Name: In vivo Postnatale Elektroporatie en time-lapse imaging van neuroblast Migratie in Muis Acute Brain Slices (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-25T21:45:00.000+00:00
Duration: 10 min 51 s
Description: Leer neuroblastmigratie visualiseren in het postnatale muizenbrein met in vivo-elektroporatie en time-lapse imaging. Deze methode maakt gedetailleerde analyse van celbeweging mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

MS en YZ worden ondersteund door KCL en KCL-China PhD-training. MO werd gefinancierd door een biotechnologie en biologische wetenschappen Research Council PhD studententijd. Wij danken Masaru Okabe en Jun-ichi Miyazaki voor de PCX-EGFP plasmide en Alain Chedotal en Athena Ypsilanti voor waardevolle adviezen over elektroporatie.

Deze procedure is in overeenstemming met de UK Home Office Verordeningen (Animal Wetenschappelijke Procedures Act, 1986). Wetenschappers zouden de gevestigde en door hun institutionele en nationale dier regelgevende organisaties goedgekeurde richtlijnen te volgen. 1. Postnatale Elektroporatie 1.1. Voorbereiding van de Glass-capillairen, DNA Solution en Electroporatie <ol><li> Bereid getrokken glas haarvaten (OD: 1,5 mm, ID: 0.86 mm) voor DNA-injectie. (Indicatieve instellingen voor een Sutter P-97 capillaire puller zijn: Heat 283; Trek 50; Velocity 90; Time 50). Een markering op de capillaire overeenkomt met een volume van ongeveer 2 ui. </li><li> Stel de spanning van de elektroporator tot 5 rechthoekimpulsen, 50 msec / puls bij 100 V, 850 msec intervallen (100 V, 50 msec puls ON, OFF puls 850 msec puls 5). </li><li> Verdun hoge zuiverheidsgraad (OD 260/280&gt; 1.80) endotoxinevrij plasmide-DNA tot een uiteindelijke concentratie van 1-2 ug / ulmet endotoxine vrij Tris-EDTA-buffer of PBS. Het wordt aanbevolen om 0,1% Fast Green aan de DNA-oplossing (de kleurstof moet verspreid in de ventrikel als succesvol geïnjecteerd). </li><li> Bereid de 5-7 mm elektroden, de elektrode gel en opwarmen van de verwarming pad. </li></ol> 1.2. Elektroporatie <ol><li> Verwijderen postnatale dag 2 muis pup van kooi en verdoven door isofluraan inhalatie (met een stroomsnelheid van ~ 0,6 L / min). </li><li> Na ongeveer 1 minuut, wordt de actuele verdoving het voetpedaal pinch respons. Als er geen beweging optreedt, doorgaan met intraventriculaire injectie. </li><li> Laad capillaire naald met 1-2 ul van DNA met behulp van een beluchtingsbuis aangesloten op het capillair. </li><li> Onder een koude lichtbron, houdt u de kop van de pup tussen duim en wijsvinger van je minder dominante hand. Iets trek de huid weer op de kop om de identificatie van de juiste injectie punt helpen. </li><li> Overweeg een denkbeeldige lijn tussen het oog en thij craniometric oriëntatiepunt lambda (Figuur 1A). Steek de capillaire naald ongeveer eenderde van de lengte van de lijn van de lambda (ongeveer 1 mm van het middelpunt lijn) 15. Plaats de capillaire ongeveer 2 mm diep, en zorg ervoor dat diepe penetratie in de hersenen voorkomen. </li><li> Injecteer plasmide door langzaam blazen door de mond (een spuit verbonden met het capillair kan worden gebruikt). Tijdens deze procedure, zorg ervoor dat uw vingers niet toepassen van te veel druk op de hersenen, omdat deze succesvolle plasmide injectie kan voorkomen. </li><li> Stop injectie wanneer een minimale hoeveelheid DNA-oplossing in de capillair. Het is raadzaam om minder dan 1 pi injectie op nadelige toename van intracraniale druk te voorkomen. </li><li> Coat beide elektroden met gel en plaats ze met de pluskant aan de laterale zijde van de halve bol waar het DNA werd geïnjecteerd (Figuur 1A). Voor het DNA van de rostrale SVZ, plaats elektroden iets rostraal van deinjectiepunt. Variërend elektrode positie kan regionale specificiteit van elektroporatie te bereiken in verschillende gebieden van de SVZ 22,25. </li><li> Initiëren huidige overdracht door op de pols voetschakelaar. Wanneer de elektroporatie is voltooid, controleert de spanning op de elektroporator scherm (spanningswaarden mag niet lager zijn dan 90 V, aangezien lagere spanningswaarden correleren met een slechte elektroporatie efficiëntie). </li><li> Reanimeren de pup onder zuurstof op verwarming pad voor een paar minuten en terug te sturen naar de kooi, waardoor het uit de buurt van de moeder. Zorg ervoor dat de moeder haalt de pup en herenigt met de rest van het nest. Na elektroporatie, laat pups met hun moeder voor 4-7 dagen voor de volgende stap. </li></ol> 2. Voorbereiding van de Acute Brain slice culturen 2.1. Bereiding van oplossingen en tools <ol><li> De volgende oplossingen zijn (het is ook mogelijk om hoog glucose DMEM gebruiken ontleden en imaging17): Dissectie Medium (500 ml) Gey&#39;s gebalanceerde media - 500ml 45% Glucose - 5ml Film medium (10 ml) 45% Glucose - 0.110 ml HEPES 1 M - 0.100 ml Pen / Strep - 0.100 ml FCS - 0.500 ml B27 - 0.100 ml Glutamine - 0.200 ml Dulbecco Modified Eagle Medium (fenol rood-vrij) - 8.89 ml </li><li> Warm-up film medium bij 37 ° C. </li><li> Plaats Millicell voegt in een 35 mm glazen bodem cultuur schotel met 1 ml medium film en plaats in een bevochtigde incubator bij 37 ° C / 5% CO 2. </li><li> Bereid vibratome accessoires (schroevendraaier, kamer, scheermesjes, lijm). </li><li> Bereid dissectie-instrumenten: schaar, kleine spatel, rechte tang. </li><li> Bereid je gereedschappen voor het omgaan met plakjes: kleine kwast of zachte entnaald (grootte: 10 pl), plastic pasteurpipetten, een ice box en diverse 6 cm plastic schaaltjes. </li><li> Precool de dissectie mediumbij 2-4 ° C. </li></ol> 2.2. Voorbereiding van Brain Slices <ol><li> Vul een 6 cm schotel met voorgekoeld dissectie medium en plaats het op het ijs (naar vers gesneden plakjes te houden). </li><li> Na cervicale dislocatie, met een schaar om de muis pup onthoofden. Verwijder de hoofdhuid met een scalpel, snijd de schedel langs de mid-pijlnaad van de OB naar het cerebellum en verwijder voorzichtig de craniale flappen behulp van een tang. Zorg ervoor dat de gehele hersenen is blootgesteld en zorgvuldig ontleden met behulp van een spatel, waarbij speciale zorg het weefsel niet beschadigt. De ontleding moet zorgvuldig gebeuren maar tegelijkertijd zeer snel (minder dan een minuut indien mogelijk). Cervicale dislocatie is onze voorkeur omdat terminal anesthesie met drugs / gas anesthetica de trekkende eigenschappen van de neuroblasts en de gezonde toestand van de hersenen slice culturen, die moeten relatief snel worden afgebeeld na het offeren van dieren kan beïnvloeden. </li><li> Hemisect de hersenen met een razof blade (figuur 2). Gooi uninjected halfrond of gebruiken voor andere experimenten. </li><li> Leg een stukje tape op de vibratome houder en gebruik de minimale benodigde hoeveelheid lijm op de hersenhelft erbovenop (figuur 2) bevestigen. Dit voorkomt beschadiging van het