Name: Aanvulling van de voeding van meervoudig onverzadigde vetzuren in Caenorhabditis elegans (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-29T16:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 38 s
Description: Leer hoe je meervoudig onverzadigde vetzuren aanvult in Caenorhabditis elegans via dieetmanipulatie. Deze methode gebruikt gaschromatografie-massaspectrometrie om lipidsamenstelling te analyseren en sterility te scoren.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij danken Chris Webster voor het uitvoeren van de voorlopige experimenten weergegeven in figuur 3 van de representatieve resultaten en Jason Watt en Chris Webster voor nuttige commentaar op het manuscript. Financiering voor deze studie werd verstrekt door een subsidie ​​van de National Institutes of Health (USA) (R01DK074114) naar JLW. Sommige nematode stammen die in dit werk werden verstrekt door de Caenorhabditis Genetics Center, dat wordt gefinancierd door de NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440).

Meervoudig onverzadigde vetzuren zijn gevoelig voor warmte, licht en zuurstof. Daarom is voorzichtigheid geboden bij het opstellen van vetzuursuppletie platen zodanig dat vetzuren niet worden blootgesteld aan overmatige warmte en licht. NGM medium dat 0,1% Tergitol (NP-40) wordt geautoclaveerd en gedeeltelijk afgekoeld, waarna vetzuren natriumzouten worden toegevoegd onder constant roeren. De platen mogen drogen in het donker. Opname van vetzuren met C. elegans gekweekt op deze platen kunnen vervolgens worden gevolgd met gaschromatografie. 1. Bereiding van vetzuur gesupplementeerd Media <ol><li> Meet media componenten in een juiste maat kolf. Per 1 L, voeg 17 g Bacto-agar, 2,5 g trypton, 3 g NaCl, 1 ml 5 mg / ml cholesterol opgelost in ethanol en 10 ml 10% Tergitol opgelost in water. </li><li> Voeg 80% van de uiteindelijke gewenste volume van Millipore water en autoclaaf de media samen met lege glazen flessen (gelijk aan het aantal verschillendevetzurenconcentraties te testen), en passende maatcilinders. </li><li> Cool media in een waterbad tot 55 ° C. Terwijl de media afkoelt bereiden werkvoorraadoplossing van het vetzuur natriumzout door het breken van de glazen flacon met veiligheidsmaatregelen en waarborgen glasdeeltjes niet mengen met de vetzuren. Weeg genoeg vetzuur om een ​​100 mM werkvoorraad maken. </li><li> Breng het vetzuur oplossing tot een eindconcentratie van 100 mM met gezuiverd water. Volledig oplossen van het vetzuur natriumzout meestal duurt ongeveer 20-30 minuten. Spoel de werkvoorraad vetzuur met argon of stikstof, omdat contact met een inert gas voorkomt oxidatie. Cap het flesje en bewaar de werkvoorraad in het donker totdat media is afgekoeld. </li><li> (Optioneel) Als RNAi media gewenst, meet ampicilline en isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) oplossingen hier. </li><li> Wanneer de agar is afgekoeld tot 55 ° C voeg per 1 L: 1ml 1 M MgSO4, 1 ml 1 M CaCl2 en 25 ml fosfaatbuffer (108,3 g KH 2 PO 4 en 35,6 g K 2 HPO 4 per 1 L geautoclaveerd). Voeg de filter gesteriliseerd ampicilline en IPTG oplossingen als het maken van RNAi platen. Voor alle soorten borden, voeg steriel water om de laatste media-volume op 1 L. brengen </li><li> In de buurt van een vlam, transfer media om een ​​autoclaaf en de juiste maat maatcilinder en voeg vervolgens warm steriel water om het gewenste volume. Transfer media terug naar de eerste kolf en meng door roeren. </li><li> Vlakbij een vlam, overbrengen medium in een aantal flessen gelijk aan het aantal concentraties worden getest door meting met een autoclaaf en geschikte afmetingen maatcilinder. Handhaving van de hoeveelheden verdeeld media als vloeistof met behulp van een waterbad tot het vetzuur werkvoorraad volledig is opgelost. </li><li> Plaats een fles op een roer plaat en roer totdat de media is warm aan, maar niet heet. Zorg ervoor dat je jezelf genoeg te verlatentijd te roeren in het vetzuur voorraad oplossing en giet platen voor de media begint te stollen. Als roerplaat heeft temperatuurregeling, stel deze in op 55 ° C. </li><li> Verdun de 100 mM vetzuur werkvoorraad in de media voor de uiteindelijke concentratie gewenst. Roer media totdat de witte neerslag in oplossing (ongeveer 1 minuut). Media kan nog licht bewolkt en wordt het daarna. </li><li> (Optioneel) Als RNAi media gewenst add ampicilline tot 0,1 mg / ml IPTG en 2 mM eindconcentratie. </li><li> Giet media met behulp van een automatische pipet hulp en een steriele 25 ml pipet, het toevoegen van 8 ml van de media per plaat van 60 mm of 25 ml van de media per 100 mm plaat. Herhaal vetzuren toevoeging en plaat gieten stappen voor de overige flessen. </li><li> Nadat de agar gestold is, bedek de vetzuren aangevuld platen met een doos of op te slaan op kamertemperatuur in een goed geventileerde