Name: Groeiende neurale stamcellen uit Conventionele en Niet-conventionele Regios van de Adult knaagdierhersenen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-18T20:45:00.000+00:00
Duration: 11 min 27 s
Description: Leer neurale stamcellen kweken uit verschillende gebieden van de volwassen knaagdierhersenen. Deze methode helpt onderzoekers om endogene stamcellen te lokaliseren en hun zelfvernieuwingspotentieel te valideren.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit werk werd gefinancierd (gedeeltelijk) door de Helmholtz Alliance ICEMED - Imaging en Genezen Milieu Metabole Ziekten, via het Initiatief en Netwerk Fonds van de Helmholtz Association, een subsidie ​​van de Else Kroener-Fresenius Foundation, en een subsidie ​​van de Deutsche Forschungsgemeinschaft ( SFB 655: cellen in de weefsels).

Het werk houdt zich aan de Verklaring van Helsinski en de ARVO Animal Statement. De dieren werden gebruikt voor weefselverzameltoestel en alle relevante werkwijzen werden gevolgd volgens de instructies van de dierfaciliteit bij de Universiteit van Dresden. De dieren werden behandeld en gehuisvest in overeenstemming met de Duitse richtlijnen voor het gebruik en de verzorging van proefdieren, en de studie werd goedgekeurd door de Landesdirektion Dresden. Neem contact op met het veterinaire beleid van uw instelling (IACUC of ander board) met betrekking tot geschikte euthanasie methodologie. Specifieke voorraad en concentraties van de reagentia kan worden gevonden in het reagens de tabellen bij dit protocol. 1. Cultuur gerecht Voorbereidingstijd <ol><li> Coat gerechten met een voldoende volume van 75 ug / ml poly-L-ornithine (dwz 2 ml / putje van een 6-wells plaat) &#39;s nachts in de celkweek incubator 2 dagen voor de geplande datum dissectie. </li><li&gt; Zuig het poly-L-ornithine de volgende dag en was elk putje 2 x met 3 ml PBS gedurende 5 minuten. </li><li> Verwijder de laatste wasbeurt, voeg dan fibronectine (verdund 1:250, 4 ug / ml in PBS) aan de plaat en plaats de gerechten in de incubator &#39;s nachts. </li><li> Zuig het fibronectine op de dag van dissectie en de afwas 2x met PBS. Keer de platen nog steeds met de laatste PBS wassen om de couveuse totdat de gedissocieerde weefsel is klaar voor het kweken. Op dat moment, verwijder de PBS voorafgaand aan het weefsel plating. </li><li> WINKEL platen bekleed met poly-L-ornithinein incubator voor maximaal 3 weken. Platen gecoat met fibronectine kan worden bewaard tot 1 week. Fibronectine coating kan in slechts 2 uur worden gedaan als dringend. Fibronectine is gevoelig voor denaturatie, hoeft de oplossing niet schudden of laten vaat drogen. </li></ol> 2. Dissectie / Plating <ol><li> Dit protocol geldt voor het gebruik van 3 volwassen ratten (3-6 maanden). </li><li> Chill de hersenen snijden blok op ijs voorafgaand aan euthanasie de rat. </li><li> Plaats een 15 ml Falcon buis die 5 ml N2 medium met toegevoegde bFGF op ijs bevat. </li><li> Euthanaseren de ratten volgens het veterinaire beleid van uw instelling. </li><li> Verwijder de hersenen uit de schedel door het maken van een incisie langs de middellijn van het hoofd. Gebruik een tang om afpellen het bot waardoor de hersenen zorgvuldig worden geëxtraheerd. </li><li> Plaats de hersenen in een 10 cm petrischaal met ijskoude PBS. Dit zal eventueel resterende haren en bloed te verwijderen. (Figuur 1A) </li><li> Plaats de hersenen in de gekoelde snijden blok. (Figuur 1B) </li><li> Steek een nieuwe schone scheermesje in het blok zoals afgebeeld in figuur 1C. </li><li> Plaats een tweede schoon scheermesje 