Name: Methoden om de NMR-resonanties van de 13C-Dimethyl N-terminale amine op reductief gemethyleerde eiwitten te identificeren (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-12T13:45:00.000+00:00
Duration: 13 min 59 s
Description: Leer NMR-signaaltoewijzing van dimethylamine op reductief gemethyleerde lysine in lysozym via pH-afhankelijke methylering en aminopeptidase-behandeling. Deze methoden verbeteren eiwitstructuuranalyse.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit onderzoek werd ondersteund door Award Nummer R00RR024105 van het National Center For Research Resources, National Institute of Health.

1. Reductieve methylering van lysozym
<ol>
	<li>Bereid 500 ml van een 50 mM natriumfosfaatbuffer op pH 7,5. Bewaar bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Label drie 1 ml microcentrifugebuizen voor volledig gelabeld monster (FLS), laag pH gedeeltelijk gelabeld monster (LpH) en hoog pH gedeeltelijk gelabeld monster (HpH).</li>
	<li>Weeg 10 mg lysozym af en los op in 2 ml natriumfosfaatbuffer om een waterige oplossing met een concentratie van 5 mg/ml te maken. Bedek de buizen met aluminiumfolie om het formaldehyde te beschermen tegen afbraak door lichtblootstelling. Voeg 500 μl lysozymoplossing toe aan elke buis.</li>
	<li>Bereid verse 1,0 M oplossingen van dimethylamine borane complex (DMAB) en 13C-formaldehyde. Bewaar bij 0 °C.</li>
	<li>Voor het volledig gelabelde monster, gebruik een molverhouding van 1:10 (reactieve amine: formaldehyde), en voor de gedeeltelijk gelabelde monsters, gebruik een 1:5 verhouding. Als alternatief kan de verhouding worden geoptimaliseerd. Om bijvoorbeeld de dominantie van de α-13C-dimethylamine piek bij lage pH te zien, was een 2:7 verhouding vereist.</li>
	<li>Voeg 6,1 μl van 1,0 M DMAB toe aan FLS, voeg 3,2 μl van 1,0 M DMAB toe aan LpH en HpH, en voorzichtig vortex. Voeg vervolgens 12,3 μl van 1,0 M 13C-formaldehyde toe aan FLS en 6,1 μl van 1,0 M 13C-formaldehyde toe aan LpH en HpH. Schud de reactiemengsels bij 4 °C gedurende 2 uur.</li>
	<li>Voeg nog een aliquot van 1,0 M DMAB en 13C-formaldehyde toe zoals in de vorige stap en schud de reactiemengsels een nacht bij 4 °C voor een totale reactietijd van 18-24 uur.</li>
	<li>Verwissel de buffer van het monster naar fosfaat op pH 7,5 om overtollige reagentia en nevenproducten te verwijderen met behulp van een centrifugaalfilter (3 kDa molecuulgewicht cut-off).</li>
	<li>Voor de gedeeltelijk gelabelde monsters, methyleer de monsters reductief bij pH 7,5 met formaldehyde met natuurlijke abundantie om een homogeen gemodificeerd eiwit te maken. Bereid nieuwe 1,0 M oplossingen van DMAB en formaldehyde met natuurlijke abundantie.</li>
	<li>Bedek de monsterbuizen met folie, voeg 6,1 μl van DMAB toe aan LpH en HpH, en voorzichtig vortex. Voeg vervolgens 12,3 μl van natuurlijke abundantie formaldehyde toe. Schud de reactiemengsels bij 4 °C gedurende 2 uur.</li>
	<li>Voeg nog een aliquot van 1,0 M DMAB en natuurlijke abundantie formaldehyde toe zoals in de vorige stap en schud de reactiemengsels een nacht bij 4 °C gedurende een totale reactietijd van 18-24 uur. Voer vervolgens bufferuitwisseling uit met behulp van stappen 2.5-2.6 en bewaar 50 μg monsters bij -20 °C voor MS.</li>
</ol>
2. Bereid het monster voor voor NMR-analyse
<ol>
	<li>Bereid een 2,0 M natriumboraatbufferoplossing op pH 8,5 in H2O.</li>
	<li>Voeg 375 μl van 2,0 M natriumboraatbufferoplossing toe aan vier 15 ml conische buizen. Bedek de bovenkant met Parafilm en maak gaatjes. Plaats de fles in een lyofilisatiefles en vries het monster in.</li>
	<li>Plaats het bevroren monster op een lyofilisator om te drogen. Verwijder wanneer droog.</li>
	<li>Voeg met een pipet 15 ml van D2O toe aan elke buis en meng.</li>
	<li>Label drie 4 ml centrifugaalfilters (3 kDa molecuulgewicht cut-off) met FLS, LpH en HpH. Voeg het corresponderende monster toe aan de filterbuizen (~500 μl). Voeg 3,0 ml van 50 mM natriumboraatbuffer op pH 8,5 toe aan elke buis. Maak een balanceerbuis voor de derde buis en concentreer de monsters tot 500 μl met behulp van een centrifuge met een 35° vaste hoekrotor bij 4 °C en 7.500 rcf.</li>
	<li>Maal de val onder elke filter leeg. Voeg nog eens 3,0 ml buffer toe aan de monsters en concentreer de monsters opnieuw tot 500 μl. Herhaal stap 2.5 4x.</li>
	<li>Bepaal met behulp van de bicinchoninezuur (BCA) eiwittest36 de concentratie van elk monster. Verdun de lysozymmonsters met 50 mM natriumboraatbuffer om monsters van 150 μM te maken.</li>
	<li>Breng 530 μl over naar een 5 mm NMR-buis of 250 μM naar een 5 mm magnetische susceptibiliteit aangepaste buis.</li>
	<li>Bereid een 80 mM stamoplossing van 1,2-dichloorethane-13C2 in D2O. Bewaar deze stamoplossing bij -80 °C. Verdun tot 24 mM in 80 μl en breng over naar een coaxiale inzetbuis om als referentie te gebruiken in NMR-analyse. Analyseer de monsters met NMR. Opmerking: Voer een 1D 1H-13C HSQC uit en integreer de piekoppervlakken voor elke resonantie. De piekoppervlakken zouden hetzelfde moeten zijn voor het volledig gelabelde monster.</li>
</ol>
3. Aminopeptidase-afbraak van lysozym
<ol>
	<li>Bereid een 5 mg/ml oplossing van lysozym in ultrapuur water.</li>
	<li>Voeg 250 μl van de lysozymoplossing toe aan een schone 1 ml centrifugebuis.</li>
	<li>Voeg 25 μl van een 0,1 M tricine-oplossing, pH

