Vroege Metamorfe Insertion technologie voor Insect Flight Behavior Monitoring

Hoi, ik ben Alex Derber uit het laboratorium van Dr. Albert Bos, van de afdeling Electrical Engineering aan de North Carolina State University. Vandaag gaan we een nieuwe chirurgische procedure demonstreren voor het implanteren van elektroden in de manica sex tijdens de vroege metamorfosefasen.

In deze procedure, die Early Metamorphic insertion technology wordt genoemd, worden de geïmplanteerde elektroden geïntegreerd in het weefsel van het insect tijdens het metamorfose stadium van de pop. Een belangrijk voordeel van deze procedure is dat het resulteert in een mechanisch stabiele en elektrisch betrouwbare koppeling met het neuromusculaire weefsel, wat de bestudering van de vluchtneurofysiologie van het insect mogelijk maakt. In de volwassen fase doorloopt IC Mensa een metamorfosecyclus die ongeveer 40 dagen duurt.

Mensa begint zijn levenscyclus in het eistadium. Na zeven tot 10 dagen is de larve uitgekomen en het derde sterlarvestadium bereikt. Er zijn in totaal vijf sterlarvestadia, en in elk van deze stadia ondergaat de larve energie-extractie en groei.

Vijf tot zes dagen na het vijfde larvale instar gaat het insect het vroege popstadium in. Tijdens het popstadium vindt er uitgebreide degeneratie en aansluitende regeneratie van de weefsels van het insect plaats. Ter voorbereiding op de uitkomst als volwassen mot verblijft het insect 17 tot 19 dagen in dit stadium.

In het vroege popstadium, vóór het intreden van het late popstadium, en tijdens het late popstadium, plaatsen we chirurgisch een elektrisch geleidende elektrode in de dorsale thorax van de pop. Het weefsel ontwikkelt zich rond de geïmplanteerde elektroden, waardoor de bevestiging aan het lichaam van het insect wordt gewaarborgd. In de loop van enkele dagen komen de in de thorax van de pop geplaatste elektroden, in het uiteindelijke volwassen stadium als mot, naar buiten als onderdeel van het lichaam van het insect, waardoor er wordt geprofiteerd van de heropbouw van het volledige weefselsysteem van het insect.

Tijdens de metamorfose worden de elektroden geïmplanteerd in de indirecte vliegspieren in de thorax. Deze spiergroepen, die indirect verantwoordelijk zijn voor de vleugelbeweging, zijn de dorsoventrale en de dorsolongitudinale spieren. Hier demonstreren we de insertie van een elektrode in de dorsoventrale spieren, die indirect verantwoordelijk zijn voor de opwaartse vleugelslag.

Met deze insertie zullen we draadloos het elektromyogram van de dorsoventrale spieren registreren tijdens de beweging. Aangezien het insect is opgehangen aan een elektromagnetisch leviterend platform binnen een LED-arena, stimuleert dit de beweging. De procedure voor de insertietechnologie tijdens de vroege metamorfose begint met de constructie van een printplaat die als interface zal dienen tussen de geïmplanteerde elektroden en de registratieapparatuur.

De draadelektroden zijn gesoldeerd op de printplaat, die is aangesloten met een platte, flexibele kabelconnector. Begin met het afmeten en uitknippen van een stuk kopergelamineerd laminaat van 0,5 bij vijf vierkante centimeter met een fijne permanent marker en een schaar. Teken met dezelfde fijne permanent marker drie pads van 0,1 bij vijf vierkante centimeter als etsmaskerpatronen.

Gebruik een liniaal of een ander recht hulpmiddel om de markeringen over de gehele lengte van het uitgesneden koperlaminaat aan te brengen. Zorg ervoor dat de markeringen duidelijk zijn en elkaar niet overlappen. Als de markeringslijnen elkaar overlappen, zullen de elektroden kortsluiten.

Bij het maken van de verbinding met de platte, flexibele kabelconnector, waardoor de printplaten onbruikbaar worden, brengt u de uitgesneden koperlaminaat naar een geventileerde ruimte, bij voorkeur naar de zuurkast, om de markeringen in het koperlaminaat te etsen. Wees voorzichtig bij het etsen van de printplaat, aangezien dit toxisch is. Indien ingenomen of ingeslikt kan het de huid irriteren bij contact; breng Teflon-tape aan op één uiteinde van de uitgesneden koperlaminaat, waarbij ongeveer één centimeter van de lengte wordt bedekt.

