Groeiende neurale stamcellen uit Conventionele en Niet-conventionele Regio's van de Adult knaagdierhersenen
18 november 2013
Neurale stamcellen geoogst uit de volwassen hersenen worden steeds gebruikt in toepassingen, variërend van het fundamenteel onderzoek van de ontwikkeling van het zenuwstelsel aan het verkennen van potentiële klinische toepassingen in de regeneratieve geneeskunde. Dit maakt strenge controle op de isolatie en kweekomstandigheden gebruikt om deze cellen cruciaal voor experimentele resultaten goed groeien.
Het algemene doel van het volgende experiment is om neurale stamcellenculturen te genereren uit verschillende delen van de volwassen knaagdierhersenen. Dit wordt bereikt door weefsel te verzamelen van een gebied van belang om de aanwezigheid en potentieel van neurale stamcellen te onderzoeken. Als tweede stap, verwerk het weefsel tot een cellensuspensie voor het plateren als een monolaagcultuur.
Vervolgens gebruiken we gedefinieerde kweekcondities om de neurale stamcellen selectief te vermenigvuldigen, waarbij hun potentieel voor zelfvernieuwing wordt gevalideerd. In vitro resultaten laten zien dat de neurale stamcellen multipotent zijn op basis van hun differentiatiepotentieel en hoe verschillende factoren hun zelfvernieuwing en lot kunnen beïnvloeden. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in de neurowetenschappen en regeneratieve geneeskunde, zoals waar endogene neurostamcellen verblijven en hoe ze te manipuleren.
We dachten eerst aan deze techniek toen we signalenreductiepaden ontdekten. Dat stelde ons in staat om zowel putatieve endogene neurostamcellen te identificeren als ook om hun aantal te reguleren. Dus we pasten deze kennis toe om robuuste culturen van deze cellen uit verschillende delen van de hersenen te vestigen.
Bestudeer hun eigenschappen en stel de vraag, zijn het inderdaad stamcellen? Goede voorbereiding van de kweekschotel is cruciaal twee dagen voorafgaand aan de geplande dissectie, bedek de schalen met poly L ornithine op 75 microgram per milliliter. Incubeer vervolgens de platen 's nachts, aspergeer de poly L ornithine ine en was elke put twee keer met drie milliliter PBS gedurende vijf minuten per wasbeurt.
De platen kunnen vervolgens maximaal drie weken in een incubator worden bewaard. Na het verwijderen van de laatste wasbeurt, voeg fibro nin toe, verdund één op 250 in PBS door voorzichtig te pipetteren. Wees voorzichtig om de oplossing niet te overmatig te roeren. Incubeer vervolgens de platen 's nachts op de dag van de dissectie.
Aspergeer de fibronectine en was de schalen twee keer met PBS. Breng de platen met de laatste PBS-was terug in de incubator en wacht op het gedissocieerde weefsel. Ongebruikte platen kunnen maximaal een week in de incubator worden bewaard, maar laat ze niet uitdrogen en schud ze niet.
De demonstratie van dit protocol is geschaald naar drie volwassen ratten. Zorg er eerst voor dat het hersensectieblok op ijs wordt gekoeld voorafgaand aan het euthaniseren van de eerste rat. Bereid vervolgens een 15 milliliter conische buis op ijs voor met vijf milliliter N twee medium en basis FGF.
Na het verwijderen van de hersenen van een geëuthanasieerde rat, plaats de hersenen in een 10 centimeter petrischaal met ijskoud PBS. Breng vervolgens de hersenen over naar een tweede schaal met PBS zonder resterend haar of bloed. Plaats nu de hersenen in het gekoelde sectieblok en voeg een nieuwe schone scheermes toe aan het blok in de nabijheid van het gebied van belang waaruit cellen zullen worden gegenereerd.
Voeg vervolgens een tweede schone scheermes toe. Drie millimeter naast de eerste scheermes. Til voorzichtig de bladen uit het blok en neem het gewenste sectie mee.
Laat de sectie van het mes zweven door het in PBS te dompelen. Haal nu het gebied van belang binnen met nummer vijf tang. In dit voorbeeld bevat de sectie de voorste commisuur. Zeker.
Verzamel de sectie in de 15 milliliter conische buis met vijf milliliter N twee medium met basis FGF. Vervolgens wordt het volume van de oplossing gereduceerd tot één tot twee milliliter. Vervolgens, in een celkweekhood, dompel een 1 milliliter pipettentip naar de bodem van de kegel en gebruik ongeveer 20 stromingen van oplossing om het weefsel mechanisch te dissociëren.