houderoppervlak door herhaalde lijm toepassingen. </li><li> Laat de lijm drogen voor een paar seconden. </li><li> Plaats de houder in de vibratome dienblad gevuld met voorgekoelde dissectie oplossing. Richt de bulbus olfactorius naar het mes (Figuur 2). </li><li> Begin het snijden van de hersenhelft met behulp van geschikte instellingen. De volgende parameters worden aanbevolen: plakdikte 300 micrometer; snelheid ~ 3-5; frequentie ~ 9. Hoge frequentie en lage snelheid wordt aangeraden om schade aan de slice te voorkomen. </li><li> Verzamel plakjes met behulp van een klein penseel of een zachte entnaald. Alleen houden plakjes met zichtbare OB (meestal 2-3 plakjes / hersenen). Typisch, het segment met de meeste RMS can te vinden op ~ 300 micrometer van het bodemoppervlak. </li><li> Controleer plakjes onder een standaard fluorescentiemicroscoop voor GFP signaal (en zorg ervoor dat ze omdraaien om de fluorescentie te controleren aan beide kanten), en kies degene die toont heldere fluorescentie langs het grootste deel van de RMS. </li></ol> 2.3. Het kweken van Brain Slices <ol><li> In een celkweek kap, weggesneden de meest caudale derde van de hersenen slice en lijm sporen met behulp van fijne rechte pincet of een microdissection scalpel verwijderen. </li><li> Fijn zuig het schijfje met een plastic Pasteur pipet (snijd de punt van de pipet om een ​​grotere opening creëren, zal dit voorkomen dat schade aan de slice) en plaats het op het midden van een voorverwarmde Millicell insert. </li><li> Controleer de kant met de helderste fluorescerende signaal wordt in contact gebracht met de Millicell invoegen (beeldvorming met een omgekeerde microscoop). </li><li> Verwijder overtollig dissectie oplossing op de top van de insert met een pipet. </li><li> Verlaat slice culturenvestigen in een 37 ° C / 5% CO2 incubator voor tenminste 1 uur voor de beeldvorming. </li></ol> 3. Time-lapse beeldvorming van neuroblast Migratie <ol><li> Ten minste 2 uur voor de beeldvorming, zet de Perkin Elmer UltraViewVoX confocale draaiende schijf systeem, omgekeerde Nikon Ti-E microscoop, Hamamatsu C10600-10B (ORCA-R2) gekoelde digitale CCD-camera, en verwarmingssysteem (Solent Scientific) ingesteld op de constante temperatuur van 37 ° C. </li><li> Open de Volocity software Acquisitie module en klik op &quot;Viz&quot; knop en selecteer de laser (s) voor de beeldvorming. </li><li> Binnen 2 uur van de hersenen slice voorbereiding, plaats de glazen bodem schaaltje met de hersenen slice in de beeldvorming kamer op de microscoop podium. </li><li> Gebruik een Nikon CFI Super Plan Fluor ELWD 20X/0.45 doelstelling onder de geschikte tl-licht aan de oppervlakte van het segment dat zal worden afgebeeld (bijvoorbeeld de eerste dalende deel van de RMS net na de injectie, of de Elbo selecteren en focusw regio van de RMS, of net na de bocht voordat neuroblasts voer de OB). </li><li> Stel de time-lapse imaging met de volgende acties: <ol><li> Op de microscoop, klik op de L100 knop om laser scanning van het monster mogelijk te maken. </li><li> In Volocity, opent u de Ultra VIEW Laser Changer door de juiste laser (bijv. 488 nm laser voor GFP). </li><li> Stel de belichtingstijd (gewoonlijk tussen 100-500 msec) en de laserintensiteit (gewoonlijk 20-30%) afhankelijk van de intensiteit van het fluorescentiesignaal. </li><li> Pas het beeld digitaal te krijgen tot celvisualisatie verbeteren. </li><li> Selecteer de z-stack interval op de foto in de hersenen slice (meestal meer dan een 100-120 um interval). Kies een interval met een geschikt aantal geïsoleerde cellen mogelijk te vermijden overlappingen zoveel mogelijk (dit zal de volgende tracking-analyse te vergemakkelijken). </li><li> Selecteer de afstand elk beeld z-stack (meestal 2-4 micrometer) tussen. </li><li> Kies de tijd intERVAL tussen de z-stack capture (bijv. 3 min) en de totale beeldvorming duur (bijv. 3 uur). </li><li> Klik op het icoon &quot;opslaan&quot; om de wijzigingen in de imaging parameters op te slaan. </li><li> Druk op de opnametoets om beeldvorming te starten. </li></ol></li><li> Alternatieve beeldvorming van controle en experimentele monsters (bijvoorbeeld voertuig / medicatie of andere geëlektroporeerd plasmiden) gedurende dezelfde dag. </li></ol> 4. Het analyseren neuroblast Migratie <ol><li> In de Volocity Kwantificering module, open de gewenste bibliotheek die na het voltooien van een time-lapse experiment. Selecteer &quot;Uitgebreide Focus&quot; vanuit de linkerbovenhoek box (Figuur 4A, stap 1). </li><li> Klik op het tabblad &quot;Metingen&quot; om de meting venster weer te geven (Figuur 4A, stap 2). </li><li> Een lijst van taken is zichtbaar in de linkerbenedenhoek van het scherm. Drag &quot;Track&quot; (onder het &quot;Varia&quot; aanwezig rubriek aan de onderkant vande lijst) ruimte boven. Dit zal de opening van een nieuw venster genaamd &quot;Track&quot; in de linkerbovenhoek van het scherm (Figuur 4A, stap 3) gevraagd. </li><li> Kies &quot;&quot; van de &quot;Input&quot; tabblad in het venster Track (Figuur 4A, stap 4). </li><li> Klik op de Point Tool (Figuur 4A, stap 5). </li><li> Beginnen met het bijhouden van de migrerende neuroblast door te klikken met de muis op het centrale gebied van de cel lichaam en houden het volgen van de beweging van cellen tot de laatste tijdstip van de time-lapse is bereikt (bijvoorbeeld punt nummer 61 voor een 3 uur durende film) . </li><li> Voor het verkrijgen van gegevens kiezen &quot;Make Meting Item&quot; van de Metingen Menu (figuur 4B, stappen 6-7). Er verschijnt een venster in het midden van het scherm. </li><li> In dit venster, selecteer &quot;Een nieuwe meting item met de naam:&quot; en typ een naam (Figuur 4C, stap 8). Vergeet niet om de optie &#39;Alle tijdstippen &quot;voor pr selecterenessing OK (Figuur 4C, stap 9). Een meting artikelbestand zal verschijnen onder de time-lapse-bestand en zal de parameters voor de kwantitatieve analyse (bijv. migratie afstand, snelheid, verplaatsing en verplaatsing tarief) bevatten. </li><li> Dubbelklik op de meting punt om het te openen als een venster (Figuur 4D, stap 10). </li><li> Om de single tracks van de geanalyseerde cellen zichtbaar te maken, kies &quot;rupsbanden Point&quot; van de &quot;Display&quot;-opties (Figuur 4D, stap 11). </li><li> Klik met de rechtermuisknop op de meting Item bestand en exporteren als een tekstbestand, dat vervolgens in programma&#39;s als Excel om migratie parameters te analyseren kan worden geïmporteerd. </li><li> Bewegingen tussen opeenvolgende frames en pauzes die door elke cel tijdens het filmen periode, in de Meting Item bestand te selecteren uit de &quot;Display&quot; opties &quot;Point&quot; of &quot;Populaties&quot; en klik op ID (elke track heeft een unieke ID) te meten. Het resulterende bestand door te gaan exporterening zoals beschreven in stap 4.10. </li></ol>