<ol><li>Bax, A., Grzesiek, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methodological+Advances+in+Protein+NMR%5BTitle%5D)+AND+%22Accounts+of+Chemical+Research%22%5BJournal%5D)">Methodological Advances in Protein NMR.</a> Accounts of Chemical Research. 26 (4), 131-138 (1993).</li>
<li>Shimba, N., Yamada, N., Yokoyama, K., Suzuki, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+Labeling+of+Arbitrary+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Enzymatic Labeling of Arbitrary Proteins.</a> Analytical Biochemistry. 301 (1), 123-127 (2002).</li>
<li>Palomares, L., Estrada-Moncada, S., Ramírez, O. Production of Recombinant Proteins. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPalomares%2C+L+%22Recombinant+Gene+Expression%22">Recombinant Gene Expression</a>. Balbás, P., Lorence, A. 267, Humana Press. New York City, New York, USA. 15-51 (2004).</li>
<li>Graslund, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+Production+and+Purification%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Protein Production and Purification.</a> Nature Methods. 5 (2), 135-146 (2008).</li>
<li>Terwilliger, T. C., Stuart, D., Yokoyama, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lessons+from+Structural+Genomics%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biophysics%22%5BJournal%5D)">Lessons from Structural Genomics.</a> Annual Review of Biophysics. 38, 371-383 (2009).</li>
<li>Goto, N. K., Kay, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+Developments+in+Isotope+Labeling+Strategies+for+Protein+Solution+NMR+Spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">New Developments in Isotope Labeling Strategies for Protein Solution NMR Spectroscopy.</a> Curr. Opin. Struct. Biol. 10 (5), 585-592 (2000).</li>
<li>Lian, L., Middleton, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Labelling+Approaches+for+Protein+Structural+Studies+by+Solution-State+and+Solid-State+NMR%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Nuclear+Magn.+Reson.+Spectroscopy%22%5BJournal%5D)">Labelling Approaches for Protein Structural Studies by Solution-State and Solid-State NMR.</a> Progress in Nuclear Magn. Reson. Spectroscopy. 39 (3), 171-190 (2001).</li>
<li>Mason, A., Siarheyeva, A., Haase, W., Lorch, M., van Veen, H., Glaubitz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amino+Acid+Type+Selective+Isotope+Labelling+of+the+Multidrug+ABC+Transporter+LmrA+for+Solid-State+NMR+Studies%5BTitle%5D)+AND+%22Febs+Lett%22%5BJournal%5D)">Amino Acid Type Selective Isotope Labelling of the Multidrug ABC Transporter LmrA for Solid-State NMR Studies.</a> Febs Lett. 568 (1-3), 117-121 (2004).</li>
<li>Chen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+Amino-Acid-Type+Selective+Isotope+Labeling+of+Protein+Expressed+in+Pichia+pastoris%5BTitle%5D)+AND+%22Proteins%3AStructure+Function+and+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Preparation of Amino-Acid-Type Selective Isotope Labeling of Protein Expressed in Pichia pastoris.</a> Proteins:Structure Function and Bioinformatics. 62 (1), 279-287 (2006).</li>
<li>Means, G., Feeney, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reductive+Alkylation+of+Amino+Groups+in+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem%22%5BJournal%5D)">Reductive Alkylation of Amino Groups in Proteins.</a> Biochem. 7 (6), 2192 (1968).</li>
<li>Jentoft, J. E., Jentoft, N., Gerken, T. A., Dearborn , D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C-13+NMR-Studies+of+Ribonuclease-A+Methylated+With+Formaldehyde-C-13.%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">C-13 NMR-Studies of Ribonuclease-A Methylated With Formaldehyde-C-13.</a> J. Biol. Chem. 254 (11), 4366-4370 (1979).</li>
<li>Rayment, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reductive+alkylation+of+lysine+residues+to+alter+crystallization+properties+of+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Macromolecular+Crystallography%2C+Pt+A%22%5BJournal%5D)">Reductive alkylation of lysine residues to alter crystallization properties of proteins.</a> Macromolecular Crystallography, Pt A. 276 (97), 171-179 (1997).</li>
<li>French, D., Edsall, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Reactions+of+Formaldehyde+with+Amino+Acids+and+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Protein+Chem%22%5BJournal%5D)">The Reactions of Formaldehyde with Amino Acids and Proteins.</a> Adv. Protein Chem. 2, 277-335 (1945).</li>
<li>Jentoft, N., Dearborn, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Labeling+of+Proteins+by+Reductive+Methylation+Using+Sodium+Cyanoborohydride%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Labeling of Proteins by Reductive Methylation Using Sodium Cyanoborohydride.</a> J. Biol. Chem. 254 (11), 4359-4365 (1979).</li>
<li>Walter, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysine+Methylation+as+a+Routine+Rescue+Strategy+for+Protein+Crystallization%5BTitle%5D)+AND+%22Struct%22%5BJournal%5D)">Lysine Methylation as a Routine Rescue Strategy for Protein Crystallization.</a> Struct. 14 (11), 1617-1622 (2006).</li>
