Name: Laser-scanning fotostimulatie van optogenetisch gerichte voorhersenencircuits (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-27T13:45:00.000+00:00
Duration: 7 min 43 s
Description: Leer laser-scanning fotostimulatie van optogenetisch gerichte voorhersenencircuits voor functionele topografie. Deze methode maakt precieze activering van specifieke neuronale populaties en analyse van synaptische eigenschappen mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door NIH/NIDCD-subsidie R03 DC 011361, SVM CORP-subsidie LAV3202, NSF-LA EPSCoR-subsidie PFUND86, en een publicatiesubsidie van Leica Microsystems (CCL) en NIH/NIDCD-subsidie R01 DC 008794 (SMS).

1. Surgery en injecties
<ol>
	<li>Anesthesier muizen met een intraperitoneaal injectie (22-25 G naald aanbevolen) van ketamine (100-120 mg/kg) en xylazine (7,5-16 mg/kg).
	<ol>
		<li>Beoordeel sedatie met krachtige vingersnufjes totdat geen reacties worden opgewekt. Voor alle beschreven dierprocedures, wijzig indien nodig om lokale IACUC-richtlijnen te volgen.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Plaats gesedeerd muizen in een stereotactisch apparaat door het hoofd en de oren in hun respectievelijke houders te bevestigen.
	<ol>
		<li>Smeer de ogen voor het plaatsen van het dier in het stereotactisch apparaat met een steriele oftalmische zalf.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Scheer de hoofdhuid met een scheermes en steriliseer het gebied met Betadine-watten.</li>
	<li>Snij met een scalpel een midline-incisie en vouw de huid en onderliggende spieren boven het te injecteren gebied omhoog.</li>
	<li>Gebruik een scalpelblad als trefiene om een craniotomie uit te voeren boven het te blootleggen gebied. Gebruik alternatief een kleine boorbijtel die is bevestigd aan een Dremel om de craniotomie uit te voeren.
	<ol>
		<li>Om de craniotomie uit te voeren, plaats het scalpelblad of de boorbijtel op het oppervlak van de schedel en draai langzaam totdat er voldoende bot is uitgegraven om de pia mater eronder te onthullen.</li>
		<li>Zodra de eerste uitgraving is gemaakt, vergroot de craniotomie met behulp van fijne pincetten om voorzichtig bot van de randen te verwijderen.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Vul een 1 µl spuit met de te injecteren virale oplossing (UNC Vector Core).
	<ol>
		<li>Om de transfectie-efficiëntie te verbeteren, bereid de virale oplossing voor met 4 µg/ml polybreen.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Laat de naald zakken in het te injecteren gebied en drukinfuseer 200 nl oplossing met virus met een spuitpomp.
	<ol>
		<li>Laat de spuit 10 min staan voordat u de naald terugtrekt.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Naai de huid met niet-opneembaar monofilament Nylon en bedek de incisie met antibioticumzalf.
	<ol>
		<li>Hechtingen moeten na 7-10 dagen worden verwijderd.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Injecteer buprenorfine (0,05-0,1 mg/kg) voor postoperatieve pijnbestrijding.</li>
	<li>Laat dieren postoperatief herstellen gedurende 14-21 dagen om adequate expressie van kanaal rhodopsine mogelijk te maken.</li>
</ol>
2. Snijvoorbereiding
<ol>
	<li>Na de herstelperiode, anesthesier het dier diep met isoflurane anesthesie, zoals geverifieerd door afwezigheid van onttrekkingsreflex wanneer de achterpoot en/of tenen stevig worden geknepen.</li>
	<li>Dissecteer de hersenen door onthoofding gevolgd door midline en frontale sneden in de schedel.</li>
	<li>Trek de schedel vanaf de midline omhoog om de hersenen bloot te leggen.</li>
	<li>Verwijder voorzichtig de hersenen met behulp van een fijne lepelspatel om de hersenzenuwen te scheiden van de basis van de hersenen.</li>
	<li>Plaats het gedissecteerde brein snel in een kleine 100 ml beker met gekoelde, ijskoud kunstmatig hersenvocht (ACSF; in mM: 125 NaCl, 3 KCl, 1,25 NaH2PO4, 1 MgCl2, 2 CaCl2, 25 NaHCO3, 25 glucose).</li>
	<li>Verwijder het brein van ACSF en plaats het op een microscoopglaasje bedekt met filterpapier voorgeweekt met ACSF.</li>
	<li>Maak een blokkerende snede van het brein in de gewenste oriëntatie met behulp van een schone scheermes.</li>
	<li>Bevestig het geblokkeerde oppervlak van het brein op het snijoppervlak met behulp van instant kleeflijm.</li>
	<li>Breng het snijoppervlak over naar een vibratome snijkamer (bewaard in de vriezer totdat klaar voor snijden).</li>
	<li>Pour ijskoud ACSF in de snijkamer.</li>
	<li>Snijd hersensneden van 400-500 µm met behulp van een vibrerende weefselsnijder.</li>
	<li>Breng hersensneden over naar een houderkamer met geoxygeneerd ACSF en incubeer gedurende minimaal 1 uur bij 30 °C voor het experiment.</li>
</ol>
3. Fysiologische opname
<ol>
	<li>Na de incubatieperiode, breng een snede over naar een opnamekamer op een gemodificeerde microscooptafel.</li>
	<li>Beveilig de snede in het bad tijdens het experiment met behulp van enkele draden Nylon-filamenten die zijn bevestigd aan een platinadraad snedehouder.</li>
	<li>Perfuseer de snede constant met ACSF.</li>
	<li>Trek opnamepipetten naar een tipweerstand van 3-6 MΩ wanneer gevuld met intracellulaire oplossing met de volgende samenstelling (in mM): 127 K-gluconaat, 3 KCl, 1 MgCl2, 0,07 CaCl2, 10 HEPES, 2 Na2-ATP, 0,3 Na-GTP, 0,1 EGTA. De intracellulaire oplossing moet een pH van 7,3 hebben, aangepast met KOH of gluconzuur en de osmolalitéit van 280-290 mOsm.</li>
	<li>Gebruik een standaard gevisualiseerde geheelcel-opnameopstelling en plaats de opnamepijpen dicht bij het te opnemen neuron terwijl u positieve druk toepast22,23.</li>
	<li>Laat de positieve druk los terwijl u zuiging toepast om een Gigaohm-seal te vormen.</li>
	<li>Breng een korte zuiging toe om het membraan te breken en een geheelcel-configuratie-opname te vormen.</li>
	<li>Neem de reacties van neuronen op in voltage of stroomklem.</li>
</ol>
4. Laser-scanning Foto-stimulatie
<ol>
	<li>Start