3 mm caudaal van de eerste zie figuur 1D. </li><li> Til de messen uit het blok, met medeneming van de sectie van belang. </li><li> Float de secTION uit het blad door onderdompeling in PBS. (Figuur 1E) </li><li> Oogst weefsel van het gebied van belang (in dit voorbeeld gebruikten we de commissura anterior (voorste) ACA, Figuur 1F) met # 5 pincet en verzamelen in een 15 ml conische buis met 1 ml N2 medium met bFGF. </li><li> Zet de buis in een laminaire stroming celkweek kap, waarmee de rest van het protocol onder steriele omstandigheden. </li><li> Mechanisch distantiëren het weefsel met behulp van een 1 ml pipet tip bevestigd aan een P1000 pipet. Pipet op en neer meerdere malen (ongeveer 20x met een snelheid van pipetteren 1 cyclus per seconde) terwijl u de opening van de pipetpunt tegen de onderzijde van de conische buis (fig. 1G 1-3). Stop wrijven wanneer de oplossing homogeen. </li><li> Laat de oplossing te zitten voor 2 minuten zodat de nog grotere nondissociated weefsel om naar de bodem. (Figuur 1G 4) </li><li> Verzamel de homogenexportgerichte bedrijven supernatant en te plaatsen in een conische buis met 8,5 ml N2 media plus 20 ng / ml bFGF, 500 ng / ml Dll4, 500 ng / ml Ang2, en 200 nMJAK Inhibitor. </li><li> Plaat ze in 3 putjes van een 6-wells plaat met behulp van 3 ml verdund cel oplossing / goed. </li><li> Plaats de plaat in een bevochtigde cel incubator bij 37 ° C, 5% CO2, 5% O2. </li></ol> 3. Daily Care <ol><li> Vervang het medium op de cultuur gerechten met N2 medium dat bFGF, Ang2, Dll4 en JAK remmer 24 uur na plating. </li><li> Voeg een bolus van bFGF, Dll4, Ang2 en JAK-remmer op de volgende dag. </li><li> Herhaal dit afwisselend proces van media veranderingen en toevoegingen factor voor een totaal van 10-14 dagen. </li></ol> 4. Inductie van differentiatie <ol><li> Trekken bFGF, Dll4, Ang2 en JAK remmer bevattend medium en te vervangen door N2 medium dat eventuele extra factoren bevat. </li><li> Verander elke tweede dag het medium. </li><li> Fixeer de cellen na 10 dagen en immunocytochemie voeren. </li></ol> 5. Immunocytochemische Detectie <ol><li> Zuig het medium en bevestig celkweek platen met 2 ml van 4% paraformaldehyde gedurende 20 minuten. </li><li> Wassen met 2x 3 ml PBS gedurende 5 minuten elk. </li><li> Zuig PBS, vervolgens doorlaatbaar en blokkeren de cellen door toevoeging van 2 ml PBS met 5% normaal serum ezel (NDS) en 0,1% Triton X-100 gedurende 20 minuten. </li><li> Bereid het primaire antilichaam mix PBS met 5% NDS. Anti-nestine antilichaam kan worden gebruikt voor het identificeren SC, terwijl TUJ1 (klasse III β-tubuline), GFAP en CNPase antilichamen kunnen samen gebruikt worden voor een drievoudige kleuring van differentiatie merkers. </li><li> Zuig het blockingbuffer en voeg 1,5 ml van het primaire antilichaam mengsel aan elk putje. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 90 minuten. </li><li> Verwijder de primaire antilichamen en was 2x met 3 ml PBS en 1x met 3 ml PBS met 5% NDS gedurende 5 minuten elk. </li><li> Prepare de secundaire antilichamen in PBS met 5% NDS. </li><li> Zuig het laatste wassing en voeg 1,5 ml secundair antilichaam oplossing in elk putje. Incubeer in het donker gedurende 40 minuten bij kamertemperatuur geroerd. </li><li> Verwijder het secundaire antilichaam oplossing en 2 ml van een vers bereide DAPI kleuring (500 ng / ml in PBS). Incubeer gedurende 3 minuten. </li><li> Zuig het DAPI oplossing was daarna 3x met 3 ml PBS gedurende 5 minuten elk. De cellen kunnen nu worden gevisualiseerd met een fluorescentiemicroscoop. </li></ol>

