Name: Microgolven Functionalisering van poly (ethyleenglycol) en On-hars Peptiden voor gebruik in Chain Polymerisaties en Hydrogel Vorming (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-10-29T18:30:00.000+00:00
Duration: 15 min 33 s
Description: Leer een snelle methode voor de functionalisering van polyethyleenglycol en peptiden met methacrylaatgroepen voor ketenpolymerisaties en hydrogelsynthese. Deze techniek versnelt biomateriaalonderzoek aanzienlijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit werk werd deels gefinancierd door een Howard Hughes Med-in-Grad gemeenschap (AVH), van start-up fondsen van de Universiteit van Rochester en de Orthopedische Research and Education Foundation / Spier-Transplantatie Stichting (open-ended vastgoedfondsen verstrekt aan dr. Danielle Benoit / MTF). De auteurs willen graag Dr James L. McGrath bedanken voor het gebruik van zijn apparatuur.

1. Microgolf-geassisteerde synthese van PEGDM <ol><li> Om besmetting met water te voorkomen, pre-droog al het glaswerk worden gebruikt in een oven (&gt; 60 º C) gedurende 1 uur. Opmerking: Vereist glaswerk omvat: twee 100-ml bekers, een bekerglas van 250 ml, 3 spatels, een 250-ml Büchner kolf, een 7-cm Büchner trechter, een 10-cm horlogeglas. </li><li> Pre-chill 100-150 ml watervrij diethylether (74,12 g / mol) voor neerslag vervolgens bij stap 1.6 uitgevoerd door gieten in een beker, die het bekerglas af met een horlogeglas, en het plaatsen van de beker in een herkristallisatie schotel gevuld met ijs. Verplaats magnetron en vortexer in een zuurkast. Opmerking: Diethyl ether kunnen ook worden voorgekoeld door het bekerglas in een chemisch vriezer. De lagere diethylether bereikte temperatuur door koeling in een vriezer zal de snelheid en efficiëntie van de neerslag te verhogen. </li><li> In een kleine wegen boot, 5 g van poly (ethyleenglycol) (PEG) van de moleculairelar gewicht van uw keuze (1,000-100,000 Da). <ol><li> Indien aanwezig, verwijder het plastic stuk uit het deksel van de scintillatieflesje. Tarra het flesje, en afzien 10 molaire overmaat van methacrylzuuranhydride in de flacon (MA, 154,16 g / mol) per vergelijking 1 in de kap. Voeg PEG aan de scintillatieflesje. <img alt="Vergelijking 1" fo:content-width="200px" src="/files/ftp_upload/50890/50890eq1.jpg" width="250px" /> (1) waar <img alt="Vergelijking 1.1" fo:content-width="30px" src="/files/ftp_upload/50890/50890eq1.1.jpg" width="30px" /> de massa van PEG in g <img alt="Vergelijking 1.2" fo:content-width="30px" src="/files/ftp_upload/50890/50890eq1.2.jpg" width="40px" /> het molecuulgewicht van PEG in g / mol, <img alt="Vergelijking 1.3" fo:content-width="40px" src="/files/ftp_upload/50890/50890eq1.3.jpg" width="40px" /> is het aantal eindstandige OH-groepen op PEG, en <img alt="Vergelijking 1.4" fo:content-width="30px" src="/files/ftp_upload/50890/50890eq1.4.jpg" width="40px" /> is de moleculairelar gewicht van MA in g / mol. </li></ol></li><li> Losjes draai de dop op de scintillatieflesje. Stel de magnetron 5 min op maximaal vermogen. Het dragen van hittebestendige handschoenen, verwijder de flacon uit de magnetron om de 30 sec. <ol><li> Volledig draai de dop aan en vortex gedurende 30 sec. Herhaal dit totdat de oplossing is zeer correct voor de volledige 5 minuten. De dop nodig heeft tijdens de procedure die moet worden vervangen als gevolg van het kraken. </li></ol></li><li> Met de dop los, laat de PEGDM afkoelen tot kamertemperatuur. Los de PEGDM in een kleine hoeveelheid (10-15 ml) dichloormethaan (DCM, 84,93 g / mol). Opmerking: Het wordt aanbevolen de PEGDM kunnen afkoelen significant (~ 5 minuten) voordat DCM Bovendien, om koken van de DCM (a verdacht carcinogeen) voorkomen door restwarmte. De PEGDM kan worden opgesplitst in kleine stukjes met behulp van een spatel en gewerveld om te helpen bij het oplossen. </li><li> Neerslaan de PEGDM in 10x teveel ijskoude diethylether gedurende 20 minuten. Opmerking: Het kan nodig zijn sc zijnRatch het bekerglas kant met een spatel kristalvorming initiëren lager gewicht PEG molecuulgewicht (2500 Da) neerslaan, maar PEG met een molecuulgewicht van minder dan 1000 Da niet neerslaan ondanks krabben. </li><li> Met behulp van een Büchner-trechter en kolf, verzamel de PEGDM door vacuümfiltratie. Filtreer niet volledig in, omdat dit water adsorptie zal promoveren naar de PEGDM. Opmerking: Zo nodig voor het specifieke vacuümsysteem gebruikt, kan een vacuum val geplaatst tussen de filtratie installatie en de vacuümbron om de vacuümpomp te beschermen tegen schade door oplosmiddeldampen. </li><li> Breng de gefilterde PEGDM in een 50 ml conische buis met een grote naald doorboord door de kap voor ventilatie. Sla overnacht in een vacuümkamer te drogen. </li><li> PEGDM opnieuw oplossen in DCM en reprecipitate (zoals in stappen 1.5-1.7) als laatste stap gereageerde MA verwijderen. Droog nogmaals zoals in stap 1.8. </li></ol> 2. Karakterisering van PEGDM Functionalisering <ol><li> Met gedeutereerd chloroform (120,38 g / mol) als oplosmiddel, bereiden monsters voor 1H-NMR. Breng een klein monster van de PEGDM (≈ 10 mg) in een scintillatieflesje met een kleine hoeveelheid oplosmiddel (≈ 1,0 ml). Het doel concentratie 10 mg / ml. <ol><li> Zodra het monster wordt opgelost, overbrengen naar een schone NMR buis. Het monster dient de onderste 4-5 cm van de NMR-buis vullen. </li></ol></li><li> Verzamel de proton-NMR-spectra. De gegevens worden verzameld met behulp van een 400 MHz spectrometer. Run monsters bij kamertemperatuur gedurende ten minste 64 scans om voldoende gegevens resolutie te verkrijgen. </li><li> Als NMR analyse (figuur 4) geeft PEGDM functionalisering minder dan 90%, moet de methacrylation worden herhaald. Stel de massa van MA gebruikt om rekening te houden met de verminderde hoeveelheid ongefunctionaliseerde PEG. </li></ol> Opmerking: Het percentage van de PEG gefunctionaliseerde in PEGDM kan worden berekend uit de waargenomen: theoretische verhouding van terminal methacrylate protonen (a, b en c) de centrale PEG protonen (d) (figuur 4). Voor lineaire PEG, wordt het theoretische aantal centrale PEG protonen berekend door vergelijking 2: <img alt="Vergelijking 2" fo:content-width="150px" src="/files/ftp_upload/50890/50890eq2.jpg" width="200px" /> (2) waar <img alt="Vergelijking 2.1" fo:content-width="30px" src="/files/ftp_upload/50890/50890eq2.1.jpg" width="40px" /> het molecuulgewicht van de PEG g / mol en <img alt="Vergelijking 2.2" fo:content-width="30px" src="/files/ftp_upload/50890/50890eq2.2.jpg" width="70px" /> het molecuulgewicht van een PEG herhaling (44 g / mol). Voor lineaire PEG moet deze vergelijking worden aangepast aan de specifieke boomstructuur (figuur 1) reflecteren. Het percentage functionalisering kan dan worden berekend volgens vergelijking 3: <img alt="Vergelijking 3" fo:content-width="150px" src="/files/ftp_upload/50890/50890eq3.jpg" width="300px" /> (3) waar <img alt="Vergelijking 3.1" fo:content-width="30px" src = &quot;/ files/ftp_upload/50890/50890eq3.1.jpg&quot; width = &quot;40px&quot; /&gt; is de geconstateerde oppervlakte onder de piek d (δ = 6.63 ppm), <img alt="Vergelijking 3.2" fo:content-width="40px" src="/files/ftp_upload/50890/50890eq3.2.jpg" width="40px" /> is het waargenomen gebied onder de methacrylaat proton pieken (a, δ = 1,94 ppm, b en c, δ = 5,57 en 6,12 ppm), en <img alt="Vergelijking 3.3" fo:content-width="40px" src="/files/ftp_upload/50890/50890eq3.3.jpg" width="40px" /> is het theoretisch aantal protonen methacrylaat (a = 3 * <img alt="Vergelijking 1.3" fo:content-width="40px" src="/files/ftp_upload/50890/50890eq1.3.jpg" width="60px" /> , B = 1 * <img alt="Vergelijking 1.3" fo:content-width="40px" src="/files/ftp_upload/50890/50890eq1.3.jpg" width="60px" /> en c = 1 * <img alt="Vergelijking 1.3" fo:content-width="40px" src="/files/ftp_upload/50890/50890eq1.3.jpg" width="60px" /> - 6, 2 en 2 respectievelijk lineaire PEG). Het percentage functionalisering berekening dient te worden uitgevoerd met pieken a, b en c afzonderlijk en averaged tot een algehele procent functionalizering verkrijgen. Opmerking: Voldoende gefunctionaliseerde PEGDM kan vervolgens worden gedialyseerd (in water, tegen water) en verzameld door vriesdrogen om resterende methacrylzuuranhydride en methacrylzuur verwijderen. Het uiteindelijke product moet worden gemengd met een kleine hoeveelheid (0,01 gew%) remmer zoals citroenzuur of vitamine C en met droogmiddel bewaard bij -20 ° C tot gebruik. Het uiteindelijke PEGDM product kan worden gebruikt om hydrogels produceren, zoals beschreven in het artikel van Jupiter Khetan en Burdick 22. 3. Microgolven Functionalisering van On-hars Peptiden Opmerking: De peptiden worden gesynthetiseerd met behulp van Fmoc-Gly-Wang-hars, met een geautomatiseerde peptide synthesizer met UV bewaking en 0,2 M aminozuur oplossingen in N-methylpyrrolidon (NMP, 99,1 g / mol). 5% piperazine (86,1 g / mol) in dimethylformamide (DMF, 73,1 g / mol) wordt gebruikt voor deprotectie, 0,5 M O-benzotriazol-N, N, N &#39;, N&#39;-tetramethyl-uronium-hexafluoro-fosfaat (HBTU, 379,3 g / mol) in DMF wordt gebruikt als activator en 2 M diisopropylethylamine (DIEA, 129.3 g / mol) in NMP wordt gebruikt als activator basis. Peptiden kunnen ook worden verkregen van een commerciële leverancier peptide. Bij het gebruik van commerciële bronnen is het essentieel dat peptiden worden verkregen on-hars met de aminozuur zijketen-beschermende groepen intact plaats volledig gesplitste, zoals gebruikelijk. Opmerking: Het is belangrijk dat alle aminozuren met reactieve zijketens beschermd zodat methacrylamide functionalisering alleen optreedt bij het primaire amine van het N-uiteinde van de sequentie. Zie tabel 1 voor aminozuren met reactieve zijgroepen, en typische beschermende groepen. Aminozuren met beschermende groepen worden opgenomen in de sequentie tijdens peptidesynthese op dezelfde wijze als niet-beveiligde aminozuren, en zijn vaak verkrijgbaar bij dezelfde leveranciers aminozuur. