Twee-foton Beeldvorming Calcium in Muizen navigeren van een Virtual Reality-omgeving
20 februari 2014
Hier beschrijven we de experimentele procedures betrokken bij twee-foton beeldvorming van de muis cortex tijdens gedrag in een virtual reality omgeving.
Het algemene doel van het volgende experiment is om de belangrijkste aspecten van chronische twee-foton beeldvorming bij muizen uit te voeren, waarbij een virtuele realiteit omgeving wordt verkend. Dit wordt bereikt door een twee-foton microscoop aan te passen voor snel en stabiel beeldvorming bij bewegende muizen. Vervolgens wordt een door lucht ondersteunde loopband opgezet die geschikt is voor het volgen van de bewegingen.
Vervolgens wordt een virtuele realiteit omgeving voorbereid die een LED-projector gebruikt, gesynchroniseerd met de microscoop om lichtlek te minimaliseren. Hierdoor worden goede en stabiele beeldopnames verkregen door de vermindering van bewegingsartefacten, de vermindering van lichtlek en de minimalisatie van fotoschade aan de rand. Hoewel deze methode kan worden gebruikt om neuroactiviteit te meten tijdens navigatie in een virtuele realiteit omgeving, kan deze ook eenvoudig worden aangepast aan een breed scala van verschillende gedragsparadigma's die visuele stimulatie vereisen.
Alle dierproeven zijn goedgekeurd en uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen van de veterinaire afdeling van de Kanton Basil sta. De twee-foton microscoop die in deze experimenten wordt gebruikt, bestaat uit een scankop die bestaat uit een acht of 12 kilohertz resonante scanner en een standaard galvanometer. Dit maakt beeldsnelheden van 40 of 60 hertz mogelijk bij 750 keer 400 pixels en vermindert door hersenbeweging veroorzaakte beeldvervorming, fotobleken en fototoxiciteit.
Een piëzo-elektrische hoge snelheid Z-stepper wordt gebruikt om sequentieel tijdsgeïnterlinieerde beelden te achterhalen op meerdere diepten. Een mechanische blanker wordt gebruikt om de laserblootstelling aan het weefsel te verminderen op de omslagpunten van het scanpad, de blanker moet instelbaar zijn om de breedte in te stellen. Afhankelijk van de amplitude van de resonante scanner, verbindt u een luchttoevoerslang met minimaal een binnendiameter van 10 millimeter met de balhouder van de loopband en plaatst u een BLE-hoeveelheid slang tussen de hoofdluchttoevoer en de balhouder om ruis te verminderen.
Plaats een polystyreenschuimbal met een diameter van 20 centimeter in een op maat gemaakte en 3D-geprinte balhouder. Als het gedragsparadigma alleen voorwaartse en achterwaartse beweging vereist, plaatst u een pin zoals een 19 gauge hypodermische naald aan de zijkant van de bal. Om de beweging van de bal in de horizontale as te beperken, gebruikt u een of twee optische computermuizen om de beweging van de bal rond twee of alle drie de assen te volgen.
Gebruik LED-projectoren of LED-achterverlichte computerschermen voor het display om de virtuele realiteit omgeving voor te bereiden. Integreer een gatingcircuit voor snel flikkeren van de LED's tijdens beeldvorming. De flikkerfrequentie van 24 kilohertz is vele malen hoger dan de flikkerfusiedrempel, waarboven flikkeren niet langer wordt waargenomen door het dier.
Stel de exacte flikkerfrequentie en duty cycle in om de lichtuitvoer van de projector te synchroniseren met de omslagpunten van de resonante scanner voor pupiltracking, gebruik een CMOs-gebaseerde videocamera. Zorg ervoor dat de camera geen infraroodblokkerende filter bevat. Ongeveer twee tot drie weken na het injecteren van de genetische calciumindicator en het implanteren van een schedelvenster, gebruik epi-fluorescentie-verlichting om het schedelvenster-implantaat te controleren op duidelijkheid en expressie.
Duidelijk zichtbaar en scherp gedefinieerd. Grenzen van oppervlakkige bloedvaten zijn een goede indicatie dat het venster-implantaat geschikt is voor beeldvorming een tot twee dagen later. Om het twee-foton experiment uit te voeren, meet en stelt u het laservermogen in op een waarde onder de 50 milliwatt op het monster.
Zet vervolgens de luchtstroom naar de sferische loopband aan. Plaats vervolgens het dier met de kop op de sferische loopband. De eerste paar keer wordt de muis met de kop vastgezet.
Dit proces kan worden vergemakkelijkt door het dier kort te sederen met isofluorine. Zodra het dier aan de procedure is gewend, kan het monteren normaal gesproken zonder sedatie worden uitgevoerd. Merk op dat het van cruciaal belang is om stress voor het dier tijdens deze procedure te minimaliseren.