<ol><li>Tye, K. M., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+investigation+of+neural+circuits+underlying+brain+disease+in+animal+models%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Optogenetic investigation of neural circuits underlying brain disease in animal models.</a> Nat. Rev. Neurosci. 13, 251-266 (2012).</li>
<li>Bernstein, J. G., Boyden, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+tools+for+analyzing+the+neural+circuits+of+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cog.+Sci%22%5BJournal%5D)">Optogenetic tools for analyzing the neural circuits of behavior.</a> Trends Cog. Sci. 15, 592-600 (2011).</li>
<li>Yizhar, O., Fenno, L. E., Davidson, T. J., Mogri, M., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetics+in+neural+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Optogenetics in neural systems.</a> Neuron. 71, 9-34 (2011).</li>
<li>Nagel, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Channelrhodopsin-2%2C+a+directly+light-gated+cation-selective+membrane+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 13940-13945 (2003).</li>
<li>Zemelman, B. V., Lee, G. A., Ng, M., Miesenbock, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+photostimulation+of+genetically+ChARGed+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Selective photostimulation of genetically ChARGed neurons.</a> Neuron. 33, 15-22 (2001).</li>
<li>Gradinaru, V., Thompson, K. R., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((eNpHR%3A+a+Natronomonas+halorhodopsin+enhanced+for+optogenetic+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">eNpHR: a Natronomonas halorhodopsin enhanced for optogenetic applications.</a> Brain Cell Biol. 36, 129-139 (2008).</li>
<li>Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. M. illisecond-timescale <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((genetically+targeted+optical+control+of+neural+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">genetically targeted optical control of neural activity.</a> Nat. Neurosci. 8, 1263-1268 (2005).</li>
<li>Lanyi, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Halorhodopsin%3A+A+light-driven+chloride+ion+pump%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Rev.+Biophys.+Biophys.+Chem%22%5BJournal%5D)">Halorhodopsin: A light-driven chloride ion pump.</a> Ann. Rev. Biophys. Biophys. Chem. 15, 11-28 (1986).</li>
<li>Han, X., Boyden, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple-color+optical+activation%2C+silencing%2C+and+desynchronization+of+neural+activity%2C+with+single-spike+temporal+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Multiple-color optical activation, silencing, and desynchronization of neural activity, with single-spike temporal resolution.</a> PLoS One. 2, (2007).</li>
<li>Zhao, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+type-specific+channelrhodpsin-2+transgenic+mice+for+optogenetic+dissection+of+neural+circuitry+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Cell type-specific channelrhodpsin-2 transgenic mice for optogenetic dissection of neural circuitry function.</a> Nat. Methods. 8, 745-755 (2011).</li>
<li>Madisen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+toolbox+of+Cre-dependent+optogenetic+transgenic+mice+for+light-induced+activation+and+silencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A toolbox of Cre-dependent optogenetic transgenic mice for light-induced activation and silencing.</a> Nat. Neurosci. 15, 793-802 (2012).</li>
<li>Fenno, L., Yizhar, O., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+and+application+of+optogenetics%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The development and application of optogenetics.</a> Annu. Rev. Neurosci. 34, 389-412 (2011).</li>
<li>Gradinaru, V., Mogri, M., Thompson, K. R., Henderson, J. M., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+deconstruction+of+parkinsonian+neural+circuit%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Optical deconstruction of parkinsonian neural circuit.</a> Science. 324, 354-359 (2009).</li>
<li>Olsen, S. R., Bortone, D. S., Adesnik, H., Scanziani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gain+control+by+layer+six+in+cortical+circuits+of+vision%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Gain control by layer six in cortical circuits of vision.</a> Nature. 483, 47-52 (2012).</li>
<li>Zhang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+interrogation+of+neural+circuits%3A+technology+for+probing+mammalian+brain+structures%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Optogenetic interrogation of neural circuits: technology for probing mammalian brain structures.</a> Nat. Protoc. 5, 439-456 (2010).</li>
<li>Petreanu, L., Huber, D., Sobczyk, A., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Channelrhodopsin-2-assisted+circuit+mapping+of+long-range+callosal+projections%5BTitle%5D)+AND+%22Na.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Channelrhodopsin-2-assisted circuit mapping of long-range callosal projections.</a> Na. Neurosci. 10, 663-668 (2007).</li>
<li>Cruikshank, S. J., Urabe, H., Nurmikko, A. V., Connors, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathway-specific+feedforward+circuits+between+thalamus+and+neocortex+revealed+by+selective+optical+stimulation+of+axons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Pathway-specific feedforward circuits between thalamus and neocortex revealed by selective optical stimulation of axons.</a> Neuron. 65, 230-245 (2010).</li>
<li>Lee, C. C., Lam, Y. W., Sherman, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracortical+convergence+of+layer+6+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroreport%22%5BJournal%5D)">Intracortical convergence of layer 6 neurons.</a> Neuroreport. 23, 736-740 (2012).</li>
<li>Mancuso, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+probing+of+functional+brain+circuitry%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Optogenetic probing of functional brain circuitry.</a> Exp. Physiol. 96, 26-33 (2011).</li>
<li>Valley, M., Wagner, S., Gallarda, B. W., Lledo, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+affordable+LED+arrays+for+photo-stimulation+of+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Using affordable LED arrays for photo-stimulation of neurons.</a> J. Vis. Exp. (57), (2011).</li>
<li>Gong, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+Cre+recombinase+to+specific+neuron+populations+with+bacterial+artificial+chromosome+constructs%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Targeting Cre recombinase to specific neuron populations with bacterial artificial chromosome constructs.</a> J. Neurosci. 27, 9817-9823 (2007).</li>
<li>Cox, C. L., Sherman, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+dendritic+outputs+of+inhibitory+interneurons+in+the+lateral+geniculate+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Control of dendritic outputs of inhibitory interneurons in the lateral geniculate nucleus.</a> Neuron. 27, 597-610 (2000).</li>
<li>Lam, Y. W., Sherman, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+by+laser+photostimulation+of+connections+between+the+thalamic+reticular+and+ventral+posterior+lateral+nuclei+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Mapping by laser photostimulation of connections between the thalamic reticular and ventral posterior lateral nuclei in the rat.</a> J. Neurophysiol. 94, 2472-2483 (2005).</li>
<li>Lam, Y. W., Sherman, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+organization+of+the+somatosensory+cortical+layer+6+feedback+to+the+thalamus%5BTitle%5D)+AND+%22Cereb+Cortex%22%5BJournal%5D)">Functional organization of the somatosensory cortical layer 6 feedback to the thalamus.</a> Cereb Cortex. 20, 13-24 (2010).</li>
<li>Shepherd, G. M., Pologruto, T. A., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circuit+analysis+of+experience-dependent+plasticity+in+the+developing+rat+barrel+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Circuit analysis of experience-dependent plasticity in the developing rat barrel cortex.</a> Neuron. 38, 277-289 (2003).</li>
<li>Suter, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ephus%3A+multipurpose+data+acquisition+software+for+neuroscience+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neural+Circuits%22%5BJournal%5D)">Ephus: multipurpose data acquisition software for neuroscience experiments.</a> Front Neural Circuits. 4, (2010).</li>
<li>Lee, C. C., Sherman, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topography+and+physiology+of+ascending+streams+in+the+auditory+tectothalamic+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Topography and physiology of ascending streams in the auditory tectothalamic pathway.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 372-377 (2010).</li>
<li>Lee, C. C., Sherman, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrinsic+modulators+of+auditory+thalamocortical+transmission%5BTitle%5D)+AND+%22Hear+Res%22%5BJournal%5D)">Intrinsic modulators of auditory thalamocortical transmission.</a> Hear Res. , 287-2843 (2012).</li>
<li>Shepherd, G. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aShepherd%2C+GM+%22Circuit+mapping+by+ultraviolet+uncaging+of+glutamate%22">Circuit mapping by ultraviolet uncaging of glutamate</a>. , Cold Spring. 998-1004 (2012).</li>
<li>ScanImage, Ephus, and other DAQ software [Internet]. , Janelia Farms. Ashburn (VA). Available from: 
	