lade te beschermen tegen licht oxidatie. </li><li> Seed E. coli OP50 op platen twee dagen na de platen gedroogd.Voor 60 mm platen, pipet 300 ul van een nacht OP50 kweek (gekweekt bij 37 ° C). Als RNAi platen werden gegoten, zaad met 300 ul van RNAi bacteriën nadat de platen zijn gedroogd gedurende vier dagen. Plaat droogtijd moet worden aangepast door verschillen in vochtigheid in diverse laboratorium omgevingen. </li><li> Incubeer de platen in een donkere plaats bij kamertemperatuur terwijl het bacteriedek droogt. </li></ol> 2. Inducerende Germ Cell Vernietiging door Suppletie van DGLA <ol><li> C. elegans gegroeid op platen die 0,3 mM DGLA (20:03 n-6) steriel worden door het vernietigen van kiemcellen in zowel larve en volwassen nematoden. <ol><li> Bereid een gesynchroniseerde bevolking van L1 larven door het behandelen van zwangere hermafrodieten met alkalische hypochloriet oplossing (voor een 10 ml oplossing: 0,5 ml 5 M NaOH, 2,5 ml bleekwater en 7 ml H 2 O). Schud de zwangere hermafrodieten in deze oplossing, totdat de volwassen worms te ontbinden. Eieren zullen worden bewaard, en kunnen worden afgedraaid door lage snelheid centrifugeren. </li><li> Was eipreparaat 3 keer in M9-buffer (3 g KH 2PO 4, 6 g Na 2 HPO 4, 5 g NaCl, 1 ml 1 M MgSO4, H 2 O tot 1 L. toevoegen MgSO4 na het autoclaveren). Om voldoende zuurstof te voorzien, resuspendeer de eieren in een 15 ml plastic buis tot een eindvolume van 5 ml M9 buffer en rock op een shaker &#39;s nachts. </li><li> L1 larven dienen aan de aangevulde platen toegevoegd twee dagen na zaaien met OP50, of een dag na het uitplaten van de RNAi bacteriën. Incubeer wormen bij 20 ° C gedurende drie dagen of totdat ze het volwassen stadium. </li></ol></li><li> Volwassen wormen kunnen worden gescoord voor steriliteit met behulp van een dissectie microscoop met hoog genoeg vergroting om embryo&#39;s te ontwikkelen in de baarmoeder te visualiseren. Succesvolle kiemcel verlies zal er als een heldere baarmoeder leegte van eieren. </li><li> Wormen kunnen ook worden gescoord door de vaststelling en kleuring met het nucleïnezuur eencid diamindinophenylindole kleurstof (DAPI), waarbij de visualisatie van kernen in kiemcellen en ontwikkelende embryo vergemakkelijkt. Een snelle DAPI kleuring wordt bereikt door het uitkiezen wormen in een druppel M9 buffer op een horlogeglas 9. <ol><li> Flood horloge-glas met 1 ml van een 0,2 ng / m. DAPI in 95% ethanol-oplossing, laat zitten voor ongeveer 5 minuten. </li><li> Kies wormen in een druppel Vectashield op een dia, en dek af met een dekglaasje. </li><li> Verbinding dekglaasje en bewaar bij 4 ° C in het donker overnacht voor optimale kleuring echter slides ook onmiddellijk bekeken. Score aanwezigheid of afwezigheid van kiemcellen kernen met een fluorescentiemicroscoop uitgerust met een UV lamp en filter. </li></ol></li></ol> 3. Fatty Acid opname bevestigt met gaschromatografie Algemeen vetzuursamenstelling van C. elegans kan worden bepaald door het produceren van vetzuurmethylesters (Fames) die vervolgens worden gescheiden en gekwantificeerd met gas chromatography 4. <ol><li> Verzamel 500-1.000 volwassen wormen door het wassen ze af van de platen met water en het overbrengen naar een gesilaniseerd 13 mm x 100 mm glazen schroef bovenbuis. </li><li> Laat wormen af ​​te wikkelen door de zwaartekracht, en verwijder zoveel mogelijk water met een glas Pasteur pipet. </li><li> Was wormen eenmaal met water, en dan weer verwijder zoveel mogelijk water. </li><li> Bekendheid worden gevormd door toevoeging van 1 ml 2,5% H 2 SO 4 in methanol, en vervolgens verwarmen bij 70 ° C gedurende 1 uur in een waterbad. </li><li> Haal de buizen uit het waterbad en afkoelen gedurende 1 minuut. </li><li> Extract Bekendheid door toevoeging van 1,5 ml water en 0,25 ml hexaan. </li><li> Recap buizen en schud krachtig. </li><li> Centrifugebuizen in een tafelblad klinische centrifuge gedurende 1 minuut bij maximale snelheid tot hexaan scheiden van waterig oplosmiddel. </li><li> Transfer hexaan (toplaag) om een ​​GC flacon insert binnen een GC flesje, dat evenwel niet tot een van de waterfase overdragen. Voor GC eennalyse, 1-2 pi Fames in hexaan wordt geïnjecteerd op een polair capillaire gaschromatografiekolom geschikt voor Fames analyse. De Agilent 7890 GC injector bij 250 ° C met een stroomsnelheid van 1,4 ml / min en de GC oven is geprogrammeerd voor een begintemperatuur van 130 ° C, dat wordt gehouden gedurende 1 minuut. Vervolgens wordt de temperatuur opgevoerd 10 ° C / min tot 190 ° C, en men daarna stijgen opnieuw bij 5 ° C / min tot 210 ° C en gedurende nog eens 1 minuut. </li><li> Om opname van DGLA opgetreden Bekendheid analyseren vlamionisatiedetectie (FID) of massaspectrometrie (MS) detectie, met authentieke standaarden voor de identificatie van C. elegans vetzuren. </li></ol>