Bevestig vervolgens de uitgesneden koperlaminaatstrip aan de binnenkant van een maatbeker met plakband, zodanig dat de helft van de strip in het etsmiddel is ondergedompeld. Plaats de beker gedurende 20 minuten op een draaiplatform. Verwijder het geëtste koperlaminaat uit de beker en plaats het gedurende 10 minuten in een beker gevuld met water.

Breng voor het afspoelen van het residu isopropylalcohol aan op een stukje fijn pluisvrij weefsel en veeg de markeringen weg om de niet-geëtste koperen pads bloot te leggen. Verwijder alle sporen van de permanente marker. Snijd de printplaat in kleinere vierkantjes van ongeveer één centimeter lang.

Nu de printplaten zijn geëtst, moeten de elektroden worden voorbereid voor bevestiging. Het wordt aanbevolen om deze stappen uit te voeren met behulp van een microscoop. Snijd met een scherp mes twee stukken gecoat, geanneald roestvrijstalen draad met een diameter van 0.11 inch gecoat en 0.008 inches onbedekt, elk met een lengte van drie centimeter.

Deze stukken roestvrijstalen draad zijn de actieve elektroden die in de thorax van het insect worden ingebracht. Verwijder met een scheermesje vier tot vijf millimeter van de plastic coating aan beide uiteinden van elke draad. Snijd vervolgens.

Eén stuk geïsoleerde roestvrijstalen draad van 0,7 centimeter om een tipverlenging voor de aarde-elektrode te maken. Verwijder voorzichtig de coating met het scheermesje zoals uitgevoerd in de vorige stap of smelt deze met de hitte van een soldeerbout. Snijd vervolgens één stuk lititz-draad op een lengte van 4,5 centimeter.

Inductiedraad kan ook voor dit soldeerwerk worden gebruikt. Soldeer het eerder voorbereide stukje roestvrijstalen punt van 0,7 centimeter aan de aardedraad. Aan het uiteinde van de aardedraad moet een blootgesteld roestvrijstalen puntje zitten.

Plak de geëtste printplaat met Teflontape op de soldeerwerkplek. Plaats de tape over de printplaat zodanig dat één tot twee millimeter van de pads vrijblijven voor het solderen van de elektroden aan de plaat. De afgemaskerde, soldeervrije uiteinden van de pads worden in de FCC-connector gestoken.

Lijn de drie elektrodedraden uit met Teflon-tape, zodat één uiteinde van elke draad aan de overeenkomstige contactpunten op de elektrodenprint gesoldeerd kan worden. De twee actieve elektroden moeten worden gesoldeerd op de contactpunten nabij de randen van de print. De geaarde referentie-elektroden moeten worden gesoldeerd op het centrale contactpunt.

Breng roestvrijstalen vloeimiddel aan op de elektrodepads om het solderen te vergemakkelijken. Let erop dat kortsluiting tussen de padverbindingen wordt vermeden door niet te veel soldeer aan te brengen. Dompel de elektroden telkens 10 minuten onder in aceton en in isopropylalcohol.

Om de soldeerresten te verwijderen. De oplossingen kunnen in afzonderlijke schaaltjes of bekerglazen worden gegoten. Om de reinigingsprestaties te verbeteren, kunnen de elektroden tijdens het onderdompelen in een ultrasoonbad met de reinigingsoplossingen worden geplaatst. De insecten zullen het meest actief zijn tijdens de overgangen tussen dag en nacht.

Daarom moet er in een insectenkamer een kunstmatige dag-nachtcyclus worden ingesteld met behulp van automatische stekkerstroomtimers. Deze moeten worden ingesteld om een cyclus van zeven uur donker en 17 uur licht te simuleren. Controleer dagelijks de manduka sex eye pu eye om het juiste tijdstip voor insertie te bepalen.

De pupillen zijn ongeveer één dag na de vleugels klaar voor insertie. De inserties van donkere vlekken zijn het meest succesvol wanneer ze zeven tot vier dagen vóór het sluiten van de pupillen worden uitgevoerd. De donkerdere pupil aan de onderkant is klaar voor de chirurgische insertie van de elektroden om de pupillen te anesthetiseren.

