyse gehele rostrocaudal omvang van de korrel cellaag en subgranulaire zone. Vermenigvuldig de verkregen getallen door 12 het geschatte aantal BrdU-gelabelde cellen per hippocampus en delen verkrijgen door twee aan het totale aantal gelabelde cellen per DG verkrijgen. </li></ol> 4. Verwijdering van de Hersenen en voorbereiding van Weefsel secties van Nonperfused Dieren <ol><li> Let op lokaal goedgekeurde procedures voor euthanasie dieren. Muizen kunnen direct worden gedood door cervicale dislocatie. </li><li> (OPTIE) Dieren kunnen worden verdoofd voordat euthanization volgens de lokale en internationale richtlijnen, bijv. door intraperitoneale injectie van 0,8 ml Avertin voor een 33 g muis (vers gemaakt door het mengen van 150 ml stockoplossing gemaakt van 2,2 mg 2,2,2-tribroomethanol in 1 ml isoamylacetaat ethanol met 1,85 ml van een zoutoplossing of fysiologische buffer). </li><li> Steriliseer het hoofd met Betadine (10% povidon-jood)-gedrenkt gaas en vervolgens wattenstaafje met gaas geweekt in 70% ethanol. </li><li> Onthoofden het dier met behulp van passende chirurgische schaar en trek de huid opzij. </li><li> (OPTIONEEL) Bevestigingsklemmen kan worden toegepast om te voorkomen terugvouwen van het vertraagde huid. </li><li> Maak een middellijn incisie in de schedel en trek de schedel fragmenten opzij. </li><li> Verwijder de hele hersenen zorgvuldig met een geschikt chirurgisch instrument (bijv. Moria Spoon). </li><li> Precool 25 ml 2-methylbutaan in een 50 ml bekerglas (bijvoorbeeld Schott Duran) tot -30 tot -40 ° C op droog ijs. Opmerking: Voor vrij zwevende kleuring van &quot;dikke&quot; secties die bij uitstek geschikt zijn voor confocale laser scanning microscopie, verwijder de hersenen, was 3keer in buffer en bewaar bij 4 ° C in fosfaat gebufferde 30% sucrose-oplossing in 50 ml buis totdat hersenen beneden gezonken naar beneden (typisch overnacht). </li><li> Plaats voorzichtig de hersenen op een stuk van Nescofilm (Parafilm) en dek af met een ruime hoeveelheid TissueTek oktober verbinding, bevriezen Nescofilm in 2-methylbutaan, bewaar bij -80 ° C tot gebruik. Opmerking: Voor de lange termijn opslag bij -20 ° C op te slaan in 9% sucrose, 7 mM MgCl2, 50 mM fosfaatbuffer, 44% glycerol. </li><li> Snijd de hersenen in 10-12 micrometer dikke secties over passende cryomicrotoom. Opmerking: Voor dikke, vrij zwevende delen, te bevriezen hersenen op cryotoom stadium van geschikte cryotoom (bijv. Reichert Jung, Frigomobil.) En snijd 40 micrometer horizontale secties bij -20 ° tot - 25 ° C. Verzamel secties van mes met fijne borstel en in een buffer of in storage oplossing te houden (stap 4.9) bij -20 ° C gedurende langere tijd opslaan. </li><li> Mount zorgvuldig twee plakjes op enkele objectglaasjes. De onse van Superfrost UltraPlus dia&#39;s wordt ten zeerste aanbevolen om de hechting van de secties te maximaliseren. </li><li> Droog de objectglaasjes gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur geroerd. Dia&#39;s kunnen worden opgeslagen bij -80 ° C tot gebruik. </li></ol> 5. Bereiding van de punten uit geperfuseerde Dieren <ol><li> Verdoven dieren zoals hierboven (stap 4.2) beschreven. </li><li> Perfuseren het dier voorzichtig transcardiaal met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) met heparine (0,025 g/100 ml PBS) en procaïne (0,5 g/100 ml PBS) gedurende 2-4 minuten, gevolgd door 4% paraformaldehyde in PBS gedurende 10-15 min . Perfusie wordt optimaal uitgevoerd te doorstromen via de linker ventrikel en openen van de rechter atrium met een hydrostatische druk van ongeveer 1,2-1,4 m of gebruik van een peristaltische pomp ingesteld op ongeveer 15 ml / min. Optimale perfusie resultaten in een bleke witte hersenen zonder rode bloedvaten zichtbaar. </li><li> Ontleden en na vaststellen van de hersenen in 4% paraformaldehyde bij 4 ° C gedurende 24 uur. </li><li> Cryobeschermen de hersenen in 30% sucrose in PBS bij 