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="502"&gt; <colgroup><col /><col /><col /></colgroup><tbody><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;width:144px;"> Amino Acid </td><td style="width:163px;"> Reactieve groep </td><td style="width:196px;"> Beschermende groep </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;width:144px;"> Lysine </td><td style="width:163px;"> Primaire Amine </td><td style="width:196px;"> tert-butyloxycarbonyl (Boc) </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;width:144px;"> Serine </td><td style="width:163px;"> Primaire alcohol </td><td style="width:196px;"> tert-butyl (tBu) </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;width:144px;"> Threonine </td><td style="width:163px;"> Secundaire Alcohol </td><td style="width:196px;"> tBu </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;width:144px;"> Tyrosine </td><td style="width:163px;"> Fenol</td><td style="width:196px;"> tBu </td></tr></tbody></table> Tabel 1: Reactieve aminozuren en typische beschermende groepen. <ol><li> Synthetiseren peptiden onder toepassing van standaard vaste fase peptidesynthese en opslaan op hars bij 4 ° C in DMF tot aan gebruik. </li><li> Met behulp van een 7 cm Büchner trechter met filtreerpapier en 250 ml fles, het verzamelen van de peptide hars van de DMF via filtratie. </li><li> Indien aanwezig verwijder het plastic stuk uit het deksel van de scintillatieflesje. Breng het hars de scintillatieflesje. Met behulp van een disposable pipet, voeg net genoeg MA aan de hars in de scintillatieflesje dekken. </li><li> Losjes plaatst de dop op de scintillatieflesje. Stel de magnetron 3 minuten op maximaal vermogen. Het dragen van hittebestendige handschoenen, verwijder de flacon uit de magnetron om de 15-20 sec. <ol><li> Volledig draai de dop aan en vortex gedurende 15 sec. Herhaal dit totdat de oplossing is zeer correct voor de full 3 min. </li></ol></li><li> Met de dop los, laat de peptide oplossing afkoelen tot kamertemperatuur. Met een kleine hoeveelheid DMF en een Büchner trechter met filtreerpapier en fles, verzamel de peptidehars van de flacon. </li><li> Breng het peptide hars om een ​​frisse scintillatieflesje en klieven en bescherming te ontdoen van de peptide. <ol><li> Per 0,25 mmol hars, gebruiken we een 2 uur bij kamertemperatuur reactie met rotatie, met een splitsing cocktail van 18,5 ml trifluorazijnzuur (TFA, 114,02 g / mol) met elk van triisopropylsilaan 0,5 ml (TIPS, 158,36 g / mol), 3,6-dioxa-1 ,8-octanedithiol (Dodt, 182,30 g / mol) en gedeïoniseerd water (18.02 g / mol). Opmerking: Deze cocktail is voldoende voor de meeste peptiden, maar niet ontschermen 2,2,4,6,7-pentamethyl-dihydrobenzofuran-5-sulfonyl (Pbf)-beschermde aminozuren (vaak gebruikt om arginine zijketens beschermen). Indien de sequentie bevat die Pbf-beschermde groepen dient 0,5 ml TFA vervangen door 0,5 ml thioanisool (124.20 g / mol) en splitsing tijd verhoogd tot 4 uur. Opmerking: Als een bewolkte, kristallijne substantie vormen in de splitsing cocktail, wordt het peptide waarschijnlijk crashen uit de oplossing en het volume van de splitsing cocktail moet worden verdubbeld. </li></ol></li><li> Chill 400 ml watervrij diethylether op ijs in een beker bedekt met horlogeglas. </li><li> Neerslaan van de peptide in 10x teveel diethylether, en verdeel de oplossing gelijkmatig onder vier 50 ml conische buizen. Centrifugeer bij 3200 xg gedurende 10 min aan het peptide verzamelen. <ol><li> Giet uit de ether, en resuspendeer de peptide in verse diethylether verdeeld over twee 50 m conisch 100 ml. Centrifugeer nogmaals proces opnieuw suspenderen in 50 ml verse ether tweemaal voor een totaal van 4 ether wasbeurten. Opmerking: Dit verwijdert de chemische stoffen die bij de splitsing cocktail en gesplitst beschermende groepen van de vaste peptide. </li></ol></li><li> Na de laatste centrifugatiestap, decanteren het afval ethaar en droog het peptide nacht onder vacuüm. </li></ol> 4. Karakterisering van Peptide functionalisering <ol><li> Gebruik 50:50 H2O: acetonitril (41.05 g / mol) + 0,1% TFA als oplosmiddel voor MALDI-TOF analyse van peptide monsters. Plaats een klein monster (1-2 mg) van het peptide in een 1,5 ml eppendorfbuisje en los het monster in 1 ml MALDI oplosmiddel. </li><li> Bereid de matrix oplossing. Een algemeen gebruikte matrix α-cyaan-4-hydroxykaneelzuur (CHCA, 189.2 g / mol) als de matrix. Los 10 mg / ml matrix MALDI oplosmiddel, waarbij een matrix stock oplossing. Opmerking: De matrix voorraadoplossing worden opgeslagen bij kamertemperatuur gedurende maximaal een week aanvullende analyses. </li><li> Combineer het peptide en matrix oplossing in een 1:1 verhouding. Spot deze gecombineerde oplossing op drie afzonderlijke locaties op de MALDI monster plaat, het toevoegen van 1 pl / spot. <ol><li> Droog de plekken, hetzij door de lucht drogen of met behulp van een warmte kanon. Respot en droog elkemonster. Opmerking: Respotting produceert een gelijkmatiger peptide / matrix monster, en helpt bij het verkrijgen van een duidelijk signaal. Een standaard peptide mix moet worden gecombineerd met de matrix oplossing in een 1:1 verhouding en gevlekte (eenmalig) op de MALDI plaat. </li></ol></li><li> Verzamel de MALDI-TOF-gegevens. Door de toevoeging van de methacrylamide-groep aan het N-uiteinde van het peptide, moet er een 68 g / mol toename van het molecuulgewicht boven dat van het peptide molecuulgewicht alleen. Opmerking: In tegenstelling tot de PEGDM synthese kunnen peptiden niet refunctionalized, zoals na splitsing van de beschermende groepen van aminozuren met reactieve zijketens worden verwijderd, en de selectieve functionalisering van de N-uiteinden niet meer worden gegarandeerd. <ol><li> Als de MALDI-analyse (figuur 5) geeft het peptide werd goed gefunctionaliseerd en alle beschermende groepen geschikt gesplitst, kan de peptide worden gedialyseerd (in water, tegen water) en verzameld door lyofilisatie remove residuele contaminanten (splitsing cocktail, ether, gesplitst beschermende groepen enz.). Het vaste peptide worden overgebracht naar een kleine Eppendorf buisje en opgeslagen bij -20 ° C tot gebruik. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Lin, C. C., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PEG+Hydrogels+for+the+Controlled+Release+of+Biomolecules+in+Regenerative+Medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Pharm.+Res%22%5BJournal%5D)">PEG Hydrogels for the Controlled Release of Biomolecules in Regenerative Medicine.</a> Pharm. Res. 26, 631-643 (2009).</li>
<li>Ifkovits, J. L., Burdick, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review%3A+Photopolymerizable+and+degradable+biomaterials+for+tissue+engineering+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng%22%5BJournal%5D)">Review: Photopolymerizable and degradable biomaterials for tissue engineering applications.</a> Tissue Eng. 13, 2369-2385 (2007).</li>
<li>Peppas, N. A., Hilt, J. Z., Khademhosseini, A., Langer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogels+in+biology+and+medicine%3A+From+molecular+principles+to+bionanotechnology%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Mater%22%5BJournal%5D)">Hydrogels in biology and medicine: From molecular principles to bionanotechnology.</a> Adv. Mater. 18, 1345-1360 (2006).</li>
<li>Lutolf, M. P., Hubbell, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+biomaterials+as+instructive+extracellular+microenvironments+for+morphogenesis+in+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Synthetic biomaterials as instructive extracellular microenvironments for morphogenesis in tissue engineering.</a> Nat. Biotechnol. 23, 47-55 (2005).</li>
<li>Benoit, D. S., Durney, A. R., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+heparin-functionalized+PEG+hydrogels+on+three-dimensional+human+mesenchymal+stem+cell+osteogenic+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The effect of heparin-functionalized PEG hydrogels on three-dimensional human mesenchymal stem cell osteogenic differentiation.</a> Biomaterials. 28, 66-77 (2007).</li>
<li>Benoit, D. S., Collins, S. D., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multifunctional+hydrogels+that+promote+osteogenic+human+mesenchymal+stem+cell+differentiation+through+stimulation+and+sequestering+of+bone+morphogenic+protein+2%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Funct.+Mater%22%5BJournal%5D)">Multifunctional hydrogels that promote osteogenic human mesenchymal stem cell differentiation through stimulation and sequestering of bone morphogenic protein 2.</a> Adv. Funct. Mater. 17, 2085-2093 (2007).</li>
<li>Fairbanks, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Versatile+Synthetic+Extracellular+Matrix+Mimic+via+Thiol-Norbornene+Photopolymerization%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Mater%22%5BJournal%5D)">A Versatile Synthetic Extracellular Matrix Mimic via Thiol-Norbornene Photopolymerization.</a> Adv. Mater. 21, 5005(2009).</li>
<li>Moon, J. J., Hahn, M. S., Kim, I., Nsiah, B. A., West, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micropatterning+of+Poly%28Ethylene+Glycol%29+Diacrylate+Hydrogels+with+Biomolecules+to+Regulate+and+Guide+Endothelial+Morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+A%22%5BJournal%5D)">Micropatterning of Poly(Ethylene Glycol) Diacrylate Hydrogels with Biomolecules to Regulate and Guide Endothelial Morphogenesis.</a> Tissue Eng. A. 15, 579-585 (2009).</li>
<li>Burdick, J. A., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoencapsulation+of+osteoblasts+in+injectable+RGD-modified+PEG+hydrogels+for+bone+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Photoencapsulation of osteoblasts in injectable RGD-modified PEG hydrogels for bone tissue engineering.</a> Biomaterials. 23, 4315-4323 (2002).</li>
<li>Yanez-Soto, B., Liliensiek, S. J., Murphy, C. J., Nealey, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemically+and+topographically+engineered+poly%28ethylene+glycol%29+diacrylate+hydrogels+with+biomimetic+characteristics+as+substrates+for+human+corneal+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Mater.+Res.+A%22%5BJournal%5D)">Biochemically and topographically engineered poly(ethylene glycol) diacrylate hydrogels with biomimetic characteristics as substrates for human corneal epithelial cells.</a> J. Biomed. Mater. Res. A. 101A, 1184-1194 (2013).</li>