<ol><li>Ming, G. L., Song, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+neurogenesis+in+the+mammalian+brain%3A+significant+answers+and+significant+questions%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Adult neurogenesis in the mammalian brain: significant answers and significant questions.</a> Neuron. 70, 687-702 (2011).</li>
<li>Deng, W., Aimone, J. B., Gage, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+neurons+and+new+memories%3A+how+does+adult+hippocampal+neurogenesis+affect+learning+and%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">New neurons and new memories: how does adult hippocampal neurogenesis affect learning and.</a> 11, 339-350 (2010).</li>
<li>Lazarini, F., Lledo, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Is+adult+neurogenesis+essential+for+olfaction%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Is adult neurogenesis essential for olfaction?</a> Trends Neurosci. 34, 20-30 (2011).</li>
<li>Arvidsson, A., Collin, T., Kirik, D., Kokaia, Z., Lindvall, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+replacement+from+endogenous+precursors+in+the+adult+brain+after+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Neuronal replacement from endogenous precursors in the adult brain after stroke.</a> Nat. Med. 8, 963-970 (2002).</li>
<li>Emsley, J. G., Hagg, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((alpha6beta1+integrin+directs+migration+of+neuronal+precursors+in+adult+mouse+forebrain%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">alpha6beta1 integrin directs migration of neuronal precursors in adult mouse forebrain.</a> Exp. Neurol. 183, 273-285 (2003).</li>
<li>Sundholm-Peters, N. L., Yang, H. K., Goings, G. E., Walker, A. S., Szele, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subventricular+zone+neuroblasts+emigrate+toward+cortical+lesions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neuropathol.+Exp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Subventricular zone neuroblasts emigrate toward cortical lesions.</a> J. Neuropathol. Exp. Neurol. 64, 1089-1100 (2005).</li>
<li>Doetsch, F., Alvarez-Buylla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Network+of+tangential+pathways+for+neuronal+migration+in+adult+mammalian+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Network of tangential pathways for neuronal migration in adult mammalian brain.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 14895-14900 (1996).</li>
<li>Ming, G. L., Song, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+neurogenesis+in+the+mammalian+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Adult neurogenesis in the mammalian central nervous system.</a> Annu. Rev. Neurosci. 28, 223-250 (2005).</li>
<li>Pathania, M., Yan, L. D., Bordey, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+symphony+of+signals+conducts+early+and+late+stages+of+adult+neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropharmacology%22%5BJournal%5D)">A symphony of signals conducts early and late stages of adult neurogenesis.</a> Neuropharmacology. 58, 865-876 (2010).</li>
<li>Belvindrah, R., Nissant, A., Lledo, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abnormal+neuronal+migration+changes+the+fate+of+developing+neurons+in+the+postnatal+olfactory+bulb%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Abnormal neuronal migration changes the fate of developing neurons in the postnatal olfactory bulb.</a> J. Neurosci. 31, 7551-7562 (2011).</li>
<li>Gotts, J. E., Chesselet, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+subventricular+zone+expansion+after+focal+cortical+ischemic+injury%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of subventricular zone expansion after focal cortical ischemic injury.</a> J. Comp. Neurol. 488, 201-214 (2005).</li>
<li>Goings, G. E., Sahni, V., Szele, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Migration+patterns+of+subventricular+zone+cells+in+adult+mice+change+after+cerebral+cortex+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Migration patterns of subventricular zone cells in adult mice change after cerebral cortex injury.</a> Brain Res. 996, 213-226 (2004).</li>
<li>Romanko, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+of+the+mammalian+subventricular+zone+in+cell+replacement+after+brain+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Prog.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Roles of the mammalian subventricular zone in cell replacement after brain injury.</a> Prog. Neurobiol. 74, 77-99 (2004).</li>
<li>Saito, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+electroporation+in+the+embryonic+mouse+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">In vivo electroporation in the embryonic mouse central nervous system.</a> Nat. Protoc. 1, 1552-1558 (2006).</li>
<li>Boutin, C., Diestel, S., Desoeuvre, A., Tiveron, M. C., Cremer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+in+vivo+electroporation+of+the+postnatal+rodent+forebrain%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Efficient in vivo electroporation of the postnatal rodent forebrain.</a> PloS One. 3, e1883(2008).</li>
<li>Barnabe-Heider, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+manipulation+of+adult+mouse+neurogenic+niches+by+in+vivo+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Genetic manipulation of adult mouse neurogenic niches by in vivo electroporation.</a> Nat. Methods. 5, 189-196 (2008).</li>
<li>Platel, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NMDA+receptors+activated+by+subventricular+zone+astrocytic+glutamate+are+critical+for+neuroblast+survival+prior+to+entering+a+synaptic+network%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">NMDA receptors activated by subventricular zone astrocytic glutamate are critical for neuroblast survival prior to entering a synaptic network.</a> Neuron. 65, 859-872 (2010).</li>
<li>Pathania, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miR-132+enhances+dendritic+morphogenesis%2C+spine+density%2C+synaptic+integration%2C+and+survival+of+newborn+olfactory+bulb+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">miR-132 enhances dendritic morphogenesis, spine density, synaptic integration, and survival of newborn olfactory bulb neurons.</a> PloS One. 7, e38174(2012).</li>
<li>dal Maschio, M., M,, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-performance+and+site-directed+in+utero+electroporation+by+a+triple-electrode+probe%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Commun%22%5BJournal%5D)">High-performance and site-directed in utero electroporation by a triple-electrode probe.</a> Nat. Commun. 3, 960(2012).</li>
<li>Oudin, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endocannabinoids+regulate+the+migration+of+subventricular+zone-derived+neuroblasts+in+the+postnatal+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Endocannabinoids regulate the migration of subventricular zone-derived neuroblasts in the postnatal brain.</a> J. Neurosci. 31, 4000-4011 (2011).</li>
<li>Lacar, B., Young, S. Z., Platel, J. C., Bordey, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+and+recording+subventricular+zone+progenitor+cells+in+live+tissue+of+postnatal+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Imaging and recording subventricular zone progenitor cells in live tissue of postnatal mice.</a> Front. Neurosci. 4, (2010).</li>
<li>Feliciano, D. M., Lafourcade, C. A., Bordey, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neonatal+subventricular+zone+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Neonatal subventricular zone electroporation.</a> J. Vis. Exp. (72), e50197(2013).</li>
<li>Nam, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+features+of+postnatal+subventricular+zone+cell+motility%3A+a+two-photon+time-lapse+study%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Dynamic features of postnatal subventricular zone cell motility: a two-photon time-lapse study.</a> J. Comp. Neurol. 505, 190-208 (2007).</li>
<li>James, R., Kim, Y., Hockberger, P. E., Szele, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subventricular+zone+cell+migration%3A+lessons+from+quantitative+two-photon+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Subventricular zone cell migration: lessons from quantitative two-photon microscopy.</a> Front. Neurosci. 5, 30(2011).</li>
<li>Fernandez, M. E., Croce, S., Boutin, C., Cremer, H., Raineteau, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+electroporation+of+defined+lateral+ventricular+walls%3A+a+novel+and+rapid+method+to+study+fate+specification+during+postnatal+forebrain+neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Dev%22%5BJournal%5D)">Targeted electroporation of defined lateral ventricular walls: a novel and rapid method to study fate specification during postnatal forebrain neurogenesis.</a> Neural Dev. 6, 13(2011).</li>
<li>Saha, B., Ypsilanti, A. R., Boutin, C., Cremer, H., Chedotal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plexin-b2+regulates+the+proliferation+and+migration+of+neuroblasts+in+the+postnatal+and+adult+subventricular+zone%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Plexin-b2 regulates the proliferation and migration of neuroblasts in the postnatal and adult subventricular zone.</a> J. Neurosci. 32, 16892-16905 (2012).</li>
<li>Sanai, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Corridors+of+migrating+neurons+in+the+human+brain+and+their+decline+during+infancy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Corridors of migrating neurons in the human brain and their decline during infancy.</a> Nature. 478, 382-386 (2011).</li>
<li>Tattersfield, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurogenesis+in+the+striatum+of+the+quinolinic+acid+lesion+model+of+Huntington%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Neurogenesis in the striatum of the quinolinic acid lesion model of Huntington's disease.</a> Neuroscience. 127, 319-332 (2004).</li>
<li>Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+selection+for+high-expression+transfectants+with+a+novel+eukaryotic+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector.</a> Gene. 108, 193-199 (1991).</li>
<li>Lledo, P. M., Alonso, M., Grubb, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+neurogenesis+and+functional+plasticity+in+neuronal+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Adult neurogenesis and functional plasticity in neuronal circuits.</a> Nat. Rev. Neurosci. 7, 179-193 (2006).</li>
<li>Khlghatyan, J., Saghatelyan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time-lapse+imaging+of+neuroblast+migration+in+acute+slices+of+the+adult+mouse+forebrain%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Time-lapse imaging of neuroblast migration in acute slices of the adult mouse forebrain.</a> J. Vis. Exp. (67), e4061(2012).</li>
<li>Snapyan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vasculature+guides+migrating+neuronal+precursors+in+the+adult+mammalian+forebrain+via+brain-derived+neurotrophic+factor+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Vasculature guides migrating neuronal precursors in the adult mammalian forebrain via brain-derived neurotrophic factor signaling.</a> J. Neurosci. 29, 4172-4188 (2009).</li>
<li>Platel, J. C., Heintz, T., Young, S., Gordon, V., Bordey, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tonic+activation+of+GLUK5+kainate+receptors+decreases+neuroblast+migration+in+whole-mounts+of+the+subventricular+zone%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Tonic activation of GLUK5 kainate receptors decreases neuroblast migration in whole-mounts of the subventricular zone.</a> J. Physiol. 586, 3783-3793 (2008).</li>
<li>Schaar, B. T., McConnell, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoskeletal+coordination+during+neuronal+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Cytoskeletal coordination during neuronal migration.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 13652-13657 (2005).</li>
<li>Valiente, M., Marin, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+migration+mechanisms+in+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.Opin.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Neuronal migration mechanisms in development and disease.</a> Curr.Opin. Neurobiol. 20, 68-78 (2010).</li>
<li>Comte, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Galectin-3+maintains+cell+motility+from+the+subventricular+zone+to+the+olfactory+bulb%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Galectin-3 maintains cell motility from the subventricular zone to the olfactory bulb.</a> J. Cell Sci. 124, 2438-2447 (2011).</li>
<li>Sonego, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fascin+regulates+the+migration+of+subventricular+zone-derived+neuroblasts+in+the+postnatal+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Fascin regulates the migration of subventricular zone-derived neuroblasts in the postnatal brain.</a> J. Neurosci. 33, 12171-12185 (2013).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Efficiënte migratie van neurale voorlopercellen langs de RMS verzekert de latere rijping in functionele neuronen 10. Prominente stromen van neurale voorlopercellen gericht de OB zijn zichtbaar in menselijke kinderschoenen en waarschijnlijk een belangrijke rol spelen in de vroege postnatale ontwikkeling hersenen 27. Bovendien zijn deze cellen kunnen gebieden van de hersenen getroffen door verwonding en neurodegeneratie 4,28 richten. In staat zijn om in real time het effect van genetische ...