4 ° C gedurende ten minste 24 uur. </li><li> Bevries de hersenen op de cryotoom podium. </li><li> Bereid 40 micrometer horizontale delen van hele forebrains met een geschikte cryotoom. </li><li> De objectglaasjes kunnen worden opgeslagen in cryobeschermingsmiddeloplossing (0,1 M fosfaatbuffer, 50% glycerol, 0,14% MgCl2, 8,6% sucrose) bij -20 ° C tot gebruik. </li></ol> 6. Immunohistochemie van Brain secties van Nonperfused Dieren <ol><li> Post-fix de cryosecties, bereid zoals boven beschreven, met -20 ° C koude methanol gedurende 10 minuten. </li><li> Blokkeer met 5% normaal serum dat 0,3% Triton-X (van de soort die werd gebruikt voor het verhogen van het secundaire antilichaam) overnacht bij 4 ° C. </li><li> Spoel 3x met 1x PBS en incubeer met primaire antilichamen overnacht bij 4 ° C. </li><li> Spoel 3x met 1x PBS en geïncubeerd met secundaire antilichamen bij kamertemperatuur gedurende een uur. </li><li> Spoel 3x met 1x PBS </li><li> Counterstain de sectie voor DNA met behulp SYTOX groen of DAPI (of een alternatieve DNA-kleurstof). </li><li> Spoel 3x met 1x PBS </li><li> Insluiten de secties in een waterig inbeddingsmedium. </li><li> Laat de inbedding medium polymeriseren gedurende tenminste 48 uur. </li></ol> 7. Immunohistochemie van Brain secties van geperfuseerde Dieren <ol><li> Blok zoals beschreven in stap 6.2 en vervolgens incubeer vaste hersencoupes in primair antilichaam verdund in PBS dat 0,3% Triton-X (vrij zwevende) overnacht bij 4 ° C. </li><li> Spoel driemaal met 1 x PBS en geïncubeerd in secundair antilichaam verdund in PBS dat 0,3% Triton-X (vrij zwevend) bij kamertemperatuur gedurende 3 uur. </li><li> Spoel 3x met 1x PBS </li><li> Tegenkleuring de sectie voor DNA met behulp SYTOX groen of DAPI (of een alternatieve DNA-kleurstof). </li><li> Spoel driemaal met 1x PBS </li><li> Insluiten de secties in een waterig inbeddingsmedium. </li><li> Laat de inbedding medium polymeriseren voor eent minste 48 uur. </li></ol> 8. Onderzoek van mosvezel projecties <ol><li> Offer de dieren bereiden 40 urn coronale secties zoals hierboven beschreven en vlekken de hippocampus gedeelte met antilichaam voor neurofilament M. </li><li> Scan de secties op de juiste golflengte met behulp van een confocale laser scanning microscoop om bemoste vezels en kernen te visualiseren. Start het scannen bij een lage vergroting. </li><li> Gebruik de lage vergroting beelden voor oriëntatie en de doelstelling van de hippocampus met mosvezel projecties. </li><li> Scan de secties (z-snijden) met een hoge resolutie en hoge vergroting. </li><li> Analyseer de morfologische verschijning en connectiviteit van de bemoste vezels gevisualiseerd via kleuring voor NF-M. </li><li> (OPTIE) Analyseer de grootte en het volume van de hippocampus messen. Gebruik het DNA signaal voor de metingen. </li></ol> 9. Fluor-Jade C Assay (neuronale celdood) <ol><li> Offer de dieren, ontleden de hippocAmpus, en bereid 12 urn zoals hierboven beschreven. </li><li> Laat de onderdelen drogen gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur geroerd. </li><li> Bevestig de secties in 4% PFA gedurende 40 minuten bij kamertemperatuur geroerd. </li><li> Kort was de secties 3x met DDH 2 O. </li><li> Incubeer de secties met 0,06% kaliumpermanganaat (KMnO 4) gedurende 10 minuten onder voortdurend, voorzichtig schudden. </li><li> Was de secties 3x met DDH 2 O. </li><li> Incubeer de secties met 0.002% Fluoro-Jade C oplossing gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur geroerd. </li><li> (OPTIONEEL) Bij gelijktijdige nucleaire kleuringen, 0.002% Fluoro-Jade C oplossing aangevuld met 10 ug / ml DAPI. </li><li> Kort was de secties 3x met DDH 2 O. </li><li> Laat de onderdelen drogen gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur geroerd. </li><li> Incubeer de secties met Xyleen (1 min) </li><li> Monteer de secties met een Xyleen-op basis van montage medium (DPX). </li></ol>