Stop de tation wanneer de oplossing homogeen wordt en laat het een paar minuten staan zodat grotere niet-geassocieerde weefsels naar de bodem zullen bezinken. Breng nu de homogene supernatant zonder enige weefselklompjes over in een kegelvormige buis met 8,5 milliliter gesupplementeerd en twee media. Meng de inhoud van de buis en houd een voorbereide zesklap klaar.
Welplaat. Verwijder de PBS uit de putten en voeg vervolgens drie milliliter celmengsel per put toe aan drie putten gedurende de volgende 10 tot 14 dagen van cultiveren. Vervang het medium elke dag met vers gesupplementeerd N twee, beginnend 24 uur na het plateren elke dag, voeg een verse volume supplementen toe in N twee.
Medium tot het medium dat al op de cellen staat. Zorgvuldigheid van de mediaomstandigheden is essentieel om de cellen ongedifferentieerd te houden en hun expansie mogelijk te maken. Na de eerste mediumverversing bleef een grote hoeveelheid cellulaire puinhopen achter samen met bloedvaten.
Echter, gedurende de volgende paar dagen werden kolonies van duidelijk proliferende stamcellen zichtbaar. Ook aanwezig waren meer langwerpige spindelvormige celpopulaties. Dit zijn geen neurale stamcellen en werden uiteindelijk overgenomen naarmate de neurale stamcellen zich vermenigvuldigden.
In de loop van de volgende twee weken groeiden de neurale stamcellen dichter totdat ze conflueren bereikten. Deze culturen kleurden positief voor een aantal stamcelmarkers, inclusief SOX twee, hesi en nest. Dit geeft vertrouwen dat de celpopulaties die zijn geselecteerd en uitgebreid inderdaad neurale stamcellen zijn.
Verdere bevestiging kwam nadat FGF uit het medium werd teruggetrokken, wat de cellen in staat stelde om zich 10 dagen te differentiëren in neuronen, astrocyten en alle cendracyten. Om differentiatie te induceren. Vervang het gesupplementeerde N twee medium door ongesupplementeerd N twee medium en kweek de cellen op deze manier gedurende 10 dagen, waarbij het N twee elke 48 uur wordt vervangen. Na 10 dagen, aspergeer het medium en fixeer de cellen met twee milliliter 4% para formaldehyde per put gedurende 20 minuten.
Was de fixeermiddel uit met drie milliliter PBS twee keer gedurende vijf minuten per wasbeurt. Na het aspergeren van de tweede wasbeurt, voeg twee milliliter
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie richt zich op het genereren van neurale stamcelculturen uit verschillende regio's van het brein van volwassen knaagdieren. Het proces omvat het oogsten van weefsel, het maken van een celsuspensie en het gebruik van specifieke kweekcondities om neurale stamcellen te propageren, waarbij hun potentieel voor zelfvernieuwing wordt gevalideerd.
Belangrijkste componenten van de studie
Wetenschappelijk vakgebied
- Neurowetenschappen
- Regeneratieve geneeskunde
Achtergrond
- Neurale stamcellen zijn van cruciaal belang voor het begrijpen van de ontwikkeling van het zenuwstelsel.
- Ze hebben potentiële toepassingen in de regeneratieve geneeskunde.
- Controle over de isolatie- en kweekcondities is essentieel voor de experimentele resultaten.
Doel van de studie
- Om neurale stamcelculturen te genereren uit hersenregio's van volwassen knaagdieren.
- Om de aanwezigheid en het potentieel van neurale stamcellen te onderzoeken.
- Om factoren te verkennen die zelfvernieuwing en differentiatie beïnvloeden.
Gebruikte methoden
- Oogsten van weefsel uit specifieke hersengebieden.
- Verwerken van weefsel tot een cel-suspensie.
- Uitplaten van cellen als een monocuultuur.
- Gebruik van gedefinieerde kweekcondities voor selectieve propagatie.
Belangrijkste resultaten
- In vitro resultaten bevestigen de multipotentie van neurale stamcellen.
- Aangetoond differentiatiepotentieel van de gekweekte cellen.
- Identificatie van factoren die de zelfvernieuwing en het lot van neurale stamcellen beïnvloeden.
Conclusies
- Deze methode helpt bij het begrijpen van de locatie van endogene neurale stamcellen.
- Het biedt inzicht in hoe neurale stamcellen kunnen worden gemanipuleerd voor onderzoek.
- De bevindingen dragen bij aan de velden van de neurowetenschappen en de regeneratieve geneeskunde.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Managers
Het opzetten van gedefinieerde neurale stamcelculturen uit verschillende hersengebieden maakt mechanistische risicoreductie mogelijk bij de targetvalidatie voor neurodegeneratieve en regeneratieve therapieën. Deze aanpak ondersteunt het voorspellend vertrouwen door multipotente populaties te isoleren en hun differentiatiepotentieel onder gecontroleerde omstandigheden te beoordelen. De methode faciliteert translationele continuïteit van ontdekking naar preklinische evaluatie door een reproduceerbaar systeem te bieden voor farmacologische en genetische analyse.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het toetsen van therapeutische hypothesen mogelijk door neurale stamcellen te isoleren uit conventionele en niet-conventionele hersenregio's om regionale heterogeniteit in stamceleigenschappen te beoordelen.