<ol><li>Haeggstrom, J. Z., Funk, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipoxygenase+and+leukotriene+pathways%3A+biochemistry%2C+biology%2C+and+roles+in+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Rev%22%5BJournal%5D)">Lipoxygenase and leukotriene pathways: biochemistry, biology, and roles in disease.</a> Chem. Rev. 111, 5866-5898 (2011).</li>
<li>de Lorgeril, M., Salen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+insights+into+the+health+effects+of+dietary+saturated+and+omega-6+and+omega-3+polyunsaturated+fatty+acids%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Med%22%5BJournal%5D)">New insights into the health effects of dietary saturated and omega-6 and omega-3 polyunsaturated fatty acids.</a> BMC Med. 10, 50(2012).</li>
<li>Spychalla, J. P., Kinney, A. J., Browse, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+an+animal+omega-3+fatty+acid+desaturase+by+heterologous+expression+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Identification of an animal omega-3 fatty acid desaturase by heterologous expression in Arabidopsis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94, 1142-1147 (1997).</li>
<li>Watts, J. L., Browse, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+dissection+of+polyunsaturated+fatty+acid+synthesis+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Genetic dissection of polyunsaturated fatty acid synthesis in Caenorhabditis elegans.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 5854-5859 (2002).</li>
<li>Watts, J. L., Phillips, E., Griffing, K. R., Browse, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deficiencies+in+C20+Polyunsaturated+Fatty+Acids+Cause+Behavioral+and+Developmental+Defects+in+Caenorhabditis+elegans+fat-3+Mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Deficiencies in C20 Polyunsaturated Fatty Acids Cause Behavioral and Developmental Defects in Caenorhabditis elegans fat-3 Mutants.</a> Genetics. 163, 581-589 (2003).</li>
<li>Kahn-Kirby, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+Polyunsaturated+Fatty+Acids+Drive+TRPV-Dependent+Sensory+Signaling+In+Vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Specific Polyunsaturated Fatty Acids Drive TRPV-Dependent Sensory Signaling In Vivo.</a> Cell. 119, 889-900 (2004).</li>
<li>Brock, T. J., Browse, J., Watts, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+regulation+of+unsaturated+fatty+acid+composition+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Genetic regulation of unsaturated fatty acid composition in C. elegans.</a> PLoS Genet. 2, e108(2006).</li>
<li>Webster, C. M., Deline, M. L., Watts, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stress+response+pathways+protect+germ+cells+from+omega-6+polyunsaturated+fatty+acid-mediated+toxicity+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Stress response pathways protect germ cells from omega-6 polyunsaturated fatty acid-mediated toxicity in Caenorhabditis elegans.</a> Dev. Biol. 373, 14-25 (2013).</li>
<li>Kadyk, L. C., Lambie, E. J., Kimble, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((glp-3+is+required+for+mitosis+and+meiosis+in+the+Caenorhabditis+elegans+germ+line%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">glp-3 is required for mitosis and meiosis in the Caenorhabditis elegans germ line.</a> Genetics. 145, 111-121 (1997).</li>
<li>Watts, J. L., Browse, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dietary+manipulation+implicates+lipid+signaling+in+the+regulation+of+germ+cell+maintenance+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Dietary manipulation implicates lipid signaling in the regulation of germ cell maintenance in C. elegans.</a> Dev. Biol. 292, 381-392 (2006).</li>
<li>Pryor, W. A., Stanley, J. P., Blair, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoxidation+of+polyunsaturated+fatty+acids%3A+II.+A+suggested+mechanism+for+the+formation+of+TBA-reactive+materials+from+prostaglandin-like+endoperoxides%5BTitle%5D)+AND+%22Lipids%22%5BJournal%5D)">Autoxidation of polyunsaturated fatty acids: II. A suggested mechanism for the formation of TBA-reactive materials from prostaglandin-like endoperoxides.</a> Lipids. 11, 370-379 (1976).</li>
<li>Kniazeva, M., Shen, H., Euler, T., Wang, C., Han, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+maternal+phospholipid+composition+and+IP%283%29-dependent+embryonic+membrane+dynamics+by+a+specific+fatty+acid+metabolic+event+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Regulation of maternal phospholipid composition and IP(3)-dependent embryonic membrane dynamics by a specific fatty acid metabolic event in C. elegans.</a> Genes Dev. 26, 554-566 (2012).</li>
<li>Edmonds, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin%2FFOXO+signaling+regulates+ovarian+prostaglandins+critical+for+reproduction%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">Insulin/FOXO signaling regulates ovarian prostaglandins critical for reproduction.</a> Dev. Cell. 19, 858-871 (2010).</li>
<li>O'Rourke, E. J., Kuballa, P., Xavier, R., Ruvkun, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((omega-6+Polyunsaturated+fatty+acids+extend+life+span+through+the+activation+of+autophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">omega-6 Polyunsaturated fatty acids extend life span through the activation of autophagy.</a> Genes Dev. 27, 429-440 (2013).</li>
<li>Taubert, S., Van Gilst, M. R., Hansen, M., Yamamoto, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Mediator+subunit%2C+MDT-15%2C+integrates+regulation+of+fatty+acid+metabolism+by+NHR-49-dependent+and+-independent+pathways+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">A Mediator subunit, MDT-15, integrates regulation of fatty acid metabolism by NHR-49-dependent and -independent pathways in C. elegans.</a> Genes Dev. 20, 1137-1149 (2006).</li>
<li>Lesa, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long+chain+polyunsaturated+fatty+acids+are+required+for+efficient+neurotransmission+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Long chain polyunsaturated fatty acids are required for efficient neurotransmission in C. elegans.</a> J. Cell Sci. 116, 4965-4975 (2003).</li>
<li>Brock, T. J., Browse, J., Watts, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fatty+acid+desaturation+and+the+regulation+of+adiposity+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Fatty acid desaturation and the regulation of adiposity in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 176, 865-875 (2007).</li>
<li>Goudeau, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fatty+acid+desaturation+links+germ+cell+loss+to+longevity+through+NHR-80%2FHNF4+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Fatty acid desaturation links germ cell loss to longevity through NHR-80/HNF4 in C. elegans.</a> PLoS Biol. 9, e1000599(2011).</li>
<li>Yang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+ARC%2FMediator+subunit+required+for+SREBP+control+of+cholesterol+and+lipid+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">An ARC/Mediator subunit required for SREBP control of cholesterol and lipid homeostasis.</a> Nature. 442, 700-704 (2006).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen.