<li>Benoit, D. S. W., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heparin+functionalized+PEG+gels+that+modulate+protein+adsorption+for+hMSC+adhesion+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomater%22%5BJournal%5D)">Heparin functionalized PEG gels that modulate protein adsorption for hMSC adhesion and differentiation.</a> Acta Biomater. 1, 461-470 (2005).</li>
<li>Lin-Gibson, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+and+characterization+of+PEG+dimethacrylates+and+their+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Synthesis and characterization of PEG dimethacrylates and their hydrogels.</a> Biomacromolecules. 5, 1280-1287 (2004).</li>
<li>Anseth, K. S., Wang, C. M., Bowman, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reaction+Behavior+and+Kinetic+Constants+for+Photopolymerizations+of+Multi%28Meth%29Acrylate+Monomers%5BTitle%5D)+AND+%22Polymer%22%5BJournal%5D)">Reaction Behavior and Kinetic Constants for Photopolymerizations of Multi(Meth)Acrylate Monomers.</a> Polymer. 35 (94), 3243-3250 (1994).</li>
<li>Bencherif, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((End-group+effects+on+the+properties+of+PEG-co-PGA+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomater%22%5BJournal%5D)">End-group effects on the properties of PEG-co-PGA hydrogels.</a> Acta Biomater. 5, 1872-1883 (1016).</li>
<li>Rydholm, A. E., Bowman, C. N., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Degradable+thiol-acrylate+photopolymers%3A+polymerization+and+degradation+behavior+of+an+in+situ+forming+biomaterial%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Degradable thiol-acrylate photopolymers: polymerization and degradation behavior of an in situ forming biomaterial.</a> Biomaterials. 26, 4495-4506 (2005).</li>
<li>Zustiak, S. P., Leach, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrolytically+Degradable+Poly%28Ethylene+Glycol%29+Hydrogel+Scaffolds+with+Tunable+Degradation+and+Mechanical+Properties%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Hydrolytically Degradable Poly(Ethylene Glycol) Hydrogel Scaffolds with Tunable Degradation and Mechanical Properties.</a> Biomacromolecules. 11, 1348-1357 (2010).</li>
<li>Malkoch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+well-defined+hydrogel+networks+using+Click+chemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Commun%22%5BJournal%5D)">Synthesis of well-defined hydrogel networks using Click chemistry.</a> Chem. Commun. , 2774-2776 (2006).</li>
<li>Hoffman, M. D., Benoit, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+Ideas%3A+Engineering+the+Periosteum%3A+Revitalizing+Allografts+by+Mimicking+Autograft%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Emerging Ideas: Engineering the Periosteum: Revitalizing Allografts by Mimicking Autograft.</a> , (2012).</li>
<li>Hoffman, M. D., Xie, C., Zhang, X., Benoit, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+mesenchymal+stem+cells+delivered+via+hydrogel-based+tissue+engineered+periosteum+on+bone+allograft+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The effect of mesenchymal stem cells delivered via hydrogel-based tissue engineered periosteum on bone allograft healing.</a> Biomaterials. , (2013).</li>
<li>Hubbell, J. A., Lutolf, M. P., Raeber, G. P., Zisch, A. H., Tirelli, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-responsive+synthetic+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Mater%22%5BJournal%5D)">Cell-responsive synthetic hydrogels.</a> Adv. Mater. 15, 888-892 (2003).</li>
<li>Lidstrom, P., Tierney, J., Wathey, B., Westman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microwave+assisted+organic+synthesis+-+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Tetrahedron%22%5BJournal%5D)">Microwave assisted organic synthesis - a review.</a> Tetrahedron. 57, 9225-9283 (2001).</li>
<li>Khetan, S., Burdick, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+encapsulation+in+3D+hydrogels+for+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Cellular encapsulation in 3D hydrogels for tissue engineering.</a> J. Vis. Exp. (32), e1590(2009).</li>
<li>Antonios, M., Kurtis, K., Lucas, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drying+poly%28ethylene+glycol%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc.+Exchange%22%5BJournal%5D)">Drying poly(ethylene glycol).</a> Nat. Protoc. Exchange. , (2012).</li>
<li>Nicolas, J., Mantovani, G., Haddleton, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Living+radical+polymerization+as+a+tool+for+the+synthesis+of+polymer-protein%2Fpeptide+bioconjugates%5BTitle%5D)+AND+%22Macromol.+Rapid+Comm%22%5BJournal%5D)">Living radical polymerization as a tool for the synthesis of polymer-protein/peptide bioconjugates.</a> Macromol. Rapid Comm. 28, 1083-1111 (2007).</li>
<li>Nuttelman, C. R., Benoit, D. S. W., Tripodi, M. C., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+ethylene+glycol+methacrylate+phosphate+in+PEG+hydrogels+on+mineralization+and+viability+of+encapsulated+hMSCs%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The effect of ethylene glycol methacrylate phosphate in PEG hydrogels on mineralization and viability of encapsulated hMSCs.</a> Biomaterials. 27, 1377-1386 (2006).</li>
<li>Hern, D. L., Hubbell, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incorporation+of+adhesion+peptides+into+nonadhesive+hydrogels+useful+for+tissue+resurfacing%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Mater.+Res%22%5BJournal%5D)">Incorporation of adhesion peptides into nonadhesive hydrogels useful for tissue resurfacing.</a> J. Biomed. Mater. Res. 39, 266-276 (1998).</li>
<li>Andreopoulos, F. M., Beckman, E. J., Russell, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-induced+tailoring+of+PEG-hydrogel+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Light-induced tailoring of PEG-hydrogel properties.</a> Biomaterials. 19, 1343-1352 (1998).</li>
<li>Merrill, E. W., Dennison, K. A., Sung, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Partitioning+and+Diffusion+of+Solutes+in+Hydrogels+of+Poly%28Ethylene+Oxide%29%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Partitioning and Diffusion of Solutes in Hydrogels of Poly(Ethylene Oxide).</a> Biomaterials. 14, 1117-1126 (1993).</li>
<li>Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+elasticity+directs+stem+cell+lineage+specification%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Matrix elasticity directs stem cell lineage specification.</a> Cell. 126, 677-689 (2006).</li>
<li>Weber, L. M., Lopez, C. G., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+PEG+hydrogel+crosslinking+density+on+protein+diffusion+and+encapsulated+islet+survival+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Mater.+Res.+A%22%5BJournal%5D)">Effects of PEG hydrogel crosslinking density on protein diffusion and encapsulated islet survival and function.</a> J. Biomed. Mater. Res. A. 90A, 720-729 (2009).</li>
<li>Mellott, M. B., Searcy, K., Pishko, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Release+of+protein+from+highly+cross-linked+hydrogels+of+poly%28ethylene+glycol%29+diacrylate+fabricated+by+UV+polymerization%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Release of protein from highly cross-linked hydrogels of poly(ethylene glycol) diacrylate fabricated by UV polymerization.</a> Biomaterials. 22, 929-941 (2001).</li>
<li>Watkins, A. W., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigation+of+molecular+transport+and+distributions+in+poly%28ethylene+glycol%29+hydrogels+with+confocal+laser+scanning+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Macromolecules%22%5BJournal%5D)">Investigation of molecular transport and distributions in poly(ethylene glycol) hydrogels with confocal laser scanning microscopy.</a> Macromolecules. 38, 1326-1334 (2005).</li>
<li>Anseth, K. S., Benoit, D. S. W., Durney, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Manipulations+in+hydrogel+degradation+behavior+enhance+osteoblast+function+and+mineralized+tissue+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng%22%5BJournal%5D)">Manipulations in hydrogel degradation behavior enhance osteoblast function and mineralized tissue formation.</a> Tissue Eng. 12, 1663-1673 (2006).</li>
<li>Hillwest, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevention+of+Postoperative+Adhesions+in+the+Rat+by+in-Situ+Photopolymerization+of+Bioresorbable+Hydrogel+Barriers%5BTitle%5D)+AND+%22Obstet.+Gynecol%22%5BJournal%5D)">Prevention of Postoperative Adhesions in the Rat by in-Situ Photopolymerization of Bioresorbable Hydrogel Barriers.</a> Obstet. Gynecol. 83, 59-64 (1994).</li>
<li>Sawhney, A. S., Pathak, C. P., Hubbell, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioerodible+Hydrogels+Based+on+Photopolymerized+Poly%28Ethylene+Glycol%29-Co-Poly%28Alpha-Hydroxy+Acid%29+Diacrylate+Macromers%5BTitle%5D)+AND+%22Macromolecules%22%5BJournal%5D)">Bioerodible Hydrogels Based on Photopolymerized Poly(Ethylene Glycol)-Co-Poly(Alpha-Hydroxy Acid) Diacrylate Macromers.</a> Macromolecules. 26, 581-587 (1993).</li>
<li>Skaalure, S. C., Milligan, I. L., Bryant, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age+impacts+extracellular+matrix+metabolism+in+chondrocytes+encapsulated+in+degradable+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed.+Mater%22%5BJournal%5D)">Age impacts extracellular matrix metabolism in chondrocytes encapsulated in degradable hydrogels.</a> Biomed. Mater. 7, 024111-0210 (2012).</li>
<li>Hoffman, M. D., Benoit, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agonism+of+Wnt-beta-catenin+signalling+promotes+mesenchymal+stem+cell+%28MSC%29+expansion%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Tissue.+Eng.+Regen.+Med%22%5BJournal%5D)">Agonism of Wnt-beta-catenin signalling promotes mesenchymal stem cell (MSC) expansion.</a> J. Tissue. Eng. Regen. Med. , (2013).</li>
<li>Sawhney, A. S., Pathak, C. P., Vanrensburg, J. J., Dunn, R. C., Hubbell, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+Photopolymerized+Bioerodible+Hydrogel+Properties+for+Adhesion+Prevention%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Mater.+Res%22%5BJournal%5D)">Optimization of Photopolymerized Bioerodible Hydrogel Properties for Adhesion Prevention.</a> J. Biomed. Mater. Res. 28, 831-838 (1994).</li>
<li>Methacrylic Anhydride [Internet]. , Available from:
		
