Name: Twee-foton Beeldvorming Calcium in Muizen navigeren van een Virtual Reality-omgeving (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-02-20T22:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 12 s
Description: Leer chronische twee-foton calciumbeeldvorming bij muizen tijdens navigatie in een virtual reality-omgeving. Deze methode minimaliseert bewegingsartefacten en lichtlek voor stabiele neuroactiviteitsmetingen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door de Friedrich Miescher Instituut voor Biomedisch Onderzoek, het Max Planck Society, en het Human Frontier Science Program.

Alle dierlijke procedures werden goedgekeurd en uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen van de veterinaire afdeling van het kanton Basel-Stadt uitgevoerd. 1. Hardware-en software-installatie <ol><li> Twee-foton scanning microscoop setup: <ol><li> Gebruik een gepulste infrarode laser als lichtbron (pulsbreedte &lt;120 FSEC). </li><li> Gebruik een scan hoofd bestaat uit een 8 of 12 kHz resonantie scanner en een standaard galvanometer. Opmerking: Dit maakt frame rates van 40 of 60 Hz bij 750 x 400 pixels. Een hoge framerate is van cruciaal belang voor het minimaliseren van de hersenen beweging geïnduceerde beeldvervorming. Bovendien, snelle resonante scanresultaten in een hogere signaal rendement en vermindert fotobleken 16 en fototoxiciteit. </li><li> Gebruik een Piëzo-elektrische hoge snelheid z-stepper te verwerven tijd interleaved beelden sequentieel op meerdere dieptes. Opmerking: Dit is optioneel en wordt gebruikt om gegevens opbrengst te verhogen ten koste van de framerate. </li><li> Gebruik amechanische uitschakel laser blootstelling aan het weefsel verminderen. De breedte van de uitschakel afhankelijk van de amplitude van de resonante scanner. Opmerking: Door de sinusvormige aard van het scanpad van een resonante scanner, de laserstraal beweegt relatief traag aan het scan om te keren. Om beschadiging van het weefsel op deze ommekeer punten waar de blootstelling laser is het grootst te voorkomen, wordt een mechanische blanker geïntroduceerd in het brandvlak tussen de scan en de buis lenzen die de laserstraal stopt. </li><li> Voor data-acquisitie gebruik van een hoge snelheid digitizer (800 MHz) in combinatie met een field-programmable gate array (FPGA). Opmerking: De FPGA high-pass filters en bakken de PMT-signaal in pixels. De combinatie van het hoogdoorlaatfilter van de FPGA en de effectieve laagdoorlaatfilter op de PMT versterker resulteren in een banddoorlaatfilter ruwweg gecentreerd rond de herhalingsfrequentie van de laser (80 MHz). Monster FPGA-code wordt geleverd als een aanvulling. </li></ol></li><li> Opblaasbare loopband setup gebaseerd op het ontwerp van Dombeck en collega&#39;s 2 <ol><li> Sluit de bal houder om een ​​luchttoevoer lijn met behulp van een luchttoevoer buis van minimaal 10 mm binnendiameter. Maximaliseren van de dwarsdoorsnede van de bal houder luchttoevoer inlaat en plaats ruime hoeveelheid slang tussen de belangrijkste luchttoevoer en de bal houder. Opmerking: Verhoogde doorsnede en toename van de lengte van de luchttoevoer buis vermindert ruis generatie. </li><li> Plaats een piepschuim bal (20 cm diameter) in een op maat ontworpen en 3D-gedrukte bal houder. </li><li> Als de gedragsmatige paradigma vereist alleen vooruit (en achteruit) motoriek, beperken beweging van de bal naar de horizontale (pitch) as door het invoegen van een pen (bv. een 19 G injectienaald) aan de kant van de bal. Opmerking: Typisch dieren zich aanpassen aan de installatie veel sneller in deze gereduceerde rotatie paradigma. </li><li> Track beweging van de bal met behulp van een of twee optische computermuizendetecteren beweging rond twee of drie assen, respectievelijk. Opmerking: De computer muizen idealiter werken met een infrarood diode minste interferentie met de beeldvorming. </li></ol></li><li> Virtual reality omgeving setup <ol><li> Bereid de virtual reality omgeving. Opmerking: Een monster omgeving op basis van Panda3D, een vrij beschikbare game-engine, wordt geleverd als een aanvulling. De objecten van de virtuele omgeving worden gegenereerd met behulp van Wings3D, een open source 3D modeler. Het monster programma leest positie-informatie op een data-acquisitie kaart en vertaalt deze in beweging in de virtuele omgeving. De code voert ook de niet-lineaire transformatie die nodig zijn voor het milieu te worden geprojecteerd op een ringkern scherm. De gedetailleerde constructie van de ringkern scherm is elders 14,17 beschreven. </li><li> Gebruik LED projectoren of LED backlit beeldschermen voor de weergave van de virtuele omgeving. Integreer een gating circuit voor het snel knipperen van de LED&#39;s tijdens de beeldvorming. Opmerking: Een inherent probleem in twee-foton beeldvorming tijdens visuele stimulatie is licht rook afkomstig van het visuele stimulatie systeem, die kan worden verminderd door het afschermen van de doelstelling. Echter, licht lekken van de visuele stimulatie systeem volledig worden afgeschaft door het synchroniseren van de lichtopbrengst van de projector om de ommekeer punten van de resonante scanner (wanneer gegevens niet worden verworven), zoals