Plaats ze gedurende ongeveer zes uur in de koelkast bij 4 °C. Bereid vervolgens de werkruimte voor de insertie voor. De werkruimte dient isopropylalcohol, scherpe pincetbladen en een hypodermische naald van 30 gauge te bevatten.

Als optie kan cyanoacrylaatlijm worden gebruikt om de fixatie van de elektroden te verbeteren; steriliseer de naaldpincet en de elektroden door ze in isopropanol te dopen of ermee af te vegen. Haal de pupil na zes uur uit de koelkast en breng deze over naar de werkruimte. Bepaal de locatie op de dorsale thorax die overeenkomt met de betreffende spiergroep.

Hier zijn we geïnteresseerd in de dorsoventrale spieren die verantwoordelijk zijn voor de opwaartse vleugelslag. Kras met een scherp mesje of een hypodermische naald voorzichtig een vierkant van één bij één centimeter door de exocuticulalaag. Pel deze stukjes vervolgens langzaam af met de pincet.

Gebruik de pincet om vleugelhaar te verwijderen uit het blootgelegde gebied van het thorax. Optioneel kan een vacuüm worden gebruikt om het reinigingsproces te ondersteunen. Het is belangrijk om zoveel mogelijk haar te verwijderen om interferentie met de geplaatste elektroden te voorkomen.

Steek de naald langzaam ongeveer vijf millimeter in het mesothorax, op de plek waar de vleugels aan de thorax vastzitten, om twee insteekpunten te creëren die op de spiergroep zijn gericht. Onthoud waar de gaatjes zijn gemaakt, omdat ze moeilijk terug te vinden kunnen zijn als u het overzicht verliest. Stabiliseer de pop op de tafel en gebruik een pincet om de twee registreerelektroden in de twee insteekpunten te geleiden als optie om de mechanische duurzaamheid te verbeteren.

Verwijder al het haar rond de elektroden en breng met de draadapplicator royaal ciano-acrylaatlijm aan rond elk insteekpunt op de thorax. Bereid de kooi voor voor ELO met een ruw en gestructureerd materiaal dat de wanden en het plafond bedekt, zodat het insect hierop kan klimmen. Na het uitkomen kunnen geperforeerde kartonnen dozen of inpakpapier worden gebruikt.

Bereid een starre fixatie voor. Gebruik een staafje van ongeveer zes centimeter lengte en twee millimeter diameter. Schuif dit staafje voorzichtig door het gat onder de uitstekende pros.

Plastic roerstaafjes. Voor deze stap kan een wattenstaafje of metaaldraad worden gebruikt. Bevestig beide zijden van het staafje op het oppervlak van de kooi, zodat de pop niet kan rondrollen.

Positioneer de pop in de kooi zodanig dat de mesothorax naar boven is gericht. Overmatige beweging kan schade aan de elektroden veroorzaken, leiden tot verlies van hemolymfe of de insertie onbruikbaar maken. De randelektrode moet in het abdomen of in de distale delen van de thorax worden ingebracht.

Om signaalkoppeling te voorkomen, kan de insertie van de disin worden uitgevoerd tijdens de latere stadia van de popontwikkeling of nadat het insect is uitgekomen. De insertieplaats van de randelektrode moet in dit popstadium worden voorbereid voor zowel insertie in het popstadium als insertie in het volwassen stadium. Hier wordt de insertie van een randelektrode in het volwassen stadium gedemonstreerd.

Plaats de motten zes uur lang in de koelkast bij 4 °C. Bereid voor de immobilisatie door koudebehandeling de werkruimte voor de insertie voor, inclusief isopropylalcohol, scherpe pincetten, een hypodermische naald van 30 gauge, cyanoacrylaatlijm, een stukje draad voor het aanbrengen van de lijm en optioneel een thermische cauterisator en een stokje met tandheelkundige was. Doop, zoals eerder beschreven, de hypodermische naald in de isopropylalcohol voordat deze in contact komt met de mot op een insertiepunt ongeveer 1 tot 2 cm verwijderd van de registratie-elektroden langs het posterieure abdomen; voer de naald langzaam in om het abdomen te doorboren en een insertiezijde te creëren.