	 <a target="_blank" href="https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=AAAL14357-18">https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=AAAL14357-18</a> (2013).</li>
<li>Acrylic Anhydride [Internet]. , Available from:
		
	 <a target="_blank" href="http://www.polysciences.com/Catalog/Department/Product/98/productid--40/">http://www.polysciences.com/Catalog/Department/Product/98/productid--40/</a> (2013).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen.

Poly (ethyleenglycol) (PEG) hydrogelen vaak biomaterialen gebruikt in regeneratieve geneeskunde en drug delivery toepassingen 1-3. Deze hydrogels bieden aanzienlijke voordelen ten opzichte van andere biomaterialen. PEG hydrogelen kunststof, met een hoge mate van controle over technische eigenschappen zoals modulus en afbraaksnelheid vergelijking met hun natuurlijke tegenhangers biomateriaal 1. Als ze synthetisch zijn afgeleid PEG is aanzienlijk minder batch-to-batch variabiliteit versus natuurlijke afgeleide materialen 4. Door de chemische samenstelling van PEG hydrogelen die sterk hydrofiel, bestand tegen eiwitadsorptie en biocompatibele 3. Deze weerstand eiwit adsorptie kan PEG hydrogels om als blanco lei &quot;, waardoor onderzoekers ondervragen en studie specifieke biologische of chemische factoren (drugs, biomoleculen, celadhesie peptiden enz.) en de specifieke rollen deze factors spelen in het controleren van cel-en / of weefsel gedrag. <img alt="Figuur 1" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50890/50890fig1.jpg" width="600px" /> <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50890/50890fig1highres.jpg" target="_blank">Klik hier voor grotere afbeelding</a> . Figuur 1: Voorbeelden van poly (ethyleenglycol) (PEG) architecturen A) lineaire PEG B) 4-arm PEG met een pentaerythritol kern C) 8-arm PEG met een hexaglycerol kern D) 8-arm PEG met een.... tripentaerythritol kern. n is het aantal PEG herhalingen aan elke arm. Elke herhaling een molecuulgewicht van 44 g / mol, derhalve n kan worden berekend uit het totale molecuulgewicht en de structuur / arm #. PEG voorlopers zijn beschikbaar met verschillende architecturen en molecuulgewichten (Figuur 1<html> ). Het variëren van de architectuur (arm #) en ethyleenglycol herhalingen (n) van PEG kan worden gebruikt om eigenschappen van de hydrogel netwerken gevormd uit deze macromeren regelen. Ongemodificeerde PEG bevat eindstandige hydroxylgroepen die moet worden vervangen door een alternatieve functionaliteit om covalente verknoping via polymerisaties, de meest gebruikte verknopende strategie voor PEG hydrogelen, vóór de vorming van hydrogel netwerken. Er zijn verschillende chemische groepen die in PEG-macromeren kunnen worden opgenomen om polymerisatie en verknoping netwerk (acrylaat, methacrylaat, vinylether, norborneen, enz.) te vergemakkelijken. Ondanks de verscheidenheid aan terminal functionaliteiten om verknoping te vergemakkelijken, zijn er slechts twee mechanismen waardoor polymerisatie kan optreden: stap-en ketengroei (of een mengsel van beide, mixed-mode). g2.jpg &quot;width =&quot; 600px &quot;/&gt; <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50890/50890fig2highres.jpg" target="_blank">Klik hier voor grotere afbeelding</a> . Figuur 2:.. Theoretische hydrogel netwerk schema A) Traditionele ketengroei polymerisatie resultaten in heterogene netwerken met dichte poly (methacrylaat) verknopen van regio&#39;s en betere netwerk nonidealities zoals lussen, gereageerde voorlopers, en permanente verwikkelingen B) Stap-groei polymerisatie resultaten in aanzienlijk homogeen netwerkstructuren (niet op schaal). Functionaliteiten die verknopen via ketengroei polymerisatie niet de aanwezigheid van een extra vernettingsmiddel nodig. Echter,-keten gepolymeriseerd hydrogels produceren heterogeen netwerk structuren die dichte verknoping regio&#39;s (Figuur 2A) 1. In tegenstelling, stap-groei polymerisatie gesmeerdres het gebruik van een verknopingsmiddel of co-monomeer dat reactief is met de eindstandige functionele groepen van de PEG macromeren. Als de eindstandige functionele groepen op PEG alleen reageren met het verknopingsmiddel en het verknopingsmiddel kan alleen reageren met de eindstandige functionele groepen op PEG, dit resulteert in een grotere homogeniteit netwerkstructuur (figuur 2B) 1. Stap-polymerisaties ook typisch leiden tot hogere omzetting van functionele groepen, het verminderen van de hoeveelheid ongereageerd precursoren en potentieel immune / ontstekingsreacties door oplosbare, niet opgenomen macromeren 1. Gemengde modus polymerisatiewerkwijzen zijn ook ontwikkeld dat zowel stap-en ketengroei polymerisatie gecombineerd door het gebruik van macromeren die zowel zelf-reactie (ketengroei) en reageren met een verknopingsmiddel (stap-groei). Dit levert hydrogels met kenmerken van elke polymerisatie mechanisme en kan worden gebruikt om complexe, afwisselende netwerkstructuren produceren dan beidestief-of keten-groei netwerken alleen 1. Hoewel er een overvloed aan functionele groepen die kunnen worden gebruikt om PEG functionaliseren en hydrogelvorming vergemakkelijken, methacrylaten en norbornenen zijn enkele van de meest voorkomende ketting-en stap-groei polymerisatie groepen, respectievelijk. Beide functionaliteiten bieden uitstekende spatiotemporal controle over het netwerk polymerisatie, en wanneer gebruikt om cellen in te kapselen, deze netwerken ondersteunen hoge totale cel overlevingskansen 5-7. Dimethacrylaat gefunctionaliseerde PEG (PEGDM) crosslink via ketenpolymerisatie en maakt de opname van biomoleculen of andere factoren door copolymerisatie met acrylaat-, methacrylaat-of soortgelijke gefunctionaliseerde biomoleculen 5,6. PEGDM hydrogels hebben belangrijke voordelen ten opzichte van alternatieve ketengroei polymerisatie systemen zoals acrylaat gefunctionaliseerde PEG (PEGDA). Met behulp van traditionele methoden, kan PEGDA sneller worden gesynthetiseerd dan PEGDM; however, met behulp van microgolf-geassisteerde synthese, PEGDM synthese is nog efficiënter. PEGDA vaak gesynthetiseerd nachts 8 of 24-uurs 9 reacties, maar kan ook worden gesynthetiseerd in vier uur bij verhoogde temperaturen 10. PEGDM wordt traditioneel ook gesynthetiseerd door reactie van &#39;s nachts 11 of 24 uur 5, met een aantal methoden de reactie tijd te breiden tot 4 dagen 12. Met behulp van de microgolf-geassisteerde methode hier aangetoond, kan PEGDM worden geproduceerd in een 5 min reactie. Hoewel PEGDM heeft langzamer kinetiek dan PEGDA 13, de verknopingsreactie voor PEGDM nog snel, voorkomen in minuten en bereikt een grotere macromeer conversie dan PEGDA de verhoogde hydrofobiciteit van de methacrylaatgroep verhoogt functionele groep aggregatie in oplossing, waardoor de kans op toenemende radicale overdracht en omzetting van methacrylaat 14. PEGDM hydrogelen zijn ook geassocieerd met verhoogde cellulaire levensvatbaarheid en groeivergeleken PEGDA hydrogelen waarschijnlijk door de verminderingen reactiesnelheid op een bepaald moment, die radicaalconcentratie en ongereageerd macromeren onderhavige 14 vermindert. Thiol-polymerisaties zoals met-norborneen gefunctionaliseerde PEG (PEGN) vorm hydrogels via stap-groei polymerisatie en vereisen het gebruik van PEGN en een verknopingsmiddel dat een gemiddelde van meer dan twee functionele groepen bevatten. Aangezien thiyl radicalen reageren met norborneen koolstof-koolstof dubbele bindingen, multi-thiol bevattende crosslinkers worden vaak gebruikt om PEGN hydrogels verknopen, waardoor gemakkelijke opname van peptiden met cysteïne aminozuren functionaliteiten 7. Hoewel er tal van andere chemicaliën die via stap-groei polymerisatie reactie (Michael-additiereacties zoals thiol-acrylaat 15 en thiol-vinylsulfon 16, &quot;Instructies&quot; reacties zoals azide-alkyn 17 enz.), thiol-norborneen hydrogelen zeer vaak voor, omdat de stam vande norborneenring de reactiesnelheid aanzienlijk verhoogt en verlaagt de kans op de norbomeen dubbele binding ondergaan ketenpolymerisatie 7. De beslissing tussen methacrylaat, norborneen, of alternatieve functionalisering aan hydrogelvorming vergemakkelijken is grotendeels gebaseerd op de aanpak. Bijvoorbeeld zijn ketengroei gepolymeriseerde PEGDM netwerken blijkt goed geschikt om cel lokalisatie beheersen de ontwikkeling van een tissue engineered periost 18,19. Stap groei gepolymeriseerd PEG netwerken zijn beter geschikt voor de opname van peptidesequenties enzymatisch-responsieve hydrogel degradatie vergemakkelijken, vanwege het gemak van opname van enzymsubstraat sequenties met thiol (cysteine) bevattende peptiden en gefunctionaliseerde norborneen macromeren 20. Indien de vraagstelling beste worden aangepakt door het gebruik van stap-groei hydrogels, Fairbanks et al.. Een gedetailleerde beschrijving van de norbornene functionaliseringsreacties strategie voor PEG 7. Dit document zal in detail hoe PEG en peptide sequenties kunnen worden gefunctionaliseerd (met een methacrylaat voor PEG, en een methacrylamide voor peptiden) voor ketenpolymerisatie reacties. Traditioneel PEGDM wordt bereid door PEG met methacryloylchloride en triethylamine in dichloormethaan. De reactie wordt vooruitgang bij kamertemperatuur 11 gedurende 24 uur of 5, met een aantal methoden uitstrekkende reactietijd op 4 dagen 12 vóór filtratie, neerslaan in diethylether en collectie. Terwijl vele variaties van deze benadering bestaan ​​allemaal tijdrovend, vereisen een grote reeks van chemische synthese apparatuur en zijn niet milieuvriendelijk daar het om het gebruik van relatief grote hoeveelheden van hoogzuiver reagentia en oplosmiddel. Om deze beperkingen te omzeilen, Lin-Gibson et al.. Een microgolf-geassisteerde, oplosmiddelvrije methode om PEG functionaliseren met te ontwikkelen<html> rminal methacrylaatgroepen (figuur 3A) 12. In deze reactie, de terminale alcoholgroepen van PEG reageren met een van de atomen van de carbonyl methacrylzuuranhydride een carboxyl vormen. Dit genereert het PEGDM product, met methacrylzuur als een bijproduct. Deze synthese heeft veel van de kenmerkende voordelen van microgolf synthese, inclusief verminderde reactietijd en oplosmiddelvrije synthesemethoden 21. De magnetron synthese de voorkeur de eerder beschreven methoden is het beduidend sneller, vergt minder uitgebreid synthese apparatuur (bijv. glaswerk, reactieplaten) en gebruikt minder algemene reagens en oplosmiddel bedragen als oplosmiddelen alleen vereist voor productzuivering / verzamelen en niet synthese, waardoor het zuiniger en milieuvriendelijker. 0px &quot;/&gt; <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50890/50890fig3highres.jpg" target="_blank">Klik hier voor grotere afbeelding</a> . Figuur 3:. Functionalisering schema A) poly (ethyleenglycol) reageren met 10x molaire overmaat methacrylzuuranhydride aan poly (ethyleenglycol) methacrylaat B) Dezelfde methode kan worden gebruikt om de N-terminus van peptidesequenties functionaliseren produceren, die een. methacrylamide gefunctionaliseerde peptide. Door deze procedure voor het splitsen van het peptide van de hars, kan selectieve functionalisering van de N-terminus worden uitgevoerd zoals aminozuurzijketens groepen beschermd blijven. n: aantal PEG herhalingen in het macromeer (n = 45,5, 227 en 455 respectievelijk de 2, 10 en 20 kDa lineaire PEG gebruikt). R1 RN: aminozuurzijketens. PG1 naar PGN: zijketenbeschermende groepen. TFA: trifluorazijnzuur. TIPS: triisopropylsilaan. Dodt: 3,6-dioxa-1 ,8-octanedithiol. H 2 O: water. De microgolven methacrylation werkwijze is onlangs aangepast door onze groep aan het N-terminus van peptiden functionaliseren met methacrylamide groepen (figuur 3B) om peptide opname in een verscheidenheid van polymeren en polymere netwerken. In deze reactie, de primaire amine van de N-terminus van het peptide reageert met het carbonyl atoom op de methacrylzuuranhydride een amide. Dit genereert het methacrylamide gefunctionaliseerde peptide met methacrylzuur geproduceerd als een bijproduct. Bij deze procedure aan de N-terminus van peptidesequenties functionaliseren, is het belangrijk dat aminozuren met reactieve zijketens (primaire aminen (lysine), alcohol (serine, threonine) en fenolen (tyrosine)) worden beschermd tijdens functionalisering en beschermende groepen worden alleen gesplitst na methacrylamide oprichting. Dit artikel zal beide microw tonenave-ondersteunde methoden om PEGDM synthetiseren en functionalize on-hars peptide sequenties, aandacht voor valkuilen en suggereren methoden voor probleemoplossing. In dit artikel zullen methoden om analytisch chemische technieken vaak gebruikt om product functionalizering beoordelen voeren gedetailleerd, en suggesties en middelen voor het uitvoeren van meer geavanceerde aanpassingen zal worden gegeven. Typische resultaten zal worden gedemonstreerd, waaronder het gebruik van de gesynthetiseerde PEGDM om hydrogel netwerken te vormen, het benutten van de gevormde hydrogelen tot het vrijkomen van een model drugscontrole, met gebruikmaking van gefunctionaliseerde peptiden naar cel-hydrogel interacties vergemakkelijken. Bijzondere aandacht zal worden besteed aan het karakteriseren hydrogelmaasgrootte en bespreken hoe hydrogel samenstelling kan worden afgestemd op deze onderliggende fysieke eigenschap, die op zijn beurt bulkmateriaal eigenschappen zoals stijfheid en geneesmiddelafgifteprofiel beïnvloeden.