In de hersenen van zoogdieren, de generatie van nieuwe neuronen (neurogenese) plaatsvindt na de geboorte voornamelijk in twee gebieden, de subventriculaire zone (SVZ) van de laterale ventrikels en de subgranulaire zone in de dentate gyrus van de hippocampus 1. Verzameld in de afgelopen jaren aanzienlijk bewijs ondersteunt een cruciale rol voor postnatale neurogenese in de hippocampus en het reukorgaan geheugenfuncties 1-3. Belangrijk postnatale neurogenese heeft ook therapeutisch potentieel vanwege de relatie met degeneratieve neurologische aandoeningen, en het vermogen van neuroblasts te migreren naar gewonde gebieden in de hersenen 4-6. Subventriculaire zone (SVZ) is onlangs naar voren gekomen als een cruciale neurogene niche. SVZ-afgeleide neuroblasts migreren naar de bulbus olfactorius (OB) via de rostrale migratie stroom (RMS), waardoor dit de langste migratieproces in de postnatale hersenen 1,7,8. De zoogdieren SVZ / RMS / OB systeem is uitgegroeid tot eenbruikbaar model voor verschillende stappen in neurogenese, bijvoorbeeld proliferatie, migratie en differentiatie 1,8 bestuderen. Veel groeifactoren en extracellulaire signalen reguleren SVZ neurogenese en migratie langs de RMS, maar de intracellulaire moleculaire mechanismen lang niet volledig begrepen 1,9. Juiste migratie langs de RMS is cruciaal voor de verdere rijping van pasgeboren neuronen 10. Daarnaast hebben sommige studies aangetoond dat SVZ-afgeleide neuroblasts kunnen migreren uit de RMS om hersenletsel locaties 4-6,11-13. Zo onderzoekt de signalerende mechanismen betrokken neuroblast migratie is niet alleen essentieel om neurogenese te begrijpen, maar ook voor potentiële therapeutische toepassingen. Hier beschrijven we een gedetailleerd protocol voor SVZ neurale voorlopercellen labelen door in vivo postnatale elektroporatie en het toezicht op hun migratie langs de RMS in acute hersenen slice culturen met behulp van time-lapse draaiende schijf confocale microscopy. Elektroporatie wordt veel gebruikt in de ontwikkelings-studies uit embryonale naar volwassen stadia 14-18. Het is een krachtig hulpmiddel te richten en te manipuleren SVZ neurale voorlopercellen en vertegenwoordigt een aanzienlijk goedkoper en sneller alternatief stereotactische injectie van virale vectoren of genereren van transgene modellen 1,15,19,20. Het is een relatief eenvoudige procedure die geen chirurgie nodig en heeft een hoge overleving. Elektroporatie van shRNA of CRE-recombinase tot expressie plasmiden muizen genetische modellen gebruik van de LoxP systeem worden gebruikt om genen van belang richten of permanente etikettering van SVZ voorlopers bereiken, zodat aan een nuttig instrument voor volwassen neurogenese studies 21,22. Imaging RMS neuroblast migratie in de intacte hersenen is nog steeds een uitdaging te wijten aan de huidige technische beperkingen. Echter, dit proces kan worden gecontroleerd met behulp van confocale draaiende schijf time-lapse microscopie van acute hersenen plakjes, die een geschikte syst biedenem gelijkenis vertonen met de in vivo toestand ook vatbaar zijn voor farmacologische manipulatie 23,24. Koppeling in vivo postnatale elektroporatie met time-lapse imaging zal het begrip van de moleculaire mechanismen die neuroblast beweeglijkheid vergemakkelijken en bijdragen tot de ontwikkeling van nieuwe benaderingen om de hersenen te repareren te promoten.