Hier beschrijven we een werkwijze voor aanvulling van C. elegans voedingsvezels onverzadigde vetzuren. Zoals hierboven vermeld, moet erop worden gelet bij de bereiding van PUFA aangevuld platen omdat de reactieve aard van de dubbele bindingen in PUFA oorzaak van deze vetzuren gevoelig voor oxidatie door warmte en licht 11. Om oxidatie te voorkomen, is het belangrijk om de PUFA het vloeibaar agarmedium toevoegen nadat het materiaal is afgekoeld tot 55 ° C en slaat platen in een donkere omgeving. <...

Vetzuren essentiële structurele componenten van membranen en energieopslagtechnologieën moleculen. Daarnaast kunnen vetzuren worden afgesplitst van cellulaire membranen door lipasen en enzymatisch gewijzigd om signalering effectoren 1 produceren. Natuurlijk voorkomende meervoudig onverzadigde vetzuren (PUFA&#39;s) bevatten twee of meer cis dubbele bindingen. De omega-3-vetzuren en omega-6-vetzuren zijn van elkaar onderscheiden op basis van de posities van dubbele bindingen ten opzichte van het methyl einde van het vetzuur. Gezonde voeding vereisen zowel omega-6 en omega-3 vetzuren. Echter, Westerse diëten zijn bijzonder rijk aan omega-6 vetzuren en arm aan omega-3 vetzuren. Een hoog omega-6 tot omega-3-vetzuren is geassocieerd met een verhoogd risico van cardiovasculaire en ontstekingsziekten zijn echter de precieze gunstige en ongunstige functies van specifieke vetzuren niet goed begrepen 2. De rondworm Caenorhabditis elegans is nuttig bij het ​​bestuderen van vetzuren functie omdat synthetiseert alle enzymen die nodig zijn om een reeks van omega-6 en omega-3 vetzuren, waaronder een omega-3 desaturase, een activiteit die afwezig is in de meeste dieren 3,4 produceren. Mutanten die vetzuurdesaturase-enzymen niet specifieke PUFA&#39;s te produceren, wat leidt tot verschillende ontwikkelings-en neurologische gebreken 4-6. De fysiologische effecten van dieet vetzuren bestuderen, hebben we een biochemische assay geschikt genetische analyse ontwikkeld met zowel mutant en RNAi knock-down technieken C. elegans. Suppletie met specifieke PUFA wordt bereikt door een vetzuur natriumzout oplossing van het agarmedium voegen voor het gieten. Hierdoor PUFA opname door de E. coli voedselbron, waar het zich ophoopt in de bacteriële membranen. C. elegans innemen de PUFA-bevattende bacteriën en dit dieetaanvulling voldoende is om de defecte reddents van PUFA-deficiënte mutanten. Suppletie meeste vetzuren geen nadelige effecten op wildtype dieren echter specifiek omega-6-vetzuren, met name dihomo-gammalinoleenzuur (DGLA, 20:03 n-6) veroorzaken een permanente vernietiging van C. elegans kiemcellen 7,8. Gaschromatografie wordt gebruikt om de introductie van de aangevulde vetzuur in de bacteriële voedselbron (hetzij OP50 of HT115) en in de nematoden controleren. De toevoeging van het detergens Tergitol (NP-40) in het medium zorgt voor een gelijkmatige verdeling van vetzuren door de gehele plaat en efficiëntere opname van vetzuren door de E. coli en nematoden. We hebben gevonden dat onverzadigde vetzuren gemakkelijk ingang vinden door bacteriën en C. elegans, maar de opname van verzadigde vetzuren is veel minder efficiënt. Dit artikel beschrijft stap voor stap hoe u de agar media vullen met vetzuren, evenals hoe om vetzuur opname in th controlerene nematode met behulp van gaschromatografie.