<li>Rypniewski, W., Holden, H., Rayment, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+Consequences+of+Reductive+Methylation+of+Lysine+Residues+in+Hen+Egg-White+Lysozyme+-+An+X-ray+Analysis+at+1.8-Angstrom+Resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem%22%5BJournal%5D)">Structural Consequences of Reductive Methylation of Lysine Residues in Hen Egg-White Lysozyme - An X-ray Analysis at 1.8-Angstrom Resolution.</a> Biochem. 32 (37), 9851-9858 (1993).</li>
<li>Bokoch, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ligand-specific+regulation+of+the+extracellular+surface+of+a+G-protein-coupled+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Nat%22%5BJournal%5D)">Ligand-specific regulation of the extracellular surface of a G-protein-coupled receptor.</a> Nat. 463 (7277), (2010).</li>
<li>Jentoft, J., Gerken, T., Jentoft, N., Dearborn, D. C-13] Methylated Ribonuclease-A - C-13 NMR Studies of the Interaction of Lysine 41 with Active Site. 256 (1), 231-236 (1981).</li>
<li>Sherry, A., Teherani, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physical+Studies+of+C-13-Methylated+Concanavalin+A+-+pH+and+Co2%2B-Induced+Nuclear+Magn.+Reson.+Shifts.%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Physical Studies of C-13-Methylated Concanavalin A - pH and Co2+-Induced Nuclear Magn. Reson. Shifts.</a> J. Biol. Chem. 258 (14), 8663-8669 (1983).</li>
<li>Dick, L., Sherry, A., Newkirk, M., Gray, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reductive+Methylation+and+C-13+NMR+Studies+of+the+Lysyl+Residues+of+fd+Gene+5+Protein+-+Lysines+24%2C+46%2C+and+69+May+be+Involved+in+Nucleic+Acid+Binding.%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Reductive Methylation and C-13 NMR Studies of the Lysyl Residues of fd Gene 5 Protein - Lysines 24, 46, and 69 May be Involved in Nucleic Acid Binding.</a> J. Biol. Chem. 263 (35), 18864-18872 Forthcoming.</li>
<li>Moore, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-epsilon%2CN-epsilon-dimethyl-lysine+cytochrome+c+as+an+NMR+probe+for+lysine+involvement+in+protein-protein+complex+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+J%22%5BJournal%5D)">N-epsilon,N-epsilon-dimethyl-lysine cytochrome c as an NMR probe for lysine involvement in protein-protein complex formation.</a> Biochem. J. 332, 439-449 (1998).</li>
<li>Jentoft, J. E., Gerken, T. A., Jentoft, N., Dearborn, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+of+the+Active-Site+Lysine+of+Ribonuclease-A+By+C-13+NMR.%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Studies of the Active-Site Lysine of Ribonuclease-A By C-13 NMR.</a> Biophys. J. 25 (2), 56 (1979).</li>
<li>Gerken, T., Jentoft, J., Jentoft, N., Dearborn, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intramolecular+Interactions+of+Amino+Groups+in+C-13+Reductively+Methylated+Hen+Egg-White+Lysozyme%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Intramolecular Interactions of Amino Groups in C-13 Reductively Methylated Hen Egg-White Lysozyme.</a> J. Biol. Chem. 257 (6), 2894-2900 (1982).</li>
<li>Dick, L. R., Geraldes, C., Sherry, A. D., Gray, C. W., Gray, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C-13+NMR+of+Methylated+Lysines+of+fd+Gene-5+Protein+-+Evidence+for+A+Conformational+Change+Involving+Lysine-24+Upon+Binding+of+A+Negatively+Charged+Lanthanide+Chelate%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem%22%5BJournal%5D)">C-13 NMR of Methylated Lysines of fd Gene-5 Protein - Evidence for A Conformational Change Involving Lysine-24 Upon Binding of A Negatively Charged Lanthanide Chelate.</a> Biochem. 28 (19), 7896-7904 (1989).</li>
<li>Gluck, M., Sweeney, W. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C-13-NMR+of+Clostridium-Pasteurianum+Ferredoxin+After+Reductive+Methylation+of+the+Amines+Using+C-13+Formaldehyde%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+Et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">C-13-NMR of Clostridium-Pasteurianum Ferredoxin After Reductive Methylation of the Amines Using C-13 Formaldehyde.</a> Biochimica Et Biophysica Acta. 1038 (2), 146-151 (1990).</li>
<li>Jentoft, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reductive+Methylation+and+C-13+Nuclear-Magnetic-Resonance+in+Structure-Function+Studies+of+Fc+Fragment+and+Its+Subfragments%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Reductive Methylation and C-13 Nuclear-Magnetic-Resonance in Structure-Function Studies of Fc Fragment and Its Subfragments.</a> Methods in Enzymology. 203, 261-295 (1991).</li>
<li>Sparks, D., Phillips, M., Lundkatz, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Conformation+of+Apolipoprotein+A-I+in+Discoidal+and+Spherical+Recombinant+High+Density+Lipoprotein+Particles+-+C-13+NMR+Studies+of+Lysine+Ionization%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">The Conformation of Apolipoprotein A-I in Discoidal and Spherical Recombinant High Density Lipoprotein Particles - C-13 NMR Studies of Lysine Ionization.</a> J. Biol. Chem. 267 (36), 25830-25838 (1992).</li>