Plaats vervolgens het visuele displaysysteem zo dicht mogelijk bij het dier om nog steeds toegang tot het dier mogelijk te maken. Zorg ervoor dat het schedelvenster-implantaat vrij is van vuil en maak het schoon met water indien nodig, breng helder ultrasoon gel aan als immersiemedium tussen het schedelvenster en het water-immersieobjectief voor lichtafscherming. Wikkel een stuk zwart plakband rond het objectief en de hoofdbalk.
Verplaats de virtuele omgeving naar zijn eindpositie en stel de videocamera in voor pupiltracking. Stel tenslotte de laserblanker in om overeen te komen met de scanslag die tijdens het experiment wordt gebruikt en start het opnemen van gegevens wanneer experimenten voltooid zijn. Euthanasie het dier volgens de richtlijnen van uw instelling.
De beeldkwaliteit in twee-foton calciumbeeldvorming van celpopulaties gelabeld met een genetische calciumindicator hangt grotendeels af van de kwaliteit van het schedelvenster-implantaat zoals hier wordt aangetoond bij het controleren van het schedelvenster op duidelijkheid na virusinjectie, er mogen geen granulatieweefsel of botweefselgroei zichtbaar zijn. Bovendien moet het patroon van oppervlakkige bloedvaten onveranderd blijven en de grenzen van de vaatbundel moeten scherp gedefinieerd zijn. Tegelijkertijd moet BOI van gelabelde cellen duidelijk zichtbaar zijn onder een epi-fluorescentiemicroscoop.
Idealiter is de voorbereiding stabiel genoeg zodat vervormingen van de twee-foton beelden veroorzaakt door de bewegingen van de muis niet zichtbaar zijn in het beeld na frameregistratie. Lichtlek van het visuele stimulatiesysteem kan volledig worden afgeschaft door de lichtuitvoer van de projector correct te timen met de omslagpunten van de resonante scanner. Wanneer gegevens niet worden verzameld, moet de flikkerfrequentie van de lichtbron twee keer de scanfrequentie zijn.
In dit voorbeeld is de blanker verwijderd om het effect van lichtlek te illustreren dat wordt getoond in de oranje vakken tijdens visuele stimulatie. Na het
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel beschrijft de experimentele procedures voor chronische tweefoton-beeldvorming van de cortex van de muis terwijl de proefpersonen door een virtuele realiteitsomgeving navigeren. De methodologie richt zich op het minimaliseren van artefacten en het verbeteren van de beeldkwaliteit tijdens gedragsstudies.
Belangrijkste componenten van de studie
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Beeldvormingstechnieken
- Gedragsstudies
Achtergrond
- Chronische twee-foton imaging maakt het mogelijk om neuroactiviteit in levende proefpersonen te observeren.
- Virtual reality-omgevingen kunnen gecontroleerde stimuli bieden voor gedragsexperimenten.
- Het minimaliseren van lichtlekkage en bewegingsartefacten is cruciaal voor beelden van hoge kwaliteit.
- Aanpasbare methoden kunnen worden toegepast op diverse gedragsparadigma's.
Doel van de studie
- Om neuroactiviteit bij muizen te onderzoeken tijdens navigatie in een virtuele realiteitsomgeving.
- Om een stabiele imaging-opstelling te ontwikkelen die beweging mogelijk maakt.
- Om het begrip van de hersenfunctie in reactie op visuele stimuli te verbeteren.
Gebruikte methoden
- Modificatie van een tweefotonmicroscoop voor snelle beeldvorming.
- Opstelling van een luchtgestuurd loopband voor het volgen van locomotie.
- Voorbereiding van een gesynchroniseerde virtual reality-omgeving met behulp van een LED-projector.
- Implementatie van technieken om bewegingsartefacten en lichtlekkage te verminderen.
Belangrijkste resultaten
- Stabiele en hoogwaardige beeldopnames werden behaald.
- Verminderde bewegingsartefacten verbeterden de betrouwbaarheid van de metingen van de neuroactiviteit.
- De methode is veelzijdig en kan worden aangepast voor diverse gedragsstudies.
- Succesvolle demonstratie van de meting van neuroactiviteit tijdens navigatietaken.
Conclusies
- De aangepaste imaging-opstelling is effectief voor het bestuderen van hersenactiviteit in gedragende muizen.
- Virtual reality-omgevingen bieden waardevolle inzichten in neurale responsen op stimuli.
