Name: Cultuur van Geïsoleerde Vloerplaat Tissue en productie van geconditioneerd medium om functionele eigenschappen van Floor-plaat uitgebracht Signalen Assess (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-02-11T17:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 53 s
Description: Leer de isolatie en cultuur van vloerplaatweefsel uit muizenembryo's om geconditioneerd medium te produceren voor het bestuderen van neurale signaaloverdracht in de ontwikkelende ruggengraat.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij danken Karine Kindbeiter, Muriel Bozon, en Florie Reynaud voor hun hulp. Het werk wordt ondersteund door CNRS, ANR YODA programma en Labex DevWeCan.

DAG 1 1. Dissectie van de Spinal Cord Vloerplaat (FP) van E12.5 muizenembryo&#39;s Opmerking: De gehele procedure vereist het gebruik van steriele omstandigheden. Het verdient de voorkeur de dissectie voeren onder een dissectie kap te voorkomen. Het oppervlak van de kap worden gereinigd met ethanol. Alle dissectie instrumenten moeten worden gesteriliseerd en bewaard in een steriele petrischaal. De vloeistoffen (gemiddeld, dissectie medium) moeten gesloten worden gehouden en in een ijsbad. Elk embryo moet worden verzameld in individuele verse druppel. Dit is belangrijk voor weefsel bewaring. De dissectie wordt uitgevoerd met Dumont # 5 tang. Om de embryo&#39;s tussen de gerechten in, greep de navelstreng of het hoofd zonder enige schade aan de achterste hersenen overbrengen. Het is essentieel het ruggenmerg niet tot schade aan de dissectie voltooid. Bereid koude fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS), koude Hank&#39;s Balanced Salt Solution (HBSS) -6,5% glucose en kamertemperatuur Neurobasal medium. 1.1 ruggenmerg dissectie Dieren worden behandeld volgens het dier zorg richtlijnen van het Centre National de la Recherche Scientifique volgende Europese richtlijnen. Werkwijze euthanasie cervicale dislocatie, dat bestaat uit het toepassen van druk op de nek en ontwrichten de wervelkolom de hersenen. Deze methode wordt aanbevolen voor muismodellen en kan snel en efficiënt worden uitgevoerd. <ol><li> Euthanaseren een zwangere muis op E12.5 van de dracht (E0.5 = eerste dag na matten). Plaats de muis ventrale zijde naar boven. </li><li> Week de buik met 70% ethanol. Knijp de huid van de buik met Adson pincet en snijd door de huid en de peritoneale lagen met chirurgische schaar. Maak een insnijding en te gebruiken om te snijden aan beide zijden van de muis naar de buikholte bloot. </li><li> Een reeks van embryo aanwezig aan elke zijde van de muis. Pak een hoorn van de uterus in het weefsel tussen twee embryo&#39;s en ontleden het uit vanaf de buitenzijde. Breng de baarmoeder om een ​​100 mm petrischaal met koud PBS op ijs. </li><li> Pak de embryo&#39;s uit extra-embryonale weefsels. Pak de placenta weefsel (in het donker rood) met twee paar tang en trek zachtjes aan het weefsel scheuren en verwijder de embryo&#39;s uit de baarmoeder weg. </li></ol> Opmerking: Voor een beter behoud, het verzamelen van de embryo&#39;s uit hun baarmoeder weg een voor een. <ol start="5"><li> De volgende stappen zijn gedaan onder verrekijker vergrootglas en dissectie kap. Plaats een embryo in een druppel koud HBSS-6,5% glucose. </li><li> Behulp van een tang, onthoofden het embryo. </li></ol> Opmerking: Snijd tussen de onderkaak en de achterhersenen, het achterste deel van de achterhersenen is belangrijk voor de volgende stappen. <ol start="7"><li> Plaats de embryo ventrale zijde naar beneden met het voorste deel naar de experimentator. </li><li> Knijp de huidvan de embryo met een pincet en de andere paar trek de huid weg. </li></ol> Opmerking: Deze stap wordt herhaald totdat de huid volledig wordt verwijderd uit het voorste deel van het embryo. <ol start="9"><li> Draai de embryo voorvlak naar links. Met een tang &quot;vastpinnen&quot; het embryo in het voorste deel. Met de andere tang pak de huid en trek naar de rostrale zijde van het embryo. Het ruggenmerg is dan toegankelijk. </li><li> Gebruik een zijde van de tang om de hersenvliezen die nog wikkel het ruggenmerg snijden. Het ruggenmerg is nu open. </li><li> Draai de embryo voorvlak