wordt gedaan met LED-arena gebruikt voor visuele stimulatie tijdens de beeldvorming in Drosophila 18. Dit resulteert in een effectieve snelle afwisseling van visuele stimulatie en data acquisitie (zie figuur 2). De flikkering frequentie (24 kHz) is ordes van grootte hoger dan de flikkering fusie drempel, waarboven het trillen wordt niet langer gezien door het dier. De elektronische schema van deze wijziging een commerciële LED projector getoond in figuur 3. </li></ol></li><li> Jongenil volgen <ol><li> Gebruik een CMOS-gebaseerde video-camera (30 fps) voor pupilpositie tracking. Zorg ervoor dat de camera een infrarood blocking filter bevat. Opmerking: De leerling is zichtbaar bij hoge contrast tijdens opnames als gevolg van strooilicht van de twee-foton excitatie laser verlaten door het oog. Pupilpositie en diameter wordt geëxtraheerd in real time met speciaal geprogrammeerde software gebaseerd op het ontwerp van Sakatani en Isa 19. </li></ol></li></ol> 2. Injectie van Genetische Calcium Indicator en Window Implant De injectie van een calcium indicator 20 en de implantatie van de craniale venster 21 worden uitgevoerd zoals eerder beschreven met de volgende toevoegingen: <ol><li> Injecteer het virus in het gebied van belang met een glazen injectiepipet opgevuld met virusoplossing en op een druk injectiesysteem. Stel de druk afhankelijk van de pipet binnen-diameter, typisch ongeveer. 70-140 mbar tot ongeveer 100 nl van virusoplossing injecteren in de loop van 1-2 minuten. Laag Volume injectie pulsen bij lage frequentie (0,05 seconden pulsen bij 2 Hz) worden gebruikt om overloop van het virus aan de pipet tijdens injectie te voorkomen. Opmerking: Om het injectievolume bewaken, kan de pipet op kleine gemarkeerd , gelijkmatig verdeeld lengtes (bv. 0,5 mm) onder een stereo microscoop. Verplaatsing van de meniscus tussen de markeringen kan dan gebruikt worden om het geïnjecteerde volume te schatten. </li><li> Enkele weken na injectie moet dit leiden tot een bolus van dicht gemerkte cellen met een diameter van ongeveer 500 urn. Werkzaamheid van GECI expressie in het interessegebied afhankelijk van de keuze van GECI en promotor combinatie, en de infectieuze titer en serotype van het recombinante AAV gebruikt. Opmerking: Als een representatief voorbeeld injectie van AAV2/1-EF1α-GCaMP5 met een virale titer of 8 x 10 12 GC / ml in primaire visuele cortex van muis leidt bevredigende expressie ongeveer twee weken na de injectie (Figuur 1). </li><li> Het hoofd balk moet niet het gezichtsveld van de muis belemmeren, maar stijf genoeg om te zorgen voor een stabiele beeldvorming tijdens gedrag zou moeten zijn. Dit vereist meestal twee bevestigingspunten aan weerszijden van de kopboom (zie figuur 1). Om het hoofd bar aan de schedel goed vast, zorg ervoor om te maximaliseren en droog het gebied van de blootgestelde schedel waar de hoofd bar zal worden gehecht. Bovendien, met behulp van een scalpel of een spuit, krassen op de schedel om oppervlakkige groeven waardoor het oppervlak toenemende lijmen creëren. Bedek het bot met cyanoacrylaat weefselhechtmiddel voordat u het hoofd bar met tandheelkundige cement. </li></ol> 3. Experimentele procedure <ol><li> Twee tot drie weken na virus injectie, controleer dan de craniale venster implantaat voor duidelijkheid en expressie onder epifluorescentie verlichting. Duidelijk zichtbaar en scherp gedefinieerde grenzen van oppervlakkige bloedvaten een goede indicatie dat het raam implantaat geschikt is voor beeldvorming (zie figuur 1). </li><li> Meet en pas laservermogen tot een waarde onder 50 mW bij het monster. </li><li> Zet de luchtstroom naar de bolvormige loopband. </li><li> Voor hoofd fixatie onder de microscoop, kort verdoven het dier met isofluraan om stress te verminderen. Plaats het dier in een isofluraananesthesie container en wacht tot het dier stopt met bewegen (ongeveer 10 sec). Haal het dier onmiddellijk hoofd repareren onder de microscoop. </li><li> Plaats de visuele weergave systeem zo dicht mogelijk bij het dier nog steeds de mogelijkheid om toegang tot het dier. Hoe minder visueel contact met het dier de experimentator, hoe minder stress zal het dier tijdens de beginfase van het experiment. </li><li> Zorg ervoor dat de craniale venster implantaat is vrij van stof en vuil. Schoon met waterindien nodig. </li><li> Solliciteer duidelijk ultrasound gel als onderdompeling medium tussen de craniale raam en water-immersie objectief. Dit lost de problemen van langzame verslechtering van het beeld als gevolg van water verdamping of lekkage en vermindert de noodzaak om een kegel te monteren op het hoofd bar om water vast te houden. Opmerking: Centrifuge de gel vóór gebruik om alle luchtbellen te verwijderen, en verzorgen alle lucht te creëren bellen tijdens het aanbrengen van de gel. Luchtbellen ernstig verminderen beeldkwaliteit. </li><li> Wikkel een stukje zwarte tape rond het doel en de hoofd bar voor lichte afscherming. </li><li> Verplaats de virtuele omgeving arena om zijn definitieve positie en pas de videocamera voor pupil tracking. </li><li> Stel de laser uitschakel de scan amplitude tijdens het experiment passen. </li><li> Start de opname van gegevens. </li></ol>