 <a target="_blank" href="http://www.ephus.org">http://www.ephus.org</a> (2003).</li>
<li>UNC Gene Therapy Center [Internet]. , University of North Carolina. Chapel Hill (NC). Available from: 
	
 <a target="_blank" href="http://genetherapy.unc.edu/services.htm">http://genetherapy.unc.edu/services.htm</a> (2003).</li>
<li>Optogenetics Resource Center [Internet]. , Stanford University. Stanford (CA). Available from: 
	
 <a target="_blank" href="http://www.stanford.edu/group/dlab/optogenetics">http://www.stanford.edu/group/dlab/optogenetics</a> (2003).</li>
<li>Synthetic Neurobiology Group [Internet]. , MIT. Cambridge (MA). Available from: 
	
 <a target="_blank" href="http://syntheticneurobiology.org">http://syntheticneurobiology.org</a> (2003).</li>
<li>Mutant Mouse Regional Resource Centers [Internet]. , NIH. Bethesda (MD). Available from: 
	 <a target="_blank" href="http://www.mmrrc.org">http://www.mmrrc.org</a> (2003).</li>
<li>GENSAT Brain Atlas [Internet]. , NIH. Bethesda (MD). Available from: 
	 <a target="_blank" href="http://www.gensat.org/cre.jsp">http://www.gensat.org/cre.jsp</a> (2003).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat ze geen concurrentieel belang hebben.
De auteur (CCL) ontving een publicatiesubsidie van Leica Microsystems, dat een instrument produceert dat bij het filmen van dit protocol werd gebruikt.