<table><tbody><tr><td>3,6-Dioxa-1,8-octanedithiol</td><td>Tokyo Chemical Industry Co, LTD</td><td>D2649</td><td>CAS 14970-87-7</td></tr><tr><td>Acetonitrile</td><td>J.T. Baker</td><td>UN1648</td><td>CAS 75-05-8</td></tr><tr><td>Aminozuren</td><td>AAPPTech</td><td>Glycine: AFG101</td><td>CAS 29022-11-5</td></tr><tr><td> </td><td></td><td>Arginine: AFR105</td><td>CAS 154445-77-9</td></tr><tr><td> </td><td></td><td>Asparagine: AFD105</td><td>CAS 71989-14-5</td></tr><tr><td> </td><td></td><td>Serine: AFS105</td><td>CAS 71989-33-8</td></tr><tr><td>Anhydrisch diethylether</td><td>Fisher Scientific</td><td>UN1155</td><td>CAS 60-29-7</td></tr><tr><td>Citroenzuur</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C1857</td><td>CAS 77-92-9</td></tr><tr><td>Gedeutereerd chloroform</td><td>Cambridge Isotope Laboratories Inc.</td><td>DLM-7-100</td><td>CAS 865-49-6</td></tr><tr><td>Dichloormethaan</td><td>Fisher Scientific</td><td>UN1593</td><td>CAS 75-09-2</td></tr><tr><td>Diisopropylethylamine</td><td>Alfa Aesar</td><td>A1181</td><td>CAS 7087-68-5</td></tr><tr><td>Dimethylformamide</td><td>Fisher Scientific</td><td>D119-4</td><td>CAS 68-12-2</td></tr><tr><td>Fmoc-Gly-Wang-hars</td><td>Peptides International</td><td>RGF-1301-PI</td><td>100-200 mesh maat</td></tr><tr><td>Methacrylzuuranhydride</td><td>Alfa Aesar</td><td>L14357</td><td>CAS 760-93-0</td></tr><tr><td>N-Methylpyrrolidon</td><td>VWR</td><td>BDH1141-4LG</td><td>CAS 872-80-4</td></tr><tr><td>Op-hars peptiden</td><td>Gesynthetiseerd in eigen huis</td><td></td><td>Op-hars peptiden kunnen ook worden gekocht bij Peptides International, GenScript, AAPPTec, etc.</td></tr><tr><td>O-Benzotriazool-N,N,N&rsquo;,N&rsquo;-tetramethyl-uronium-hexafluorofosfaat</td><td>AnaSpec Inc</td><td>510/791-9560</td><td>CAS 94790-37-1</td></tr><tr><td>Peptide kalibratiestandaard</td><td>Care</td><td>206195</td><td></td></tr><tr><td>Piperazine</td><td>Alfa Aesar</td><td>A15019</td><td>CAS 11-85-0</td></tr><tr><td>Poly(ethyleenglycol) 2 kDa lineair</td><td>Alfa Aesar</td><td>B22181</td><td>CAS 25322-68-3</td></tr><tr><td>Poly(ethyleenglycol) 10 kDa lineair</td><td>Alfa Aesar</td><td>B21955</td><td></td></tr><tr><td>Poly(ethyleenglycol) 20 kDa lineair</td><td>Sigma Aldrich</td><td>81300</td><td>JenKem Technologies USA is een alternatieve leverancier van lineair en multi-arm PEG</td></tr><tr><td>Tioanisol</td><td>Alfa Aesar</td><td>L5464</td><td>CAS 100-68-5</td></tr><tr><td>Trifluorazijnzuur</td><td>Alfa Aesar</td><td>A12198</td><td>CAS 76-05-1</td></tr><tr><td>Triisopropylsilaan</td><td>Alfa Aesar</td><td>L09585</td><td>CAS 6485-79-6</td></tr><tr><td>&alpha;-Cyano-4-hydroxycininezuur</td><td>Tokyo Chemical Industry Co, LTD</td><td>C1768</td><td>CAS 28166-41-8</td></tr></tbody></table>

microgolven functionalisering van poly (ethyleenglycol) en on-hars peptiden voor gebruik in chain polymerisaties en hydrogel vorming