<ol><li>Helmchen, F., Fee, M. S., Tank, D. W., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Miniature+Head-Mounted+Two-Photon+MicroscopeHigh-Resolution+Brain+Imaging+in+Freely+Moving+Animals%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">A Miniature Head-Mounted Two-Photon MicroscopeHigh-Resolution Brain Imaging in Freely Moving Animals.</a> Neuron. 31 (6), 903-912 (2001).</li>
<li>Dombeck, D. A., Khabbaz, A. N., Collman, F., Adelman, T. L., Tank, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+large-scale+neural+activity+with+cellular+resolution+in+awake%2C+mobile+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Imaging large-scale neural activity with cellular resolution in awake, mobile mice.</a> Neuron. 56, 43-57 (2007).</li>
<li>Dombeck, D. A., Harvey, C. D., Tian, L., Looger, L. L., Tank, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+imaging+of+hippocampal+place+cells+at+cellular+resolution+during+virtual+navigation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Functional imaging of hippocampal place cells at cellular resolution during virtual navigation.</a> Nat. Neurosci. 13 (11), 1433-1440 (2010).</li>
<li>Harvey, C. D., Coen, P., Tank, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Choice-specific+sequences+in+parietal+cortex+during+a+virtual-navigation+decision+task%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Choice-specific sequences in parietal cortex during a virtual-navigation decision task.</a> Nature. 484 (7395), 62-68 (2012).</li>
<li>Huber, D., Gutnisky, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+dynamic+representations+in+the+motor+cortex+during+sensorimotor+learning%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Multiple dynamic representations in the motor cortex during sensorimotor learning.</a> Nature. 484 (7395), 473-478 (2012).</li>
<li>Keller, G. B., Bonhoeffer, T., Hübener, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensorimotor+mismatch+signals+in+primary+visual+cortex+of+the+behaving+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Sensorimotor mismatch signals in primary visual cortex of the behaving mouse.</a> Neuron. 74 (5), 809-815 (2012).</li>
<li>Akerboom, J., Chen, T. -W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+a+GCaMP+Calcium+Indicator+for+Neural+Activity+Imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Optimization of a GCaMP Calcium Indicator for Neural Activity Imaging.</a> J. Neurosci. 32 (40), 13819-13840 (2012).</li>
<li>Zhao, Y., Araki, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+expanded+palette+of+genetically+encoded+Ca2%2B+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">An expanded palette of genetically encoded Ca2+ indicators.</a> Science. 333 (6051), 1888-1891 (2011).</li>
<li>Mittmann, W., Wallace, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+calcium+imaging+of+evoked+activity+from+L5+somatosensory+neurons+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Two-photon calcium imaging of evoked activity from L5 somatosensory neurons in vivo.</a> Nat. Neurosci. 14 (8), 1089-1893 (2011).</li>
<li>Katona, G., Szalay, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+two-photon+in+vivo+imaging+with+three-dimensional+random-access+scanning+in+large+tissue+volumes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Fast two-photon in vivo imaging with three-dimensional random-access scanning in large tissue volumes.</a> Nat. Methods. 9 (2), 201-208 (2012).</li>
<li>Mank, M., Santos, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetically+encoded+calcium+indicator+for+chronic+in+vivo+two-photon+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">A genetically encoded calcium indicator for chronic in vivo two-photon imaging.</a> Nat. Methods. 5 (9), 805-811 (2008).</li>
<li>Margolis, D. J., Lütcke, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reorganization+of+cortical+population+activity+imaged+throughout+long-term+sensory+deprivation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Reorganization of cortical population activity imaged throughout long-term sensory deprivation.</a> Nat. Neurosci. 15 (11), 1539-1546 (2012).</li>
<li>Zariwala, H. A., Borghuis, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Cre-dependent+GCaMP3+reporter+mouse+for+neuronal+imaging+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A Cre-dependent GCaMP3 reporter mouse for neuronal imaging in vivo.</a> J. Neurosci. 32 (9), 3131-3141 (2012).</li>
<li>Harvey, C. D., Collman, F., Dombeck, D. A., Tank, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+dynamics+of+hippocampal+place+cells+during+virtual+navigation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Intracellular dynamics of hippocampal place cells during virtual navigation.</a> Nature. 461 (7266), 941-946 (2009).</li>
<li>Hölscher, C., Schnee, A., Dahmen, H., Setia, L., Mallot, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rats+are+able+to+navigate+in+virtual+environments%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Biol%22%5BJournal%5D)">Rats are able to navigate in virtual environments.</a> J. Exp. Biol. 208, 561-5519 (2005).</li>
<li>Borlinghaus, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MRT+letter%3A+high+speed+scanning+has+the+potential+to+increase+fluorescence+yield+and+to+reduce+photobleaching%29%5BTitle%5D)+AND+%22Microsc.+Res.+Tech%22%5BJournal%5D)">MRT letter: high speed scanning has the potential to increase fluorescence yield and to reduce photobleaching).</a> Microsc. Res. Tech. 69 (9), 689-692 (2006).</li>
<li>Reiff, D. F., Plett, J., Mank, M., Griesbeck, O., Borst, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virtual+Reality+for+Mice%2C+mousevr.blogspot.com%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Virtual Reality for Mice, mousevr.blogspot.com.</a> Nat. Neurosci. 13, 973-978 (2010).</li>
<li>Sakatani, T., Isa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+spontaneous+saccade-like+rapid+eye+movements+in+C57BL%2F6+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci.+Res%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of spontaneous saccade-like rapid eye movements in C57BL/6 mice.</a> Neurosci. Res. 58, 324-331 (2007).</li>
<li>Golshani, P., Portera-Cailliau, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+2-photon+calcium+imaging+in+layer+2%2F3+of+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">In vivo 2-photon calcium imaging in layer 2/3 of mice.</a> J. Vis. Exp. (13), (2008).</li>
<li>Holtmaat, A., Bonhoeffer, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term%2C+high-resolution+imaging+in+the+mouse+neocortex+through+a+chronic+cranial+window%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Long-term, high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window.</a> Nat. Protoc. 4 (8), 1128-1144 (2009).</li>
<li>Schmidt-Hieber, C., Häusser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+mechanisms+of+spatial+navigation+in+the+medial+entorhinal+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Cellular mechanisms of spatial navigation in the medial entorhinal cortex.</a> Nat. Neurosci. 16 (3), 325-331 (2013).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen.