Het beschreven protocol beschrijft een aanpak voor de in vitro beoordeling van functionele topografie en fysiologie van neuronale circuits, die niet beperkt is tot het onderzoek van voorhersencircuits, d.w.z. die van de thalamus en cortex. Er zijn verschillende virale constructen voor optogenetische transfectie beschikbaar gesteld aan de wetenschappelijke gemeenschap en zijn gemakkelijk verkrijgbaar bij de UNC Vector Core. Voor een beschrijving van de beschikbare virale constructen, zie de UNC Vector Core31, de optogenetische bronnenpagina op het Deisseroth Lab aan de Stanford University32 en het Boyden synthetische neurobiologie-lab aan de MIT33. Varianten van deze opsins zijn ontwikkeld door deze labs en maken een breed scala aan modi mogelijk voor het controleren van neuronale exciteerbaarheid1,2. Het verkrijgen van deze vectoren van de UNC Vector Core vereist een materiaaloverdrachtovereenkomst van de oorspronkelijke labs. In dit protocol merken we op dat het toevoegen van polybrene de transfectie-efficiëntie verbetert. Bovendien is een andere variabele die de expressie beïnvloedt de post-chirurgische herstelperiode, waarbij we opmerken dat een periode van minimaal 14 dagen voldoende is om een robuuste expressie in de voorhersenbanen van muizen te verkrijgen.
Voor de gerichte transfectie van specifieke neuronale groepen zijn verschillende Cre-transgene muislijnen ontwikkeld, die kunnen worden gebruikt in combinatie met 'floxed' omgekeerde open leesraam virale constructen die zijn ontwikkeld11. Verschillende stamsoorten die relevant zijn voor neurowetenschappelijk onderzoek zijn verkrijgbaar via de Mutant Mouse Regional Resource Centers34. Atlassen van Cre-recombinase-expressiepatronen in deze transgene lijnen worden aangeboden via de GENSAT-database35. Daarnaast biedt Jackson Labs verschillende Cre-transgene stammen, evenals andere die opsins constitutief tot expressie brengen in specifieke neuronale groepen. Een cruciale stap bij het gebruik van deze muislijnen is het meenemen van de tijd die nodig is voor het verkrijgen en vestigen van een fokkolonie, wat kan variëren op basis van de specifieke stam van belang.
Voor fotostimulatie hebben we het opgezette apparaat gebruikt en aangepast dat is ontwikkeld door het Shepherd Lab aan de Northwestern University, beschreven in een recent protocol29. Hoewel geoptimaliseerd voor het ontketenen van glutamaat, is dit apparaat ook geschikt voor fotostimulatie van channelrhodopsine zonder aanpassing. Dit apparaat maakt nauwkeurige ruimtelijke controle en positionering van de loci van fotostimulatie mogelijk, wat een beoordeling van de functionele topografie van channelrhodopsine innervatie van opgenomen neuronen mogelijk maakt. Hoewel ruimtelijke controle wordt verbeterd met deze methode van fotostimulatie, is het kostenintensiever dan methoden die gebruik maken van LED-gebaseerde veldverlichting20. Bovendien is de nonuniformiteit van hersenweefsel een beperking van optogenetiek, of enige technieken die manipulatie van licht omvatten. In de praktijk is het echter zelden een factor omdat resultaten meestal kwalitatief worden geïnterpreteerd. In het geval dat een meer kwantitatief vergelijk tussen hersengebieden nodig is, kan men altijd de maximale lichtintensiteit gebruiken om 'verzadigde' reacties te bereiken.
Bovendien hebben we zowel Tidelwave als Ephus softwareprogramma's geschreven in Matlab gebruikt voor het besturen van laser-scanning fotostimulatie en data-acquisitie25,26. Het wordt echter aanbevolen dat degenen die een soortgelijk systeem opzetten, de nieuwere Ephus-software26 gebruiken, die beschikbaar is via de Janelia Farms ontwikkelsite30. Een sleutelstap is het kiezen van welke van deze softwarepakketten te gebruiken, omdat hun hardwarevereisten enigszins verschillen. Bovendien zijn de kaartanalyseprogramma's afgestemd op hun respectieve data-acquisitieprogramma's.
Verschillende van deze stappen kunnen worden aangepast om aan de specifieke setup van de beoefenaar te voldoen. Injecties van virale oplossingen kunnen worden uitgevoerd met leveringsmechanismen naast een spuit, bijv. capillaire glazen pipetten getrokken naar tipdiameters van ~40 μm werken ook goed. Voor operaties kan een niet-stereotaxische hoofdhouder worden vervangen als dergelijke coördinaten niet vereist zijn voor het begeleiden van injecties. Bovendien kunnen de samenstellingen van ACSF en intracellulaire oplossing worden gewijzigd, afhankelijk van de specifieke experimentele vereisten, bijv. het vervangen van een cesium of hoge chloride intracellulaire oplossing om remmende stromen te isoleren. Ook kan een alternatief voor het beeldvormen van expressiepatronen in vaste plakken ook worden gedaan in de levende plak op een geschikte beeldvormingsstelling met een badperfusiesysteem.
Kortom, dit protocol stelt de beoefenaar in staat om de functionele topografie en synaptische fysiologie van projecties in vitro te karakteriseren, wat mogelijk niet mogelijk is met standaardmethoden, bijv. karakterisering van langeafstandsprojecties die niet in een plak kunnen worden bewaard. Het beschreven transfectieprotocol kan worden toegepast op in vivo optogenetische experimenten1-3,12,14, aangezien het afleveringsmechanisme hetzelfde is. Ten slotte, hoewel dit protocol transfectie van muizen beschrijft, kunnen veel van de beschikbare virale vectoren theoretisch worden gebruikt om deze opsins in een breed scala aan zoogdiersoorten te transfecteren en tot expressie te brengen, waardoor een groot aantal vergelijkende en soortspecifieke studies mogelijk zijn1-3.

De uitgebreide circuitstructuur van de voorhersenen van zoogdieren levert een experimentele uitdaging op voor het ontcijferen van de functionele rollen van de onderling verbonden componenten. Het ontwarren van deze relaties is onlangs vergemakkelijkt door de ontwikkeling van optogenetische methoden om specifiek neuronale populaties en hun projecties te stimuleren en te remmen1-3. Deze benaderingen maken gebruik van de genetisch gecontroleerde expressie van membraankanalen die reageren op licht4-6. Van bijzonder belang is channelrhodopsine, een lichtgevoelige ionenkanaal, dat neuronale membranen depolariseert na optische stimulatie, wat leidt tot excitatie van de expresserende neuron en zijn projecties4,7. Omgekeerd hyperpolariseert halorhodopine, een lichtgevoerde chloorpump, het membraan, waardoor de gerichte projectie wordt geremd6,8,9. Er zijn verschillende varianten van deze opsines ontworpen, er zijn meerdere vectoren geproduceerd voor transfectie en expressie in neuronale populaties van belang, en er zijn transgene muislijnen ontwikkeld die deze opsines constitutief expresseren of die cre-lox-gemedieerde controle van hun expressie mogelijk maken1,2,10,11.
De bruikbaarheid van deze optogenetische methoden en materialen heeft een revolutie teweeggebracht in de moderne experimentele neurowetenschap, waardoor de rol van specifieke neurale circuits in de fysiologie en het gedrag van het organisme kan worden ontrafeld12-15. In het bijzonder kunnen deze methoden krachtig worden toegepast op de functionele dissectie van hersencircuits met behulp van in vitro plakpreparaten16-20. In deze context is een van de belangrijkste voordelen van deze methode de mogelijkheid om de fysiologie van langeafstandsprojecties te karakteriseren die moeilijk, zo niet onmogelijk, te behouden zijn in een dikke plak, zoals de commissurale verbindingen tussen de hersenhemisferen16. Bovendien maakt deze technologie manipulaties mogelijk die met andere methoden niet mogelijk zijn, zoals de selectieve remming van projecties met fijne temporele precisie met behulp van halorhodopsine6,8,9. Bovendien maakt de celtypespecifieke expressie van deze opsines het mogelijk om geïsoleerde componenten in een neurale circuit selectief te stimuleren of te remmen1,2,11,15,21. Als zodanig maken deze nieuwe optogenetische tools de ongekende analyse van de neuronale bijdragen aan de fysiologie en het gedrag mogelijk.
Hier beschrijven we een protocol voor het tot expressie brengen van channelrhodopsine in de muizenhersenen met behulp van adeno-geassocieerde virale (AAV) vectoren1,2. Specifieke transfectie van gerichte neuronale populaties kan worden bereikt met behulp van dit protocol, met de juiste keuze van promotorconstructen of transgene muizen die Cre-recombinase tot expressie brengen in de gerichte neuronen van belang en een 'floxed' virale construct1,11,15,21 (Figuur 1). Als voorbeelden onderzoeken we hier de corticocorticale projecties tussen de primaire visuele cortex (V1) en de secundaire visuele cortex (V2) en we onderzoeken ook de laag 6 corticothalamische projectie van de primaire somatosensorische cortex (S1) naar de ventroposterior mediale kern (VPm). We combineren deze specifieke expressie met laser-scanning fotostimulatie in vitro  om de synaptische fysiologie en functionele topografie te beoordelen. De hier gepresenteerde setup maakt de nauwkeurige ruimtelijke positionering en controle van de loci van fotostimulatie mogelijk. Ten slotte beschrijven we de visualisatie van expressiepatronen met behulp van confocale microscopie.

```html
<table><tbody><tr><td>Polybrene</td><td>Santa Cruz Biotech</td><td>SC134220</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde 32% oplossing</td><td>EMS</td><td>15714</td><td></td></tr><tr><td>VECTASHIELD</td><td>Vector Labs</td><td>H-1400</td><td></td></tr><tr><td>AAV virale constructies</td><td>UNC Vector Core</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Muis stereotactische hoofdhouder</td><td>Stoelting</td><td>51730</td><td></td></tr><tr><td>Nanocool-injector</td><td>Harvard Apparatus</td><td>703040</td><td></td></tr><tr><td>UV-laser: 355 nm, Nd:YVO4; 1 W;</td><td>DPSS Lasers, Inc</td><td>3500</td><td></td></tr><tr><td>Galvanometer</td><td>Cambridge Scanning</td><td>6210</td><td></td></tr><tr><td>spiegels</td><td>Cambridge Scanning</td><td>6m2003S-A</td><td></td></tr><tr><td>montage</td><td>Cambridge Scanning</td><td>6102103L</td><td></td></tr><tr><td>kabel</td><td>Cambridge Scanning</td><td>6010-19-120</td><td></td></tr><tr><td>driver/controller</td><td>Cambridge Scanning</td><td>67121-1</td><td></td></tr><tr><td>Shutter - ZM gecoat (UV-compatibel)</td><td>Uniblitz</td><td>L23-ZM2</td><td></td></tr><tr><td>Shutter Controller</td><td>Uniblitz</td><td>VMM-D1</td><td></td></tr><tr><td>Stroomversterker</td><td>Stanford Research Systems</td><td>SR570</td><td></td></tr><tr><td>6713 board</td><td>National Instruments</td><td>777741-01</td><td></td></tr><tr><td>2110 break-out box</td><td>National Instruments</td><td>777643-01</td><td></td></tr><tr><td>PCI-MIO-16E-4</td><td>National Instruments</td><td>777383-01</td><td></td></tr><tr><td>BNC-2090</td><td>National Instruments</td><td>777270-01</td><td></td></tr><tr><td>Kabels</td><td>National Instruments</td><td>184749-01</td><td></td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>Mathworks</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TCS SP2</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>
```