<ol><li>Gutierrez, H., Davies, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+neural+process+growth%2C+elaboration+and+structural+plasticity+by+NF-kappaB%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Regulation of neural process growth, elaboration and structural plasticity by NF-kappaB.</a> Trends Neurosci. 34, 316-325 (2011).</li>
<li>Imielski, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regrowing+the+adult+brain%3A+NF-kappaB+controls+functional+circuit+formation+and+tissue+homeostasis+in+the+dentate+gyrus%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Regrowing the adult brain: NF-kappaB controls functional circuit formation and tissue homeostasis in the dentate gyrus.</a> PLoS One. 7, (2012).</li>
<li>Zheng, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrahippocampal+injection+of+A+beta%281-42%29+inhibits+neurogenesis+and+down-regulates+IFN-gamma+and+NF-kappaB+expression+in+hippocampus+of+adult+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Amyloid%22%5BJournal%5D)">Intrahippocampal injection of A beta(1-42) inhibits neurogenesis and down-regulates IFN-gamma and NF-kappaB expression in hippocampus of adult mouse brain.</a> Amyloid. 20 (1-42), 13-20 (2013).</li>
<li>Denis-Donini, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+adult+neurogenesis+associated+with+short-term+memory+defects+in+NF-kappaB+p50-deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Impaired adult neurogenesis associated with short-term memory defects in NF-kappaB p50-deficient mice.</a> J. Neurosci. 28, 3911-3919 (2008).</li>
<li>Bracchi-Ricard, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astroglial+nuclear+factor-kappaB+regulates+learning+and+memory+and+synaptic+plasticity+in+female+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J%2C+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Astroglial nuclear factor-kappaB regulates learning and memory and synaptic plasticity in female mice.</a> J, Neurochem. 104, 611-623 (2008).</li>
<li>Koo, J. W., Russo, S. J., Ferguson, D., Nestler, E. J., Duman, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+factor-kappaB+is+a+critical+mediator+of+stress-impaired+neurogenesis+and+depressive+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Nuclear factor-kappaB is a critical mediator of stress-impaired neurogenesis and depressive behavior.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 2669-2674 (2010).</li>
<li>Fridmacher, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Forebrain-specific+neuronal+inhibition+of+nuclear+factor-kappaB+activity+leads+to+loss+of+neuroprotection%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Forebrain-specific neuronal inhibition of nuclear factor-kappaB activity leads to loss of neuroprotection.</a> J. Neurosci. 23, 9403-9408 (2003).</li>
<li>Whiteside, S. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C-terminal+sequences+control+degradation+of+MAD3%2FI+kappa+B+alpha+in+response+to+inducers+of+NF-kappa%5BTitle%5D)+AND+%22B+activity.+Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">C-terminal sequences control degradation of MAD3/I kappa B alpha in response to inducers of NF-kappa.</a> B activity. Mol. Cell. Biol. 15, 5339-5345 (1995).</li>
<li>Mayford, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+memory+formation+through+regulated+expression+of+a+CaMKII+transgene%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Control of memory formation through regulated expression of a CaMKII transgene.</a> Science. 274, 1678-1683 (1996).</li>
<li>Rosenfeld, M. E., Prichard, L., Shiojiri, N., Fausto, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevention+of+hepatic+apoptosis+and+embryonic+lethality+in+RelA%2FTNFR-1+double+knockout+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Prevention of hepatic apoptosis and embryonic lethality in RelA/TNFR-1 double knockout mice.</a> Am. J. Pathol. 156, 997-1007 (2000).</li>
<li>Morris, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developments+of+a+water-maze+procedure+for+studying+spatial+learning+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">Developments of a water-maze procedure for studying spatial learning in the rat.</a> J Neurosci. Methods. 11, 47-60 (1984).</li>
<li>Barnes, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Memory+deficits+associated+with+senescence%3A+a+neurophysiological+and+behavioral+study+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Compar.+Physiol.+Psychol%22%5BJournal%5D)">Memory deficits associated with senescence: a neurophysiological and behavioral study in the rat.</a> J. Compar. Physiol. Psychol. 93, 74-104 (1979).</li>
<li>Brun, V. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Place+cells+and+place+recognition+maintained+by+direct+entorhinal-hippocampal+circuitry%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Place cells and place recognition maintained by direct entorhinal-hippocampal circuitry.</a> Science. 296, 2243-2246 (2002).</li>
<li>Meshi, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hippocampal+neurogenesis+is+not+required+for+behavioral+effects+of+environmental+enrichment%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Hippocampal neurogenesis is not required for behavioral effects of environmental enrichment.</a> Nat. Neurosci. 9, 729-731 (2006).</li>
<li>Bakker, A., Kirwan, C. B., Miller, M., Stark, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pattern+separation+in+the+human+hippocampal+CA3+and+dentate+gyrus%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Pattern separation in the human hippocampal CA3 and dentate gyrus.</a> Science. 319, 1640-1642 (2008).</li>
<li>Dupret, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+relational+memory+requires+hippocampal+adult+neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Spatial relational memory requires hippocampal adult neurogenesis.</a> PLoS One. 3, (2008).</li>
<li>Leutgeb, J. K., Leutgeb, S., Moser, M. B., Moser, E. I. Pattern separation in the dentate gyrus and CA3 of the hippocampus. Science. 315. , 961-966 (2007).</li>
<li>Kaltschmidt, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NF-kappaB+regulates+spatial+memory+formation+and+synaptic+plasticity+through+protein+kinase+A%2FCREB+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">NF-kappaB regulates spatial memory formation and synaptic plasticity through protein kinase A/CREB signaling.</a> Mol. Cell. Biol. 26, 2936-2946 (2006).</li>
<li>Clelland, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+functional+role+for+adult+hippocampal+neurogenesis+in+spatial+pattern+separation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A functional role for adult hippocampal neurogenesis in spatial pattern separation.</a> Science. 325, 210-213 (2009).</li>
<li>Kempermann, G., Jessberger, S., Steiner, B., Kronenberg, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Milestones+of+neuronal+development+in+the+adult+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Milestones of neuronal development in the adult hippocampus.</a> Trends Neurosci. 27, 447-452 (2004).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat zij geen belangenconflict.