<ol><li>Cajal, R. Y. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCajal%2C+RY+%22Comparative+Study+of+Sensory+Areas+of+the+Human+Cortex%22">Comparative Study of Sensory Areas of the Human Cortex</a>. , Harvard University. (1899).</li>
<li>Altman, J., Das, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoradiographic+and+histological+evidence+of+postnatal+hippocampal+neurogenesis+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Autoradiographic and histological evidence of postnatal hippocampal neurogenesis in rats.</a> J. Comp. Neurol. 124, 319-335 (1965).</li>
<li>Kaplan, M. S., Hinds, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurogenesis+in+the+adult+rat%3A+electron+microscopic+analysis+of+light+radioautographs%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Neurogenesis in the adult rat: electron microscopic analysis of light radioautographs.</a> Science. 197, 1092-1094 (1977).</li>
<li>Nottebohm, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+replacement+in+adulthood%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+N.Y.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Neuronal replacement in adulthood.</a> Ann. N.Y. Acad. Sci. 457, 143-161 (1985).</li>
<li>Gould, E., Reeves, A. J., Graziano, M. S., Gross, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurogenesis+in+the+neocortex+of+adult+primates%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Neurogenesis in the neocortex of adult primates.</a> Science. 286, 548-552 (1999).</li>
<li>Kornack, D. R., Rakic, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Continuation+of+neurogenesis+in+the+hippocampus+of+the+adult+macaque+monkey%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Continuation of neurogenesis in the hippocampus of the adult macaque monkey.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 5768-5773 (1999).</li>
<li>Alvarez-Buylla, A., Kohwi, M., Nguyen, T. M., Merkle, F. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+heterogeneity+of+adult+neural+stem+cells+and+the+emerging+complexity+of+their+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb.+Symp.+Quant.+Biol%22%5BJournal%5D)">The heterogeneity of adult neural stem cells and the emerging complexity of their niche.</a> Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 73, 357-365 (2008).</li>
<li>Reynolds, B. A., Weiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+neurons+and+astrocytes+from+isolated+cells+of+the+adult+mammalian+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system.</a> Science. 255, 1707-1710 (1992).</li>
<li>Luskin, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Restricted+proliferation+and+migration+of+postnatally+generated+neurons+derived+from+the+forebrain+subventricular+zone%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Restricted proliferation and migration of postnatally generated neurons derived from the forebrain subventricular zone.</a> Neuron. 11, 173-189 (1993).</li>
<li>Lendahl, U., Zimmerman, L. B., McKay, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CNS+stem+cells+express+a+new+class+of+intermediate+filament+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">CNS stem cells express a new class of intermediate filament protein.</a> Cell. 60, 585-595 (1990).</li>
<li>Androutsellis-Theotokis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+neural+precursors+in+the+adult+brain+rescues+injured+dopamine+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Targeting neural precursors in the adult brain rescues injured dopamine neurons.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 13570-13575 (2009).</li>
<li>Jin, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurogenesis+in+dentate+subgranular+zone+and+rostral+subventricular+zone+after+focal+cerebral+ischemia+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Neurogenesis in dentate subgranular zone and rostral subventricular zone after focal cerebral ischemia in the rat.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 4710-4715 (2001).</li>
<li>Zhang, R. L., Zhang, Z. G., Chopp, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ischemic+stroke+and+neurogenesis+in+the+subventricular+zone%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropharmacology%22%5BJournal%5D)">Ischemic stroke and neurogenesis in the subventricular zone.</a> Neuropharmacology. 55, 345-352 (2008).</li>
<li>Caplan, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Why+are+MSCs+therapeutic%3F+New+data%3A+new+insight%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Why are MSCs therapeutic? New data: new insight.</a> J. Pathol. 217, 318-324 (2009).</li>
<li>Goldman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+and+progenitor+cell-based+therapy+of+the+human+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Stem and progenitor cell-based therapy of the human central nervous system.</a> Nat. Biotechnol. 23, 862-871 (2005).</li>
<li>Sun, N., Longaker, M. T., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+iPS+cell-based+therapy%3A+considerations+before+clinical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Human iPS cell-based therapy: considerations before clinical applications.</a> Cell Cycle. 9, 880-885 (2010).</li>