laser-scanning fotostimulatie van optogenetisch gerichte voorhersenencircuits

Laser-scanning Photostimulation of Optogenetically Targeted Forebrain Circuits

De sensorische voorhersenen zijn samengesteld uit ingewikkeld verbonden celtypen, waarvan de functionele eigenschappen nog niet volledig zijn opgehelderd. Het begrijpen van de interacties van deze voorhersenencirkels is recent bevorderd door de ontwikkeling van optogenetische methoden voor licht-gemedieerde modulatie van neuronale activiteit. Hier beschrijven we een protocol voor het onderzoeken van de functionele organisatie van voorhersenencirkels in vitro door middel van laser-scanning foto-stimulatie van channelrhodopsine, optogenetisch tot expressie gebracht via viraan-gemedieerde transfectie. Deze aanpak benut ook het nut van cre-lox recombinatie in transgene muizen om expressie in specifieke neuronale celtypen te targeten. Na transfectie worden neuronen fysiologisch opgenomen in plakpreparaten met behulp van gehele-cel patch clamp om hun geëvokeerd responsen op laser-scanning foto-stimulatie van channelrhodopsine expresserende vezels te meten. Deze aanpak maakt een evaluatie van functionele topografie en synaptische eigenschappen mogelijk. Morfologische correlaties kunnen worden verkregen door beeldvorming van de neuroanatomische expressie van channelrhodopsine expresserende vezels met behulp van confocale microscopie van de levende plak of post-gefixeerd weefsel. Deze methoden maken functionele onderzoeken van voorhersenencirkels mogelijk die uitbreiden op meer conventionele benaderingen.