De sleutel tot het succes van gedrags twee-foton beeldvorming is de stabiliteit van het preparaat op twee manieren: <ol><li> In de loop van de dagen na de implantatie venster, kan ontstekingsreacties van het weefsel leiden tot verbetering van de vorming van granulatieweefsel en kraakbeen dat zal belemmeren of zelfs beeldvorming te voorkomen. </li><li> Tijdens het experiment de hersenen stabiel genoeg om te voorkomen bewegingsartefacten van beschadiging neurale activiteit met betrekking fluorescentiesignaal is. </li>...

Twee-foton beeldvorming van calcium indicatoren (genetisch gecodeerd zoals GCaMP5 7 of R-GECO 8, of synthetische kleurstoffen zoals OGB of Fluo4) heeft zich ontpopt als een krachtige methode voor het meten van neuronale activiteit in gedragen muizen 1-6. Het maakt de gelijktijdige meting van de activiteit van honderden cellen bij bijna enkele actiepotentiaal resolutie tot ongeveer 800 urn onder het hersenoppervlak 9,10. Bovendien, met behulp van genetisch gecodeerde calcium indicatoren (GECIS) neuronale activiteit kan worden gemeten chronisch 5,11,12, en genetische gedefinieerde celtypes 13. Samen bieden deze methodes een zekere mate van temporele en ruimtelijke resolutie die het openen van een veelheid aan nieuwe mogelijkheden in de studie van neuronale berekening in vivo. Chirurgische ingreep noodzakelijk is om bloot te leggen en het etiket van de hersenen van muizen voor de beeldvorming. Cellen worden kenmerkend getransfecteerd met een recombinant adeno geassocieerde vir<html> us (AAV) voor GECI levering en een craniale venster wordt ingeplant op de injectieplaats om optische toegang tot de hersenen te krijgen. Een hoofd balk wordt dan aan de schedel voor kop bevestiging kader van de twee-foton microscoop bevestigd. Het ontwerp en de uitvoering van deze stappen is van cruciaal belang, aangezien de meeste van de problemen met wakker beeldvorming ontstaan ​​van instabiliteiten in de voorbereiding. Idealiter zou de hier beschreven procedure mogelijk maken chronische beeldvorming tot enkele maanden na de operatie. Om visueel geleide gedrag tijdens twee-foton beeldvorming mogelijk te maken, de kop vaste muis zit op een lucht ondersteund sferische loopband, die zij kan gebruiken om een ​​virtual reality omgeving te navigeren. Locomotion van de muis op de loopband is gekoppeld aan beweging in de virtuele omgeving die wordt weergegeven op een ringkern scherm rond de muis 14,15. Behavioral variabelen zoals motoriek, visuele stimulus, en leerling positie kan worden opgenomen 6. t &quot;&gt; We beschrijven de bij chronische twee-foton beeldvorming in muizen verkennen van een virtual reality omgeving procedures De belangrijkste punten behandeld:. reductie van bewegingsartefacten, vermindering van licht lekken, maximalisatie van het aantal gelijktijdig opgenomen cellen en minimalisering van foto schade. We bieden ook informatie over het instellen van de lucht ondersteund loopband, pupil tracking, en de virtual reality omgeving. De hier beschreven procedures kan worden gebruikt voor het afbeelden van fluorescent gelabelde celpopulaties in het hoofd vast muizen in een potentieel breed scala van gedrags-paradigma .

<table><tbody><tr><td>Cover slips (diameter = 3-5 mm)</td><td>Menzel</td><td></td><td>venster implantaat</td></tr><tr><td>InSight DeepSee laser</td><td>Spectra-Physics</td><td></td><td>microscoop</td></tr><tr><td>12 kHz Resonance scanner</td><td>Cambridge Technology</td><td>G1-003-30026</td><td>microscoop</td></tr><tr><td>Galvanometer</td><td>Cambridge Technology</td><td>G6215H</td><td>microscoop</td></tr><tr><td>Digitizer</td><td>National Instruments</td><td>NI 5772</td><td>microscoop</td></tr><tr><td>FPGA</td><td>National Instruments</td><td>PXIe 7965R</td><td>microscoop</td></tr><tr><td>Acquisitiekaart</td><td>National Instruments</td><td>PCIe 6363</td><td>microscoop</td></tr><tr><td>Emissiefitter 525/50</td><td>Semrock</td><td>FF03-525/50-25</td><td>microscoop</td></tr><tr><td>Piëzo-elektrische z-aandrijving</td><td>Physikinstrumente</td><td>P-726.1CD</td><td>microscoop</td></tr><tr><td>Controller voor piëzo-elektrische aandrijving</td><td>Physikinstrumente</td><td>E665 LVPZT</td><td>microscoop</td></tr><tr><td>Objectief 16X, 0.8NA</td><td>Nikon</td><td>CFI75</td><td>microscoop</td></tr><tr><td>Stroomversterker</td><td>Femto</td><td>DHPCA-100</td><td>microscoop</td></tr><tr><td>Fotovermenigvuldigingsbuis</td><td>Hamamatsu</td><td></td><td>microscoop</td></tr><tr><td>USB-camera zonder IR-filter</td><td>ImagingSource</td><td>DMK22BUC03</td><td>pupil tracking</td></tr><tr><td>Objectief 50 mm</td><td>ImagingSource</td><td>M5018-MP</td><td>pupil tracking</td></tr><tr><td>Macro adapterringen</td><td>ImagingSource</td><td>LAexSet</td><td>pupil tracking</td></tr><tr><td>Optische computermuis</td><td>Logitech</td><td>G500</td><td>motion tracking</td></tr><tr><td>Plexiglas bal 20 cm</td><td>bijv. idee-shop.de</td><td>08797.00.15</td><td>virtuele omgeving</td></tr><tr><td>LED-projector</td><td>Samsung</td><td>SP-F10M</td><td>virtuele omgeving</td></tr><tr><td>Acquisitiekaart</td><td>National Instruments</td><td>NI 6009</td><td>virtuele omgeving</td></tr><tr><td>Panda3D game engine</td><td></td><td><a href="http://www.panda3d.org/">www.panda3d.org</a></td><td>virtuele omgeving</td></tr><tr><td>Numpy bibliotheek voor Python</td><td></td><td><a href="http://www.scipy.org/">www.scipy.org</a></td><td>virtuele omgeving</td></tr><tr><td>Scipy bibliotheek voor Python</td><td></td><td><a href="http://www.scipy.org/">www.scipy.org</a></td><td>virtuele omgeving</td></tr><tr><td>NI-DAQmx driver</td><td>National Instruments</td><td><a href="http://www.ni.com/">www.ni.com</a></td><td>virtuele omgeving</td></tr><tr><td>Ultragel gel</td><td>Dahlhausen</td><td>5701.0342.10</td><td>beeldvorming</td></tr></tbody></table>

twee-foton beeldvorming calcium in muizen navigeren van een virtual reality-omgeving