<table><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Millicell</td><td>Millipore</td><td>PICM0RG50</td><td></td></tr><tr><td>35 mm Glass bottom culture dish</td><td>MatTek</td><td>P35G-0-14-C</td><td></td></tr><tr><td>Gey's Balanced media</td><td>Sigma</td><td>G9779-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Glucose, 45%</td><td>Sigma</td><td>G8769-100ML</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375-25G</td><td></td></tr><tr><td>Pen/Strep</td><td>GIBCO</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>FCS</td><td>GIBCO</td><td>10109-163</td><td></td></tr><tr><td>B27 supplement</td><td><a>Invitrogen Life Technologies</a></td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td><a>Invitrogen Life Technologies</a></td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>DMEM (phenol red-free)</td><td>GIBCO</td><td>31053-028</td><td></td></tr><tr><td>Fast Green</td><td>Sigma</td><td>F7252-5G</td><td></td></tr><tr><td>Glass capillaries for injection</td><td>Harvard Apparatus</td><td>30-0057</td><td></td></tr><tr><td>Aspirator tube</td><td>Sigma</td><td>A5177</td><td></td></tr><tr><td>Sutter P-97 capillary puller</td><td>Sutter Instrument</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>ECM830 Square Wave Electroporator</td><td>Harvard Apparatus</td><td>45-0052</td><td></td></tr><tr><td>Platinum Tweezertrodes 7 mm</td><td>Harvard Apparatus</td><td>45-0488</td><td></td></tr><tr><td>Footswitch Model 1250F</td><td>Harvard Apparatus</td><td>45-0211</td><td></td></tr><tr><td>Gel for electrodes</td><td>Cefar Compex</td><td>6602048</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Merial</td><td>AP/DRUGS/220/96</td><td></td></tr><tr><td>Vibratome</td><td>Leica</td><td>VT1000S</td><td></td></tr><tr><td>Glue</td><td>Roti coll</td><td>Roti coll 1</td><td></td></tr><tr><td>UltraViEW VoX spinning disk system</td><td>Perkin Elmer</td><td></td><td>Aangepaste setup (meerdere laserbronnen kunnen worden gebruikt) uitgerust met Hamamatsu ORCA R2 C10600-10B CCD-camera</td></tr><tr><td>Volocity software</td><td>Perkin Elmer</td><td></td><td>Acquisition, Quantitation, Visualization Modules</td></tr><tr><td>Environmental chamber for microscopy</td><td>Solent Scientific</td><td></td><td>Op maat gemaakt</td></tr><tr><td>Ti-E inverted microscope</td><td>Nikon</td><td></td><td>CFI Super Plan Fluor ELWD 20X/0.45 NA objectief wordt aanbevolen voor de toepassing die in dit artikel wordt beschreven</td></tr></tbody></table>