Laser-scanning fotostimulatie van projecties tussen het primaire visuele gebied (V1) en het secundaire visuele gebied (V2) bij de muis werd uitgevoerd na injecties van pAAV-CaMKIIa-hChR2(H134R)-EYFP in V1 van een Balb/C-muis (Figuur 3). De CaMKIIa-promoter in dit viraal construct stuurt de specifieke expressie van channelrhodopsin-EYFP aan in excitatoire glutamaterge neuronen1,15. Na de preparatie van coupes voor fysiologische registratie werd de expressie van channelrhodopsin-EYFP-vezels, i.e. de epifluorescentie van het geconjugeerde EYFP, waargenomen terwijl deze van V1 naar V2 liepen (Figuur 3A). Daarnaast werden ook de corticothalamische vezels in de nucleus geniculatus lateralis (LGN) waargenomen (Figuur 3A). Whole-cell patch clamp-registraties van een neuron in V2 onthulden EPSC's die werden opgewekt na laser-scanning fotostimulatie van channelrhodopsin-EYFP-expresserende vezels in de onderste lagen van V2 (Figuur 3B).
In een ander voorbeeld werd laser-scan fotostimulatie van de corticothalamische projecties van laag 6 van de primaire somatosensorische cortex (S1) naar de ventroposteriore nucleus (VP) uitgevoerd met behulp van dit protocol. Hierbij hebben we een Cre-Lox benadering gebruikt om specifiek de expressie van channelrhodopsine in de neuronen van laag 6 en de betreffende corticothalamische projecties te targeten. Concreet hebben we pAAV-Ef1a-DIO-hChR2(H134R)-EYFP-WPRE-pA geïnjecteerd in S1 van B6.Cg-Tg(Ntsr1-cre)GN220Gsat/Mmcd muizen (Figuren 1 en 4). Deze transgene muizenstam tot expressie van Cre-recombinase specifiek in de corticothalamische neuronen van laag 621, wat resulteert in ChR-YFP expressie uitsluitend in die neuronen na transfectie door het 'floxed' AAV-construct. Na bereiding van de coupes werden channelrhodopsine-EYFP vezels waargenomen in de neuronen van laag 6 en vezels die projecteren naar laag 4 en VP (Figuren 4A en 4B). Fysiologische registraties van een VPm-neuron met behulp van whole-cell patch clamp onthulden dat er EPSC's konden worden opgewekt na laser-scan fotostimulatie nabij het geregistreerde neuron (Figuren 4C en 4D).
De morfologie van de gelabelde vezels kon gemakkelijker worden beoordeeld na de fysiologische opnames. Hierbij hebben we coupes (50 μm) opnieuw gesneden die channelrhodopsin-EYFP expressie vertoonden in corticothalamische neuronen van laag 6 (Figuur 5). Dit onthulde een fijn patroon van gelabelde vezels die van laag 6 naar laag 4 liepen, waar ze eindigden en uitgebreid vertakten (Figuur 5A). Daarnaast werden corticothalamische vezels waargenomen die de witte stof binnengingen en richting de thalamus liepen (Figuren 5A en 5B).
<img alt="Diagram van genbewerking met gebruik van Cre-loxP voor gerichte ChR-YFP expressie in een muismodel." fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50915/50915fig1.jpg" width="500px" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figuur 1"> 
Figuur 1. Schematische weergave van de gerichte expressie van channelrhodopsine via een Cre-Lox benadering. Transgene muizen die Cre-recombinase tot expressie brengen in de neuronale populaties van belang worden geïnjecteerd met een 'gefloxed' virus dat codeert voor channelrhodopsine gefuseerd aan een fluorescent eiwit, zoals YFP. Na transfectie zullen alleen neuronen met Cre-recombinase channelrhodopsine-EYFP tot expressie brengen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50915/50915fig1highres.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken</a>.
<img alt="Lasermicroscopie-diagram met laseroptica, dichroïsche spiegel, CCD-camera en scanning-opstelling." fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50915/50915fig2.jpg" width="500px" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figuur 2"> 
Figuur 2. Schematische illustratie van de fotostimulatie-opstelling. (A) Diagram van de laser-scanning fotostimulatie-opstelling. De laserstraal wordt opeenvolgend via een open straalsysteem naar een sluiter en een neutraal dichtheidsfilter (N.D.-filter) geleid. Een dekglas reflecteert een deel van de straal naar een fotodiode die is verbonden met een versterker voor laservermetingen. Spiegelgalvanometers worden gebruikt om de laserstraal via een scanlens te positioneren, die de straal door een zijpoort aan de bovenzijde van de microscoop leidt. De straal wordt vervolgens via een dichroïsche spiegel naar beneden door de objectieflens naar de coupe-preparaat gereflecteerd. Voor verdere details zie Lam en Sherman23 en Shepherd29. (B) Voorbeeld van het fotostimulatie-rasterpatroon voor het representatieve experiment getoond in Figuur 3. Het 16 x 16 stimulatieraster is overgelegd op een fotomicrografie van het coupe-preparaat. Een rode ster geeft de locatie aan van een neuron dat is geregistreerd met whole-cell patch clamp. De positie van de laserstraal wordt naar elk van de 256 posities in het stimulatieraster geleid door computergestuurde positionering van de spiegelgalvanometers. De laserposities van de eerste 5 stimulatieplaatsen zijn in de figuur afgebeeld. De responsen van het geregistreerde neuron op fotostimulatie op elk van de plaatsen zijn weergegeven in Figuur 3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50915/50915fig2highres.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken</a>.
<img alt="Neuro-imagingkaart diagram; analyse van LGN, V1, V2 visuele cortex; studie naar neurale verbindingen." fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50915/50915fig3.jpg" width="500px" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 3"> 
Figuur 3. Laser-scanning fotostimulatie van corticocorticale projecties van de primaire visuele cortex (V1) naar de secundaire visuele cortex (V2) bij de muis. (A) Epifluorescentiebeeld van de slice-preparatie waarop channelrhodopsine-EYFP-vezels van V1 naar V2 en in de nucleus geniculatus lateralis (LGN) te zien zijn. Specifieke expressie van channelrhodopsine-EYFP in excitatoire glutamaterge neuronen wordt aangestuurd door een viraal construct met de CaMKIIa-promotor. (B) Excitatoire postsynaptische stromen (EPSC's) opgewekt in een neuron in V2 na laser-scanning fotostimulatie. De rode ster geeft de registratieplaats aan. Schaalbalken: (A) 500 µm, (B) 200 pA, 100 msec. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50915/50915fig3highres.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken</a>.
<img alt="Diagram van de corticale laag met analyse van de VP-regio; brengt micro-elektrische activiteit in kaart; elektrofysiologische gegevens." fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50915/50915fig4.jpg" width="500px" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figuur 4"> 
Figuur 4. Laser-scanning fotostimulatie van corticothalamische projecties van de primaire somatosensorische cortex (S1) naar de ventroposterieure nucleus (VP) in de muis. (A) Epifluorescentiebeeld van de coupespreparaat waarop channelrhodopsine-EYFP-vezels in S1 te zien zijn. (B) Epifluorescentiebeeld van gelabelde vezels in VP. (C) Excitatoire postsynaptische stromen (EPSCs) opgewekt in een VP-neuron na laser-scanning fotostimulatie. (D) Grafiek van de gemiddelde EPSCs. De rode ster geeft de registratieplaats aan. De omkaderde sporen in (C) komen overeen met de omkaderde waarden in (D). Schaalbalken: (A) 250 µm, (B) 250 µm, (C) 100 pA, 100 msec. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50915/50915fig4highres.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken</a>.
<img alt="Fluorescentiemicroscopie die neuronale structuren laat zien, gelabeld met groene markers; vergelijkingsdiagram." fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50915/50915fig5.jpg" width="500px" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figuur 5"> 
Figuur 5. Beeldvorming van laag 6-neuronen die channelrhodopsin-EYFP tot expressie brengen in de primaire somatosensorische cortex (S1) van de muis. (A-B) Gelabelde neuronen in laag 6 en vezels die projecteren naar laag 4 en de witte stof. Schaalbalken: (A) 250 µm, (B) 250 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50915/50915fig5highres.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken</a>.

We beschrijven een methode voor het karakteriseren van de functionele topografie en synaptische eigenschappen van voorhersenencircuits met behulp van een optogenetische aanpak om neuronale populaties in vitro te fotostimuleren.