Two-photon Calcium Imaging in Mice Navigating a Virtual Reality Environment

In de afgelopen jaren, heeft twee-foton beeldvorming uitgegroeid tot een onmisbaar hulpmiddel in de neurowetenschappen, omdat het zorgt voor chronische meting van de activiteit van genetisch geïdentificeerde cellen tijdens gedrag 1-6. Hier beschrijven we methoden naar twee-foton beeldvorming uitvoeren muis cortex terwijl het dier navigeert een virtual reality omgeving. We richten ons op de aspecten van de experimentele procedures die essentieel zijn voor de beeldvorming in een gedragen dier in een helder verlichte virtuele omgeving zijn. De belangrijkste problemen die zich voordoen in deze experimentele opstelling die we hier adresgegevens zijn: het minimaliseren van de hersenen motion gerelateerde artefacten, het minimaliseren van licht lekken van de virtual reality projectiesysteem, en het minimaliseren van laser-induced weefselschade. We bieden ook sample software om de virtual reality omgeving controleren en leerling bijhouden doen. Met deze procedures en middelen moet het mogelijk zijn om een ​​conventionele twee-foton microscoop voor gedragen te converteren in muizen.

De beeldkwaliteit twee-foton calcium beeldvorming van celpopulaties gelabeld met een GECI grotendeels afhankelijk van de kwaliteit van de craniale venster implantaat. Twee weken na virus injectie de craniale venster moet worden gecontroleerd voor de duidelijkheid. Er mag geen granulatieweefsel of bot hergroei zichtbaar (Figuur 1A) zijn. Bovendien moet het patroon van oppervlakkige bloedvaten behouden en grenzen van de vasculatuur dienen nauwkeurig gedefinieerd. Tegelijkertijd kan GECI expressie worden g...

Hier beschrijven we de experimentele procedures betrokken bij twee-foton beeldvorming van de muis cortex tijdens gedrag in een virtual reality omgeving.

Twee-foton Beeldvorming Calcium in Muizen navigeren van een Virtual Reality-omgeving

In recent years, two-photon imaging has become an invaluable tool in neuroscience, as it allows for chronic measurement of the activity of genetically ...