<li>Amariglio, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Donor-derived+brain+tumor+following+neural+stem+cell+transplantation+in+an+ataxia+telangiectasia+patient%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Med%22%5BJournal%5D)">Donor-derived brain tumor following neural stem cell transplantation in an ataxia telangiectasia patient.</a> PLoS Med. 6, e1000029(2009).</li>
<li>Lindvall, O., Bjorklund, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+therapeutics+in+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neurotherapeutics%22%5BJournal%5D)">Cell therapeutics in Parkinson's disease.</a> Neurotherapeutics. 8, 539-548 (2011).</li>
<li>Kittappa, R., Bornstein, S. R., Androutsellis-Theotokis, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Role+of+eNSCs+in+Neurodegenerative+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Mo.l+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">The Role of eNSCs in Neurodegenerative Disease.</a> Mo.l Neurobiol. , (2012).</li>
<li>Cattaneo, E., McKay, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+and+manipulating+neuronal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Identifying and manipulating neuronal stem cells.</a> Trends Neurosci. 14, 338-340 (1991).</li>
<li>Jensen, J. B., Parmar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strengths+and+limitations+of+the+neurosphere+culture+system%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Strengths and limitations of the neurosphere culture system.</a> Mol. Neurobiol. 34, 153-161 (2006).</li>
<li>Duarte, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dosage-sensitive+requirement+for+mouse+Dll4+in+artery+development%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Dosage-sensitive requirement for mouse Dll4 in artery development.</a> Genes Dev. 18, 2474-2478 (2004).</li>
<li>Maisonpierre, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiopoietin-2%2C+a+natural+antagonist+for+Tie2+that+disrupts+in+vivo+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Angiopoietin-2, a natural antagonist for Tie2 that disrupts in vivo angiogenesis.</a> Science. 277, 55-60 (1997).</li>
<li>Androutsellis-Theotokis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notch+signalling+regulates+stem+cell+numbers+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Notch signalling regulates stem cell numbers in vitro and in vivo.</a> Nature. 442, 823-826 (2006).</li>
<li>Alderson, R. F., Alterman, A. L., Barde, Y. A., Lindsay, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain-derived+neurotrophic+factor+increases+survival+and+differentiated+functions+of+rat+septal+cholinergic+neurons+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Brain-derived neurotrophic factor increases survival and differentiated functions of rat septal cholinergic neurons in culture.</a> Neuron. 5, 297-306 (1990).</li>
<li>Johe, K. K., Hazel, T. G., Muller, T., Dugich-Djordjevic, M. M., McKay, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+factors+direct+the+differentiation+of+stem+cells+from+the+fetal+and+adult+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Single factors direct the differentiation of stem cells from the fetal and adult central nervous system.</a> Genes Dev. 10, 3129-3140 (1996).</li>
<li>Ourednik, J., Ourednik, V., Lynch, W. P., Schachner, M., Snyder, E. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+stem+cells+display+an+inherent+mechanism+for+rescuing+dysfunctional+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Neural stem cells display an inherent mechanism for rescuing dysfunctional neurons.</a> Nat. Biotechnol. 20, 1103-1110 (2002).</li>
<li>Ryu, J. K., Cho, T., Wang, Y. T., McLarnon, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+progenitor+cells+attenuate+inflammatory+reactivity+and+neuronal+loss+in+an+animal+model+of+inflamed+AD+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Neural progenitor cells attenuate inflammatory reactivity and neuronal loss in an animal model of inflamed AD brain.</a> J. Neuroinflammation. 6, 39(2009).</li>
<li>Androutsellis-Theotokis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiogenic+factors+stimulate+growth+of+adult+neural+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Angiogenic factors stimulate growth of adult neural stem cells.</a> PLoS One. 5, e9414(2010).</li>
<li>Park, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hes3+regulates+cell+number+in+cultures+from+glioblastoma+multiforme+with+stem+cell+characteristics%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">Hes3 regulates cell number in cultures from glioblastoma multiforme with stem cell characteristics.</a> Sci. Rep. 3, 1095-1010 (2013).</li>
<li>Poser, S. W., et al. Ch. 5. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPoser%2C+SW+%22Cancer+Stem+Cells+-+The+Cutting%22">Cancer Stem Cells - The Cutting</a>. Shostak, S. , InTech. Europe, Rijeka, Croatia. 89-110 (2011).</li>
<li>Androutsellis-Theotokis, A., Rueger, M. A., Mkhikian, H., Korb, E., McKay, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signaling+pathways+controlling+neural+stem+cells+slow+progressive+brain+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb.+Symp.+Quant.+Biol%22%5BJournal%5D)">Signaling pathways controlling neural stem cells slow progressive brain disease.</a> Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 73, 403-410 (2008).</li>
</ol>