<li>Ashfield, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+Modification+of+a+Variant+of+Human+MIP-1+Alpha%2C+Implications+for+Dimer+Structure.%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Science%22%5BJournal%5D)">Chemical Modification of a Variant of Human MIP-1 Alpha, Implications for Dimer Structure.</a> Protein Science. 9 (10), 2047-2053 (2000).</li>
<li>Goux, W., Teherani, J., Sherry, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amine+Inversion+in+Proteins+-+A+C-13-NMR+Study+of+Proton+Exchange+and+Nitrogen+Inversion+Rates+in+N-Epsilon%2CN-Epsilon%2CN-Alpha%2CN-Alpha-%5BC-13%5DTetramethyllysine%2C+N-Epsilon%2CN-Epsilon%2CN-Alpha%2CN-Alpha%5BC-13%5DTetramethyllysine+Methyl-Ester%2C+and+Reductively+Methylated+Concanavalin-A.%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Amine Inversion in Proteins - A C-13-NMR Study of Proton Exchange and Nitrogen Inversion Rates in N-Epsilon,N-Epsilon,N-Alpha,N-Alpha-[C-13]Tetramethyllysine, N-Epsilon,N-Epsilon,N-Alpha,N-Alpha[C-13]Tetramethyllysine Methyl-Ester, and Reductively Methylated Concanavalin-A.</a> Biophysical Chemistry. 19 (4), 363-373 (1984).</li>
<li>Sherry, A. D., Keepers, J., James, T. L., Teherani, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methyl+Motions+in+C-13+Methylated+Concanavalin-as+Studied+by+C-13+Magnetic-Resonance+Relaxation+Techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Methyl Motions in C-13 Methylated Concanavalin-as Studied by C-13 Magnetic-Resonance Relaxation Techniques.</a> Biochemistry. 23 (14), 3181-3185 (1984).</li>
<li>Huque, M., Vogel, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C-13+NMR+Studies+of+the+Lysine+Side+Chains+of+Calmodulin+and+Its+Proteolytic+Fragments%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Protein+Chemistry%22%5BJournal%5D)">C-13 NMR Studies of the Lysine Side Chains of Calmodulin and Its Proteolytic Fragments.</a> Journal of Protein Chemistry. 12 (6), 695-707 (1993).</li>
<li>Brown, L., Bradbury, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proton-Magnetic-Resonance+Studies+of+Lysine+Residues+of+Ribonuclease-A%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Proton-Magnetic-Resonance Studies of Lysine Residues of Ribonuclease-A.</a> Eur. J. Biochem. 54 (1), 219-227 (1975).</li>
<li>Zhang, M., Vogel, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+the+Side+Chain+pKa+Values+of+the+Lysine+Residues+in+Calmodulin%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Determination of the Side Chain pKa Values of the Lysine Residues in Calmodulin.</a> J. Biol. Chem. 268 (30), 22420-22428 (1993).</li>
<li>Macnaughtan, M., Kane, A., Mass Prestegard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectrometry+Assisted+Assignment+of+NMR+Resonances+in+Reductively+C-13-Methylated+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Spectrometry Assisted Assignment of NMR Resonances in Reductively C-13-Methylated Proteins.</a> J. Am. Chem. Soc. 127 (50), 17626-17627 (2005).</li>
<li>Cordova, E., Gao, J., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noncovalent+Polycationic+Coatings+for+Capillaries+in+Capillary+Electrophoresis+of+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Noncovalent Polycationic Coatings for Capillaries in Capillary Electrophoresis of Proteins.</a> Anal. Chem. 69 (7), 1370-1379 (1997).</li>
<li>Smith, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+Protein+Using+Bicinchoninic+Acid%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Measurement of Protein Using Bicinchoninic Acid.</a> Anal. Biochem. 150 (1), 76-85 (1985).</li>
<li>Larda, S. T., Bokoch, M. P., Evanics, F., Prosser, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysine+methylation+strategies+for+characterizing+protein+conformations+by+NMR%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomolec.+NMR%22%5BJournal%5D)">Lysine methylation strategies for characterizing protein conformations by NMR.</a> J. Biomolec. NMR. 54 (2), 199-209 (2012).</li>
<li>Bradbury, J. H., Brown, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+Dissociation+Constants+of+Lysine+Residues+of+Lysozyme+by+Proton-Magnetic-Resonance+Spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Determination of Dissociation Constants of Lysine Residues of Lysozyme by Proton-Magnetic-Resonance Spectroscopy.</a> Eur. J. Biochem. 40 (2), 565-576 (1973).</li>
<li>Frey, S. T., Guilmet, S. L., Egan, R. G., Bennett, A., Soltau, S. R., Holz, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immobilization+of+the+Aminopeptidase+from+Aeromonas+proteolytica+on+Mg2%2B%2FAl3%2B+Layered+Double+Hydroxide+Particles%5BTitle%5D)+AND+%22Acs+Appl.+Mater.%2C+%26+Interfaces%22%5BJournal%5D)">Immobilization of the Aminopeptidase from Aeromonas proteolytica on Mg2+/Al3+ Layered Double Hydroxide Particles.</a> Acs Appl. Mater., & Interfaces. 2 (10), 2828-2832 (2010).</li>
<li>Poncz, L., Dearborn, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Resistance+to+Tryptic+Hydrolysis+of+Peptide-Bonds+Adjacent+to+N-epsilon%2CN-Dimethyllysyl+Residues%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">The Resistance to Tryptic Hydrolysis of Peptide-Bonds Adjacent to N-epsilon,N-Dimethyllysyl Residues.</a> J. Biol. Chem. 258 (3), 1844-1850 (1983).</li>
</ol>