Het algemene doel van het volgende experiment is om de belangrijkste aspecten van chronische twee-foton beeldvorming bij muizen uit te voeren, waarbij een virtuele realiteit omgeving wordt verkend. Dit wordt bereikt door een twee-foton microscoop aan te passen voor snel en stabiel beeldvorming bij bewegende muizen. Vervolgens wordt een door lucht ondersteunde loopband opgezet die geschikt is voor het volgen van de bewegingen.Vervolgens wordt een virtuele realiteit omgeving voorbereid die een LED-projector gebruikt, gesynchroniseerd met de microscoop om lichtlek te minimaliseren. Hierdoor worden goede en stabiele beeldopnames verkregen door de vermindering van bewegingsartefacten, de vermindering van lichtlek en de minimalisatie van fotoschade aan de rand. Hoewel deze methode kan worden gebruikt om neuroactiviteit te meten tijdens navigatie in een virtuele realiteit omgeving, kan deze ook eenvoudig worden aangepast aan een breed scala van verschillende gedragsparadigma's die visuele stimulatie vereisen.Alle dierproeven zijn goedgekeurd en uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen van de veterinaire afdeling van de Kanton Basil sta. De twee-foton microscoop die in deze experimenten wordt gebruikt, bestaat uit een scankop die bestaat uit een acht of 12 kilohertz resonante scanner en een standaard galvanometer. Dit maakt beeldsnelheden van 40 of 60 hertz mogelijk bij 750 keer 400 pixels en vermindert door hersenbeweging veroorzaakte beeldvervorming, fotobleken en fototoxiciteit.Een piëzo-elektrische hoge snelheid Z-stepper wordt gebruikt om sequentieel tijdsgeïnterlinieerde beelden te achterhalen op meerdere diepten. Een mechanische blanker wordt gebruikt om de laserblootstelling aan het weefsel te verminderen op de omslagpunten van het scanpad, de blanker moet instelbaar zijn om de breedte in te stellen. Afhankelijk van de amplitude van de resonante scanner, verbindt u een luchttoevoerslang met minimaal een binnendiameter van 10 millimeter met de balhouder van de loopband en plaatst u een BLE-hoeveelheid slang tussen de hoofdluchttoevoer en de balhouder om ruis te verminderen.Plaats een polystyreenschuimbal met een diameter van 20 centimeter in een op maat gemaakte en 3D-geprinte balhouder. Als het gedragsparadigma alleen voorwaartse en achterwaartse beweging vereist, plaatst u een pin zoals een 19 gauge hypodermische naald aan de zijkant van de bal. Om de beweging van de bal in de horizontale as te beperken, gebruikt u een of twee optische computermuizen om de beweging van de bal rond twee of alle drie de assen te volgen.Gebruik LED-projectoren of LED-achterverlichte computerschermen voor het display om de virtuele realiteit omgeving voor te bereiden. Integreer een gatingcircuit voor snel flikkeren van de LED's tijdens beeldvorming. De flikkerfrequentie van 24 kilohertz is vele malen hoger dan de flikkerfusiedrempel, waarboven flikkeren niet langer wordt waargenomen door het dier.Stel de exacte flikkerfrequentie en duty cycle in om de lichtuitvoer van de projector te synchroniseren met de omslagpunten van de resonante scanner voor pupiltracking, gebruik een CMOs-gebaseerde videocamera. Zorg ervoor dat de camera geen infraroodblokkerende filter bevat. Ongeveer twee tot drie weken na het injecteren van de genetische calciumindicator en het implanteren van een schedelvenster, gebruik epi-fluorescentie-verlichting om het schedelvenster-implantaat te controleren op duidelijkheid en expressie.Duidelijk zichtbaar en scherp gedefinieerd. Grenzen van oppervlakkige bloedvaten zijn een goede indicatie