We hebben niets te onthullen.

Veel van de kritische stappen succesvolle isolatie, expansie en differentiatie van neurale stamcellen uit volwassen hersenen worden gedeeld gemeen met standaard weefselkweektechnieken. De doelstelling om in gedachten te houden is dat NSCs geïsoleerd van de volwassen hersenen als veel van hun in vivo eigenschappen mogelijk (Figuur 2J) moet blijven. Vaak een evenwicht tussen noodzakelijke voorzichtigheid en gepaste snelheid moet worden gevonden. Zorg met de isolatie van de hersenen uit de schedel...

Het centrale dogma van neurobiologie, door de fundamentele opmerkingen van de hersenen cytoarchitecture gemaakt door Ramón Y. Cajal meer dan een eeuw geleden gelegd, geoordeeld dat neurogenese onwaarschijnlijk was na de adolescentie gezien de complexiteit van de neurale netwerken in het CZS 1. Hoewel de werkzaamheden van Altman in de jaren 1960 en later Kaplan, waaruit blijkt dat 3H-thymidine kunnen worden gevonden in volwassen neuronen aangeeft dat daadwerkelijk neuronen werden geproduceerd in verschillende gebieden van de volwassen hersenen, het dogma bleef houden 2, 3. Bewijs bleef te monteren met Nottebohm onderzoek beschrijft de seizoensgebonden veranderingen in het aantal neuronen aanwezig in zangvogel hersenen 4. Het was niet tot 1999, toen Gould et al.. Gepubliceerde werk op de generatie van neuronen in de hippocampus neemt toe met de prestaties van associatieve leertaken in rat, evenals de opmerkingen van Kornack en Rakic ​​demonstratieting verder neurogenese in de volwassen makaak dat het begrip minder stijve, meer kunststof hersenen, werd erkend 5, 6. De zoektocht naar de cellulaire bron voor deze novo gegenereerde neuronen leiden tot de ontdekking van een discrete populatie van stamcellen (SC) dat in gebieden van de hersenen verblijven genoemd niches 7. Subventriculaire zone sub korrelige gebied van de hippocampus worden beschouwd als de twee belangrijkste neurogene regio 8,9 zijn. Cellen geïsoleerd uit deze locaties toont de klassieke kenmerken van embryonale of foetale afgeleide SC, zelfvernieuwing en differentiatie potentieel. Bij neurale stamcellen (NSC&#39;s), kunnen ze worden gedifferentieerd tot neuronen, astrocyten en oligodendrocyten. Bovendien, deze SC vlek positief voor foetale NSC merkers zoals het intermediaire filament eiwit nestine 10. Meer recent werk benadrukt dat SC&#39;s niet kan worden beperkt tot deze two gebieden, en in feite gelokaliseerd door de hersenen als een grotendeels rustende populatie cellen stevig verbonden aan het vaatstelsel 11. De opmerkingen die SCS gemobiliseerd in reactie op letsel suggereert de mogelijkheid van het kunnen deze cellen te gebruiken voor regeneratieve doeleinden om te helpen bij het ​​herstel van neurodegeneratieve ziekte en beroerte 12, 13. Dit is niet anders dan de rol die mesenchymale stamcellen (MSC&#39;s) spelen bij de genezing van bindweefsel, die worden aangetroffen als perivasculaire cellen die het potentieel om osteoblasten, chondrocyten en vetcellen 14 geworden. Echter, NSCs niet op dezelfde wijze als MSCs geoogst uit beenmerg door routine aspiratie en dichtheidsgradiënt centrifugatie technieken en vervolgens gebruikt in autologe cellen gebaseerde therapieën. Bijgevolg andere bronnen van cellen, zoals het gebruik van foetale NSCs of neuronale precursors afgeleid van embryonic stamcellen zijn uitgebreid onderzocht in dierlijke ziekten en letsel modellen met wisselend succes 15. Geïnduceerde pluripotente stamcel technologieën gebruik te maken van somatische cellen bronnen bieden een andere potentiële weg voor de productie van therapeutisch bruikbare cel-gebaseerde therapieën voor een breed scala van toepassingen, het overwinnen van de beperkte beschikbaarheid en ethische bezorgdheid over het gebruik van embryonale cellen en foetale weefsels 16. Klinische vertaling van deze bevindingen blijkt een moeilijke taak, zoals gedemonstreerd in de strijd van de behandeling van verschillende neurologische aandoeningen met SC-gebaseerde therapeutische benaderingen 17,18, evenals een kronkelige baan regelgevende goedkeuring. Als alternatieve benadering kan invoering van specifieke farmacologische behandelingen NSC nummers moduleren en herstel van de ziekte van Parkinson en beroerte 19 vergemakkelijken. Ongeacht de strategie kan worden, begrijpen hoe ze effectief te manipuleren deze cellenvereist een toegankelijk in vitro systeem. Culturen van NSCs kan worden uitgevoerd als aggregaat culturen, ook bekend als neurosferen, of een monolaag 8,20. Beide technieken zijn op grote schaal gebruikt, waardoor de vestiging van bepaalde kweekomstandigheden, dwz gebruik van epidermale groeifactor (EGF) of basische fibroblast groeifactor (bFGF) als een mitogeen bron, die voorzien in de uitbreiding van multipotente voorlopers. Terwijl neurosfeerculturen beter geschikt voor het bestuderen van klonale vermeerdering vermogen van een geïsoleerde celtype zijn, is het systeem getoond om een gemengde populatie van cellen tijdens de expansie 21. Bovendien, de gesloten structuur neurosferen maakt farmacologische manipulatie van de cellen onpraktisch en de interpretatie van deze factoren invloed kunnen hebben kunnen verward worden door de in de neurosphere zich gevestigd micromilieu. Monolaagkweken, anderzijds, kanwerkzaam in high throughput-schermen van kleine molecule bibliotheken, die een krachtig hulpmiddel om de signaaltransductie mechanismen die SC groei en differentiatie regelen en opent de mogelijkheid om nieuwe verbindingen die specifiek deze cel bevolking ontdekken verkennen. Bijgevolg kan de mogelijkheid om reproduceerbaar genereren kweken van volwassen NSCs uit verschillende gebieden van belang in de hersenen worden gebruikt in een breed spectrum van wetenschappelijke toepassingen, variërend van ontwikkelingsstudies van het centrale zenuwstelsel (CZS) te onderzoeken van nieuwe regeneratieve geneeskunde benaderingen . De hier gepresenteerde protocol laat zien hoe te ontleden en de differentiatie potentieel van CNS SC&#39;s geïsoleerd van de volwassen knaagdierhersenen beoordelen.