<table><tbody><tr><td>Bacto-Agar</td><td>Difco</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>Tryptone</td><td>Difco</td><td>211705</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>J.T. Baker</td><td>3624-05</td><td></td></tr><tr><td>Tergitol</td><td>Sigma</td><td>NP40S-500mL</td><td></td></tr><tr><td>Cholesterol</td><td>Sigma</td><td>C8667-25G</td><td>(5 mg/mL in ethanol)</td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>J.T. Baker</td><td>2504-01</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>J.T. Baker</td><td>1311-01</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>J.T. Baker</td><td>3254-05</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>J.T. Baker</td><td>3246-05</td><td></td></tr><tr><td>Sodium dihomogamma linolenate</td><td>NuCHEK</td><td>S-1143</td><td></td></tr><tr><td>Warm steriel Millipore water</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sterile water voor het verzamelen van wormen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nuclease-vrij water voor DGLA voorraadoplossing</td><td>Ambion</td><td>AM9932</td><td></td></tr><tr><td>Ampicilline</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1760-25</td><td>100 mg/ml in water (voor RNAi platen)</td></tr><tr><td>Isopropyl-bèta-D-thiogalactopyranosid (IPTG)</td><td>Gold Biotechnology</td><td>12481C100</td><td>1 M in water (voor RNAi platen)</td></tr><tr><td>HSO4</td><td>J.T. Baker</td><td>9681-03</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A452-4</td><td></td></tr><tr><td>Hexaan</td><td>Fisher Scientific</td><td>H302-4</td><td></td></tr><tr><td>diamindinofenylindole (DAPI)</td><td>Sigma</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>VectaShield</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>Glaskolf</td><td>Corning</td><td>4980-2L</td><td></td></tr><tr><td>Autoclaveerbare glazen flessen met roerstaafjes</td><td>Fisherbrand</td><td>FB-800</td><td></td></tr><tr><td>Autoclaveerbare glazen scheikundige cilinder</td><td>Fisherbrand</td><td>08-557</td><td></td></tr><tr><td>Roerplaat</td><td>VWR</td><td>97042-642</td><td></td></tr><tr><td>Waterbad op 55+ &deg;C</td><td>Precision Scientific Inc.</td><td>66551</td><td></td></tr><tr><td>Schroefdop bruine glazen flacon</td><td>Sun SRI</td><td>200 494</td><td></td></tr><tr><td>Argon gastank</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Geautomatiseerde pipettenhulp</td><td>Pipette-Aid</td><td>P-90297</td><td></td></tr><tr><td>Steriele serologische pipetten (25 ml)</td><td>Corning</td><td>4489</td><td></td></tr><tr><td>Bunsenbrander</td><td>VWR</td><td>89038-534</td><td></td></tr><tr><td>Dissectiemicroscoop</td><td>Leica</td><td>TLB3000</td><td></td></tr><tr><td>Gesilaniseerde glazen buis</td><td>Thermo Scientific</td><td>STT-13100-S</td><td>voor FAMEs derivatisatie</td></tr><tr><td>PTFE schroefdoppen</td><td>Kimble-Chase</td><td>1493015D</td><td></td></tr><tr><td>Klinische tafelcentrifuge</td><td>IEC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GC Crimp-vial</td><td>SUN SRi</td><td>200 000</td><td></td></tr><tr><td>GC-vial insert</td><td>SUN SRi</td><td>200 232</td><td></td></tr><tr><td>GC-vial dop</td><td>SUN SRi</td><td>200 100</td><td></td></tr><tr><td>Gaschromatograaf</td><td>Agilent</td><td>7890A</td><td></td></tr><tr><td>Massaspectrometrie detector</td><td>Agilent</td><td>5975C</td><td></td></tr><tr><td>Kolom voor gaschromatografie</td><td>Suppelco</td><td>SP 2380</td><td>30 m x 0.25 mm fused silica capillaire kolom</td></tr></tbody></table>