We hebben niets te onthullen.

Het toewijzen van de NMR-signalen van reductief 13C-gemethyleerde eiwitten is noodzakelijk om deze isotopische labelmethode volledig te benutten. Het gebruik van MS om te helpen bij het toewijzen van de NMR-signalen door correlatie van de gedeeltelijke 13C-incorporatiegegevens is een veelbelovende techniek. Het voordeel van deze techniek ten opzichte van andere toewijzingsmethoden is dat alleen de primaire aminozuursequentie nodig is. De door MS ondersteunde toewijzingsmethode is beperkt wanneer het...

Kernspinresonantie (NMR) spectroscopie is een waardevol hulpmiddel voor het bepalen van de structuur van eiwitten1. NMR-spectroscopie kan worden gebruikt om de oplossingsstructuur van een eiwit in zijn oorspronkelijke toestand te bepalen. Om de lage natuurlijke abundantie van stabiele magnetische isotopen te overwinnen, is het noodzakelijk om 13C en 15N in het eiwit van belang te incorporeren. De meest gebruikte methode is recombinante expressie in een bacteriële gastheer2-3. Twee nadelen van overexpressie in een bacteriële gastheer zijn dat het geen post-translationele modificaties kan produceren en niet voor alle eiwitten werkt3-4. Wanneer bacteriële expressie geen haalbare route voor eiwitproductie is, kan overexpressie in niet-bacteriële gastheren worden gebruikt, maar isotopische markering moeilijk en duur5. Alternatieve expressiemethoden voor het incorporeren van 13C en 15N isotopen in eiwitten voor NMR-analyse omvatten sparse labeling-technieken met behulp van metabolische voorlopers voor methyl-labeling6 en enkele 13C, 15N aminozuren7-9. Een chemische benadering van sparse labeling die hierin wordt gebruikt, is de bekende reductieve 13C-methyleringsreactie (Figuur 1), waarbij de primaire aminogroepen op een eiwit - de N-terminale α-amine en de lysine, zijketen ε-amines - worden gemethyleerd. Zodra monomethylaminen zijn gevormd, ondergaat het amine gemakkelijk opnieuw methylering, vanwege de hogere pKa-waarde, om dimethylaminen te vormen.
Reductieve methylering werd voor het eerst geïntroduceerd als een methode om eiwitten chemisch te modificeren door Means en Feeney10. De voordelen van deze reactie zijn de brede toepasbaarheid en milde reactieomstandigheden bij gebufferde, fysiologische pH en lage temperaturen11,12. In de aanwezigheid van formaldehyde en een reducerend middel, zoals dimethylamineboraancomplex (DMAB), worden de lysine ε-aminogroepen en de N-terminale α-aminogroep selectief gemethyleerd om gedimethyleerde aminen te produceren. Hoewel bekend is dat formaldehyde eiwitten kruist via de vorming van methyleenbruggen, wordt dit proces geblokkeerd door het reducerende middel13,14.
Reductieve methylering is met succes gebruikt om eiwitten te bestuderen met zowel NMR als röntgenkristallografie. Reductieve methylering wordt gebruikt om de kristallisatie van anders ontoegankelijke eiwitten te vergemakkelijken15. Het eerste eiwit dat in zijn gedimethyleerde vorm werd gekristalliseerd, was het hennepeiwit-lysozym. Het wortelgemiddelde kwadratische verschil tussen de zware atomen in de gemethyleerde en ongemethyleerde lysozymstructuren is 0,40 Å16. Deze vergelijking toont aan dat de eiwitstructuur na reductieve methylering kan worden gehandhaafd, waardoor de reactie een haalbare, markeringstool voor structuurbepaling is.
Door 13C-gelabeld formaldehyde te gebruiken in de reductieve methyleringsreactie, worden 13C-gedimethyleerde aminen geproduceerd. De 13C-dimethylaminen zijn NMR-detecteerbare sondes die op grote schaal zijn gebruikt om eiwitdynamica, structuur en functie te bestuderen. NMR en reductieve 13C-methylering zijn gebruikt om eiwit-ligand en eiwit-eiwit interacties te bestuderen voor de β2 adrenerge receptor17, ribonuclease A18, lysozym19, fd gen 5-eiwit20 en cytochroom c21. Evenzo zijn structurele en functionele eigenschappen bestudeerd van reductief 13C-gemethyleerd ribonuclease A22, lysozym23, fd gen 5-eiwit24, Clostridium pasteurianum ferredoxine25, Fc-fragment van IgG26, apolipoproteïne A-I27 en MIP-1α28 De dynamica van de 13C-dimethylaminogroepen is bestudeerd op concanavalin A29-30 en calmoduline31.
Hoewel reductieve 13C-methylering veel is gebruikt om eiwitten met NMR te bestuderen, is de markeringsmethode altijd beperkt door de moeilijkheden bij het toewijzen van de NMR-resonanties26. De meeste toewijzingsstrategieën voor reductief 13C-gemethyleerde eiwitten zijn gebaseerd op een klein aantal locaties,20,28 bekende structurele eigenschappen11,19,23,26,31,32 of uitgebreide genetische modificaties33. Geen van deze studies heeft met succes alle 13C-dimethylamine-pieken toegewezen, behalve voor de calmodulinestudie, waar de pieken werden toegewezen door middel van richtinggebonden mutagenese van elke lysine33. Bij de studie van MIP-1α dimervorming werd voor het eerst gemeld dat massaspectrometrie (MS) werd gebruikt om de NMR-toewijzing van reductief 13C-gemethyleerde aminen te ondersteunen28. Matrix-ondersteunde laserdesorptie/ionisatie-tijd-van-vlucht (MALDI-TOF) MS werd gebruikt om de lysine op het grensvlak van het dimeer te identificeren. De gedeeltelijk gemethyleerde lysines van humane MIP-1α tryptische peptiden werden geïdentificeerd met MS en gecorreleerd met het verschijnen van mono- en dimethylamine-signalen van het intacte eiwit, waargenomen in 2D 1H-13C HSQC NMR-spectra28. Onze groep breidde het gebruik van MS uit en presenteerde een toewijzingsmethode die ge