Microwave-assisted Functionalization of Poly(ethylene glycol) and On-resin Peptides for Use in Chain Polymerizations and Hydrogel Formation

Een van de belangrijkste voordelen voor het gebruik van poly (ethyleenglycol) (PEG) macromeren in hydrogelvorming synthetisch veelzijdigheid. De mogelijkheid om putten uit een grote verscheidenheid aan PEG molecuulgewichten en configuraties (arm getal, armlengte en vertakking) levert onderzoekers strakke controle resulterende hydrogel structuren en eigenschappen, zoals elasticiteitsmodulus en maaswijdte. Deze video zal een snelle, efficiënte, oplosmiddelvrije, microgolven methode om PEG voorlopers methacrylaat in poly (ethyleenglycol) dimethacrylaat (PEGDM) illustreren. Deze synthetische methode biedt de broodnodige grondstoffen voor toepassingen in drug delivery en regeneratieve geneeskunde. De aangetoonde methode is superieur aan traditionele methacrylation methoden is aanzienlijk sneller en eenvoudiger, evenals economischer en milieuvriendelijker, met kleinere hoeveelheden reagentia en oplosmiddelen. We zullen ook een aanpassing van deze techniek tonen voor on-hars methacrylamide functionalisering van peptiden. Deze on-hars methode kan de N-terminus van peptiden worden gefunctionaliseerd met methacrylamide groepen voor ontscherming en afsplitsing van hars. Dit maakt selectieve toevoeging methacrylamide groepen de N-termini van de peptiden terwijl aminozuren met reactieve zijgroepen (bijv. primair amine van lysine, primaire alcohol van serine, threonine of secundaire alcoholen en fenol tyrosine) beschermd blijven, waardoor functionalisering op meerdere plaatsen. Dit artikel zal detail gemeenschappelijke analysemethoden (proton Nucleaire Magnetische Resonantie spectroscopie (, H-NMR) en Matrix laserdesorptie ionisatie Time of Flight massaspectrometrie (MALDI-TOF)) om de efficiëntie van de funtionaliseringen beoordelen. Valkuilen en stelde probleemoplossingsmethoden worden aangepakt als modificaties van de techniek die kan worden gebruikt om verder afstemmen macromeer en functionaliteit resulterende hydrogel fysische en chemischeeigenschappen. Gebruik van gesynthetiseerde producten voor de vorming van hydrogels voor drug delivery en cel-materiaal interactie studies moeten worden aangetoond, met bijzondere aandacht besteed aan het wijzigen hydrogelsamenstelling te maaswijdte beïnvloeden, controleren hydrogel stijfheid en afgifte van geneesmiddelen.