aanvulling van de voeding van meervoudig onverzadigde vetzuren in<em&gt; caenorhabditis elegans</em

Dietary Supplementation of Polyunsaturated Fatty Acids in Caenorhabditis elegans

Vetzuren zijn essentieel in vele celfuncties. Ze dienen als energieopslagtechnologieën moleculen vormen de hydrofobe kern van membranen, en deelnemen aan verschillende signaalwegen. Caenorhabditis elegans synthetiseert alle enzymen die nodig zijn om een reeks van omega-6 en omega-3 vetzuren te produceren. In combinatie met de eenvoudige anatomie en het bereik van beschikbare genetische hulpmiddelen, het een aantrekkelijk model vetzuur functie te bestuderen. Om de genetische wegen die de fysiologische effecten van dieet vetzuren mediëren onderzoeken, hebben wij een methode om de C. aanvulling ontwikkelde elegans dieet met onverzadigde vetzuren. Suppletie is een effectief middel om de vetzuursamenstelling van wormen veranderen en kan ook worden gebruikt om defecten in vetzuur-deficiënte mutanten redden. Onze methode maakt gebruik van nematoden groeimedium agar (NGM), aangevuld met vette acidsodium zouten. De vetzuren in de aangevulde platen worden incorporated in de membranen van de bacteriële voedselbron, dat vervolgens wordt opgenomen door de C. elegans die zich voeden met het aangevulde bacteriën. We gaschromatografie protocol beschrijft ook de veranderingen in vetzuursamenstelling die liggen in aangevuld wormen volgen. Dit is een efficiënte manier om de voeding van zowel grote als kleine populaties C. vullen elegans, waardoor voor een aantal toepassingen voor deze methode.

Suppletie van de C. elegans dieet beperkt door het vermogen van de bacteriële voedselbron voor opname en nemen vetzuur in het bacteriële membraan. Om het vermogen van E. bepalen coli OP50 verschillende vetzuren assimileren in de membranen, OP50 werd uitgeplaat op medium zonder supplement, 0,1 mM en 0,3 mM concentraties stearinezuur (18:00), natriumoleaat (18:01 n-9) en natrium DGLA (20 : 3n-6). Platen werden gedroogd bij kamertemperatuur gedurende 2 dagen in het donker, en geïncubeerd bij 20 °...

&lt;em&gt; Caenorhabditis elegan &lt;/ em&gt; is een bruikbaar model om de functies van meervoudig onverzadigde vetzuren verkennen in ontwikkeling en fysiologie. Dit protocol beschrijft een efficiënte methode van aanvulling van het &lt;em&gt; C. elegans &lt;/ em&gt; dieet van meervoudig onverzadigde vetzuren.

Aanvulling van de voeding van meervoudig onverzadigde vetzuren in<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Fatty acids are essential for numerous cellular functions. They serve as efficient energy storage molecules, make up the hydrophobic core of membranes, ...