dat het venster-implantaat geschikt is voor beeldvorming een tot twee dagen later. Om het twee-foton experiment uit te voeren, meet en stelt u het laservermogen in op een waarde onder de 50 milliwatt op het monster.Zet vervolgens de luchtstroom naar de sferische loopband aan. Plaats vervolgens het dier met de kop op de sferische loopband. De eerste paar keer wordt de muis met de kop vastgezet.Dit proces kan worden vergemakkelijkt door het dier kort te sederen met isofluorine. Zodra het dier aan de procedure is gewend, kan het monteren normaal gesproken zonder sedatie worden uitgevoerd. Merk op dat het van cruciaal belang is om stress voor het dier tijdens deze procedure te minimaliseren.Plaats vervolgens het visuele displaysysteem zo dicht mogelijk bij het dier om nog steeds toegang tot het dier mogelijk te maken. Zorg ervoor dat het schedelvenster-implantaat vrij is van vuil en maak het schoon met water indien nodig, breng helder ultrasoon gel aan als immersiemedium tussen het schedelvenster en het water-immersieobjectief voor lichtafscherming. Wikkel een stuk zwart plakband rond het objectief en de hoofdbalk.Verplaats de virtuele omgeving naar zijn eindpositie en stel de videocamera in voor pupiltracking. Stel tenslotte de laserblanker in om overeen te komen met de scanslag die tijdens het experiment wordt gebruikt en start het opnemen van gegevens wanneer experimenten voltooid zijn. Euthanasie het dier volgens de richtlijnen van uw instelling.De beeldkwaliteit in twee-foton calciumbeeldvorming van celpopulaties gelabeld met een genetische calciumindicator hangt grotendeels af van de kwaliteit van het schedelvenster-implantaat zoals hier wordt aangetoond bij het controleren van het schedelvenster op duidelijkheid na virusinjectie, er mogen geen granulatieweefsel of botweefselgroei zichtbaar zijn. Bovendien moet het patroon van oppervlakkige bloedvaten onveranderd blijven en de grenzen van de vaatbundel moeten scherp gedefinieerd zijn. Tegelijkertijd moet BOI van gelabelde cellen duidelijk zichtbaar zijn onder een epi-fluorescentiemicroscoop.Idealiter is de voorbereiding stabiel genoeg zodat vervormingen van de twee-foton beelden veroorzaakt door de bewegingen van de muis niet zichtbaar zijn in het beeld na frameregistratie. Lichtlek van het visuele stimulatiesysteem kan volledig worden afgeschaft door de lichtuitvoer van de projector correct te timen met de omslagpunten van de resonante scanner. Wanneer gegevens niet worden verzameld, moet de flikkerfrequentie van de lichtbron twee keer de scanfrequentie zijn.In dit voorbeeld is de blanker verwijderd om het effect van lichtlek te illustreren dat wordt getoond in de oranje vakken tijdens visuele stimulatie. Na het

two-photon-calcium-imaging-mice-navigating-virtual-reality

Research

JoVE Journal

Behavior

Gedrag

Om te begrijpen netwerk dynamiek van microcircuits in de neocortex, is het essentieel om tegelijkertijd op te nemen van de activiteit van een groot aantal neuronen. In-vivo twee-foton calcium beeldvorming is de enige methode die het mogelijk maakt een op te nemen van de activiteit van een dichte neuronale populatie met single-cell resolutie.

In vivo 2-Photon Imaging Calcium in Layer 2 / 3 van Muizen

Source: Maruoka, H., et. al. Simultaneous Imaging of Microglial Dynamics and Neuronal Activity in Awake Mice. J. Vis. Exp. (2022)     This video shows a two-photon microscopy procedure for imaging neuronal activity and microglial dynamics in an awake mouse during visual stimulation, highlighting calcium transients and cellular interactions.