De naald mag niet dieper dan vier millimeter penetreren. Als er hemolymfe optreedt bij de insteekzijde, is de naald te diep ingebracht en is de kans op succes van de procedure kleiner. Plaats met een pincet voorzichtig de geaarde elektrode in de insteekplaats en oefen druk uit tot een diepte van drie tot vier millimeter.

Houd de elektrode op zijn plaats en gebruik een draad om lijm rond de insertieplaats aan te brengen als optionele stap. Om de mechanische sterkte van de insertie verder te vergroten, kan de thermische cauterisator worden gebruikt om een kleine druppel was van twee tot drie millimeter op de punt te verzamelen. Plaats de punt dicht bij de insertieplaats en breng warmte aan zodat de was de elektrode omringt en stevig op zijn plaats houdt.

Laat het insect na het afkoelen één dag herstellen van de insertie voordat de experimenten worden uitgevoerd. Er is een adapterboard met vlakke flexibele kabelconnectoren nodig om het elektrodeboard op het insect te verbinden met de internationale head stage-unit van Triangle Biosystems. Het adapterboard maakt gebruik van een geëtst koperlaminaatbord dat moet worden voorbereid volgens de eerder beschreven stappen voor het voorbereiden van het elektrodeboard; soldeer vervolgens bij het soldeerstation een vlakke flexibele kabelconnector aan één uiteinde van het voorbereide board.

Een platte flexibele kabelconnector met 10 pinnen kan op de printplaat worden gesoldeerd, waarbij de twee paren pinnen aan de randen van de connector en het centrale pinpaar in contact staan met de drie koperen contactvlakken. Soldeer vervolgens drie aansluitdraden van 30 American wire gauge aan drie contactvlakken. Soldeer aan het andere uiteinde van de printplaat drie miniconnectoren aan de drie contactvlakken op de adapterplaat voor de beschreven oscilloscoopmetingen.

Plaats in de volgende fase twee van de connectoren loodrecht op de randen van de printplaat. De centrale connector moet iets schuin omhoog staan, weg van het vlak van de plaat; soldeer het andere uiteinde van deze drie draden aan de connector van de headstage, geleverd door Triangle Biosystems International.

De printplaat van de headstage moet vervolgens bovenop het levitatieframe worden bevestigd om de betrouwbaarheid van de elektroden te waarborgen en de signaal-ruisverhouding te observeren. Er kunnen bedrade oscilloscoopregistraties worden gemaakt. Sluit vóór het implementeren van het draadloze registratiesysteem de oscilloscoop aan op een multichannel AC-neuro-registratieversterker.

Stel de parameters van de versterker in op een hoogpass-afsnijfrequentie van 1 Hz, een laagpass-afsnijfrequentie van 20 kHz en een versterking van 100. Verbind elke vrouwelijke minidraadconnector op de adapterplaat met de ingangskanalen van de versterker. Haal het insect met de geïmplanteerde elektrodeplaat uit de kooi.

Wanneer het insect zich in een actieve staat bevindt, kan er met een pincet een stuk weefsel onder de mot worden geplaatst om op te rusten voordat de metingen worden uitgevoerd; schuif vervolgens de elektrodeplaat in de aansluiting voor de platte flexibele kabel op de adapterplaat. Verwijder het weefsel onder het insect en observeer de generatie van elektromyogram-spikes. Leg de gegevens vast op de oscilloscoop en sla deze op terwijl het insect met zijn vleugels klappert.

Deze figuur toont het spierpotentiaalsignaal dat met de oscilloscoop is geregistreerd bij een van de spieren vóór en tijdens het klapperen met de vleugels. Het signaal is verwerkt met een honderdvoudige versterking, een hoogdoorlaatfilter van 1 Hz en een laagdoorlaatfilter van 20 kHz en de rustperiode. Er worden geen spierpotentialen waargenomen.

De spierpotentialen tijdens het klapperen met de vleugels treden op bij ongeveer 15 tot 20 hertz. Zodra de oscilloscoopmetingen zijn verzameld en geverifieerd, moeten de draadloze EMG-signalen worden verzameld. Er kan een elektromagnetisch levitatieplatform worden gebouwd voor de draadloze registratie van EMG-signalen tijdens het gebonden vliegen van Manus sex.

Het levitatieplatform bestaat uit een frame dat is ontworpen om een bevestigingsmechanisme in balans te houden. De vrije zwevende levitatie zorgt ervoor dat het frame en daarmee het insect kunnen ya. Tijdens testen zonder de beperking van bevestigingsdraden kan het frame snel worden geprototyped met behulp van een fused deposition modeling-machine.