- Deze benadering kan worden ingezet in een breed scala aan experimentele paradigma's.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de Industrie
Deze methode maakt chronische, high-fidelity monitoring van neurale activiteit in bewegende muizen mogelijk, wat bijdraagt aan target-validatie en mechanistische risicoreductie bij de ontdekking van neurowetenschappelijke geneesmiddelen. Door tweefoton-imaging tijdens locomotie te stabiliseren, wordt de voorspellende betrouwbaarheid in studies naar pathway-modulatie verbeterd. De aanpak slaat een brug tussen in vitro bevindingen en in vivo functionele read-outs, waardoor de translationele continuïteit voor therapeutica gericht op het centrale zenuwstelsel wordt vergroot.
Strategische Toepassingen in Biopharma R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het mogelijk om therapeutische hypothesen te onderzoeken via celtypespecifieke calciumdynamiek tijdens doelgerichte navigatie.
- Operationele waarde: Vermindert mechanistische ambiguïteit door neuronale populatieactiviteit te koppelen aan gedefinieerde gedragsmatige output in een gecontroleerd VR-paradigma.
- Voorspellende waarde: Ondersteunt portfoliotriage door kwantificeerbare, reproduceerbare neurofysiologische read-outs van target-engagement te leveren.
Screening & assayontwikkeling
- Klaarheid van de assay: Bereidt gevalideerde biologische systemen voor op downstream compound-screening door stabiele, artefact-geminimaliseerde imaging-windows vast te stellen.
- Kwantitatieve output: Maakt fluorescentiegebaseerde metingen van de afhankelijke variabele (ΔF/F) mogelijk die dosis-respons- en kinetische analyses ondersteunen.
- Schaalbaarheid: Ondersteunt het hergebruik van het platform over verschillende gedragsparadigma's dankzij gesynchroniseerde LED-projectie en bewegingsvolg-infrastructuur.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Relevantie voor ziektebeelden: Faciliteert de studie naar dysfunctie van neurale circuits in modellen die relevant zijn voor neuropsychiatrische en neurodegeneratieve indicaties.
- Translationele continuïteit: Verbindt vroege ontdekkingsmechanismen met preklinische validatie via consistente, longitudinale metingen van neuronale activiteit.
- Risico-gecorrigeerde voortgang: Informeert go/no-go-beslissingen door te onthullen of targetmodulatie de verwachte effecten op circuitniveau produceert tijdens het gedrag.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode is geïntegreerd in het ontdekkingscontinuüm, van hypothesetoetsing tot leadoptimalisatie, en levert mechanistische resultaten die bijdragen aan de selectie van targets en de prioritering van verbindingen.
- Discovery Biology: Ondersteunt de verduidelijking van signaalpaden en targetvalidatie door cel-specifieke activiteitsmapping tijdens navigatietaken mogelijk te maken.
- Screening: Biedt assay-gereedheid en reproduceerbare kwantitatieve output, essentieel voor een betrouwbare evaluatie van verbindingen in CNS-programma's.
- Analytics: Levert ΔF/F-metingen en tijdgekoppelde gedragsmatige correlaties die statistische vergelijking van experimentele condities mogelijk maken.
- Translationeel onderzoek: Waarborgt continuïteit van discovery naar preklinisch werk via stabiele, chronische imaging van genetisch gedefinieerde neuronale populaties.
- Enterprise Reuse: Vestigt een herbruikbaar imaging-platform dat aanpasbaar is aan diverse visuele stimuleringsparadigma's over meerdere projecten heen.
Operationele impact en impact op de organisatie
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen in doelwitmodulatie door ruis van bewegingsartefacten en lichtlekkage te verminderen.
- Operationele waarde: Verbetert de reproduceerbaarheid en standaardisatie door gesynchroniseerde laser-blanking en pupiltracking.
- Strategische waarde: Verbetert de kapitaalefficiëntie door het verminderen van uitvalpercentages in latere stadia van CNS-programma's via vroege mechanistische risicoreductie.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering van verbindingen mogelijk op basis van functionele effecten op neurale circuits in plaats van enkel op bindingsaffiniteit.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in craniale vensterchirurgie, expressie van genetische calciumindicatoren en de uitlijning van tweefoton-systemen.
- Is afhankelijk van resonant scannen met hoge snelheid, piëzo-elektrische Z-stapverplaatsing en LED-projectiesystemen met gating-circuits.
- Maakt cross-team standaardisatie mogelijk voor chirurgische voorbereiding, gedragstraining en image processing-pipelines.
- Moet rekening houden met modelspecifieke aanpassingen in hoofdfixatie, loopbandmechanica en visuele veldekking.
- Praktische beperkingen omvatten het chirurgische levensvatbaarheidsvenster, de stabiliteit van de indicatorexpressie en de gevoeligheid voor resterende bewegingsartefacten ondanks correctie.