Proton nucleaire magnetische resonantie is een van de meest voorkomende analytische technieken om de efficiëntie van een chemische reactie te beoordelen, zoals het oppervlak onder elke piek spectra evenredig aan de relatieve niveaus van deze proton in het monster, waardoor de bepaling van de verhouding van product en reagens in het monster. Voor deze reactie kan 1H-NMR-analyse (figuur 4) worden gebruikt om het% functionalisatie van de waargenomen berekenen: theoretische verhouding van terminale methacrylaat protonen (a, b en c) de centrale PEG protonen (d). De in Figuur 4 PEGDM was 2.000 Da voor functionalisering, dus n = 2000 Da / (44 Da / PEG herhaling) = 45,5, zodat d = 4 * (n-1) = 178, waardoor de proton: NMR reductor 178 / 102,16 = 1,74. In dit geval kan een piek niet wordt dan beoordeeld% functionalisering, de aanwezigheid van water in het monster kunstmatig verhoogt het oppervlak van de piek. Met behulp van piek b, het% functionalisering is 1,00 * 1,74 / 2 * 100% = 87,1%; using piek c, het% functionalisering is 1,08 * 1,74 / 2 * 100% = 94,1%. Bijgevolg zal het% functionalisering is 91% en dit PEGDM adequaat gefunctionaliseerd voor gebruik in hydrogel synthese. Typisch, wordt ongeveer 90% functionaliseringsreacties bereikt na een enkele ronde van methacrylation. Door de veelheid van proton pieken die zich in 1H-NMR-analyse van peptiden, peptide wordt functionalisering gemakkelijker onderzocht middels MALDI-TOF massaspectrometrie. Dit wordt aangetoond in figuur 5, waarbij het ​​peptide GKRGDSG werd gesynthetiseerd en aan functionalisering methacrylamide. Een klein deel van het peptide werd gesplitst voor prefunctionalization molecuulgewicht beoordeling (figuur 5A), waaruit bleek het waargenomen molecuulgewicht piek optreedt bij 676 g / mol, het verwachte molecuulgewicht van het peptide, die de juiste synthese van de peptidesequentie. De rest van het peptide onderging methacrylamide functionelenisatie voorafgaand aan decollete. Omdat dit peptide Pbf beschermde R aminozuren, werd splitsing uitgevoerd in een cocktail met thioanisool 4 uur. Na methacrylamide functionalisering, het waargenomen molecuulgewicht piek treedt op bij 744 g / mol (figuur 5B), het verwachte gewicht van het methacrylamide gefunctionaliseerde peptide (676 68 g / mol) en niet op het verwachte molecuulgewicht van het gefunctionaliseerde peptide, die de juiste functionalisering. Om de werking van zowel de PEG en methacrylamide gefunctionaliseerde peptide tonen, werden PEGDM hydrogels geproduceerd met en zonder 0,5 mM methacrylamide gefunctionaliseerd GKRGDSG (figuur 6). Hydrogelen werden gemaakt met 10 gew% lineair 10 kDa PEGDM in PBS met 0,05 gew% lithium fenyl-2 ,4,6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP) als fotoinitiator. De hydrogel voorloper oplossing werd geïnjecteerd tussen twee glasplaatjes gescheiden door een glasplaatje spacer en bij elkaar gehouden met bindmiddel clips. Precursor oplossing werd vervolgens blootgesteld aan 365 nm UV licht bij 2 mW / cm 2 gedurende 10 minuten verknoping induceren, waarna gels 8 mm werden verzameld met behulp van een cilindrische punch. Gels werden gespoeld in PBS en zwellen gedurende 2 dagen om te zorgen evenwichtzwelling voorwaarden werden bereikt 16,20. Menselijke MSCs (doorgang 3) werden gekweekt tot 80% confluentie en gezaaid op hydrogelen bij 15.000 cellen / cm 2. De cellen werden toegestaan ​​te hechten gedurende 48 uur alvorens te worden overgebracht naar vers medium bevattende 0,5 ul / ml calceïne AM en 2 pl / ml ethidium homodimeer (Live / dead Levensvatbaarheid kit van Invitrogen) en afgebeeld onder fase contrast en fluorescentie bij 10x vergroting met een Nikon Eclipse Ti 2000. MSC&#39;s waren niet in staat zich te houden aan de ongefunctionaliseerd PEG hydrogelen (figuur 6A), maar na de opneming van de cel adhesie peptide RGD ze in staat waren om zich te houden aan en te verspreiden over de hydrogel oppervlak (figuur 6B). De live / DEAD beeldengepresenteerde de levensvatbaarheid van de gezaaide MSC populatie vormen zoals MSC&#39;s zijn adhesie-afhankelijke cellen die los van het gel oppervlak na de dood en tijdens media overdracht worden verwijderd, waardoor opblazen gezaaid cellevensvatbaarheid. In plaats daarvan zijn de fluorescerende beelden ter bakenen tussen hechtende cellen en kleine variaties in de hydrogel topologie, die alleen moeilijk onder fasecontrast. Interessant is dat de nonspread cellen gezaaid op enige PEG-gelen vlek positief voor zowel calceïne AM en ethidiumhomodimeer, wat aangeeft dat de cellen stierven bij de beeldvorming. Een van de vele voordelen PEG hydrogelen is hun zeer afstembare aard. De specifieke samenstelling van de PEG hydrogel wijzigen onderzoekers biedt een hoge mate van controle over eigenschappen zoals modulus. Zoals getoond in fig. 7, zowel PEG molecuulgewicht (figuur 7A) en gewichtspercentage ( <strong&gt; Figuur 7B) is bekend dat ze hydrogelmaasgrootte (ξ) en de daaruit voortvloeiende hydrogel stijfheid controle en geneesmiddel-afgifte van ingekapselde geneesmiddelen. Dit werd aangetoond door het overleggen hydrogelen met verschillende moleculair gewicht PEGDM, en het onderzoeken van de resulterende hydrogel modulus en maaswijdte (figuur 8). Alle hydrogelen werden gemaakt met 10 gew% lineair PEGDM in PBS met 0,05 gew% LAP als fotoinitiator. 40 pl hydrogel precursor oplossing was 1 ml spuiten met uiteinden afgesneden, en blootgesteld aan 365 nm UV licht bij 2 mW / cm 2 gedurende 10 minuten tot hydrogelen vormen, produceert cilindrische geometrie ongeveer 5 mm in diameter en 2 mm hoog . Gelen liet men zwellen in PBS gedurende 2 dagen voor mechanische testen. Hydrogel modulus werd bepaald met een MTS QT / 5 met 5 N load cell terwijl comprimeren tussen 5 en 10% van de aanvankelijke hydrogel hoogte met een snelheid van 0,1 mm / sec. Na mechanische testen werd voltooid, werd maaswijdte bepaald door hydrogel mass pre-(M s) en post-(M D) 24 uur van vriesdrogen via de Flory-Rehner vergelijking als omschreven in de paragraaf discussie, met berekeningen uitgevoerd in MATLAB. Als hypothese, waardoor het molecuulgewicht van de PEG-macromeer een toename hydrogelmaasgrootte (Figuur 8A) en een afname van stijfheid hydrogel (figuur 8B) veroorzaakt. Hydrogel maaswijdte en de resulterende gel stijfheid kan ook worden geregeld door het veranderen gewichtspercentage PEG. Hydrogelen werden geproduceerd met verschillende gewichts% lineair 10 kDa PEGDM en hydrogel stijfheid en maaswijdte werden bepaald zoals eerder beschreven (figuur 9). Zoals geïllustreerd in figuur 7B, verhogen gew% PEG veroorzaakt een significante afname maaswijdte (figuur 9A) en de toename van de stijfheid hydrogel (figuur 9B). Hydrogels met ingekapselde runderserumalbumine (BSA) werden gevormd onder toepassing variërende molecular gewicht PEG (2, 10 en 20 kDa). Alle hydrogelen werden gemaakt met 10 gew% PEGDM in PBS dat 50 ug / ml BSA, zoals beschreven bij figuur 6. Gels werden geïncubeerd in 1 ml PBS bij 37 ° C en overgebracht naar vers PBS op elk tijdstip. Uitgebracht BSA werd gekwantificeerd met behulp van de Bradford assay van Thermo Scientific. Hydrogelmaasgrootte werd bepaald zoals beschreven voor Figuur 8. Zoals getoond in figuur 7A, BSA afgifte treedt sneller uit hydrogelen gevormd met hoger molecuulgewicht PEGDM als gevolg van de grotere maaswijdte in de hydrogel (figuur 10). <img alt="Figuur 4" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50890/50890fig4.jpg" width="500px" /> Figuur 4. Representatieve 1H-NMR van 2 kDa lineaire PEGDM gefunctionaliseerd met de microgolven methode. Procent functionalisering kan worden calculated op basis van de waargenomen:. theoretische verhouding van terminal methacrylaat protonen (a, b en c) naar het centrum van PEG protonen (d) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50890/50890fig4highres.jpg" target="_blank">Klik hier voor grotere afbeelding</a> . <img alt="Figuur 5" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50890/50890fig5.jpg" width="500px" /> Figuur 5. Representatieve MALDI-ToF peptide GKRGDSG (A) vóór en (B) na functionalisering met de microgolven methode. Merk op dat het waargenomen molecuulgewicht piek na functionalisering vindt plaats bij 744 g / mol, het verwachte gewicht van het methacrylamide gefunctionaliseerde peptide (676 68 g / mol) en niet op de verwachte molecuulgewicht van de niet-gefunctionaliseerde peptide (676 g / mol). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50890/50890fig5highres.jpg" target="_blank">Klik hier voor grotere afbeelding</a> . Figuur 6. Vertegenwoordiger fase contrast (links) en Live / DEAD (groen / rood) fluorescerende beelden (rechts) van MSC&#39;s gekweekt op A) PEG-gelen alleen en B) PEG-gelen die 0,5 mM methacrylamide gefunctionaliseerde GKRGDSG. MSC&#39;s zijn niet in staat zich te houden aan en verspreid over de PEGDA gels alleen, maar bij de oprichting van de cel adhesie peptide RGD, in staat zijn zich te houden aan en te verspreiden over de hydrogel oppervlak. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50890/50890fig6highres.jpg" target="_blank">Klik hier voor grotere afbeelding</a> . <img alt="Figuur 7" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50890/50890fig7.jpg" width="500px" /> Figuur 7. A) PEG molecuulgewicht en B) gewichtspercentage PEG gebruikt om hydrogel netwerken vormen beïnvloedt hydrogelmaasgrootte (_8 ;) en de resulterende hydrogel stijfheid en afgiftesnelheid van ingekapselde geneesmiddelen. A) Toenemende PEG molecuulgewicht (links naar rechts) en constant gewichtspercentage vergroot hydrogelmaasgrootte, aflopend hydrogel stijfheid en verhogen van de snelheid van geneesmiddelafgifte. B) verlagen het gewicht percentage van PEG (links naar rechts) gebruikt om hydrogels vormen verhoogt hydrogelmaasgrootte, evenzo afnemende hydrogel stijfheid en het verhogen van de snelheid van afgifte van het geneesmiddel (niet op schaal). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50890/50890fig7highres.jpg" target="_blank">Klik hier voor grotere afbeelding</a> . <img alt="Figuur 8" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50890/50890fig8.jpg" width="500px" /> Figuur 8. A) Mesh schaalvergroting en B) hydrogel stijfheid neemt af met toenemend molecuulgewicht van de PEG-macromeer. N = 10, foutbalken = SEM, *** p &amp;# 60; 0.001 door one-way ANOVA met Tukey HSD post-hoc test. Alle statistische analyses werden uitgevoerd met behulp Prism 5. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50890/50890fig8highres.jpg" target="_blank">Klik hier voor grotere afbeelding</a> . <img alt="Figuur 9" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50890/50890fig9.jpg" width="500px" /> Figuur 9. A) Maaswijdte afneemt en B) hydrogel stijfheid toeneemt met toenemende gew% PEG. N = 9-10, foutbalken = SEM, ** p &lt;0,01, *** p &lt;0,001 door eenzijdige ANOVA met Tukey HSD post- hoc test. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50890/50890fig9highres.jpg" target="_blank">Klik hier voor grotere afbeelding</a> . <img alt="Figuur 10" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50890/50890fig10.jpg" width="500px" /> Figuur 10. Vrijgave van encapsulated modelgeneesmiddel runderserumalbumine (BSA) uit hydrogels gevormd met 2 kDa, 10 kDa, 20 kDa molecuulgewicht PEG. BSA afgifte komt sneller uit hydrogelen gevormd met hoger molecuulgewicht PEGDM als gevolg van de grotere maaswijdte in de hydrogel . n = 6, error bars = SEM. Het% BSA model is significant verschillend (p &lt;0,0001) tussen de drie groepen op elk tijdstip behalve t = 1 en 2,5 uur bij de afgifte uit de 2 en 10 kDa gels gelijkwaardig, twee-weg herhaalde metingen ANOVA met Bonferroni post-hoc test. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50890/50890fig10highres.jpg" target="_blank">Klik hier voor grotere afbeelding</a> .

Deze video is een snelle, efficiënte methode om poly (ethyleenglycol) methacrylaat illustreren, waardoor keten polymerisaties en hydrogel synthese. Het zal laten zien hoe je methacrylamide functionaliteiten dezelfde wijze te introduceren in peptiden, detail gemeenschappelijke analytische methoden om functionalisering efficiëntie te beoordelen, suggesties voor het oplossen van problemen en geavanceerde aanpassingen, en tonen typische hydrogel karakterisering technieken.

Microgolven Functionalisering van poly (ethyleenglycol) en On-hars Peptiden voor gebruik in Chain Polymerisaties en Hydrogel Vorming

One of the main benefits to using poly(ethylene glycol) (PEG) macromers in hydrogel formation is synthetic versatility. The ability to draw from a large ...