Simultaneous Imaging of Microglial Dynamics and Neuronal Activity in an Awake Mouse

Source: Lee, H. et. al., Successful In vivo Calcium Imaging with a Head-Mount Miniaturized Microscope in the Amygdala of Freely Behaving Mouse. J. Vis. Exp. (2020)This video demonstrates in vivo calcium imaging in a mouse using a gradient refractive index, or GRIN lens, and a miniaturized microscope. The setup combines head fixation within a frictionless mobile cage system, stimulating neurons and triggering calcium ion influx. The GRIN lens captures calcium signaling in the brain, enabling...

Real-Time Microendoscopic Calcium Imaging in a Freely Moving Mouse

Source: Thapa, R., et. al., Stereotaxic Viral Injection and Gradient-Index Lens Implantation for Deep Brain In Vivo Calcium Imaging. J. Vis. Exp. (2021)The video demonstrates real-time calcium imaging using a miniscope in a transduced mouse, correlating neuronal activity with behavior.

Real-Time Calcium Imaging of a Mouse Medial Prefrontal Cortex Using a Miniscope

Deze video toont de craniotomieprocedure die chronische beeldvorming van neuronen in de retrospleniale cortex van muizen mogelijk maakt met in vivo twee-foton microscopie in de Thy1-GFP transgene lijn. Deze benadering wordt gecombineerd met injectie van mCherry-expresserend adeno-geassocieerd virus in de dorsale hippocampus. Deze technieken maken langdurige monitoring van ervaringsafhankelijke structurele plasticiteit in RSC mogelijk.

Simultane twee-foton<em&gt; In Vivo</em&gt; Beeldvorming van Synaptic In- en Postsynaptische Doelen op Mouse retrospleniale Cortex

We presenteren een protocol om de hersenstam van volwassen muizen van de ventrale kant bloot te leggen. Door een gradiënt-brekingsindexlens met een miniatuurmicroscoop te gebruiken, kan calciumbeeldvorming worden gebruikt om de activiteit van inferieure olijfneurale somata in vivo te onderzoeken.

In vivo Calcium beeldvorming in muis inferieure olijf

Miniscope in vivo calcium imaging is een krachtige techniek om neuronale dynamica en microcircuits te bestuderen in vrij gedragende muizen. Dit protocol beschrijft het uitvoeren van hersenoperaties om goede in vivo calciumbeeldvorming te bereiken met behulp van een miniscoop.

Stereotaxische virale injectie en gradiënt-index lensimplantatie voor diepe hersenen in vivo calciumbeeldvorming

Hier beschrijven we een protocol dat adeno-geassocieerde virusinjectie combineert met craniale raamimplantatie voor gelijktijdige beeldvorming van microgliale dynamiek en neuronale activiteit bij wakkere muizen.

Gelijktijdige beeldvorming van microgliale dynamica en neuronale activiteit bij wakkere muizen

Het huidige protocol beschrijft het maken van een groot (6 x 3 mm2) schedelvenster met behulp van voedselwikkel, transparante siliconen en afdekglas. Dit schedelvenster maakt in vivo wide-field en twee-foton calcium imaging experimenten in dezelfde muis mogelijk.

In vivo Wide-Field en Two-Photon Calcium Imaging van een muis met behulp van een groot craniaal venster

Hier presenteren we een vereenvoudigde open-source hardware- en software-opstelling voor het onderzoeken van ruimtelijk leren van muizen met behulp van virtual reality (VR). Dit systeem toont een virtueel lineair spoor naar een hoofd-ingetogen muis die op een wiel draait door gebruik te maken van een netwerk van microcontrollers en een single-board computer met een eenvoudig te gebruiken Python grafisch softwarepakket.

Een open-source virtual reality-systeem voor het meten van ruimtelijk leren bij hoofdremmende muizen

Dit protocol beschrijft de procedure voor het in beeld brengen van calciumresponsen in de superieure colliculus (SC) van wakkere muizen, inclusief het in beeld brengen van de activiteit van één neuron met twee fotonen met behulp van twee-fotonmicroscopie terwijl de cortex intact blijft bij wild-type muizen, en het in beeld brengen van de gehele SC met breedveldmicroscopie bij mutante muizen met gedeeltelijke cortex.

Calciumbeeldvorming bij superieure colliculus bij muizen

Leer chronische twee-foton calciumbeeldvorming bij muizen tijdens navigatie in een virtual reality-omgeving. Deze methode minimaliseert bewegingsartefacten en lichtlek voor stabiele neuroactiviteitsmetingen.

Twee-foton Beeldvorming Calcium in Muizen navigeren van een Virtual Reality-omgeving

Meer video's verkennen