- Operationele waarde: Ondersteunt biologische risicoreductie door validatie van zelfvernieuwing en multipotentie met behulp van gedefinieerde kweekcondities en markeranalyse (SOX2, Hes1, nestine).
- Voorspellende waarde: Differentiatie tot neuronen, astrocyten en oligodendrocyten biedt functionele read-outs voor studies naar pathway-modulatie en lotbepaling.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Genereert homogene monocuulcultures die geschikt zijn voor high-content imaging en kwantitatieve beoordeling van de proliferatie en differentiatie van stamcellen.
- Operationele waarde: Gedefinieerde media (N2 aangevuld met bFGF) en substraatcoatings (poly-L-ornithine, fibronectine) waarborgen standaardisatie en reproduceerbaarheid over verschillende experimenten heen.
- Schaalbaarheid: Het protocol ondersteunt expansie gedurende 10–14 dagen met om de dag een mediumverversing, wat een consistente productie van ongedifferentieerde progenitorpopulaties mogelijk maakt.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Differentiatie-assays na onttrekking van groeifactoren modelleren regeneratieve reacties en ondersteunen de evaluatie van pro-regeneratieve of neuroprotectieve verbindingen.
- Operationele waarde: Immunocytochemische validatie (TUJ1, GFAP, CCAP) biedt gestandaardiseerde eindpunten voor het beoordelen van lineage commitment.
- Translationele continuïteit: Toepasbaar op knaagdiermodellen en aanpasbaar aan menselijke klinische monsters, wat cross-species validatie van stamcelgedrag ondersteunt.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode kan worden geïntegreerd in vroege discovery-workflows door een gevalideerd neuraal stamcelplatform te bieden voor studies naar target-engagement en het werkingsmechanisme voorafgaand aan de lead-optimalisatie.
- Ontdekkingsbiologie: Maakt hypothesetesten mogelijk met betrekking tot regionale stamcelniches en hun reactiviteit op micro-omgevingssignalen van het vasculaire en immuunsysteem.
- Screening: Monolaagculturen ondersteunen reproduceerbare plating en expansie, wat de assay-gereidheid voor screening van verbindingenbibliotheken vergemakkelijkt.
- Analytica: Kwantitatieve outputs omvatten markerexpressie (immunocytochemie), differentiatie-efficiëntie en proliferatiekinetiek onder gedefinieerde condities.
- Translationeel onderzoek: Het differentiatiepotentieel naar drie neurale lineages ondersteunt de uitlijning van biomarkers en preklinische modellering van regeneratieve capaciteit.
- Hergebruik binnen de organisatie: Gestandaardiseerde procedures voor dissociatie, plating en onderhoud maken hergebruik over projecten en modelsystemen mogelijk met minimale heroptimalisatie.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Vermindert mechanistische ambiguïteit door kweekcondities te definiëren die endogene eigenschappen en multipotentie van neurale stamcellen isoleren.
- Operationele waarde: Gestandaardiseerde weefseldissociatie, gedefinieerde media en substraatpreparatie verbeteren de reproduceerbaarheid en verminderen de variabiliteit tussen laboratoria.
- Strategische waarde: Informeert go/no-go-beslissingen door vroegtijdige bewijslast te leveren voor target-engagement en pathway-modulatie in een fysiologisch relevant systeem.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering van regeneratieve kandidaten mogelijk op basis van aangetoonde effecten op zelfvernieuwing van stamcellen en lineage-specificatie.
Overwegingen bij de implementatie
- Vereist expertise in aseptische weefseldissectie, neurale stamcelkweek en immunofluorescentietechnieken.
- Afhankelijkheid van een steriele celkweekkap, incubatoren, omgekeerde microscopen en standaard moleculair-biologische reagentia (antilichamen, DAPI, PBS).
- Standaardisatie tussen teams vereist een consistente substraatcoating (poly-L-ornithine/fibronectine), mediasuppletie en differentiatie-tijdslijnen.
- Aanpassing aan niet-knaagdiermodellen kan optimalisatie van dissociatie-enzymen en kweekduur vereisen op basis van soortspecifieke stamcelkinetiek.
- Beperkingen omvatten potentiële contaminatie door niet-stamcelpopulaties (bijv. vasculair, gliaal) tijdens de vroege kweekfasen, wat wordt beperkt door selectieve proliferatie in de loop van de tijd.