in vivo postnatale elektroporatie en time-lapse imaging van neuroblast migratie in muis acute brain slices

In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain Slices

Subventriculaire zone (SVZ) is een van de belangrijkste neurogene niches in de postnatale hersenen. Hier, neurale voorlopercellen vermenigvuldigen en aanleiding geven tot neuroblasts staat langs de rostrale migratie stroom (RMS) te verplaatsen naar de bulbus olfactorius (OB). Deze lange-afstand migratie vereist voor de daaropvolgende rijping van pasgeboren neuronen in de OB, maar de moleculaire mechanismen reguleren deze taak zijn nog onduidelijk. Het onderzoeken van de signaalwegen leidend neuroblast beweeglijkheid kan niet alleen helpen begrijpen een fundamentele stap in neurogenese, maar ook therapeutisch regeneratief potentieel, gezien het vermogen van deze neuroblasts hersenen plaatsen aangetast door verwonding, beroerte, of degeneratie richten. In dit manuscript beschrijven we een gedetailleerd protocol voor in vivo postnatale elektroporatie en de daaropvolgende time-lapse imaging van neuroblast migratie in de muis RMS. Postnatale elektroporatie kan efficiënt transfecteren SVZ voorlopercellencellen, die op hun beurt neuroblasts migreren langs de RMS. Met behulp van confocale draaiende schijf time-lapse microscopie op acute hersenen slice culturen, kan neuroblast migratie worden bewaakt in een omgeving die gelijkenis vertonen met de in vivo toestand. Bovendien kan neuroblast beweeglijkheid worden gevolgd en kwantitatief geanalyseerd. Als voorbeeld beschrijven we hoe in vivo postnatale elektroporatie van een GFP-expressie plasmide gebruiken labelen en visualiseren neuroblasts migreren langs de RMS. Elektroporatie van shRNA of CRE-recombinase tot expressie plasmiden conditionele knockout muizen onder toepassing van de LoxP systeem kan ook worden gebruikt om genen van belang richten. Farmacologische manipulatie van acute hersenen slice culturen kunnen worden uitgevoerd om de rol van verschillende signaalmoleculen in neuroblast migratie te onderzoeken. Door de koppeling van in vivo elektroporatie met time-lapse imaging, hopen we de moleculaire mechanismen die neuroblast beweeglijkheid te begrijpen en bij te dragen tot de ontwikkeling vanling van nieuwe benaderingen herstelmechanismen in de hersenen te bevorderen.