naar rechts. </li><li> Maak het weefsel van het ruggenmerg vanaf de cervicale zijde van het embryo. Schuif de tang onder het ruggenmerg (de tang worden dichtgehouden ruggenmerg beschadiging te voorkomen). De forceps zijn zichtbaar onder het ruggenmerg zijn. Kleine draaiende bewegingen onder het ruggenmerg voldoende zijn om los van deomringende weefsel en de dorsale wortel ganglia (DRG). </li></ol> Opmerking: Het verlaten verbonden omliggende weefsel in te brengen ruggenmerg, waardoor de kans op breken bij de volgende stap toe. <ol start="13"><li> Plaats de geïsoleerde ruggenmerg in een frisse druppel koud HBSS-6,5% glucose. </li><li> Plaats het ruggenmerg in een vlakke positie, meninges op de bovenkant en voorste zijde weg van de experimentator. </li><li> &quot;Vastpinnen&quot; het ruggenmerg met behulp van de resterende hindbrain met een tang, en met de tweede tang pak de hersenvliezen. Afpellen de hersenvliezen vanaf de rostrale zijde van het ruggenmerg. </li></ol> Opmerking: Deze beweging moet langzaam en constant elke onderbreking van het ruggenmerg te voorkomen. Vibrerende bewegingen kunnen het losmaken van de hersenvliezen te vergemakkelijken. 1.2 FP dissectie <ol><li> Knijp de achterhersenen met een pincet. </li><li> De FP is de centrale transparent deel van het weefsel. Met behulp van een scalpel knip de vloerplaat. </li></ol> Opmerking: als u beide kanten snijden met dezelfde kwaliteit, starten vanaf de rostrale kant en afwisselend knip de rechterkant en de linkerkant van de vloerplaat. <ol start="3"><li> Instandhouding van het ontleed FP in Neurobasal medium bij kamertemperatuur. </li></ol> 2. FP Cultuur Opmerking: Alle stappen dienen onder steriele omstandigheden worden uitgevoerd in een weefselkweek kap. Gebruik vers medium en vers ontdooid supplementen en reagentia. Bereid steriele glazen dekglaasjes, warm Neurobasal + B27, plasma en HBSS-trombine. 2.1 FP cultuur <ol><li> Plaats verscheidene steriele dekglaasjes in een 100 mm petrischaal en pipetteer 20 pl plasma in het midden van elke dekglaasje. </li><li> Transfer 03:58 FP in elk plasma drop en voeg 20 ul HBSS-trombine naast de plasma-drop en meng voorzichtig. Houd de dekglaasjesgedurende ten minste tien minuten bij kamertemperatuur om stolling van het plasma mogelijk. </li></ol> Opmerking: Transfer twee KP&#39;s in geval van een volledige dissectie en meer in het geval van gedeeltelijke versnijding. Meng langzaam met een pipet en het contact met de FP explantaten voorkomen. De plasma stolsel trekt een paar micrometer als een teken van de coagulatie. De coagulatie niet voortijdig worden gestopt, om losraken van het plasma stolsel voorkomen. <ol start="3"><li> Breng elke dekglaasje in een 24-well plaat en voeg 500 ul van Neurobasal + B27. Incubeer 48 uur bij 37 ° C. </li></ol> DAG 3 3. FP geconditioneerd medium (FP cm) Oogsten Opmerking: Het oogsten moet onder steriele omstandigheden worden uitgevoerd in een weefselkweek kap. Als de bovenstaande vloeistof vervuild is of als vloerplaten zweven (wat betekent dat ze zouden zijn gestorven tijdens de cultuur period) dan niet de FP cm oogsten uit deze bron. 3.1 FP cm oogsten <ol><li> Oogst zorgvuldig het medium uit elk putje. </li></ol> Opmerking: Gebruik geen pipet de gepolymeriseerde plasma-trombine mix of FP fragmenten. <ol start="2"><li> WINKEL 100 ul aliquots bij -80 ° C. </li></ol> DAG 4 4. Dissectie van Spinal Cord commissurale neuronen van E12.5 muizenembryo&#39;s Opmerking: Dit preparaat hoeft niet onder steriele omstandigheden te worden uitgevoerd. Volg de hierboven beschreven procedure de embryo&#39;s te verzamelen. Bereid koude PBS, koude HBSS-6,5% glucose en koud Neurobasal. 