Volwassen neurogenese en de mogelijkheid van een manipulatie door remming van NF-KB in neuronen en de latere reactivering via doxycycline, biedt een fascinerende voor onderzoek naar pasgeboren neuronen in de volwassen hersenen, alsook in neuronale de-en regeneratie . Het mooie van dit systeem is dat NF-kB signaling pathway remming in neuronen niet alleen tot veranderingen in neuronale celdood, progenitor proliferatie en migratie, en ernstige structurele en anatomische veranderingen, maar ook evidente defecten leren. Bel...

Ontologisch, de hippocampus is een van de oudste anatomische hersenstructuren bekend. Het is verantwoordelijk voor diverse complexe taken, zoals het centrale functie in de regulatie van de lange-termijn geheugen, ruimtelijke oriëntatie, en de vorming en consolidatie van het betreffende geheugen. Anatomisch, de hippocampus bestaat uit piramidale cellagen (stratum pyramidale) met inbegrip van de cornu Ammonis (CA1, CA2, CA3 en CA4) regio&#39;s en de dentate gyrus (gyrus dentatus), die granule cellen en enkele neuronale voorlopercellen binnen haar subgranulaire zone bevat . De granule cellen projecteren naar het gebied CA3 via de zogenaamde bemoste vezels (axons van granule cellen). Tot het einde van de vorige eeuw, werd de volwassen hersenen van zoogdieren verondersteld om een ​​statisch orgaan ontbreekt cellulaire plasticiteit en neurogenese zijn. Echter, tijdens de laatste twee decennia een groeiende hoeveelheid bewijs toont volwassen neurogenese plaats in duidelijk minstenstwee hersengebieden, de subventriculaire zone (SVZ) en de subgranulaire zone van de hippocampus. Onze eerdere studies, en die van andere groepen hebben aangetoond dat de transcriptiefactor NF-KB is een van de cruciale moleculaire regulatoren van volwassen neurogenese, en dat de deregulering leidt tot ernstige structurele hippocampale afwijkingen en cognitieve stoornissen 1-6. NF-KB is de generieke naam van een induceerbare transcriptiefactor uit verschillende dimere combinaties van vijf DNA-bindende subeenheden: p50, P52, c-Rel, RelB en p65 (RelA), de laatste drie daarvan met transactiveringsdomeinen. In de hersenen, de meest voorkomende vorm in het cytoplasma is een heterodimeer van p50 en p65, die in een inactieve vorm wordt gehouden door inhibitor van kappa B (IKB)-eiwitten. Te bestuderen en rechtstreeks manipuleren NF-kB-driven neurogenese, maken we gebruik van transgene muismodellen voor de eenvoudige remming van alle van de NF-kB subun staatzijn, met name in de voorhersenen 7 (zie figuur 1). Voor dit doel hebben we gekruist de volgende transgene muis lijnen, IKB / - en -/tTA. De transgene IKB / - lijn werd gegenereerd met behulp van een trans-dominant negatieve mutant van NF-kB-remmer IκBa (super-repressor IκBa-AA1) 8. In tegenstelling tot het wildtype IKBa, IKBa-AA1 twee serine residuen gemuteerd naar alanines (V32 en V36), die de fosforylering en daaropvolgende proteasomale degradatie van de remmer belemmeren. Voor voorhersenen neuron-specifieke expressie van de IκBa-AA1-transgen, IKB / - muizen werden gekruist met muizen die een calcium-calmodulin-afhankelijke kinase IIα (CAMKIIα)-promotor die kan worden aangedreven door tetracycline trans-activator (TTA) 9. p65 knock-out muizen een embryonaal lethaal fenotype wegens massieve apoptose lever 10, zodat de hier getoonde aanpak biedt