<table><tbody><tr><td>6-well tissue culture dishes</td><td>BD Biosciences</td><td>353934</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-ornithine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-3655</td><td> 5 mg/ml stockoplossing bereid in tweemaal gedestilleerd water (stabiel gedurende meerdere maanden bij -20 &deg;C). Werkconcentratie 0,5 mg/ml in water (stabiel gedurende 1 maand bij 4 &deg;C). </td></tr><tr><td>Fibronectine</td><td>R&amp;D Systems</td><td>1030-Fn</td><td>Stockoplossing niet schudden</td></tr><tr><td>Filtratieapparaat</td><td>Corning Life Sciences</td><td>430769</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12</td><td>Mediatech</td><td>10-090-CV</td><td>Zie opmerking hieronder voor volledige N2-mediavoorbereiding</td></tr><tr><td>Apo-transferrine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T-2036</td><td></td></tr><tr><td>Insuline</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I-0516</td><td></td></tr><tr><td>Putrescine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-5780</td><td>1 M stockoplossing in ddH2O (stabiel bij 20 &deg;C gedurende 6 maanden)</td></tr><tr><td>Natriumseleniet</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S-5261</td><td>500 &micro;M stockoplossing in ddH2O (stabiel bij -20 &deg;C gedurende 6 maanden)</td></tr><tr><td>Progesteron</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-8783</td><td>100 &micro;M stockoplossing in ethanol (stabiel bij -20&deg;C gedurende 6 maanden)</td></tr><tr><td>Penicilline/Streptomycine</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Fosfaat gebufferde zoutoplossing</td><td>Mediatech</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Basic Fibroblast Growth Factor (bFGF)</td><td>R&amp;D Systems</td><td>233-FB</td><td>Werkconcentratie 20 ng/ml&nbsp;</td></tr><tr><td>Delta4 (Dll4)</td><td>R&amp;D Systems</td><td>1389-D4</td><td>Werkconcentratie&nbsp; 500 ng/ml</td></tr><tr><td>Angiopoetine 2 (Ang2)</td><td>R&amp;D Systems</td><td>623-AN</td><td>Werkconcentratie&nbsp; 500 ng/ml</td></tr><tr><td>JAK-remmer</td><td>Calbiochem</td><td>420099</td><td>Werkconcentratie 200 nM&nbsp;</td></tr><tr><td>Rundserumalbumine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-2058</td><td></td></tr><tr><td>15- en 50-ml Conische buizen</td><td>Corning Life Sciences</td><td>430053, 430829</td><td></td></tr><tr><td>Andere benodigde items omvatten: Algemene dissectie-instrumenten, inclusief scheermes en pincet, Volwassen rat (3-6 maanden oud; Sprague-Dawley of Long Evans), CO2 vergiftigingskamer, Laminaire stroomkap voor celkweek en incubator Incubator (bevochtigd, 37 &deg;C, 5% CO2, 5% O2). Opmerking: Voor volledige N2-mediavoorbereiding, voeg aan een fles DMEM/F-12 (500 ml) 0,05 g apotransferine toe, 0,0125 g insuline (vers opgelost in 1 ml van 10 mM NaOH), 50 &mu;l putrescine, 30 &mu;l natriumseleniet, 100 &mu;l progesteron-stocks en 5 ml penicilline/streptomycine-oplossing.&nbsp; Pas pH aan op 7,2, indien nodig. Filter-steriliseer en bewaar bij 4 &deg;C gedurende maximaal 3 weken en bescherm tegen licht.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Immunofluorescence Reagents Table</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15719</td><td></td></tr><tr><td>Normal Donkey Serum (NDS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D-9663</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T-8787</td><td></td></tr><tr><td>4,6-Diamidino-2-fenylindol (DAPI)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D-8417</td><td>5 mg/ml stockoplossing in methanol</td></tr><tr><td colspan="4">Primary Antibody Table</td></tr><tr><td>Nestin</td><td>Chemicon</td><td>MAB353</td><td> Verdunningsfactor: 1:400 Soort: Muis IgG1 </td></tr><tr><td>Hes3</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-25393</td><td> Verdunningsfactor: 1:100 Soort: Konijn IgG </td></tr><tr><td>Sox2</td><td>R&amp;D Systems</td><td>MAB2018</td><td> Verdunningsfactor: 1:100 Soort: Muis IgG2a </td></tr><tr><td>CNPase</td><td>Chemicon</td><td>MAB326</td><td> Verdunningsfactor: 1:200 Soort: Muis IgG1 </td></tr><tr><td>&beta;-tubuline III (TUJ1)</td><td>R&amp;D Systems</td><td>MAB1195</td><td> Verdunningsfactor: 1:500 Soort: Muis IgG2a </td></tr><tr><td>Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP)</td><td>Dako North America</td><td>Z0334</td><td> Verdunningsfactor 1:500 Soort: Konijn </td></tr><tr><td colspan="4">Secondary Antibody Table</td></tr><tr><td>Alexa&nbsp;&nbsp; 568</td><td>Invitrogen</td><td>A-21124</td><td> Verdunningsfactor: 1:200 Soort: Geit anti Muis IgG1 </td></tr><tr><td>Alexa 488</td><td>Invitrogen</td><td>A-21131</td><td> Verdunningsfactor: 1:200 Soort: Geit anti Muis IgG2a </td></tr><tr><td>Cy5</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>59883</td><td> Verdunningsfactor: 1:200 Soort: Geit anti Konijn </td></tr></tbody></table>

groeiende neurale stamcellen uit conventionele en niet-conventionele regio&#39;s van de adult knaagdierhersenen

