Met behulp van flatbed scanners om High-resolution-Time vervallen Beelden van de Arabidopsis wortel gravitropic Response Collect
25 januari 2014
Dit protocol beschrijft een werkwijze voor snelle verzameling afbeeldingen van Arabidopsis zaailingen reageren op een stimulus zwaartekracht met behulp van commercieel verkrijgbare flatbed scanners. De methode maakt het mogelijk voor goedkope, high-volume vastleggen van beelden met hoge resolutie vatbaar voor downstream analyse algoritmen.
Het algemene doel van deze video is om een scanner-gebaseerde methode van hoogwaardige beeldacquisitie van de worteltropische respons in de modelplant opsis te illustreren. Om dit protocol te beginnen, worden zaden van de aangewezen zaadvoorraad geplant op petrischalen met een transparant medium. Nadat de zaden gedurende de aangegeven tijdperiode zijn ontkiemd, worden de petrischalen uit de groeikamer gehaald, voorbereid voor scannen en vervolgens in verticaal georienteerde flatbedscanners geplaatst. Platen worden vervolgens 90 graden gedraaid en gedurende een aangegeven tijdsperiode gescand.
De beelden worden opgeslagen op de computer of een gegevensopslagapparaat en worden later gebruikt voor beeldverwerking. Voorafgaand aan de beeldacquisitie, bereid aga platen voor met de twee B-gescande plantweefsels. Eerst, absorbeer eventuele gevormde condensatie op het deksel en de zijden van de AGA-plaat met een kimdoek.
Vervolgens, breng een royale hoeveelheid Triton X 100 aan om toekomstige condensatie te voorkomen. Ten slotte, voltooi dit proces door de plaat met micropore tape te omwikkelen om het deksel vast te zetten en ventilatie mogelijk te maken om met beeldacquisitie te beginnen. Stel mappen in voor het opslaan van de beelden op de gewenste locatie.
Elke mapnaam bestaat uit een samenstelling van metadata die betrekking heeft op de te scannen informatie. In dit voorbeeld waren unieke id-leeftijd, grootte en zaadvoorraad gegevens die op de mapnamen stonden. Deze metadata kan vervolgens worden gekopieerd en geplakt in een mapnaam.
Dit Protocol gaat ervan uit dat er meer dan één scanner wordt gebruikt om beelden te verzamelen en geeft instructies om meerdere scanners op één computer aan te sluiten. Om deze reden zijn er drie mappen ingesteld voor het opslaan van beelden. De volgende stap is het instellen van de timers voor een aangegeven verzamelingstijd.
Aangezien er op dit punt nog behoorlijk wat voorbereidingen moeten worden gedaan, zorg ervoor om de timers in te stellen voor een beetje extra tijd. Zet vervolgens de eerste scanner aan en open het bekijk scanprogramma. Zet onder het tabblad invoer de bron in op de juiste scanner en het vervolgkeuzemenu voor automatisch herhalen naar 'geen' onder het tabblad bijsnijden.
Stel het voorbeeldgebied in op Maximum en druk op voorbeeld. Kies een bijsnijdingsvak dat het gebied van belang zal vastleggen en stel het voorbeeldgebied in op bijsnijdingsvak. Bekijk vervolgens het beeld opnieuw.
Om de verzamelde gegevens op de gewenste locatie op te slaan, druk op het tabblad uitvoer en vind de eerder gemaakte mapnamen die overeenkomen met elke scanner. Zet de volgende scanner aan en herhaal de weergave scan. Stel richtingen in voor de andere twee scanners, zorg ervoor dat u de juiste mappen kiest om de gegevens op te slaan.
Het is ook belangrijk om door elk tabblad te gaan en ervoor te zorgen dat alle scannerinstellingen naar wens zijn. Ons lab heeft gevonden dat de volgende instellingen het beste werken voor het type beeldacquisitie dat wordt uitgevoerd. Verschillende soorten beeldacquisitie kunnen echter andere instellingen vereisen.
Nadat alle instellingen zijn gecontroleerd, kies het tabblad invoer en stel het vervolgkeuzemenu voor automatisch herhalen in op continu voor alle drie Scanners. Plaats de voorbereide platen in de scanners met de zaailingen horizontaal georienteerd en plaats tijdelijk de viltzijde van de achtergrond tegen de platen om stabiliteit in de scanner te garanderen. Als u dit protocol met een partner uitvoert, laat één persoon de platen 90 graden draaien en onmiddellijk de viltachtergrond, de andere persoon drukt vervolgens op de scanknop en beide bevestigen de achtergrond aan de scanner met een bungee-koord.
Herhaal dit proces voor scanners twee en drie. Elke afbeelding zou ongeveer twee tot drie minuten moeten duren om volledig te scannen. De uiteindelijke afbeeldingen zullen eruitzien zoals getoond. Het is een goed idee om de mappen te controleren waarin de afbeeldingen worden opgeslagen om ervoor te zorgen dat ze allemaal correct worden opgeslagen.