een elegante methodehet onderzoek naar de rol van NF-KB in postnatale en volwassen neurogenese. De klassieke gedragstest ruimtelijke leren en geheugen te bestuderen werd in de jaren 1980 beschreven door Richard Morris, een test bekend als de Morris water-maze (MWM) 11. In deze open-veld water-doolhof, dieren leren om te ontsnappen aan ondoorzichtige water op een verborgen platform op basis van oriëntatie en extra-doolhof cues. Een droge variant van MWM is de zogenaamde Barnes doolhof (BM) 12. Deze test maakt gebruik van een ronde plaat met 20 ronde gaten aangebracht aan de rand van een plaat, met een gedefinieerd gat als een ontsnapping doos, en visuele extra-doolhof signalen voor oriëntatie. Zowel experimentele paradigma&#39;s vertrouwen op het gedrag vlucht veroorzaakt door een knaagdier `s afkeer van water, of open en helder verlichte ruimtes. Beide tests laten een onderzoek naar ruimtelijke oriëntatie, en de daarmee verband houdende geheugenprestaties. Hoewel de hippocampus speelt een algemene en essentiële rol in de ruimtelijke vorming van het geheugen, de hippocampus rgewesten betrokken verschillen afhankelijk van de gebruikte test. Het geheugen getest BM voortvloeit uit neuronale activiteit tussen de enthorinal cortex (EC) en de piramidale neuronen in het CA1-gebied van de hippocampus zonder bijdrage van DG 13-16. Met name de klassieke BM berust vooral op navigatie via de monosynaptic temporo-ammonic weg van EG III CA1 EG V. Belangrijk is DG cruciaal betrokken bij de zogenaamde ruimtelijk patroonherkenning 17, die niet alleen de verwerking impliceert visuele en ruimtelijke informatie, maar ook de transformatie van soortgelijke verklaringen of herinneringen in ongelijksoortige, niet-overlappende representaties. Deze taak vereist een functionele tri-synaptische circuit van EC II DG om CA3 naar CA1 en EG VI, die niet kunnen worden getest in de BM 15. Om deze uitdagingen aan te pakken, hebben we SPS-BM bedacht als een gedragstest om specifiek te testen dentate gyrus-afhankelijke cognitieve prestaties in control dieren en met de IKB / tTA super-repressor model na NF-KB-inhibitie. Belangrijk is, in tegenstelling tot de MWM of BM, de SPS-BM subtiele gedragstekorten gevolg van aantasting van neurogenese onthullen. Sinds ruimtelijk-patroon-scheiding is strikt afhankelijk van een functioneel circuit tussen EC II en DG en CA3 en CA1 en EG VI, deze test is zeer gevoelig voor potentiële veranderingen in neurogenese, wijzigingen van het bemoste vezels pad of wijzigingen van weefsel homeostase binnen de DG. Technisch gezien is de set-up van onze test op basis van de studie van Clelland et al.., Waarin de ruimtelijke scheiding patroon werd getest met behulp van een houten 8-arm radiale arm doolhof (RAM) 19. In onze gewijzigde set-up, werden de acht armen vervangen door zeven identieke gele voedsel huizen. Kortom, hier de methoden getoond, inclusief een analyse van-doublecortin uitdrukken (DCX +) cellen in de hippocampus, de mosvezel projecties, neuronale cel death en met name de SPS-BM gepresenteerd hier, kan worden toegepast op onderzoeken van andere muismodellen waarin transgenen die een impact hebben op volwassen neurogenese hebben. Verdere toepassingen kan de bestudering van farmacologische middelen en het meten van hun impact op de DG en ruimtelijk patroon scheiding omvatten.