Het algemene doel van het volgende experiment is om voedingsmiddelen te gebruiken om de vetzuursamenstelling van zee-elegantie te veranderen om vetzuurfunctie en -regulatie te bestuderen. Dit wordt bereikt door de voedselbron van de nematode in aanwezigheid van onverzadigde vetzuren te kweken. Vervolgens worden zee-elegantie gevoed met de aangevulde bacteriën, waardoor de opname van het vetzuur en de incorporatie ervan in de worm mogelijk wordt.Lipiden veranderen vervolgens in zee-elegantie. Vetzuursamenstelling wordt bevestigd door gaschromatografie massaspectrometrie analyse. Ten slotte worden de wormen, na het voeren van onverzadigde vetzuren, beoordeeld op steriliteit.Er worden resultaten verkregen die de fysiologische effecten van veranderde vetzuursamenstelling laten zien door middel van ontwikkelingsgedrag en veranderingen in genexpressie. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van de ontwikkeling en fysiologie van zee-elegantie, omdat we zowel genetische manipulatie als voedingsbijdragen kunnen gebruiken om de vetzuursamenstelling te veranderen en de gevolgen te monitoren. Over het algemeen moeten individuen die nieuw zijn bij deze methode voorzichtig en voorzichtig zijn omdat het moeilijk is om consistente resultaten te verkrijgen vanwege de gevoeligheid van onverzadigde vetzuren voor zuurstof en hoge temperaturen.Om één liter vetzuuraangevuld medium voor te bereiden, meet u de volgende componenten af in een kolf. Voeg millipore-water tot 800 milliliter toe en autoclaveer het medium samen met een lege glazen fles voor elke te testen vetzuurconcentratie, evenals geschikte gemeten cilinders terwijl het medium afkoelt bij 55 graden Celsius. Bereid de werkoplossing van het vetzuurnatriumzout voor door voorzichtig de glazen flacon te breken om geen glazen deeltjes in het poeder te krijgen en weeg voldoende af om een 100 millimolair stofoplossing te maken en voeg de benodigde hoeveelheid gezuiverd water toe.Gebruik vervolgens argon of stikstofgas om de oplossing te purgen om vetzuuroxidatie te voorkomen. Bedek vervolgens de flacon en bewaar de flacon in het donker terwijl het vetzuur, natriumzout zich oplost. Wanneer de agri is afgekoeld tot 55 graden Celsius, wordt de oplossing vervolgens in de buurt van een vlam overgebracht naar een steriele gemeten cilinder.Voordat u sterieel water tot één liter toevoegt, brengt u het medium terug naar de kolf en blijft u mixen. Gebruik een steriele gemeten cilinder om een ​​aliquot medium over te brengen naar een geautoclaveerde fles voor elke vetzuurconcentratie die moet worden getest. Houd vervolgens de flessen warm op een roerplaat.Roer de juiste concentratie vetzuurstofoplossing voordat u een steriele 25 milliliter pipet gebruikt om de platen te gieten nadat de platen zijn gestold, dek af en bewaar het op kamertemperatuur in een goed gecontroleerde ruimte in het donker. Gebruik twee dagen later e coli OP 50 om de platen te zaaien, bewaar vervolgens de platen in een donkere omgeving op kamertemperatuur terwijl de bacteriële laag droogt. Bereid een gesynchroniseerde populatie van L een larven voor door Ravi Hermafrodieten te behandelen met alkalische hypochlorietoplossing.Schud de GR hermafrodieten voorzichtig in deze oplossing totdat de volwassen wormen zich oplossen. Centrifugeer vervolgens met lage snelheid om de eieren te pelletten. Gebruik M negen buffer om de eieren drie keer te wassen.Schors ze vervolgens in een 15 milliliter buis opnieuw op in vijf milliliter M negen buffer en schud ze een nacht lang. Voeg de L een larven toe aan OP 50 gezaaide platen die zijn aangevuld met 0,3 millimolair di homo gammalin zuur of DGLA en incubeer ze gedurende drie dagen of tot de larven de volwassen fase bereiken. Gebruik een dissectiescoop om volwassen wormen op steriliteit te scoren.Succesvolle kiemverliezen zullen verschijnen als een heldere baarmoeder zonder eieren. Beoordeel wormen alternatief door ze in een druppel M negen buffer op een horlogeglas te kiezen. Gebruik vervolgens één milliliter van 0,2 nanogram per milliliter dappy-oplossing om het horlogeglas te overspoelen en ongeveer vijf minuten te incuberen.Na de incubatie, kies de wormen in een druppel montagemedium op een dia voordat u deze bedekt met een dekglas, verzegel het dekglas en bewaar het bij vier graden Celsius in het donker overnacht of bekijk het onmiddellijk onder een fluorescerende microscoop om vetzuurmethylesters of fames te produceren. Om de opname van vetzuren te kwantificeren, verzamel 500 tot 1000 volwassen wormen door water te gebruiken om ze van de platen te wassen en ze over te brengen naar gesiliconiseerd. 13 bij 100 millimeter glazen schroefdopbuizen.Laat de wormen door zwaartekracht bezinken en gebruik vervolgens een glazen pastpijp om zoveel mogelijk water te verwijderen. Voeg een milliliter van 2,5% zwavelzuur in methanol toe en verwarm de buizen in een waterbad op 70 graden Celsius gedurende één uur. Na één minuut afkoelen onder de kap, extraheer de frames door 1,5 milliliter water en 0,25 milliliter hexaan toe te voegen. Doe de buizen weer dicht en schud krachtig.Centrifugeer vervolgens de buizen in een tafelklinische centrifuge gedurende één minuut om de hexaan van het waterige oplosmiddel te scheiden. Breng de bovenste hexaanlaag over naar een gaschromatografie of GC vial insert in een GC vial. Om te analyseren door gc, injecteer één tot twee microliters fames op een polaire capillaire gaschromatografie kolom die geschikt is voor fame-analyse.Stel de injector in op 250 graden Celsius met een stroomsnelheid van 1,4 milliliter per minuut. Programmeer de oven voor een begintemperatuur van 130 graden Celsius gedurende één minuut. Verhoog vervolgens de temperatuur met 10 graden Celsius per minuut tot het 190 graden Celsius bereikt, en verhoog het vervolgens weer met vijf graden Celsius per minuut tot 210 graden Celsius, en houd het vervolgens nog een minuut vast om ervoor te zorgen dat opname van DGLA is gebeurd.Analyseer frames door vlamionisatiedetectie of massaspectrometrie of MS-detectie met behulp van