Het is ideaal om de scanners in een gebied te houden dat gedurende de aangegeven tijdscan vrij zal zijn van storingen. Het is ook verstandig om de omgevingscondities in het scangebied te overwegen om ideale fenotyische reacties te garanderen. De volgende afbeeldingen zijn voorbeelden van die welke zijn verzameld met behulp van de methode die in deze video wordt beschreven.
Panelen A en B en C en D zijn de eerste en laatste afbeeldingen van een enkele scanperiode. A en B tonen het volledige gescande gebied. Terwijl C en D een bijgesneden gebied van het gescande gebied zijn waarin een enkele plaat te zien is, kunnen er verschillende onregelmatigheden worden waargenomen.
Figuur A toont variatie in ontkieming en in groeitraject. Afbeelding B toont aan dat platen condensatie kunnen accumuleren terwijl afbeeldingen C en D worden beschouwd als goede resultaten vanwege de robuuste groei van zaailingen en beeldkwaliteit gedurende de hele run. De procedure die in dit artikel is geschetst, past in zijn eigen niche in de wereld van wortelbeeldvorming doordat het hoogwaardig en hoog opbrengend is, terwijl het nog steeds relatief betaalbaar is.
Een extra voordeel van deze aanpak is dat het gemakkelijk kan worden aangepast om tegemoet te komen aan de beeldvormingsbehoeften van een specifieke onderzoeksgroep. De methode wordt ook aangepast voor beeldvorming van andere.
Overzicht
Dit protocol beschrijft een methode voor het maken van hoge-resolutiebeelden van Arabidopsis-zaailingen als reactie op zwaartekracht met behulp van flatbedscanners. Deze aanpak is kosteneffectief en maakt het mogelijk om een groot volume aan beelden te verzamelen die geschikt zijn voor verdere analyse.
Belangrijkste studieonderdelen
Wetenschapsgebied
- Plantbiologie
- Beeldanalyse
- Tropische wortelrespons
Achtergrond
- Arabidopsis dient als modelorganisme in het plantonderzoek.
- Het begrijpen van wortelresponsen op zwaartekracht is cruciaal voor studies naar plantontwikkeling.
- Beeldvormingstechnieken met een hoge resolutie verbeteren de gegevensverzameling voor fenotypische analyse.
- Flatbedscanners bieden een betaalbare oplossing voor high-throughput imaging.
Doel van de studie
- Om een scannergebaseerde methode aan te tonen voor het vastleggen van tropische reacties van wortels.
- Om de verzameling van beelden voor eftergelijke analyse te vergemakkelijken.
- Om een aanpasbaar beeldvormingsprotocol te bieden voor onderzoeksgroepen.
Gebruikte methoden
- Zaden worden gekiemd op transparante media in Petrischalen.
- Platen worden gescand met behulp van verticaal georiënteerde flatbedscanners.
- Voor een hogere efficiëntie kunnen meerdere scanners worden aangesloten op één computer.
- De instellingen voor beeldacquisitie worden aangepast voor optimale resultaten.
Belangrijkste resultaten
- De vastgelegde beelden tonen variaties in de kiemings- en groeitrajecten.
- Er werden condensatieproblemen op de platen opgemerkt, wat de beeldkwaliteit beïnvloedde.
- Er zijn beelden van hoge kwaliteit verkregen, die een robuuste groei van de zaailingen aantonen.
- De methode maakt high-throughput en aanpasbare beeldvorming mogelijk.
Conclusies
- Het protocol biedt een effectieve methode voor het in beeld brengen van wortelresponsen.
- Het is aanpasbaar aan verschillende beeldvormingsbehoeften binnen onderzoeksettings.
- De aanpak balanceert kosten en efficiëntie bij de gegevensverzameling.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Directie
Fenotypische beeldvorming met hoge resolutie van de gravitropische respons van wortels maakt mechanistische risicoreductie mogelijk bij vroege targetvalidatie voor de ontdekking van plantaardige therapeutica. Deze kosteneffectieve high-throughput beeldvormingsmethode vergroot het voorspellend vertrouwen in genfunctiestudies door kwantitatieve time-lapsegegevens te genereren die geschikt zijn voor downstream image-analysepipelines. De methode pakt schaalbaarheidsproblemen in discovery biology aan, terwijl de dataintegriteit voor translationele continuïteit behouden blijft.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het toetsen van therapeutische hypothesen mogelijk door middel van kwantitatieve meting van wortelgroeitrajecten als fenotypische weergave van genfunctie.
- Operationele waarde: Biedt biologische risicoreductie via high-throughput vastlegging van 216 individuele responsen per dag met een resolutie van 4.800 dpi.