Laser-scanning fotostimulatie van optogenetisch gerichte voorhersenencircuits

The sensory forebrain is composed of intricately connected cell types, of which functional properties have yet to be fully elucidated. Understanding the ...

Het algemene doel van deze procedure is om moderne optogenetische technieken toe te passen om gerichte neurale pathways te fotostimuleren in in vitro slice-preparaten. Dit wordt bereikt door eerst channelrhodopsine tot expressie te brengen in de neurale cellijnen van belang. De tweede stap van de procedure is het maken van acute slice-preparaten van de relevante hersenstructuren die bestudeerd moeten worden.De volgende stap is het registreren van de reacties van neuronen in de coupespreparaat in reactie op fotostimulatie van de vezels die de kanaalopsine tot expressie brengen. De laatste stap is het in beeld brengen van de distributie van de neuronen en vezels die de kanaalopsine tot expressie brengen. Uiteindelijk maakt deze aanpak een beoordeling mogelijk van de functionele topografie en synaptische eigenschappen van neurale circuits met behulp van laser-scanning fotostimulatie van optogenetisch getargete neurale componenten.De belangrijkste voordelen van deze techniek ten opzichte van traditionele methoden voor elektrische stimulatie zijn de mogelijkheid om specifiek bepaalde neurale celtypen te targeten en te stimuleren, en om hun lange-afstandsprojecties in vitro te onderzoeken. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in het veld van de systeemneurowetenschappen, zoals de functionele organisatie van complexe war sockets. Bereid een spuit en naald voor om de virale oplossing te injecteren, die vier microgram per milliliter poly bevat om de transfectie te verbeteren.Inject vervolgens 200 nanoliters van de oplossing onder druk met behulp van de spuitpomp; twee tot drie weken later zal er voldoende expressie zijn in de channel rod Dossin-slice. De preparatie moet zo snel mogelijk worden uitgevoerd. Maak, na het verwijderen van het geïnjecteerde brein, een blok van het brein in de gewenste oriëntatie met een schoon scheermesje. Bevestig vervolgens het geblokte oppervlak van het brein aan de snijtafel met secondelijm.Verplaats vervolgens de houder naar een in de vriezer gekoelde vibram-snijkamer en giet ijskoud aCSF in de snijkamer. Snijd de hersensecties met een viome in vier tot 500 micron dikke secties. Verplaats de hersensnijden naar een geoxygeneerde bewaarkamer en laat ze minimaal een uur incuberen bij 30 °C voordat u verdergaat met het experiment.Wanneer u klaar bent om met het experiment te beginnen, brengt u de hersensectie over naar de tafel van de elektrofysiologische registratie-opstelling. Registreer een neuron met behulp van standaard whole-cell patchclamp-technieken. Positioneer de registratiepipet kort bij het neuron terwijl er positieve druk op de pipet wordt uitgeoefend.Nadat contact met de cel is gemaakt, laat u de druk los en past u zuigkracht toe om de giga-seal te vormen. Pas vervolgens kortstondig zuigkracht toe om het membraan te doorbreken voor de whole-cell configuratie en maak opnames in de voltage- of current-clamp modi. Bedien de laserscanner met ofwel TidalWave of EFAs data-acquisitielogistiek.De software moet vóór gebruik worden gekalibreerd op de fotodiode om het vermogen van de laser te regelen. Een variabel neutraal dichtheidsfilterwiel wordt in de lichtweg geplaatst. Door het wiel te draaien wordt het laservermogen aangepast door middel van metingen in het achterste brandvlak.Het vermogen wordt doorgaans ingesteld tussen 25 en D milliwatt. De pulsparameter van de sluiter regelt de duur en timing van de stimulatie in de software. Met de functie voor het vastleggen van video kan een afbeelding worden gemaakt van het te stimuleren gebied.Stel vervolgens het stimulatierooster in, bijvoorbeeld een rooster van 16 bij 16 met een tussenruimte van 80 micron. Leg het rooster daarna over de verkregen afbeelding en pas de XY-coördinaten en de mate van offset aan om de oriëntatie te optimaliseren voordat de stimulatie wordt gestart. Activeer de kaartfunctie.De gegevens worden bewaard en kunnen worden geanalyseerd met het offline analyseprogramma in tidal wave, of ze kunnen worden geanalyseerd met het map-analyseprogramma in de EFAs-software. Na voltooiing van de fysiologische opnames op de slice kan het expressiepatroon van de YFP-getagde kanaalopsine worden gedocumenteerd. Fixeer de slice eerst gedurende de nacht in 4% PFA in 0,01 molair PBS bij vier graden Celsius.Breng de slice de volgende dag over naar een oplossing van 30%sucrose 4%PFA voor cryoprotectie gedurende de nacht. Snijd de volgende dag secties van 50 micron van de slice met een cryostaat. Spoel de secties met PBS en monteer ze voor beeldvorming met een anti-fade medium voor de confocale microscoop.Nadat het gebied van interesse in wit licht is gevonden, wordt een excitatiegolflengte van 514 nanometer en een emissiegolflengte van 527 nanometer gebruikt. Om het YFPA virale construct te beelden dat de expressie van channel rod Dobson, EYFP, aanstuurt in excitatoire glutamaterge neuronen, is dit geïnjecteerd in de primaire visuele cortex van een BSY-muis.Virale expressie werd aangetroffen in banen tussen de primaire en secundaire visuele cortex, en in de cortico-thalamische vezels van de LGN; whole-cell patchclamp-opnamen van een neuron in de secundaire visuele cortex, gemarkeerd door de ster, onthulden e PSC's. Na laser-scanning fotostimulatie van het kanaal, vertoonden channelrhodopsine-expresserende vezels in de onderste lagen van V2 cortico-thalamische projecties vanuit laag zes van de primaire somatosensorische cortex. De ventrale posterieure nucleus werd bestudeerd met een Cre-Lox-benadering om channelrhodopsine tot expressie te brengen in cortico-thalamische neuronen van laag zes en in hun projecties; zoals verwacht leidde transfectie met een geflockt AAV-construct in een Cre-transgene muis tot channelrhodopsine-expressie in de getargete laag zes-neuronen en hun vezels die zich uitstrekten tot laag vier.Bij expressie van Channelrhodopsin-EYFP werd ook expressie waargenomen in vezels die naar de VP projecteren; fysiologische opnames van een VP-neuron werden uitgevoerd. Met behulp van whole-cell patch-clamp bleek dat ePSC's konden worden opgewekt na fotostimulatie nabij het geregistreerde neuron, dat is gemarkeerd met de ster. De offline-analyse toont de gemiddelde responsamplitude op fotostimulatie in de VP. In opnieuw gesneden 50 micron dikke plakken van cortico-thalamische neuronen uit laag zes die Channelrhodopsin-EYFP tot expressie brachten, werd een fijn patroon van gelabelde vezels waargenomen die van laag zes naar laag vier liepen, waar ze terminaal eindigden en uitgebreid vertakten.Daarnaast werden cortico-thalamische vezels waargenomen die de witte stof binnengingen en richting de thalamus liepen. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u moderne optogenetische technieken kunt toepassen om gerichte neurale banen te fotostimuleren in in vitro slice-preparaten. Vergeet niet dat werken met lasers extreem gevaarlijk kan zijn wanneer u de kalibratiestappen uitvoert die bij deze procedure horen.Draag een beschermende bril.