Labeling van SVZ-afgeleide trekkende neuroblasts kan worden waargenomen langs de RMS, meestal 4-8 dagen na een succesvolle elektroporatie (Figuur 1B). Langere tijd punten kunnen ook worden gekozen, maar minder cellen worden gevonden in de RMS, aangezien de meeste van hen zullen de OB hebt ingevoerd. Neuroblasts beginnen te verwerven typische morfologie en eigenschappen van rijpe granule cellen in de OB ongeveer 2-3 weken na elektroporatie (niet getoond). Na kweken gedurende ~ 1 uur, kan hersenplakjes va...

Neuroblast migratie is een fundamentele gebeurtenis in postnatale neurogenese. We beschrijven een protocol voor efficiëntie-etikettering van neuroblasts door in vivo postnatale elektroporatie en de daaropvolgende visualisatie van hun migratie met behulp van time-lapse imaging van acute hersenen plakjes. Wij beschikken over een beschrijving van de kwantitatieve analyse van neuroblast dynamiek door video-tracking.

In vivo Postnatale Elektroporatie en time-lapse imaging van neuroblast Migratie in Muis Acute Brain Slices

The subventricular zone (SVZ) is one of the main neurogenic niches in the postnatal brain. Here, neural progenitors proliferate and give rise to ...

Het algemene doel van deze procedure is om de migratie van Neuroblast langs de rostrale migratiestroom in de postnatale muizenhersenen te visualiseren en te analyseren. Dit wordt bereikt door eerst Electroporation, een DNA-plasmide ENC dat groen fluorescerend eiwit bevat, in de laterale ventrikel van de muispopjes te injecteren. De tweede stap is het voorbereiden van hersensneden van de geëlektropoerde muizen.Vervolgens worden de sneden met het beste GFP-signaal geselecteerd voor cultivering. De laatste stap is time-lapse beeldvorming van de hersensneden die de GFP-gelabelde migrerende neuroblast bevatten, met behulp van een spinning disc confocale microscoop. Uiteindelijk worden de time-lapse films gebruikt voor celtracking en kwantitatieve analyse van neuroblastmigratie.Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van neurogenese, zoals hoe de beweging van stamcel-afgeleide neuroblast in de postnatale hersenen wordt geleid en gereguleerd. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden zoals virale vectorlevering is dat het eenvoudiger, goedkoper en tijdsbesparend is. Bovendien maakt het schaarse markering van neuroblast mogelijk, waardoor een gedetailleerde analyse van hun migratiedynamiek mogelijk wordt.Begin deze procedure door de spanning van de geëlektropoerde popjes in te stellen op vijf vierkante pulsen, 50 milliseconden per puls bij 100 volt met 850 milliseconde intervallen. Laad vervolgens een capillaire naald met één tot twee microliter DNA met behulp van een aspiratorbuis die op de capillaire is aangesloten. Vervolgens verwijdert u een postnatale dag twee muispop uit de kooi en anesthetiseert u deze door isoflurine in te ademen.Houd vervolgens de kop van de pop tussen uw duim en wijsvinger van uw minder dominante hand. Trek de huid lichtjes terug op de kop om de identificatie van het juiste injectiepunt te helpen. Overweeg een virtuele lijn tussen het oog en het craniometrische kenmerk Lambda.Breng vervolgens de capillaire naald in op ongeveer een derde van de lengte van deze lijn vanaf Lambda tot ongeveer twee millimeter diep en injecteer vervolgens plasmide door langzaam door de mond te blazen. Zorg er tijdens deze procedure voor dat uw vingers geen te veel druk op de hersenen uitoefenen. Stop met injecteren wanneer er nog een minimale hoeveelheid DNA-oplossing in de capillaire achterblijft.Vervolgens bedekt u beide elektroden met gel en plaatst u ze met de positieve kant aan de laterale kant van de hersenhelft waar de DNA is geïnjecteerd. Voor DNA-incorporatie in de rostrale SVZ plaatst u de elektroden iets rostraal van het injectiepunt. Start vervolgens de stroomoverdracht door op het voetschakelaarpedaal te drukken.Wis vervolgens het gel van het hoofd van de pop, reanimeer de pop met zuurstof op een verwarmingskussen gedurende enkele minuten. Plaats het vervolgens terug in de kooi en plaats het weg van de moeder. Zorg ervoor dat de moeder de pop ophaalt en hem herenigt met de rest van het nest.Plaats in deze procedure milli cell inserts in een 35 millimeter glazen bodem kweekbak met één milliliter kweekmedium. Plaats vervolgens de kweekbak in een bevochtigde incubator bij 37 graden Celsius, 5% koolstofdioxide. Nadat de muispop is gedecapiteerd, verwijdert u de hoofdhuid met een scalpel.Snij vervolgens de schedel langs de midden sagittale naad van de hersenen tot de reukbol. Maak enkele extra transversale sneden op de schedel en verwijder voorzichtig de craniale flappen met behulp van een pincet. Zorg ervoor dat de hele hersenen worden blootgelegd en snij ze voorzichtig uit met behulp van een spatel, waarbij u ervoor zorgt het weefsel niet te beschadigen.Nadat u het hersenweefsel in hemis heeft gesneden met een scheermes, gooit u de niet-geïnjecteerde hemis weg. Plaats vervolgens een klein stukje tape op de vibram-houder. Gebruik de minimale hoeveelheid lijm die nodig is om de hersenhelft eraan te bevestigen.Begin met het snijden van de hersenhelft in 300 micron dikke plakjes. Verzamel vervolgens de plakjes met behulp van een kleine schilderskwast of een zachte inoculatielus. Controleer vervolgens beide kanten van de plakjes onder een standaard fluorescentiemicroscoop op GFP-signaal en kies de plakjes die langs het grootste deel van de rostrale migratiestroom een heldere fluorescentie vertonen.Snij in een zelfcultuurhood het meest coddle derde deel van de hersensnede weg en verwijder eventuele lijmsporen. Aspeer vervolgens de snede met een plastic past pipette en plaats deze op het midden van een voorverwarmd milli cell insert. Verwijder overtollig dissectiesoplossing op de top van de insert met een gilson pipette.Laat vervolgens de snedecultuur ten minste een uur rusten in een incubator van 37 graden Celsius, 5% koolstofdioxide. Voor beeldvorming binnen twee uur na de bereiding van de hersensnede. Plaats de glazen bodembak met de hersensnede in de beeldvormingskamer op het microscoopplatform.Gebruik vervolgens een 20 x 0,45 objectief onder de juiste fluorescentielicht om het gebied van de snede te selecteren en te focussen dat zal worden afgebeeld. Om de time-lapse beeldvorming op de microscoop in te stellen, klikt u op de L 100-knop om laserscan van het monster mogelijk te maken. Volgende in snelheid, open de ultra view laserveranderaar door de juiste laser te selecteren.Stel de belichtingstijd, versterking en de laserintensiteit in. Selecteer vervolgens het Zack-interval om binnenin de hersenen te beeldvormen. Selecteer vervolgens de afstand tussen elke ZS-stack afbeelding.Kies het tijdsinterval tussen elke ZS-stack opname en de totale beeldvormingsduur. Klik vervolgens op de opslaan icoon om de wijzigingen in de beeldvormingsparameters op te slaan. Aan het einde drukt u op de opnameknop om te beginnen met beeldvorming in de Velocity kwantitatieve module.Open de gewenste bibliotheek die is gemaakt. Nadat u een time-lapse-experiment hebt voltooid, selecteert u extended focus uit het vak bovenaan links. Klik op het tabblad metingen om het meetvenster weer te geven.</