4.1 ruggenmerg dissectie <ol><li> Behulp van een tang, onthoofden het embryo. </li></ol> Opmerking: Snijd tussen de onderkaak en de achterhersenen, het achterste deel van de achterhersenen is belangrijk voor devolgende stappen. <ol start="2"><li> Plaats de embryo ventrale zijde naar beneden in een verse druppel met het voorste deel naar de experimentator. </li><li> Knijp de huid van het embryo met een pincet en met de ander weg te trekken van de huid. </li></ol> Opmerking: Deze stap wordt herhaald totdat de huid volledig wordt verwijderd uit het voorste deel van het embryo. <ol start="4"><li> Draai de embryo voorvlak naar links. Met een tang &quot;vastpinnen&quot; het embryo in het voorste deel. Met andere tang, grijpen de huid trekken naar de rostrale zijde van het embryo, het ruggenmerg bloot. </li><li> Gebruik een zijde van de tang om de hersenvliezen die nog wikkel het ruggenmerg snijden. Het ruggenmerg is nu bloot en open. </li><li> Plaats de embryo anterieure zijde naar rechts. </li><li> Maak het weefsel van het ruggenmerg vanaf de cervicale zijde van het embryo. Schuif de tang onder het ruggenmerg (houd de tang gesloten). Vooreekhoorntjesbrood moet zichtbaar onder het ruggenmerg. Kleine draaiende bewegingen onder het ruggenmerg voldoende zijn om het aangrenzende weefsel en de dorsale wortel ganglia (DRG) los te maken. </li><li> Breng de geïsoleerde ruggenmerg in een nieuwe druppel koud HBSS-6,5% glucose. </li><li> Plaats het ruggenmerg in een vlakke positie, meninges op de bovenkant en voorste zijde weg van de experimentator. </li><li> &quot;Vastpinnen&quot; het ruggenmerg met de resterende achterhersenen met een pincet, tweede tang pak de hersenvliezen. Afpellen de hersenvliezen vanaf de rostrale zijde van het ruggenmerg. </li></ol> 4.2 commissurale Neuron dissectie <ol><li> Knijp de achterhersenen met een pincet. </li><li> De commissural neuronen in de zijkant van het ruggenmerg (de rugzijde). Knip dit zijkant met een fijn scalpel. </li></ol> Opmerking: De dorsale gedeelte van het ruggenmerg kan worden onderscheiden van het ventrale deel van verschil cel density, het ventrale deel is ondoorzichtiger. Opmerking: als u beide kanten snijden met dezelfde kwaliteit, starten vanaf de rostrale kant en afwisselend snijd een kleine lengte van de rechterzijde en de linkerzijde. <ol start="3"><li> Instandhouding van het ontleed weefsel in Neurobasal medium op ijs voor onmiddellijk gebruik. </li></ol> 5. Behandeling van commissurale Tissue met de FP cm Opmerking: Deze procedure geldt niet steriele omstandigheden vereisen. Het weefsel moet worden verzameld in afzonderlijke 1,5 ml buizen. De bevroren FP cm mag slechts eenmaal worden gebruikt. Vermijd meerdere opnieuw invriezen. Bereid warme FP cm (37 ° C). 5.1 Behandelingen van commissurale neuronen <ol><li> Dilacerate de commissural weefsel met een klein schaartje. </li></ol> Opmerking: Snijd het weefsel zo klein mogelijk, de toegankelijkheid van de cellen versterken. <ol start="2"><li> Een billijke verdeling van het weefsel tussen de verschillende experimentele condities controle behandeling en FP cm behandeling. </li><li> Centrifugeer de weefselfragmenten bij 800 xg gedurende 1 min bij 4 ° C. </li><li> Controleer de verdeling tussen de buizen. </li></ol> Opmerking: Indien nodig herdistribueren en centrifuge opnieuw totdat fragmenten gelijk verdeeld. <ol start="5"><li> Verwijder het supernatant. </li><li> Voeg de warme FP cm en controlebehandelingen naar de weefsels. </li></ol> Opmerking: Het volume moet worden aangepast aan de hoogte van de pellet en ten minste tweemaal het volume van het pellet worden. <ol start="7"><li> Incubeer bij 37 ° C gedurende 30 minuten. </li></ol> Opmerking: Schud elke 10-15 min <ol start="8"><li> Centrifugeer bij 800 xg gedurende 1 minuut en verwijder de behandeling. </li><li> Voeg de lysisbuffer </li></ol> Opmerking: Het volume moet worden aangepast om de eenmount van de pellet en moet minstens twee keer het volume van de pellet zijn. <ol start="10"><li> Pipet op en neer om de pellet opnieuw in suspensie. </li></ol> Opmerking: Een vortex kan worden gebruikt. <ol start="11"><li> Incubeer 15 minuten op ijs. </li><li> Centrifugeer bij 14.000 xg gedurende 15 min bij 4 ° C. </li><li> Houd de supernatant en meet de hoeveelheid eiwit met een Bradford assay 9. </li><li> Voeg 6x Laemmli Buffer. </li><li> Incubeer bij 95 ° C gedurende 5 minuten van het eiwitgehalte denatureren. </li></ol> Opmerking: Monsters kunnen direct worden gebruikt of kan worden opgeslagen bij -80 ° C. <ol start="16"><li> Beoordelen van de effecten van de behandeling door de Western Blot 10. </li></ol> Opmerking: Ten minste 50 ug totaal eiwit moet voor elke baan geladen.