Growing Neural Stem Cells from Conventional and Nonconventional Regions of the Adult Rodent Brain

Recent onderzoek toont aan dat het centrale zenuwstelsel (CNS) regeneratie en het ontstaan ​​van tumoren gaat populaties van stamcellen (SC) ingezetene in de volwassen hersenen. Echter, de mechanismen die normaal rustende cellen gebruiken om de goede werking van neurale netwerken, alsook hun rol in het herstel van de schade en de beperking van neurodegeneratieve processen te waarborgen zijn weinig begrepen. Deze cellen verblijven aangeduid als &quot;niches&quot; dat een onderhoudende milieu door modulerende signalen van zowel de vasculaire en immuun systemen regio. De isolatie, onderhoud, en differentiatie van CNS SCs onder gedefinieerde kweekomstandigheden die onbekende factoren uit te sluiten, maakt ze toegankelijk zijn voor behandeling met farmacologische of genetische middelen, en geven zicht op hun in vivo gedrag. Hier bieden we gedetailleerde informatie over de methoden voor het genereren van culturen van CNS SC&#39;s uit verschillende regio&#39;s van de volwassen hersenen en benaderingen om hun d beoordelenifferentiation potentieel tot neuronen, astrocyten en oligodendrocyten in vitro. Deze techniek levert een homogene celpopulatie een monolaag cultuur die kunnen worden gevisualiseerd individuele SC en hun nageslacht bestuderen. Bovendien kan het worden toegepast in verschillende diermodellen en klinische monsters, die eerder werden gebruikt voor regeneratieve reacties in de beschadigde volwassen zenuwstelsel voorspellen.

Het identificeren van de regio van belang om uit te neurale stamcellen te oogsten is de belangrijke eerste stap en zal de hoeveelheid tijd die het duurt om een ​​samenvloeiing plaat van cellen krijgen definiëren. Bijvoorbeeld, de SVZ is een klassiek neurogene stippellijn daarom een ​​hogere relatieve verhouding van neurale stamcellen. Echter, de hier gepresenteerde techniek worden gebruikt met andere regio&#39;s vaak niet erkend als robuust neurogene mogelijk tijdens de volwassenheid. Voor de toepassing van dit protocol...

Neurale stamcellen geoogst uit de volwassen hersenen worden steeds gebruikt in toepassingen, variërend van het fundamenteel onderzoek van de ontwikkeling van het zenuwstelsel aan het verkennen van potentiële klinische toepassingen in de regeneratieve geneeskunde. Dit maakt strenge controle op de isolatie en kweekomstandigheden gebruikt om deze cellen cruciaal voor experimentele resultaten goed groeien.

Groeiende neurale stamcellen uit Conventionele en Niet-conventionele Regio&#39;s van de Adult knaagdierhersenen

Recent work demonstrates that central nervous system (CNS) regeneration and tumorigenesis involves populations of stem cells (SCs) resident within the ...

Het algemene doel van het volgende experiment is om neurale stamcellenculturen te genereren uit verschillende delen van de volwassen knaagdierhersenen. Dit wordt bereikt door weefsel te verzamelen van een gebied van belang om de aanwezigheid en potentieel van neurale stamcellen te onderzoeken. Als tweede stap, verwerk het weefsel tot een cellensuspensie voor het plateren als een monolaagcultuur.Vervolgens gebruiken we gedefinieerde kweekcondities om de neurale stamcellen selectief te vermenigvuldigen, waarbij hun potentieel voor zelfvernieuwing wordt gevalideerd. In vitro resultaten laten zien dat de neurale stamcellen multipotent zijn op basis van hun differentiatiepotentieel en hoe verschillende factoren hun zelfvernieuwing en lot kunnen beïnvloeden. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in de neurowetenschappen en regeneratieve geneeskunde, zoals waar endogene neurostamcellen verblijven en hoe ze te manipuleren.We dachten eerst aan deze techniek toen we signalenreductiepaden ontdekten. Dat stelde ons in staat om zowel putatieve endogene neurostamcellen te identificeren als ook om hun aantal te reguleren. Dus we pasten deze kennis toe om robuuste cul

growing-neural-stem-cells-from-conventional-nonconventional-regions

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Deze video protocol laat de neurosphere assay methode voor het genereren en uit te breiden neurale stamcellen uit een volwassen muis periventriculaire regio, en biedt technische inzichten om ervoor te zorgen kan men reproduceerbare neurosphere culturen te bereiken.