in-vivo-postnatal-electroporation-time-lapse-imaging-neuroblast

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

We beschrijven een protocol voor real-time videoimaging van neuronale migratie in de muis voorhersenen. De migratie van viraal gemerkte of geënte neuronale precursors opgenomen in acute levende plakjes met breedveld fluorescerende beeldvorming met een relatief snelle verwerving interval de verschillende fasen van celmigratie, zoals de duur van de stationaire en migratiefasen en de snelheid van bestuderen migratie.

Time-lapse imaging van neuroblast migratie in Acute Schijfjes van de volwassen muis voorhersenen

Source: Wiegreffe, C., et. al.,  Time-lapse Confocal Imaging of Migrating Neurons in Organotypic Slice Culture of Embryonic Mouse Brain Using In Utero Electroporation. J. Vis. Exp. (2017) This video demonstrates time-lapse confocal microscopy to observe cortical neuron radial migration from the subventricular zone to the cortical plate via radial glial scaffolds in transduced mouse embryonic brain slices.

Time-Lapse Imaging of Cortical Neuron Radial Migration in Transduced Mouse Embryonic Brain Slices

Neuroblast migratie is een cruciale stap in postnatale neurogenese. Het protocol hier beschreven kan worden gebruikt om de rol van de kandidaat regulatoren van neuroblast migratie door gebruik DNA / small hairpin RNA (shRNA) nucleofection en een 3D migratietestsysteem met neuroblasts geïsoleerd van het knaagdier postnatale rostrale migratiestroom onderzoeken.

Nucleofectie van knaagdieren neuroblasts om neuroblast Migratie Studie<em&gt; In vitro</em

Dit protocol geeft instructies voor directe observatie van radiaal migrerende corticale neuronen. Bij utero- elektroporatie, organotypische snijcultuur en tijdverlopen confocal beeldvorming worden gecombineerd om de effecten van overexpressie of downregulatie van genen die geïnteresseerd zijn in migrerende neuronen direct en dynamisch te bestuderen en hun differentiatie tijdens de ontwikkeling te analyseren.

Time-lapse Confocal Imaging van Migreren Neuronen in Organotypische Slice Cultuur van Embryonale Muishersenen Met behulp van<em&gt; In Utero</em&gt; Elektroporatie

Hier bieden we een goedkope en betrouwbare methode voor het genereren van electroporated brein organotypic segment culturen van muis embryo's geschikt voor confocale microscopie en live-imaging technieken.

Ex Utero Electroporation en Organotypic Slice culturen van muis embryonale hersenen voor Live-Imaging van GABAergic interneuronen migreren

Dit protocol demonstreert een eenvoudige en robuuste methode om in situ axongroei en groeikegeldynamiek te bestuderen. Het beschrijft hoe ex vivo fysiologisch relevante acute hersenplakken kunnen worden bereid en biedt een gebruiksvriendelijke analysepijplijn.

In situ Visualisatie van Axon-groei en groeikegeldynamiek in acute ex vivo embryonale hersenplakculturen

Tijdens de ontwikkeling van de hersenschors ontstaan neuronen en gliacellen in de ventriculaire zone die het ventrikel bekleedt en migreren ze naar het hersenoppervlak. Bij dit proces zijn veel genen betrokken. Dit protocol introduceert de techniek voor de time-lapse beeldvorming van migrerende neuronen en glia-voorlopercellen.

Time-lapse beeldvorming van migrerende neuronen en glia-voorlopercellen in embryonale hersenplakjes van muizen

Dit protocol beschrijft een organotypische slice assay geoptimaliseerd voor de postnatale hersenen en hoge-resolutie time-lapse beeldvorming van neuroblast migratie in de rostrale migratie stroom.

Een organotypische Slice Assay voor High-Resolution Time-Lapse Imaging van neuronale migratie in de postnatale Brain

De huidige video toont een methode die gebruik maakt van de combinatie van elektroporatie en confocale microscopie te leven imaging op individuele neurale stamcellen uit te voeren in de zich ontwikkelende zebravis voorhersenen.

Time-lapse Live-Imaging van klonaal verwante neurale progenitorcellen in de ontwikkelingslanden zebravis voorhersenen

Transfectie van Mouse retinale ganglioncellen door In vivo Elektroporatie

Leer neuroblastmigratie visualiseren in het postnatale muizenbrein met in vivo-elektroporatie en time-lapse imaging. Deze methode maakt gedetailleerde analyse van celbeweging mogelijk.

In vivo Postnatale Elektroporatie en time-lapse imaging van neuroblast Migratie in Muis Acute Brain Slices

Meer video's verkennen