<table><tbody><tr><td>Moria MC17 Perforated Spoon&nbsp;</td><td>FST</td><td>10370-18</td><td>verwijdering van de hersenen</td></tr><tr><td>Dissectiemicroscoop</td><td>Carl Zeiss</td><td>Stemi SV8</td><td>verwijdering van de hersenen</td></tr><tr><td>Chirurgische schaar&nbsp;</td><td>FST</td><td>14084-08</td><td>verwijdering van de hersenen</td></tr><tr><td>Chirurgische schaar&nbsp;</td><td>FST</td><td>14381-43</td><td>verwijdering van de hersenen</td></tr><tr><td>Dumont #5 pincet</td><td>FST</td><td>11254-20</td><td>verwijdering van de hersenen</td></tr><tr><td>SuperFrost Slides</td><td>Carl Roth</td><td>1879</td><td>slides voor immunohistochemistry</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td>fixatief</td></tr><tr><td>TissueTek OCT compound</td><td>Sakura Finetek</td><td>1004200018</td><td>inbedding van de hersenen</td></tr><tr><td>Normal Goat Serum</td><td>Jackson Immunolabs</td><td>005-000-001</td><td>blocking in IHC</td></tr><tr><td>Normal Rabbit Serum</td><td>Jackson Immunolabs</td><td>011-000-001</td><td>blocking in IHC</td></tr><tr><td>Normal Donkey Serum</td><td>Jackson Immunolabs</td><td>017-000-001</td><td>blocking in IHC</td></tr><tr><td>anti-Neurofilament-M antilichaam</td><td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td><td>2H3</td><td>IHC, Verdunning 1:200</td></tr><tr><td>anti-Doublecortin&nbsp;antilichaam</td><td>sc-8066</td><td>Santa Cruz</td><td>IHC, Verdunning 1:800</td></tr><tr><td>anti-GFP antilichaam</td><td>Abcam</td><td>ab290</td><td>IHC, Verdunning 1:2.000</td></tr><tr><td>anti-BrdU antilichaam</td><td>OBT0030G</td><td>Accurate Chemicals</td><td>IHC, Verdunning 1:2.000&nbsp;</td></tr><tr><td>Fluoro-Jade C</td><td>FJ-C</td><td>HistoChem</td><td>Bepaling van neuronale celdood</td></tr><tr><td>Betadine</td><td>Mundipharma</td><td>D08AG02</td><td>ontsmettingsmiddel</td></tr><tr><td>Cryomicrotoom</td><td>Leica</td><td>CM1900</td><td>voorbereiding van hersensneden</td></tr><tr><td>Heparine natriumzout</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3393</td><td>perfusie</td></tr><tr><td>Circulaire plaat gemaakt van hard-plastic (diameter 120 cm)</td><td>zelfgemaakt</td><td>geen</td><td>plaat voor SPS-BM, diameter 120 cm</td></tr><tr><td>Buraton sneldesinfectiemiddel&nbsp;</td><td>Sch&uuml;lke Mayr</td><td>113 911</td><td>ontsmettingsmiddel</td></tr><tr><td>Video-tracking systeem TSE VideoMot 2 met Softwarepakket VideoMot2</td><td>TSE Systems</td><td>302050-SW-KIT</td><td>tracking en analyse van SPS-BM</td></tr><tr><td>Triton X-100&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T8787</td><td>permeabilisatie/IHC</td></tr><tr><td>Cryotoom</td><td>Reichert Jung/Leica</td><td>Frigomobil 1206</td><td>voorbereiding van 40 &micro;m hersensneden</td></tr><tr><td>Mowiol 4-88</td><td>Carl Roth</td><td>Art.-Nr. 0713</td><td>inbedding van de slides</td></tr><tr><td>SYTOX groen</td><td>Invitrogen</td><td>S7020</td><td>nucleaire kleuring</td></tr><tr><td>Voedselpellets (Kellog`s Froot Loops)</td><td>Kellog`s</td><td></td><td>SPS-BM</td></tr><tr><td>Prism, versie 3.0</td><td>Graph Pad Software, San Diego, USA</td><td></td><td>Statistische evaluatie van SPS-BM</td></tr><tr><td>Zen 2008 of Zen 2011 Software</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td>Software (Confocale microscoop)</td></tr><tr><td>D.P.X</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>317616</td><td>montagemedium voor Fluoro-Jade C-kleuring</td></tr></tbody></table>