<table><tbody><tr><td>Acetonitrile</td><td>Sigma</td><td>34851</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra 4 ml centrifugal filter (3k MWCO)</td><td>Fisher Scientific</td><td>UFC800308 (8pk)</td><td></td></tr><tr><td>Aminopeptidase</td><td>Creative Biomart</td><td>Aminopeptidase-86A</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium bicarbonate</td><td>Sigma</td><td>A6141</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium sulfate</td><td>Sigma</td><td>A5132</td><td></td></tr><tr><td>Borane-dimethylamine complex</td><td>Sigma</td><td>180238</td><td>Maak vers 1 M oplossing voor gebruik.</td></tr><tr><td>Boorzuur</td><td>Sigma</td><td>B6768</td><td></td></tr><tr><td>Bovine pancreas insulin</td><td>Sigma</td><td>I5500</td><td></td></tr><tr><td>C18 Spin Columns</td><td>Thermo Scientific</td><td>89870</td><td></td></tr><tr><td>Deuterium oxide</td><td>Cambridge Isotope Laboratories</td><td>DLM-4-100</td><td></td></tr><tr><td>1,2-dichloroethane-13C2</td><td>Sigma</td><td>714321</td><td>80 mM stockoplossing bewaard bij -80 &deg;C. Gebruikt als referentie in NMR-spectra op 24 mM.</td></tr><tr><td>Formaldehyde (36,5% wt/wt)</td><td>Sigma</td><td>33220</td><td>Maak vers 1 M oplossing voor gebruik.</td></tr><tr><td>13C-formaldehyde (99%)</td><td>Cambridge Isotope Laboratories</td><td>CLM-806-1</td><td>Maak vers 1 M oplossing voor gebruik.</td></tr><tr><td>Lysozyme (kippeneiwit)</td><td>Sigma</td><td>L6376</td><td></td></tr><tr><td>Natriumfosfaat (dibasisch heptahydraat)</td><td>Sigma</td><td>S9390</td><td></td></tr><tr><td>Natriumfosfaat (monobasisch)</td><td>Sigma</td><td>S9638</td><td></td></tr><tr><td>Tricine</td><td>Sigma</td><td>T0377</td><td></td></tr><tr><td>Trifluorazijnzuur</td><td>Sigma</td><td>302031</td><td></td></tr><tr><td>700 MHz Varian VNMRS met 5 mm HCN 5922 sonde</td><td>Agilent Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bruker UltrafleXtreme MALDI TOF/TOF</td><td>Bruker</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

methoden om de nmr-resonanties van de 13c-dimethyl n-terminale amine op reductief gemethyleerde eiwitten te identificeren