Isolatie en uitbreiding van de volwassen muis neurale stamcellen Met behulp van de Neurosphere Assay

This video presents a method for isolating neural stem/progenitor cells from the periventricular tissue of the spinal cord in adult rats. The technique includes incubating the tissue fragments in a solution containing proteolytic enzymes to disrupt the extracellular matrix and release the cells. Subsequently, the released cells are plated in a medium containing specific growth factors that enhance neural stem/progenitor proliferation and promote aggregation into three-dimensional neurospheres.

Isolation of Neural Stem Progenitor Cells from the Spinal Cord Periventricular Region of an Adult Rat

Dit protocol beschrijft een nieuwe mechanische snij methode die de sferische expansie van neurale stamcellen en voorlopercellen aggregaten zonder dissociatie een enkele celsuspensie maakt. Handhaving van cel / cel contact maakt een snelle en stabiele groei voor meer dan 40 passages.

Een cGMP-toepassing Uitbreiding Methode voor Aggregaten van menselijke neurale stamcellen en stamcellen afgeleid uit pluripotente stamcellen of foetaal hersenweefsel

Hier beschrijven we een gedetailleerd protocol voor het gelijktijdig opwekken van neurale precursoren celculturen, hetzij als hechtende monolagen of neurosferen, uit de subventriculaire zone en dentate gyrus van individuele volwassen muizen.

Een muis, twee culturen: Isolatie en Cultuur van adulte neurale stamcellen uit de Twee Neurogeen Zones van individuele muizen

Het volwassen zoogdierspinaalmerg bevat neurale stam-/voorlopercellen (NSPC's) die kunnen worden geïsoleerd en uitgebreid in cultuur. Dit protocol beschrijft het oogsten, isoleren, kweken en passeren van NSPC's die zijn gegenereerd uit de periventriculaire regio van het volwassen ruggenmerg van de rat en van menselijke orgaantransplantatiedonoren.

Isolatie van neurale stamcellen / stamcellen uit de periventriculaire regio van de volwassen rat en Human Spinal Cord

We rapporteren een op Fluorescent Activated Cell Sorting (FACS) gebaseerde methode om neurale stamcellen (NSC's) en hun nakomelingen te isoleren uit de subventriculaire zone (SVZ) van de volwassen muizenhersenen. Toegepast op Fluorescent Ubiquitination Cell Cycle Indicator (FUCCI) transgene muizen, maakt het de studie van celcyclusprogressie mogelijk door live beeldvorming.

Celsortering van neurale stamcellen en stamcellen uit de Adult Mouse subventriculaire zone en Live-beeldvorming van de celcyclus Dynamics

Het opzetten van cultuursystemen voor de expansie van volwassen neurale stamcellen (aNSCs) maakt het mogelijk om aNSCs te onderzoeken en toe te passen voor therapie. De subcallosale zone (SCZ) is onlangs herkend als een nieuwe neuroblastvormende regio in volwassen muizen. Hier worden methoden beschreven voor de isolatie, expansie en differentiatie van SCZ-aNSCs.

Isolatie en cultuur van de volwassen neurale stamcellen van de muis Subcallosal Zone

De hond hersenen is een waardevol model waarin volwassen neurogenese bestuderen. hier gepresenteerde zijn protocollen voor het isoleren en het uitbreiden van volwassen honden hippocampus neurale voorlopercellen uit primaire hersenweefsel.

Isolatie en uitbreiding van Adult Canine hippocampus Neural Voorlopers

Hier introduceren wij een nieuwe microchirurgische techniek voor de isolatie van neurale stamcellen uit de E13 muis embryo ganglionaire eminentie.

Isolatie en cultuur van muis embryonale neurale stamcellen

Een methode voor de isolatie van neurale stamcellen en oligodendrocytenvoorlopercellen uit de hersenen van levende ratten wordt hier in experimenteel detail gepresenteerd. Het maakt meerdere verzamelingen van deze cellen van dezelfde dieren mogelijk zonder hun welzijn in gevaar te brengen.

De "Brain Milking"-methode voor de isolatie van neurale stamcellen en voorlopercellen van oligodendrocyten uit levende ratten

Hier beschrijven we een nucleofectiesysteem dat is ontworpen om de efficiëntie van genafgifte te verbeteren in uitgebreide neurale stamcellen (NSC's) geïsoleerd uit de subventriculaire zone van volwassen muizen. De bevindingen tonen aan dat deze methode de genverstoring in NSC's aanzienlijk verbetert, de effectiviteit van traditionele transfectieprotocollen overtreft en de celoverleving verbetert.

Isolatie, expansie en nucleofectie van neurale stamcellen uit de subventriculaire zone van volwassen muizen

Leer neurale stamcellen kweken uit verschillende gebieden van de volwassen knaagdierhersenen. Deze methode helpt onderzoekers om endogene stamcellen te lokaliseren en hun zelfvernieuwingspotentieel te valideren.

Groeiende neurale stamcellen uit Conventionele en Niet-conventionele Regio's van de Adult knaagdierhersenen

Meer video's verkennen