Het algemene doel van deze procedure is om polyethyleenglycol en peptiden functioneel te maken met methacrylaatgroepen voor daaropvolgende kettingpolymerisaties en hydrogelsynthese. Dit wordt bereikt door eerst methacrylzuuranhydride en de niet-functionele precursor in een scintillatieglas te combineren. De tweede stap is om microgolfenergie te gebruiken om de peg of het peptide te functioneliseren.Vervolgens wordt de PEG DM opgelost in chloormethan, of wordt het peptide van de hars afgesplitst. En alle beschermende groepen van de zijketen worden verwijderd in een op zuur gebaseerde cocktail. De laatste stap is om de PEG DM of het met acrylzuur gefunctionaliseerde peptide in ether te precipiteren.Uiteindelijk wordt proton NMR of Maldi time of flight mass spectrometry gebruikt om de succesvolle functionelering van de peg of het peptidemacro te laten zien. Hallo, mijn naam is Amy Van Hove. Ik ben een PhD-student in de afdeling Biomedische Technologie aan de Universiteit van Rochester.Het belangrijkste voordeel van deze techniek boven bestaande methoden zoals het reageren van PEG met methacrylzuurfluoride is dat de reactie aanzienlijk sneller en milieuvriendelijker is. Hallo, mijn naam is Brandon Wilson. Ik ben een student scheikunde aan de Universiteit van Rochester.Deze methode kan helpen om belangrijke vragen in het biomaterialenveld te beantwoorden, zoals hoe hydrogels die worden geproduceerd met peg dimethyl kunnen worden gebruikt om de afgifte van therapeutische cellen in moleculen te beheersen. Hallo, ik ben Danielle Benoit, een assistent-professor in de afdeling Biomedische Technologie aan de Universiteit van Rochester. De implicaties van deze techniek zijn voor het ontwikkelen van therapieën voor een verscheidenheid aan ziekten, aangezien de gesynthetiseerde verbindingen kunnen worden gebruikt voor cel- en medicijnafgiftetoepassingen.Voordat u met deze procedure begint, droogt u het vereiste glaswerk gedurende één uur in een oven om besmetting met water in een grote weibrood te voorkomen. Weg uit vijf gram peg met een moleculair gewicht tussen 1000 en 100.000 dalton. Verwijder indien aanwezig het plastic stuk van het deksel van een scintillatieglas in de chemische kap in de chemische kap.Sproeit 10 molaire overmaat van methacrylzuuranhydride in een gescheurde scintillatieglas. Voeg vervolgens PEG toe aan de fles. Draai vervolgens los de dop op de fles en plaats de fles in de magnetron.Stel de magnetron in op vijf minuten op maximaal vermogen met hittebestendige handschoenen. Verwijder de fles uit de magnetron elke 30 seconden. Draai vervolgens de dop helemaal dicht en vortex de steekproef gedurende 30 seconden.Maak de dop los voordat u de fles terugbrengt naar de magnetron. Herhaal deze stappen totdat de oplossing gedurende de volledige vijf minuten in de magnetron is geplaatst. Nadat u de fles uit de magnetron hebt verwijderd, maakt u de dop los en laat u de PEG DM afkoelen tot kamertemperatuur.Los vervolgens de PEG DM op in 10 tot 15 milliliter dichloromethaan. Precipiteer de PEG DM in 10 x overmaat van pre dathyl ether gedurende 20 minuten. Gebruik een zeven centimeter Buckner trechter en een 500 milliliter fles.Verzamel de PEG DM door vacuümfiltratie. Breng vervolgens de gefilterde PEG DM over naar een 50 milliliter kegelvormige buis met een naald met grote maat door de dop voor ventilatie. Plaats de buis in een vacuümkamer en droog de PEG DM een nacht lang.Na het verwijderen van de buis uit de vacuümkamer, los op de PEG DM in DI chloromethaan op met ijskoud dathyl ether. Om niet-reactief methacrylzuuranhydride te verwijderen na filtratie en verzameling, droog de PEG DM op dezelfde manier als eerder in een vacuümkamer. Voor proton NMR-analyse, plaats ongeveer 10 milligram PEG DM in een scintillatieglas en voeg ongeveer één milliliter gedeutereerd chloroform toe.Zodra het monster is opgelost, breng het over naar een schone NMR-buis. Verzamel vervolgens de proton NMR-spectra en voer de monsters bij kamertemperatuur uit gedurende ten minste 64 scans om voldoende gegevensresolutie te verkrijgen. Nadat het peptide van belang is gesynthetiseerd door vaste fase synthese, bewaar het op de hars in DMF bij vier graden Celsius totdat het klaar is om te worden gebruikt.Verzamel vervolgens het peptidehars via filtratie met behulp van een zeven centimeter Buckner trechter met filterpapier en een 250 milliliter fles. Verwijder het plastic stuk van het deksel van een scintillatieglas en breng de hars over naar de fles. Voeg met een wegwerppipet net genoeg methacrylzuuranhydride toe om de hars te bedekken Na losjes de dop op de fles te hebben gedraaid, plaats deze in de magnetron en stel de timer in op drie minuten.Op maximaal vermogen met hittebestendige handschoenen, verwijder de fles uit de magnetron elke 15 tot 20 seconden. Na het volledig vastdraaien van de dop, vortex de steekproef gedurende 15 seconden. Maak de dop los voordat u de fles terugbrengt naar de magnetron.Herhaal deze totdat de oplossing gedurende de volledige drie minuten in de magnetron is geplaatst. Laat met de losgemaakte flesdop de peptideoplossing afkoelen tot kamertemperatuur met behulp van een kleine hoeveelheid DMF en een zeven centimeter Buckner trechter. Met filterpapier en een 250 milliliter fles.Verzamel het peptidehars uit de fles voor splitsing en diepe bescherming. Breng het peptidehars over naar een verse scintillatieglas voor 0,25 millimol arginine bevattend peptide. Voeg 0,25 milliliter toe van elk tri ISO propyleen drie zes dioxide één acht octandiol thiol gedeïoniseerd water, en 18,0 milliliter TFA.Draai vervolgens het reactiemengsel vier uur op een lab quake rotator bij kamertemperatuur. Wanneer u klaar bent, precipiteert u het peptide in 10 x overmaat van pre chill ethyl ether. Verdeel de oplossing gelijkmatig over vier 50 milliliter kegelvormige buizen, centrifugeert de vier monsters bij 3.200 G gedurende 10 minuten om het peptide te verzamelen na centrifugatie, decanteert de ether, suspendeert het peptide opnieuw in 100 milliliter vers ethylether verdeeld tussen twee 50 milliliter kegelvormige buizen.Herhaal het centrifugatieproces. Suspensie het peptide in 50 m

microwave-assisted-functionalization-poly-ethylene-glycol-on-resin

Research

JoVE Journal

Chemistry

Scheikunde

Het volgende protocol biedt technieken voor het inkapselen van pancreatische β-cellen in stap-groei PEG-peptide hydrogels gevormd door thiol-een foto-click reacties. Dit materiaal platform niet alleen een cytocompatible micro voor cel inkapseling, maar maakt ook de gebruiker gecontroleerde snelle herstel van celstructuren gevormd binnen de hydrogels.

Generatie en terugwinning van β-cel sferoïden Van Step-groei PEG-peptide Hydrogelen

Dit werk beschrijft de vorming van poly(ethyleenglycol) (PEG) microgels via een fotogepolymeriseerde precipitatiereactie. Het verhogen van het moleculair gewicht van PEG verhoogde de diameter van de microgel en de zwellingsverhouding. Er worden eenvoudige aanpassingen aan de PEG microgel precipitatiereactie onderzocht voor toekomstige toepassingen van microgels als geneesmiddelafgiftesystemen en weefselengineering scafolds.

Kenmerken van neerslag gevormde Polyethyleen Glycol Microgels worden gecontroleerd door Moleculair gewicht van de reactanten

Ons laboratorium heeft DNA verknoopt polyacrylamide hydrogels, een dynamisch hydrogel systeem ontwikkeld om de effecten van modulerende weefsels stijfheid op celfunctie beter te begrijpen. Hier bieden we schema's, beschrijvingen en protocollen om deze hydrogels bereiden.

Bereiding van DNA verknoopt polyacrylamide hydrogels

Cel-adhesiviteit is essentieel voor veel benaderingen in biomateriaalonderzoek en weefselengineering. Er wordt een stapsgewijze techniek gepresenteerd die gebruik maakt van natte chemie voor de oppervlaktemodificatie van het belangrijke polymeer PTFE met peptiden.

Natte Chemie en Peptide immobilisatie op Polytetrafluoroethyleen voor betere Cel-adhesie

De belangrijkste stappen van levende anionische polymerisatie van fenylglycidylether (PheGE) met methoxy-polyethyleenglycol (MPEG- -PPheGE b) worden beschreven. Het verkregen blokcopolymeer micellen (BCMS) werden beladen met doxorubicine 14% (gew%) en aanhoudende afgifte van geneesmiddel gedurende 4 dagen onder fysiologisch relevante omstandigheden werd verkregen.

Anionische polymerisatie van een amfifiele copolymeer voor de bereiding van blokcopolymeer micellen gestabiliseerd door π-π stapelen interacties

We presenteren een protocol voor de synthese van RGD-gefunctionaliseerde hydrogels als apparaten voor cel- en geneesmiddelafgifte. De procedure omvat koper gekatalyseerde alkyn-azide cycloadditie (CuAAC) tussen alkyn-gemodificeerde polyacrylzuur (PAA) en een RGD-azide-derivaat. De hydrogels worden gevormd met behulp van microgolf-geassisteerde polycondensatie en hun fysisch-chemische eigenschappen worden onderzocht.

De synthese van RGD-gefunctionaliseerde Hydrogels als een instrument voor therapeutische toepassingen

We beschrijven een sequentieel proces voor lichtgemedieerde vorming en daaropvolgende biochemische patroonvorming van synthetische hydrogelmatrices voor toepassingen in driedimensionale celcultuur. De constructie en modificatie van hydrogels met cytocompatibele fotoclick-chemie wordt gedemonstreerd. Bovendien worden eenvoudige technieken gepresenteerd om patronen te kwantificeren en observeren en de celviabiliteit binnen deze hydrogels te bepalen.

Light-gemedieerde Vorming en patroonvorming van hydrogels voor Cultuur van de Cel Applications

Protocollen zijn beschreven voor de fabrikatie van afbreekbaar thermoresponsive hydrogels op basis van het hydrazon cross-linking van polymere oligomeren op de schaal van de bulk, microscale, en nanoscale, de laatste voorbereiding van zowel de nanofibers als de gel nanodeeltjes.

Fabriceren van afbreekbaar Thermoresponsive Hydrogels op meerdere lengte schalen via reactieve extrusie, Microfluidics, zelf-assemblage en Electrospinning

Dit protocol presenteert drie snelle en eenvoudige bereidingsmethoden die omgevingsomstandigheden gebruiken om de zelfassemblage van peptiden tot hydrogels op gang te brengen. Daarnaast wordt de karakterisering van peptidehydrogels beschreven, wat aantoont dat mechanisch stabiele peptidehydrogels onder deze eenvoudige omstandigheden kunnen worden gevormd.

Bereiding van mechanisch stabiele, zelf geassembleerde peptiden, hydrogels

Microgolf-geassisteerde intramoleculaire dehydrogenerende Diels-Alder (DA) reacties geven beknopt toegang tot gefunctionaliseerde cyclopenta...

Microgolf-geassisteerde Intramoleculaire dehydrogenerende Diels-Alder reacties voor de synthese van gefunctionaliseerde naftalenen / Solvatochromic Kleurstoffen

Leer een snelle methode voor de functionalisering van polyethyleenglycol en peptiden met methacrylaatgroepen voor ketenpolymerisaties en hydrogelsynthese. Deze techniek versnelt biomateriaalonderzoek aanzienlijk.

Microgolven Functionalisering van poly (ethyleenglycol) en On-hars Peptiden voor gebruik in Chain Polymerisaties en Hydrogel Vorming (Video) | JoVE Journal

Microgolven Functionalisering van poly (ethyleenglycol) en On-hars Peptiden voor gebruik in Chain Polymerisaties en Hydrogel Vorming

Meer video's verkennen