Methods to Identify the NMR Resonances of the 13C-Dimethyl N-terminal Amine on Reductively Methylated Proteins

Kernspinresonantie (NMR) spectroscopie is een bewezen techniek voor eiwitstructuur- en dynamische studies. Om eiwitten met NMR te bestuderen, worden doorgaans stabiele magnetische isotopen metabolisch opgenomen om de gevoeligheid te verbeteren en sequentiële resonantie-toewijzing mogelijk te maken. Reductieve 13C-methylering is een alternatieve labelmethode voor eiwitten die niet geschikt zijn voor overexpressie in een bacteriële gastheer, de meest gebruikelijke methode voor isotoopincorporatie. Reductieve 13C-methylering is een chemische reactie die onder milde omstandigheden wordt uitgevoerd en die de primaire aminogroepen van een eiwit (lysine ε-aminogroepen en de N-terminale α-aminogroep) wijzigt in 13C-dimethylaminogroepen. De structuur en functie van de meeste eiwitten worden niet aangepast door de wijziging, waardoor het een haalbare alternatief is voor metabolische labeling. Omdat reductieve 13C-methylering schaarse, isotopenlabels toevoegt, zijn traditionele methoden voor het toewijzen van de NMR-signalen niet toepasbaar. Er is een alternatieve toewijzingsmethode ontwikkeld die massaspectrometrie (MS) gebruikt om te helpen bij het toewijzen van de eiwit 13C-dimethylamine NMR-signalen. De methode is afhankelijk van gedeeltelijke en verschillende hoeveelheden 13C-labeling bij elke primaire aminogroep. Een beperking van de methode ontstaat wanneer de N-terminale rest van het eiwit een lysine is, omdat de α- en ε-dimethylaminogroepen van Lys1 niet afzonderlijk kunnen worden gemeten met MS. Om deze beperking te omzeilen, worden twee methoden beschreven om de NMR-resonantie van de 13C-dimethylamines te identificeren die zijn geassocieerd met zowel de N-terminale α-amine als de zijketen ε-amine. De NMR-signalen van de N-terminale α-dimethylamine en de zijketen ε-dimethylamine van hennepeiwit lysozym, Lys1, worden geïdentificeerd in 1H-13C heteronucleaire single-quantum coherentie-spectra.

Reductieve methylering en pH
Een pH-geïnduceerde chemoselectieve reductieve 13C-methyleringsreactie is aangetoond bij lysozym. Bij een lage pH geniet de reactie de voorkeur voor het N-terminale α-amine boven de zijketen ε-amines en vice versa bij een hoge pH. In oplossing bevinden de aminogroepen van het eiwit zich in een evenwicht tussen het vrije amine en het geconjugeerde zuur, wat instelbaar is via de pH. Het optimale pH-bereik voor deze reactie hangt af van het gebruikte ...

Twee methoden voor het toewijzen van de α- en ε-dimethylamine nucleaire magnetische resonantiesignalen van een reductief 13C-gemethyleerd N-terminaal lysine worden beschreven. De ene methode maakt gebruik van de pH-geïnduceerde selectiviteit van de reductieve methyleringsreactie, en de andere maakt gebruik van aminopeptidase om selectief het N-terminale lysine te verwijderen.

Methoden om de NMR-resonanties van de 13C-Dimethyl N-terminale amine op reductief gemethyleerde eiwitten te identificeren

Nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy is a proven technique for protein structure and dynamic studies. To study proteins with NMR, stable magnetic ...

Het algemene doel van deze procedure is om de alfa- en epsilon-koolstof toe te wijzen. 13 dimethylamine NMR-resonantie van de terminale lysine, restant van lysozym. Dit wordt bereikt door lysozym eerst reductief te methyleren bij lage en hoge pH, met een subgeometrische hoeveelheid koolstof 13-formaldehyde.De tweede stap is om de lage en hoge pH-monsters reductief te methyleren met een overmaat aan natuurlijke abundantie voor formaldehyde om de methylering te voltooien. De laatste stap is om de reductief gemethyleerde monsters uit te wisselen naar D twee O-buffer voor NMR-analyse. Bij de tweede methode wordt het doel bereikt door aminopeptidase-afbraak van een lysozymmonster.De tweede stap is om het geamputeerde eiwitmonster reductief te methyleren met een overmaat aan koolstof 13-formaldehyde, gevolgd door bufferuitwisseling voor NMR-analyse. Uiteindelijk wordt NMR-spectroscopie gebruikt om de afwezigheid van koolstof 13-methylresonantie te tonen om toewijzingen te maken. Het belangrijkste voordeel van deze techniek boven bestaande methoden is dat het de ondubbelzinnige toewijzing van zowel de alfa- als de SSON-dimethylamine en ML-resonanties van de interne lysine van een eiwit mo

methods-to-identify-nmr-resonances-13c-dimethyl-n-terminal-amine-on

Research

JoVE Journal

Chemistry

Scheikunde

Stabiele isotoop labeling van peptiden door reductieve dimethylering (Redi etikettering) is een snelle, goedkope strategie voor nauwkeurige massa-spectrometrie gebaseerde kwantitatieve proteomics. Hier laten we een robuuste werkwijze voor de bereiding en analyse van eiwitmengsels met de Redi aanpak die kan worden toegepast op vrijwel elk type monster.