methoden voor de modulatie en analyse van nf-kb-afhankelijke adult neurogenese

Methods for the Modulation and Analysis of NF-&#954;B-dependent Adult Neurogenesis

De hippocampus speelt een centrale rol in de vorming en consolidatie van episodische herinneringen, en in ruimtelijke oriëntatie. Historisch gezien is de volwassen hippocampus gezien als een statisch anatomisch gebied van de hersenen van zoogdieren. Echter, recente bevindingen aangetoond dat de dentate gyrus van de hippocampus is een gebied van enorme plasticiteit bij volwassenen, waarbij niet alleen wijzigingen van bestaande neuronale circuits, maar ook volwassen neurogenese. Deze plasticiteit wordt gereguleerd door complexe transcriptienetwerken, waarin de transcriptiefactor NF-kB speelt een belangrijke rol. Het bestuderen en manipuleren volwassen neurogenese, een transgeen muismodel voor voorhersenen specifieke neuronale inhibitie van NF-KB-activiteit kunnen worden gebruikt. In deze studie, worden werkwijzen beschreven voor het analyseren van NF-kB-afhankelijke neurogenese, inclusief de structurele aspecten, neuronale apoptose en proliferatie van voorlopercellen en cognitieve betekenis which werd speciaal via een dentate gyrus (DG)-afhankelijke gedragstest, het ruimtelijk patroon scheiding-Barnes maze (SPS-BM) beoordeeld. Het SPS-BM protocol kan eenvoudig worden aangepast voor gebruik met andere transgene diermodellen ontworpen om de invloed van bepaalde genen op volwassen hippocampus neurogenese beoordelen. Bovendien kan SPS-BM worden gebruikt in andere experimentele instellingen wil nagaan en manipuleren DG-afhankelijk leren, bijvoorbeeld met farmacologische middelen.

Kruisen van de IKB / - en tTA transgene muizenlijnen tot voorwaardelijke remming van NF-KB-activiteit in de hippocampus. Om de expressie van de IKBa-AA1-transgen in de dubbele transgene muizen (Figuur 1A) te onderzoeken, werden hersenen geïsoleerd cryosectioned en gekleurd met een antilichaam tegen GFP (groen fluorescent eiwit). Confocale laser scanning microscopie onthulde hoge expressie van het transgen in het CA1 en CA3 regio en DG (Figuur 1B).</s...

Werkwijzen voor de manipulatie en analyse van NF-kB-afhankelijke volwassen hippocampus neurogenese beschreven. Een gedetailleerd protocol wordt gepresenteerd voor een dentate gyrus-afhankelijke gedragstest (genoemd het ruimtelijk patroon scheiding-Barnes doolhof) voor het onderzoek naar cognitieve uitkomst bij muizen. Deze techniek moet ook helpen onderzoek mogelijk te maken in andere experimentele instellingen.

Methoden voor de modulatie en analyse van NF-kB-afhankelijke Adult Neurogenese

The hippocampus plays a pivotal role in the formation and consolidation of episodic memories, and in spatial orientation. Historically, the adult ...

Het algemene doel van deze procedure is om de functie van de transcriptiefactor NF kappa B in de volwassen hersenen te onderzoeken. Dit wordt bereikt door eerst transgene muizen te fokken die specifiek de NF kappa B-activiteit in neuronen remmen. De tweede stap van de procedure is om de gedragsgevolgen van de NF kappa B-remming te testen met behulp van het ruimtelijke patroon, scheiding of barns, labyrint.De derde stap is de zorgvuldige perfusieverwerking van de dieren, verwijdering van de hersenen en de juiste sectie daarvan. De laatste stap is het analyseren van histologische en structurele effecten, zoals het visualiseren van mossy fiber projecties door immunokleuring. Uiteindelijk kan het gebruik van het gedragstest gevolgd door histologie correlaties aantonen tussen veranderingen in dentate gyrus-afhankelijk leren en structurele veranderingen in geassocieerde weefsels.Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden zoals Mars Vase is dat ruimtelijke patroonscheiding scheiding MA de mogelijkheid biedt om specifiek anti-kind afhankelijke leerprocessen evenals neurodegeneratie en regeneratie in dit hersengebied te meten. Deze methode kan helpen bi

methods-for-modulation-analysis-nf-b-dependent-adult

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Een manier om de integratie van de pasgeborene dentate granule cellen studie bij volwassen dieren is beschreven. Deze techniek maakt gebruik van een retrovirus ontworpen voor pasgeboren neuronen, gevolgd door elektrofysiologische opnames om te bepalen in vivo functionele integratie label.

Het bestuderen van de integratie van Adult geboren Neuronen

De functie van zoogdieren neuronen-volwassene geboren blijft een actief gebied van onderzoek. Ioniserende straling remt de geboorte van nieuwe neuronen. Met computer-tomografie geleide focale bestraling (CFIR), kunnen driedimensionale anatomische targeting van specifieke neurale populaties nu worden gebruikt om de functionele rol van volwassen neurogenese beoordelen.

Functionele Ondervraging van Adult hypothalamus Neurogenese met Focal Radiologische Remming

Neuroblast migratie is een cruciale stap in postnatale neurogenese. Het protocol hier beschreven kan worden gebruikt om de rol van de kandidaat regulatoren van neuroblast migratie door gebruik DNA / small hairpin RNA (shRNA) nucleofection en een 3D migratietestsysteem met neuroblasts geïsoleerd van het knaagdier postnatale rostrale migratiestroom onderzoeken.