<ol><li>Nawabi, H., Castellani, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axonal+commissures+in+the+central+nervous+system%3A+how+to+cross+the+midline%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Mol.+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Axonal commissures in the central nervous system: how to cross the midline.</a> Cell. Mol. Life Sci. 68, 2539-2553 (2011).</li>
<li>Placzek, M., Briscoe, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+floor+plate%3A+multiple+cells%2C+multiple+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The floor plate: multiple cells, multiple signals.</a> Nat. Rev. Neurosci. 6, 230-240 (2005).</li>
<li>Chedotal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Further+tales+of+the+midline%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Further tales of the midline.</a> Curr. Opin. Neurobiol. 21, 68-75 (1016).</li>
<li>Nawabi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+midline+switch+of+receptor+processing+regulates+commissural+axon+guidance+in+vertebrates%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">A midline switch of receptor processing regulates commissural axon guidance in vertebrates.</a> Genes Dev. 24, 396-410 (2010).</li>
<li>Ruiz de Almodovar, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VEGF+mediates+commissural+axon+chemoattraction+through+its+receptor+Flk1%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">VEGF mediates commissural axon chemoattraction through its receptor Flk1.</a> Neuron. 70, 966-978 (2011).</li>
<li>Charoy, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((gdnf+activates+midline+repulsion+by+Semaphorin3B+via+NCAM+during+commissural+axon+guidance%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">gdnf activates midline repulsion by Semaphorin3B via NCAM during commissural axon guidance.</a> Neuron. 75, 1051-1066 (2012).</li>
<li>Kiecker, C., Lumsden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+organizers+in+patterning+the+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The role of organizers in patterning the nervous system.</a> Annu. Rev. Neurosci. 35, 347-367 (2012).</li>
<li>Le Dreau, G., Marti, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dorsal-ventral+patterning+of+the+neural+tube%3A+a+tale+of+three+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Dorsal-ventral patterning of the neural tube: a tale of three signals.</a> Dev. Neurobiol. 72, 1471-1481 (2012).</li>
<li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Anal. Biochem. 72, 248-254 (1976).</li>
<li>Eslami, A., Lujan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Western+blotting%3A+sample+preparation+to+detection%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Western blotting: sample preparation to detection.</a> J. Vis. Exp. , (2010).</li>
<li>Salinas, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+morphogen+sonic+hedgehog+collaborates+with+netrin-1+to+guide+axons+in+the+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The morphogen sonic hedgehog collaborates with netrin-1 to guide axons in the spinal cord.</a> Trends Neurosci. 26, 641-643 (2003).</li>
<li>Bechara, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FAK-MAPK-dependent+adhesion+disassembly+downstream+of+L1+contributes+to+semaphorin3A-induced+collapse%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">FAK-MAPK-dependent adhesion disassembly downstream of L1 contributes to semaphorin3A-induced collapse.</a> EMBO J. 27, 1549-1562 (2008).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen

De productie van vloer-plaat geconditioneerd medium biedt een efficiënte en eenvoudige manier voor de beoordeling van de biologische eigenschappen van vloerplaat vrijgegeven signalen. De plasma-trombine matrix biedt uitstekende staat voor weefsel overleven. Toch zou dit verrijkte omgeving een beperking voor sommige soorten van experimenten. Aldus kan de vloerplaat weefsel worden gekweekt in agarose matrix. De kwaliteit van de vloerplaat geconditioneerde medium kan worden beoordeeld door de d...

De bodemplaat is een bekend patroon midden van de ontwikkelende ruggenmerg, spelen een sleutelrol in de specificatie van voorlopers en postmitotische cellijnen en controle axon navigatie 7,8. De hier beschreven FP cm produceren experimentele procedure kunnen onderzoekers de functionele eigenschappen van bodemplaat afgeleide signalen in verschillende contexten van ontwikkelingsprocessen beoordelen van cel patronen en overleving cel en axon migratie. Om het gebruik van dergelijke FP cm illustreren, zijn dorsale ruggenmerg weefsel dat commissural neuronen ontleed, dilacerated en gestimuleerd met de FP cm. De weefsels kunnen vervolgens worden verwerkt voor Western blot analyse. Dit maakt onderzoek naar regelgeving van de axon begeleiding machines door vloer-plaat uitgebracht signalen. De behandelingsmethode van dilacerated verse weefsel heeft het grote voordeel van het behoud van het micromilieu van cellen in ee weefsel. Dus de gevolgen van de behandeling door FP cm of soorten behandeling worden beoordeeld in een meer fysiologische wijze dan in cel-en weefselkweek omstandigheden.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Benodigde reagentia</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Invitrogen</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>HBSS, Ca2+/Mg2+- vrij</td><td>Invitrogen</td><td>14170-088</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma</td><td>G-7021</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal</td><td>Invitrogen</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>Plasma</td><td>Sigma</td><td>P-3266</td><td>1 mg/ml (Reconstituteer in H2O en filtreer)</td></tr><tr><td>Thrombin</td><td>Sigma</td><td>T-4648</td><td>10 mg/ml(Reconstituteer in H2O en filtreer)</td></tr><tr><td>B27</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td>50x</td></tr><tr><td>HEPES (260 g/mol)</td><td>Sigma</td><td>H-7006</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>E-5513</td><td>0.5 M, pH 8</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Euromedex</td><td>2189</td><td>1M</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>VWR</td><td>24388.295</td><td></td></tr><tr><td>IGEPAL</td><td>Sigma</td><td>I-3021</td><td></td></tr><tr><td>Complete Protease Inhibitor Cocktail Tablets</td><td>Roche</td><td>04 693 116 001</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Orthovanadate (Na3VO4)</td><td>Sigma</td><td>S-6508</td><td></td></tr><tr><td>Gedestilleerd H2O</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Tabel 1. Benodigde reagentia. </td></tr><tr><td colspan="4">Hulpmiddelen en materialen</td></tr><tr><td>Chirurgische schaar</td><td>Fine Science Tools</td><td>14002-12</td><td></td></tr><tr><td>Adson-tang</td><td>Fine Science Tools</td><td>11027-12</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 fijne tips tang</td><td>Fine Science Tools</td><td>11254-20</td><td></td></tr><tr><td>Microknives</td><td>Fine Science Tools</td><td>10136-14</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Tabel 2. Hulpmiddelen en materialen. </td></tr><tr><td colspan="4"><table border="1"> <tbody> <tr> <td colspan="2">Dissectie en FP-cultuur</td> </tr> <tr> <td>Ethanol 70%</td> <td></td> </tr><tr> <td>dissectiekap</td> <td></td> </tr><tr> <td>dissectiemicroscoop</td> <td></td> </tr><tr> <td>Petrischalen</td> <td></td> </tr><tr> <td>glasdekjes</td> <td>18 mm x 18 mm</td> </tr><tr> <td>Bunsen gasbrander</td> <td></td> </tr><tr> <td>24-well plate</td> <td></td> </tr><tr> <td>weefselkweekincubator (37 &deg;C, 5% CO2, bevochtiging geregeld)</td> <td></td> </tr><tr> <td>Centrifuge</td> <td></td> </tr><tr> <td colspan="2">Recepten</td> </tr> <tr> <td colspan="2">FP-cultuurmedia</td> </tr> <tr> <td>Neurobasal</td> <td></td> </tr><tr> <td>B27</td> <td>1/50e verdunning van stockoplossing</td> </tr><tr> <td colspan="2">HBSS-thrombin</td> </tr> <tr> <td>HBSS</td> <td>1 ml </td> </tr><tr> <td>Thrombin 10 mg/ml</td> <td>30 &mu;l</td> </tr><tr> <td colspan="2">Lysis Buffer pH 7,4</td> </tr> <tr> <td>HEPES (260 g/mol) </td> <td>25 mM</td> </tr><tr> <td>EDTA (pH 8) </td> <td>5 mM</td> </tr><tr> <td>MgCl2 </td> <td>1 mM</td> </tr><tr> <td>Glycerol </td> <td>10%</td> </tr><tr> <td>IGEPAL (NP40) </td> <td>0.10%</td> </tr><tr> <td>Protease Inhibitor Cocktail </td> <td>1x</td> </tr><tr> <td>Sodium Orthovanadate </td> <td>0.2 M</td> </tr><tr> <td>H2O</td> <td></td> </tr><tr> <td colspan="2">Laemmli Buffer</td> </tr> <tr> <td>Tris 0.5 M, pH 6,8 </td> <td>375 mM</td> </tr><tr> <td>SDS</td> <td>6%</td> </tr><tr> <td>Glycerol</td> <td>60%</td> </tr><tr> <td>DTT</td> <td>0.6 M</td> </tr><tr> <td>Bromofenolblauw</td> <td></td> </tr><tr> <td>H2O</td> <td></td> </tr></tbody> </table></td></tr></tbody></table>