dietary-supplementation-polyunsaturated-fatty-acids-caenorhabditis

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Hier presenteren wij een protocol voor het uitvoeren van solide plaat op basis van dieetbeperking...

Solid Plate-based dieetbeperking in Caenorhabditis elegans</em

We stellen robuuste biochemische en microscopische methoden voor het...

Biochemische en High Throughput microscopische beoordeling van Fat Mass in<em&gt; Caenorhabditis Elegans</em

In dit artikel beschrijven we een geoptimaliseerd voor de extractie en analyse van prostaglandines en andere eicosanoïden...

Prostaglandine-extractie en analyse in<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Hier presenteren we een Caenorhabditis elegans -specifieke test die is ontworpen om veranderingen in het koperen aversiegedrag te evalueren en het vermogen om een ​​gemeenschappelijke voedingsbron te lokaliseren, als het organisme zich voortbrengt van een goed gevoed aan hongerige voedingswaarde.

EEN<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Voedingsstatus gebaseerde Koper Aversion Assay

Nile rode kleuring van vaste Caenorhabditis elegans is een methode voor kwantitatieve meting van neutrale lipide deposito's, terwijl kwalitatieve beoordeling van lipide verdeling over weefsels olie rood O kleuring vergemakkelijkt.

Kwantificering van lipide overvloed en evaluatie van de distributie van het lipide in Caenorhabditis elegans door Nile rood en olie Red O kleuring

Hier presenteren we een protocol voor de isolatie van RNA, DNA en eiwit uit hetzelfde monster, in een poging om de variatie te reduceren, reproduceerbaarheid te verbeteren en vergemakkelijken van interpretaties.

Gecombineerde Nucleotide en eiwit extracties in Caenorhabditis elegans

Proteostatische achteruitgang is een kenmerk van veroudering en vergemakkelijkt het begin van neurodegeneratieve ziekten. We schetsen een protocol om proteostase kwantificeerbaar te meten in twee verschillende Caenorhabditis elegans-weefsels door heterologe expressie van polyglutamine-herhalingen gefuseerd met een fluorescerende verslaggever. Dit model maakt een snelle in vivo genetische analyse van proteostase mogelijk.

Kwantificering van weefselspecifieke proteostatische achteruitgang van Caenorhabditis elegans

Om Caenorhabditis elegans (C. elegans) te gebruiken in omics-onderzoek, is een methode nodig om grote populaties wormen te genereren waar een enkel monster kan worden gemeten op verschillende platforms voor vergelijkende analyses. Hier wordt een methode gepresenteerd om C. eleganspopulaties op grootschalige cultuurplaten (LSCPs) te culteren en de bevolkingsgroei te documenteren.

Cultuur en assay van grootschalige gemengde caenorhabditis elegans populaties

Gestimuleerde Raman scattering (SRS) microscopie maakt selectieve, labelvrije beeldvorming van specifieke chemische moieties mogelijk en het is effectief gebruikt om lipidemoleculen in vivo in beeld te brengen. Hier geven we een korte inleiding tot het principe van SRS-microscopie en beschrijven we methoden voor het gebruik ervan bij de opslag van beeldvormende lipiden in Caenorhabditis elegans.

Labelvrije beeldvorming van lipideopslagdynamiek bij Caenorhabditis elegans met behulp van gestimuleerde Raman-verstrooiingscopie

Het huidige protocol beschrijft lipidensuppletiemethoden in vloeibare en on-plate culturen voor Caenorhabditis elegans, in combinatie met longitudinale studies en gentranscriptionele analyse van bulk of een paar wormen en wormweefsels.

Lipidensuppletie voor een lange levensduur en gentranscriptionele analyse bij Caenorhabditis elegans

Dit protocol beschrijft een test om de voedingssnelheid van Caenorhabditis elegans te kwantificeren op basis van het meten van de klaring van bacteriën in vloeibare cultuur.

Kwantificering van de voedselinname bij Caenorhabditis elegans door de bacteriële klaring te meten

Leer hoe je meervoudig onverzadigde vetzuren aanvult in Caenorhabditis elegans via dieetmanipulatie. Deze methode gebruikt gaschromatografie-massaspectrometrie om lipidsamenstelling te analyseren en sterility te scoren.

Aanvulling van de voeding van meervoudig onverzadigde vetzuren in

Meer video's verkennen