Nucleofectie van knaagdieren neuroblasts om neuroblast Migratie Studie<em&gt; In vitro</em

Deze video-artikel illustreert een uitgebreid protocol om alle stadia van neurogenese van de hippocampus bij volwassenen binnen dezelfde weefselsectie te detecteren en te kwantificeren. We hebben een methode ontwikkeld om de beperkingen van indirecte meervoudige immunofluorescentie te overwinnen die zich voordoen wanneer geschikte antilichamen van verschillende gastheersoorten niet beschikbaar zijn.

Immunohistochemie en Multiple Labeling met antilichamen van dezelfde Host te onderzoeken soorten volwassen hippocampus Neurogenese

We beschrijven een immunohistochemie protocol om het profiel van de hippocampus neuron activering studeren na blootstelling aan een ruimtelijke leertaak in een muismodel gekenmerkt door cognitieve tekorten van neurologische oorsprong. Dit protocol kan worden toegepast op zowel genetische of farmacologische muismodellen gekenmerkt door cognitieve tekorten.

Immunohistochemische Visualisatie van hippocampus Neuron activiteit na Ruimtelijke Leren in een muismodel van Neurodevelopmental Disorders

Hier beschrijven we een procedure gebaseerd op het gebruik van lentivirale deeltjes voor de langetermijn genetische modificatie van neurale stamcellen en/of hun aangrenzende ependymale cellen in de volwassen ventriculair-subventriculaire neurogene niche, wat de aparte analyse mogelijk maakt van cel-autonome en niet-autonome, niche-afhankelijke effecten op neurale stamcellen.

Stabiele en efficiënte genetische modificatie van cellen in de Adult Mouse V-SVZ voor de Analyse van de neurale stamcel autonome en niet-autonome Effects

Het doel van dit protocol is om een aanpak te beschrijven voor het analyseren van gedrag van volwassen neurale stam/voorlopercellen in reactie op chemogenetische manipulatie van een specifiek lokaal neuraal circuit.

Asgezegde circuit specifieke regulering van volwassen Hippocampal neurale precursor cellen

Het vermogen om stamcellen en hun nakomelingen permanent te markeren met een fluorofoor met behulp van een induceerbare transgene lineage tracing muislijn maakt ruimtelijke en temporele analyse van activering, proliferatie, migratie en / of differentiatie in vivo mogelijk. Lineage tracing kan nieuwe informatie onthullen over lineage commitment, reactie op interventie(s) en multipotentie.

Afstamming Tracering van induceerbare fluorescerend gelabelde stamcellen in het volwassen muizenbrein

Hier wordt een methode gepresenteerd om enkele kernen geïsoleerd uit de gyrus van de muis te sequencen die de meeste neuronen uitsluit door fluorescentie-geactiveerde kernen (FAN) -sortering. Deze aanpak genereert hoogwaardige expressieprofielen en vergemakkelijkt de studie van de meeste andere celtypen die in de niche zijn vertegenwoordigd, inclusief schaarse populaties zoals neurale stamcellen.

Fluorescentie-geactiveerde kernen negatieve sortering van neuronen gecombineerd met single nuclei RNA-sequencing om de hippocampale neurogene niche te bestuderen

Hier beschrijven we een nucleofectiesysteem dat is ontworpen om de efficiëntie van genafgifte te verbeteren in uitgebreide neurale stamcellen (NSC's) geïsoleerd uit de subventriculaire zone van volwassen muizen. De bevindingen tonen aan dat deze methode de genverstoring in NSC's aanzienlijk verbetert, de effectiviteit van traditionele transfectieprotocollen overtreft en de celoverleving verbetert.

Isolatie, expansie en nucleofectie van neurale stamcellen uit de subventriculaire zone van volwassen muizen

Neriet-uitgroeianalyses bieden een kwantitatieve waarde over regeneratieve neuronale processen. Het voordeel van deze semi-automatische software is dat het cellichamen en neurieten afzonderlijk segmenteert door een masker te maken en verschillende parameters meet, zoals neurietlengte, aantal vertakkingspunten, cel-lichaamclusteroppervlak en aantal celclusters.

Standaardisatie van een nieuwe semi-automatische software voor het meten van de uitgroei van je nauriet 

Leer methoden voor NF-κB-afhankelijke neurogenese in de volwassen hersenen met behulp van transgene muizen en het Barnes-maze gedragstest. Deze techniek helpt onderzoekers om cognitieve uitkomsten te correleren met structurele veranderingen in de dentate gyrus.

Methoden voor de modulatie en analyse van NF-kB-afhankelijke Adult Neurogenese

Meer video's verkennen