laser-scanning-photostimulation-optogenetically-targeted-forebrain

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Laser-scanning fotostimulatie van optogenetisch gerichte voorhersenencirkels

Deze paper introduceert een benadering van het combineren van laser scanning fotostimulering met hele cel opnames in transgene muizen die GFP in beperkte remmende neuron populaties. De techniek maakt uitgebreide mapping en kwantitatieve analyse van lokale synaptische circuits specifieke remmende corticale neuronen.

Het in kaart brengen Remmende neuronale circuits door Laser Scanning fotostimulatie

De ontwikkeling van optogenetics biedt nu de middelen om nauwkeurig te stimuleren genetische gedefinieerde neuronen en...

Glasvezel-implantatie voor chronische Optogenetic Stimulatie van hersenweefsel

De recente ontwikkeling van de neurowetenschappen tools die genetica en optica combineren, aangeduid als "optogenetics", stelt de controle over neurale circuit activiteit met een ongekend niveau van ruimtelijke en temporele resolutie. Hier bieden wij een protocol voor de integratie in vivo opnemen met optogenetic manipulatie van genetisch gedefinieerde subsets van de prefrontale cortex en subicular piramidale neuronen.

Een methode voor High Fidelity optogenetic controle van individuele piramidale neuronen<em&gt; In vivo</em

Hier een protocol beschrijven we voor optogenetic manipulatie van motoneuronal activiteit, terwijl het volgen van veranderingen in motorvermogen (spiercontractie) in...

Optogenetic Perturbation van neurale activiteit met Laser Verlichting in Semi-intacte<em&gt; Drosophila</em&gt; Larven in Motion

Optogenetica is een krachtig hulpmiddel geworden voor gebruik in gedragsneurowetenschappelijke experimenten. Dit protocol biedt een stapsgewijze handleiding voor het ontwerp en de installatie van lasersystemen en biedt een volledig protocol voor het uitvoeren van meerdere en gelijktijdige in vivo optogenetische stimulaties die compatibel zijn met de meeste gedragstestparadigma's bij knaagdieren.

In vivo optogenetische Stimulatie van de knaagdieren centrale zenuwstelsel

Dit protocol beschrijft de stappen en gegevensanalyse die nodig zijn om optogenetisch functioneel magnetische resonantiebeeldvorming (ofMRI) met succes uit te voeren. ofMRI is een nieuwe techniek die high-field fMRI-uitlezing combineert met optogenetische stimulatie, waardoor het mogelijk wordt om celtype-specifieke kaarten van functionele neurale circuits en hun dynamica in de gehele levende hersenen te maken.

Optogenetische Functionele MRI

Dit protocol beschrijft een reeks methoden voor het identificeren van de cel-type specifieke functionele connectiviteit van lange-bereik ingangen van verre hersengebieden met behulp van optogenetische stimulaties in ex vivo hersenen segmenten.

In vivo intracerebrale Stereotaxic injecties voor Optogenetische stimulatie van lange-afstand ingangen in muis hersenen segmenten

Zoals momenteel geïmplementeerd, vereist optogenetica bij niet-menselijke primaten injectie van virale vectoren in de hersenen. Een optimale injectiemethode moet betrouwbaar zijn en, voor veel toepassingen, in staat zijn om individuele locaties van willekeurige diepte te targeten die gemakkelijk en ondubbelzinnig worden geïdentificeerd in de postmortale histologie. Een injectiemethode met deze eigenschappen wordt gepresenteerd.

Injecties van AAV-vectoren voor optogenetica in verdoofde en wakkere zich gedragende niet-menselijke primatenhersenen

Hier presenteren we een protocol dat virale transductie van discrete hersengebieden beschrijft met optogenetische constructies om synapsspecifieke elektrofysiologische karakterisering in acute hersenplakken van knaagdieren mogelijk te maken.

Ex Vivo | Optogenetische ondervraging van synaptische transmissie en plasticiteit op lange afstand van mediale prefrontale cortex naar laterale entorhinale cortex

De hier beschreven methoden schetsen een procedure die wordt gebruikt om cocaïne-geïnduceerde plasticiteit in een gedragsrelevant circuit bij ratten op optogenetisch om te keren. Aanhoudende laagfrequente optische stimulatie van thalamo-amygdala synapsen induceert langdurige depressie (LTD). In vivo optogenetisch geïnduceerde LTD bij cocaïne-ervaren ratten resulteerde in de daaropvolgende verzwakking van cue-gemotiveerde drug seeking.

Optogenetica gebruiken om neuroplasticiteit om te keren en cocaïne zoeken bij ratten te remmen

Hier presenteren we twee protocollen voor de registratie van micro-elektrocorticografie met hoge dichtheid (μEcoG) bij ratten en muizen, inclusief chirurgische, implantatie- en registratiemethoden. μECoG-opnames worden uitgevoerd in combinatie met laminaire polytrode-opname in de auditieve cortex van de rat of met optogenetische manipulatie van neurale activiteit in de somatosensorische cortex van de muis.

Multischaalonderzoek van corticale verwerking door integratie van laminaire polytrodes en optogenetica met micro-elektrocorticografie bij knaagdieren

Leer laser-scanning fotostimulatie van optogenetisch gerichte voorhersenencircuits voor functionele topografie. Deze methode maakt precieze activering van specifieke neuronale populaties en analyse van synaptische eigenschappen mogelijk.

Laser-scanning fotostimulatie van optogenetisch gerichte voorhersenencircuits

Meer video's verkennen