cultuur van geïsoleerde vloerplaat tissue en productie van geconditioneerd medium om functionele eigenschappen van floor-plaat uitgebracht signalen assess

Culture of Isolated Floor Plate Tissue and Production of Conditioned Medium to Assess Functional Properties of Floor Plate-released Signals

Tijdens de ontwikkeling, voorouders en post-mitotische neuronen ontvangen signalen van aangrenzende gebieden die hun lot te reguleren. De vloer-plaat is een groep van gliacellen voering de ependymale kanaal bij ventrale positie. De bodemplaat drukt toets morfogenen bijdragen tot de patroonvorming van cellijnen in het ruggenmerg. Op latere ontwikkelingsstadia, de vloer-plaat regelt de navigatie van axonen in het ruggenmerg, als een belemmering voor de overschrijding van de ipsilaterale axonen en controlling middellijn oversteken te voorkomen door commissurale axonen 1. Deze functies worden bereikt door de secretie van verschillende begeleiding signalen. Sommige van deze signalen fungeren als lokstoffen en insectenwerende de groeiende axonen terwijl reguleert begeleiding receptoren en stroomafwaartse signalering naar de gevoeligheid van de axonen moduleren de lokale richtlijnen 2,3 signalen. Hier beschrijven we een werkwijze die het mogelijk maakt onderzoek naar de eigenschappen van bodemplaat afgeleide signalen in verschillende ontwiklopmental contexten, gebaseerd op de productie van vloer-Plate geconditioneerd medium (FP cm) 4-6. We illustreren dan het gebruik van dit FP cm in de context van axon guidance. Eerst wordt het ruggenmerg geïsoleerd uit muizenembryo op E12.5 en de bodemplaat wordt uitgesneden en gekweekt in een plasma-trombine matrix (figuur 1). Tweede twee dagen later worden commissural weefsel ontleed uit E12.5 embryo&#39;s, fijngewreven en blootgesteld aan de FP cm. Ten derde, het weefsel verwerkt voor Western blot analyse van commissural merkers.