- Voorspellende waarde: Ondersteunt portfolio-triage door het genereren van voldoende kwalitatieve beeldata voor beeldanalyse-applicaties die variaties in het groeitraject verduidelijken.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Bereidt gevalideerde biologische systemen voor (Arabidopsis-zaailingen op transparante media) voor gestandaardiseerde, reproduceerbare workflows voor het screenen van verbindingen of genetica.
- Operationele waarde: Zorgt voor assay-gereedheid via geautomatiseerde time-lapse beeldacquisitie om de paar minuten met behulp van goedkope flatbedscanners.
- Schaalbaarheidswaarde: Maakt hergebruik van het platform en aanpassing tussen groepen mogelijk dankzij het aanpasbare protocolontwerp en de connectiviteit van meerdere scanners met één computer.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Translationele waarde: Handhaaft de continuïteit van ziekterelevante systemen, van ontdekking tot fenotypische kwantificering van de worteltropische respons, een geconserveerd mechanisme in modelorganismen.
- Mechanische risicoreductie: Vermindert ambiguïteit bij targetvalidatie door de onafhankelijke variabele (verplaatsing van de zwaartekrachtvector) te isoleren en de afhankelijke variabele (correctieve groei) te meten met een hoge temporele resolutie.
- Predictieve betrouwbaarheid: Ondersteunt risico-gecorrigeerde beslissingen voor verdere ontwikkeling door kwantitatieve resultaten te leveren die statistische analyse van variaties in kieming en groeitrajecten mogelijk maken.
Integratie van Pipeline & Workflow
Deze methode integreert in het ontdekkingscontinuüm, van hypothesetoetsing tot lead-identificatie, door gestandaardiseerde, kwantitatieve fenotypische gegevens te leveren die de go/no-go-beslissingen bij vroege targetvalidatie onderbouwen.
- Ontdekkingsbiologie: Ondersteunt hypothesetests en de verduidelijking van signaalpaden door het mogelijk maken van de observatie van correctieve groei in kiemwortels die zijn verschoven ten opzichte van de zwaartekrachtvector.
- Screening: Zorgt voor standaardisatie en reproduceerbaarheid van assays via gecontroleerde plaatpreparatie (voorkomen van condensatie via Triton X-100 en micropore-tape) en consistente protocollen voor het opslaan van beelden.
- Analytiek: Genereert time-lapse beeldsets met een resolutie van 4.800 dpi, geschikt voor kwantitatieve metingen van groeitrajecten en de consistentie van kieming.
- Translationeel onderzoek: Sluit aan op preklinische continuïteit door ziekterelateerde fenotypische read-outs te verschaffen in een modelsysteem dat vatbaar is voor genetische en farmacologische perturbatie.
- Bedrijfsmatige herbruikbaarheid: Functioneert als een herbruikbare imaging-capaciteit in plaats van een eenmalige techniek vanwege de lage kosten, hoge doorvoer en het gemak van aanpassing voor verschillende onderzoeksgroepen.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Voorspellende betrouwbaarheid bij targetvalidatie door het verminderen van mechanistische ambiguïteit bij het fenotyperen van de gravitropische respons.
- Operationele waarde: Standaardisatie, reproduceerbaarheid en schaalbaarheid gerealiseerd via geautomatiseerde scanprotocollen en metadata-gestuurde mapnaamgeving voor dataorganisatie.
- Strategische waarde: Betere go/no-go-beslissingen, kapitaalefficiëntie en verminderd biologisch risico in een laat stadium door vroege fenotypische risicoreductie met behulp van high-volume, high-resolution imaging.
- Impact op portfolio: Risico-gecorrigeerde prioritering en beslissingen over verdere ontwikkeling, mogelijk gemaakt door uitgebreide kwalitatieve beeldata ter ondersteuning van beeldanalyse-applicaties.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereiste wetenschappelijke expertise in plantbiologie en protocollen voor beeldacquisitie voor beeldvorming van Arabidopsis-wortels.
- De benodigde instrumentatie omvat verticaal georiënteerde flatbedscanners met een resolutie van 4.800 dpi en connectiviteit naar één computer voor de bediening van meerdere scanners.
- Standaardisatie tussen teams vereist een consistente plaatvoorbereiding (condensatiebeheersing via Triton X-100 en micropore-tape) en mappenbenaming op basis van metadata voor reproduceerbare gegevensopslag.
- Overwegingen voor adaptatie over verschillende modelsystemen omvatten het aanpassen van de scanneroriëntatie en de plaatvoorbereiding voor verschillende kiemplantgroottes en groeicondities.
- Praktische beperkingen omvatten het beheersen van condensatie op platen en het waarborgen van een stabiele oriëntatie van de kiemplanten tijdens de rotatie van 90 graden voor de inductie van de gravitrope respons.