Dit frame met magneten wordt geleveerd door een serie elektromagneten in het basisplatform. Dit leviterende platform bevindt zich in de LED-arena, die is opgebouwd uit 60 panelen bestaande uit een matrix van vijf bij zeven individuele LED's. De arena wordt aangestuurd door een APIC 18 F 45 20-microcontroller, waardoor zowel rotatie met de klok mee als tegen de klok in kan worden gesimuleerd, evenals de regeling van de rotatiesnelheid.

Stel het draadloze registratiesysteem van TBSI in door de TBSI-headstage aan te sluiten op de connector van de adapterplaat op het levitatieplatform. Haal het insect uit de kooi wanneer het actief is, bij voorkeur tijdens de schemering.

Gebruik een pincet. Plaats de elektrodenprintplaat voorzichtig in de receptor voor de platte flexibele kabel op het zwevende frame, zodat het insect stevig in de opstelling is opgehangen. Plaats de magnetische pen nabij de magnetschakelaar op de headstage om de draadloze gegevensoverdracht te activeren.

Er gaat een blauw lampje branden om aan te geven dat de headstage actief is en klaar is voor opname. Doe de lichten in de kamer uit voor volledige duisternis en open de TBSI neuro aware-software op een computer. U kunt een rode lamp gebruiken voor extra verlichting in de kamer.

Selecteer het juiste configuratiebestand. Het configuratiebestand dat in deze procedure wordt gebruikt, is de standaardinstelling W five. Klik vervolgens op de knop 'start deck' in de linkerbovenhoek van de initiële interface.

Om signalen te gaan bekijken, selecteert u het tabblad 'all channels' (alle kanalen) om EMG-signalen op het TBSI-registratiesysteem waar te nemen. Schakel alle LED-arena-componenten, de gereguleerde DC-voeding en de microcontroller in om een betrouwbare draadloze verbinding en werking van de elektroden te garanderen. Balanceer het levitatieplatform langzaam binnen de arena.

Selecteer het tabblad 'record to binary' in het linkerpaneel van de NorAware-interface. Bepaal de opnameduur en de opslaglocatie van het bestand. Kies de juiste uitvoerinstellingen om uw gegevens op te slaan.

Klik op de startknop om een opnamesessie te starten in de TBSI-opnamesoftware. Hiermee wordt uw bestand opgeslagen als een .next-bestand, dat kan worden geïmporteerd in veelgebruikte programma's voor gegevensverwerking.

Observe hoe het insect vliegt in de richting die overeenkomt met de beweging van de LED's. Keer de richting van de LED's om en bevestig dat het insect van richting verandert. Voer dit proces zoveel keer uit als gewenst. De getoonde pijl geeft de rotatierichting van het LED-patroon aan.

De pijl wordt geel. Wanneer het insect een tegenwijzerdraaiende draai maakt, wordt de pijl blauw wanneer het insect een met de klok mee draai maakt. De spraak bij het afspelen van de film is 50% sneller dan normaal.

Deze figuur toont het spierpotentiëleignaal verkregen via de draadloze instrumentatie van één spier vóór en tijdens het klappen van de vleugels in de rustperiode. Er worden geen spierpotentialen waargenomen. De spierpotentialen tijdens het klappen van de vleugels treden op bij ongeveer 15 tot 20 hertz.

Hier hebben we zojuist een opname met één kanaal laten zien. Een opname met meerdere kanalen, gemaakt met deze opstelling, kan echter worden gebruikt om de coördinatie tussen meerdere spiergroepen tijdens vliegmanoeuvres waar te nemen. We hebben u zojuist laten zien hoe u een elektrode-insertie uitvoert in een mannelijke sex-to-pupa in een vroeg metamorfose-stadium.

Het is belangrijk om de timing van de insertie in de late pupilfase zodanig te plannen dat de insertie niet te vroeg of te laat in deze fase plaatsvindt. Anders kan het problematisch zijn om een betrouwbare elektrode-opstelling te realiseren. We hebben u daarnaast laten zien hoe u de elektrische componenten assembleert die nodig zijn voor het draadloos registreren van EMG-data van indirecte vliegspieren terwijl het insect zweeft in de LED-arena.

Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.