Commissural weefsels werden behandeld met de FP cm en de monsters werden voor analyse van receptor niveaus in Western blot. Toepassing van de FV cm bleek de niveaus van een leiding receptor, PlexinA1, die de gevoeligheid van commissurale axonen aan de middellijn afstotende Semaphorin3B bemiddelt na splitsing (figuur 2) te verhogen. Hieruit bleek dat signalen vrijgegeven door de FP reguleren PlexinA1 niveaus 4,6. <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page="a...

De vloerplaat is een cruciale structuur van de ontwikkeling van het ruggenmerg, waardoor dampdoorlatend signalen naar voorouders en differentiëren neuronen. We beschrijven een methode om vloer-plaat geconditioneerd medium produceren, toe te passen op verse ruggenmerg weefsel, en de consequenties daarvan op de eiwitten van belang door biochemie.

Cultuur van Geïsoleerde Vloerplaat Tissue en productie van geconditioneerd medium om functionele eigenschappen van Floor-plaat uitgebracht Signalen Assess

During development, progenitors and post-mitotic neurons receive signals from adjacent territories that regulate their fate. The floor-plate is a group of ...

Het algemene doel van deze procedure is om de eigenschappen van de signalen die zijn afgeleid van de vloerplaat te onderzoeken in verschillende ontwikkelingscontexten op basis van de productie van vloerplaat geconditioneerd medium. Dit wordt bereikt door eerst de ruggenmerg van het muisembryo bij E 12.5 te isoleren en de vloerplaat te verwijderen. De tweede stap is om de vloerplaat te cultiveren in een plasma trombine matrix om vloerplaat geconditioneerd medium te produceren.Vervolgens worden de ruggenmergen van muisembryo's bij E 12.5 geïsoleerd en wordt dorsaal weefsel dat comm, koorneuronen bevat, verwijderd. De laatste stap is de tation en blootstelling van gedisseceerd comm-weefsel aan monsters van vloerplaat geconditioneerd medium. Uiteindelijk wordt het weefsel verwerkt voor biochemische analyse zoals western blot om de expressie van commissural markers te tonen.Deze methode kan helpen bij vragen in het veld van ontwikkelingsbiologie. Signalen die vrijkomen door de vloerplaat spelen cruciale rollen bij het reguleren van celvet, differentiatie, proliferatie en axon geleiding van weefsel en cellen van verschillende oorsprong. ZA worden blootgesteld aan vloerplaatconditioneel m

culture-isolated-floor-plate-tissue-production-conditioned-medium-to

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

We stellen een nieuwe werkwijze voor het onderhoud van menselijke intestinale mucosa in cultuur en controle van de reactie op verschillende soorten stimuli gedurende tenminste 24 uur. Bij onze werkwijze, wordt de polariteit van het weefsel gehandhaafd, waardoor een fysiologische stimulering via de apicale route.

Een nieuwe methode voor de cultuur en de gepolariseerde Stimulatie van Human darmslijmvlies Explantaten

Bacteriën produceren uitgescheiden verbindingen die het potentieel heeft om de fysiologie van hun microbiële buren beïnvloeden. Hier beschrijven we een coculture scherm dat de opsporing van dergelijke chemisch gemedieerde interspecies interacties door het mengen bodemmicroben met fluorescerende transcriptionele reporter stammen van Bacillus subtilis op vaste media toelaat.

Met behulp Coculture te sporen Chemisch Mediated Interspecies Interacties

Het volgende protocol beschrijft de procedure om sandwich-achtige culturen te assembleren die kunnen worden gebruikt als een tussenstadium tussen bi-dimensionele (2D) en driedimensionale (3D) cellulaire omgevingen. De ontworpen systemen kunnen toepassingen hebben in microscopie, biomechanica, biochemie en celbiologie assays.