Kwantitatieve Proteomics behulp Reductieve dimethylering voor stabiele isotopen Labeling

De neurochemie van het zoogdierbrein verandert bij vele neurologische en systemische ziekten. Karakteristieke profielen van cerebrale metabolieten kunnen efficiënt worden verkregen op basis van ruwe extracten van hersenweefsel. Hiervoor wordt hoge-resolutie NMR-spectroscopie gebruikt, wat een gedetailleerde kwantitatieve analyse van metabolietenconcentraties (metabolomics) mogelijk maakt.

Metabolomic Analyse van de hersenen van de rat door de hoge resolutie nucleaire magnetische resonantie spectroscopie van Tissue Extracten

We beschrijven hier een methode om meerdere fosforylaties van een intrinsiek ongeordend eiwit te identificeren door middel van Kernspinresonantiespectroscopie (NMR), met behulp van het Tau-eiwit als casestudie. Recombinant Tau wordt isotopisch verrijkt en gemodificeerd in vitro door een kinase voorafgaand aan gegevensverwerving en analyse.

Nucleaire magnetische resonantie spectroscopie voor de identificatie van verschillende fosforyleringen van intrinsiek ontvouwen eiwitten

Structuren van supramoleculaire eiwit samenstellingen met atomaire resolutie zijn van groot belang vanwege hun cruciale rol in een verscheidenheid van biologische fenomenen. Hierin presenteren wij een protocol voor het uitvoeren van high-resolution structurele studies op onoplosbare en niet-kristallijne macromoleculaire eiwit samenstellen door magie-angle spinning solid-state nucleaire magnetische resonantie spectroscopie (MAS SSNMR).

Atoomschaal structurele Studies van macromoleculaire samenstellen door Solid-state nucleaire magnetische resonantie spectroscopie

Protein Arginine (R)-methylatie is een wijdverspreide posttranslationele modificatie die meerdere biologische routes reguleert. Massaspectrometrie is de beste technologie om het R-methylproteoom wereldwijd te profileren, wanneer gekoppeld aan biochemische benaderingen voor gemodificeerde peptideverrijking. De workflow die is ontworpen voor de identificatie met hoge betrouwbaarheid van globale R-methylatie in menselijke cellen wordt hier beschreven.

Een op massaspectrometrie gebaseerde proteomics-benadering voor wereldwijde en betrouwbare eiwit-R-methylatieanalyse

Dit artikel beschrijft een monstervoorbereidingsmethode op basis van warmte-inactivatie om endogene peptiden te behouden die post-mortem degradatie voorkomen, gevolgd door relatieve kwantificering met behulp van isotopische etikettering plus LC-MS.

Monstervoorbereiding en relatieve kwantificering met behulp van reductieve methylering van amines voor peptidomics-studies

Een protocol voor de toepassing van paramagnetische relaxatieverbetering NMR-spectroscopie om zwakke en voorbijgaande inter- en intramoleculaire interacties in intrinsiek ongeordende eiwitten te detecteren, wordt gepresenteerd.

Paramagnetische relaxatieverbetering voor het detecteren en karakteriseren van zelfassociaties van intrinsiek ongeordende eiwitten

Het huidige protocol beschrijft de bereiding en kwantitatieve meting van vrije en eiwitgebonden arginine en methyl-arginineen door 1H-NMR spectroscopie.

Het verkennen van de Arginine Methylome door nucleaire magnetische resonantie spectroscopie

Hier presenteren we een protocol waarin de verwerving, verwerking en analyse van een reeks NMR-experimenten wordt beschreven die gericht zijn op het karakteriseren van eiwit-glycaaninteracties in oplossing. De meest voorkomende op liganden gebaseerde en op eiwitten gebaseerde methodologieën worden geschetst, die ongetwijfeld bijdragen aan de gebieden van structurele glycobiologie en moleculaire herkenningsstudies.

Ontwarren van glycaan-eiwitinteracties: nucleaire magnetische resonantie (NMR) om te redden

De NMR-oplossingsstructuur van een metallochaperone modelpeptide met Cu (I) werd bepaald, en een gedetailleerd protocol van monstersvoorbereiding en 1D en 2D dataverzameling tot een driedimensionale structuur wordt beschreven.

Structuur- en coördinatiebepaling van peptide-metaalcomplexen met behulp van 1D en 2D 1H NMR

Leer NMR-signaaltoewijzing van dimethylamine op reductief gemethyleerde lysine in lysozym via pH-afhankelijke methylering en aminopeptidase-behandeling. Deze methoden verbeteren eiwitstructuuranalyse.

Methoden om de NMR-resonanties van de ¹³C-Dimethyl N-terminale amine op reductief gemethyleerde eiwitten te identificeren

Meer video's verkennen