Sandwich-achtige microenvironments Harness Cell / Material Interactions

In vitro testen van kolonies op zelfvernieuwing en differentiatie van progenitorcellen geïsoleerd uit volwassen muizen pancreas gedetecteerd worden gepland. In deze testen pancreatische voorlopercellen leiden tot cel kolonies in 3-dimensionale ruimte-methylcellulose bevattende halfvaste medium. Protocollen voor het manipuleren van enkelvoudige cellen en karakterisering van individuele kolonies worden beschreven.

In Vitro Kolonie assays voor het karakteriseren van Tri-potente Progenitor Cellen Geïsoleerd van de volwassen muizen alvleesklier

De extracellulaire matrix speelt een belangrijke rol bij het definiëren van de micro-omgeving van cellen en bij het moduleren van celgedrag en fenotype. We beschrijven een snelle methode voor de isolatie van cel-afgeleide extracellulaire matrix, die kan worden aangepast aan verschillende schalen voor microscopische, biochemische, proteomische of functionele studies.

Een snelle, schaalbare methode voor het isoleren, functionele studie en analyse van cel-afgeleide extracellulaire matrix

Dit protocol biedt een rendabele aanpak om te isoleren en karakteriseren van muis primaire renale tubulaire cellen die vervolgens sub kunnen worden gekweekt om te beoordelen renale biologische functies- ex vivo, met inbegrip van de mitochondriale Bioenergetica.

Isolatie, karakterisering en High Throughput extracellulaire Flux-analyse van muis primaire renale tubulaire epitheliale cellen

Enterochromaffin (EG) cellen bestaan uit een kleine subset van gastro-intestinale epitheliale cellen. EG cellen zijn elektrisch prikkelbaar en vrij serotonine, nog moeilijkheden in kweken en het identificeren van de EG cellen hebben beperkte fysiologische studies. De methode die hier gepresenteerd wordt een primaire cultuur model vatbaar voor onderzoek van afzonderlijke cellen van de EG vastgesteld door electrofysiologie.

Hele cel electrofysiologie van primaire gekweekte lymfkliertest Enterochromaffin cellen

Dit manuscript beschrijft een gedetailleerd protocol om arrays van 3D menselijke skeletspierenmicrotissues en minimaal invasieve downstream in situ assays van functie te produceren, inclusief contractiele kracht en calciumbehandelingsanalyses.

Beoordeling van functionele statistieken van de gezondheid van skeletspieren in microtissues van menselijke skeletspieren

We beschrijven een aanpak om invasieve celsubpopulaties in realtime te detecteren en vast te leggen. Het experimentele ontwerp maakt gebruik van Real-Time Cellular Analysis door veranderingen in de elektrische impedantie van cellen te monitoren. Invasieve kanker, immuun-, endotheel- of stromale cellen in complexe weefsels kunnen worden vastgelegd en de impact van coculturen kan worden beoordeeld.

Real-time detectie en vastlegging van invasieve celsubpopulaties uit coculturen

Het gepresenteerde protocol beschrijft de ontwikkeling en het gebruik van een op falloidine gebaseerde filamenteuze actinekleuringstechniek met confocale laserscanmicroscopie (CLSM) om de aanhangende cellaagstructuur in microfluïdische dynamische cultuurkanalen en traditionele statische-cultuurkamers met vaste put te visualiseren. Deze benadering helpt bij het evalueren van cellaagconfluentie, monolaagvorming en uniformiteit van laagdikte.

Voorbereiding en structurele evaluatie van epitheelcelmonolagen in een fysiologisch groot microfluïdisch kweekapparaat

Hier presenteren we een protocol voor het kweken van IDG-SW3-cellen in een driedimensionale (3D) extracellulaire matrix.

IDG-SW3-celkweek in een driedimensionale extracellulaire matrix

Leer de isolatie en cultuur van vloerplaatweefsel uit muizenembryo's om geconditioneerd medium te produceren voor het bestuderen van neurale signaaloverdracht in de ontwikkelende ruggengraat.

Cultuur van Geïsoleerde Vloerplaat Tissue en productie van geconditioneerd medium om functionele eigenschappen van Floor-plaat uitgebracht Signalen Assess (Video) | JoVE Journal

Cultuur van Geïsoleerde Vloerplaat Tissue en productie van geconditioneerd medium om functionele eigenschappen van Floor-plaat uitgebracht Signalen Assess

Meer video's verkennen