Laser-scanning fotostimulatie van optogenetisch gerichte voorhersenencircuits
December 27th, 2013
We beschrijven een methode voor het karakteriseren van de functionele topografie en synaptische eigenschappen van voorhersenencircuits met behulp van een optogenetische aanpak om neuronale populaties in vitro te fotostimuleren.
Het algemene doel van deze procedure is om moderne optogenetische technieken toe te passen om gerichte neuronale paden in in vitro-snijdpreparaten te foto-stimuleren. Dit wordt bereikt door eerst het kanaalstaafje Dossin te gaan expresseren in de neuronale cellijnen van belang. De tweede stap van de procedure is om acute snijdpreparaten te maken van de relevante hersenstructuren die bestudeerd moeten worden.
De volgende stap is om reacties op te nemen van neuronen in de snijdvoorbereiding als reactie op foto-stimulatie van het kanaal, staafje Dossin expresserende vezels. De laatste stap is om de verdeling van kanaalopsine expresserende neuronen en vezels te beeldvormen. Uiteindelijk maakt deze aanpak een beoordeling mogelijk van de functionele topografie en synaptische eigenschappen van neurale circuits door middel van laser-scanning foto-stimulatie van optogenetisch getargeteerde neurale componenten.
De belangrijkste voordelen van deze techniek ten opzichte van traditionele elektrische stimulatiemethoden zijn de mogelijkheid om specifiek bepaalde neurontypen te targeten en te stimuleren en hun langeafstandsprojecties in vitro te onderzoeken. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van systeemneurowetenschappen, zoals de functionele organisatie van complexe oorwartel. Bereid een spuit en naald voor om de virale oplossing te injecteren, die vier microgram per milliliter poly bevat om de transfectie te verbeteren.
Injecteer vervolgens onder druk 200 nanoliters van de oplossing met behulp van de spuitpomp, twee tot drie weken later zal er een adequate expressie van kanaalstaafje Dossin in de snijdvoorbereiding zijn. De voorbereiding moet zo snel mogelijk worden uitgevoerd Na het verwijderen van de geïnjecteerde hersenen, maak een blok van de hersenen in de gewenste oriëntatie met behulp van een schone scheermesje. Bevestig vervolgens het geblokkeerde oppervlak van de hersenen aan de snijfas met behulp van onmiddellijke kleeflijm.
Breng de snede vervolgens over naar een gekoelde vibram-snijkamer en giet ijskou A CSF in de snijkamer. Snijd de hersensecties met behulp van een viome in vier tot 500 micrometer dikke secties. Breng de hersensneden over naar een geoxideerde houdkamer en laat ze minstens een uur incuberen op 30 graden Celsius voordat u doorgaat met het experiment.
Wanneer u klaar bent om met het experiment te beginnen, brengt u de hersensnede over naar de elektrofysiologische opname-installatie. Neem een neuron op met behulp van standaard whole cell patch clamp-technieken. Plaats kort de opnamepipet bij het neuron terwijl u positieve druk op de pipet uitoefent.
Nadat er contact met de cel is gemaakt, laat u de druk los en brengt u zuiging aan om de giga-seal te vormen. Breng vervolgens kort zuiging aan om het membraan te breken voor whole cell-configuratie en neem opnames in voltage- of stroomklemmodi. Gebruik de laserscanner met behulp van Tidal Wave of EFA's data-acquisitiesoftware.
De software moet worden gekalibreerd aan de fotodiode voor gebruik om het vermogen van de laser te regelen. Een variabele neutraal dichtheidswiel wordt in het pad geplaatst. Door het wiel te draaien, wordt het vermogen van de laser aangepast door te meten in het achtere focaal vlak.
Het vermogen wordt meestal ingesteld op tussen de 25 en D milliwatt. De sluiterparameter van de sluiter regelt de lengte en timing van de stimulatie in de software. Een afbeelding van het te stimuleren gebied kan worden gemaakt met de grab-videofunctie.
Stel vervolgens het stimulatieraster in, zoals een 16 bij 16 raster met een afstand van 80 micrometer. Plaats vervolgens het raster op de verworven afbeelding en pas de XY-coördinaten en de mate van offset aan om de oriëntatie te optimaliseren om de stimulatie te starten. Activeer de kaartfunctie.
De gegevens worden bewaard en kunnen worden geanalyseerd met behulp van het offline analyseprogramma in Tidal Wave, of ze kunnen worden geanalyseerd met behulp van het kaartanalyseprogramma in de EFA's-software. Na het voltooien van de fysiologische opnamen op de snede, kan het expressiepatroon van YFP-gelabelde kanaalopsine worden gedocumenteerd. Fixeer eerst de snede een nacht in 4% PFA in 0,01 molair PBS bij vier graden Celsius.
De volgende dag brengt u de snede over in 30% sucrose 4% PFA-oplossing voor overnacht cryo-bescherming. Snijd de volgende dag 50 micrometersecties van de snede op een cryostaat. Spoel de sneden af in PBS en monteer ze voor beeldvorming met een anti-fade medium op de confocale microscoop.
Na het vinden van het gebied van belang in wit licht, gebruikt u een 514 nanometer opwindende golflengte en een 527 nanometer emissiegolflengte. Om YFPA-viraal construct te beeldvormen dat de expressie van kanaalstaafje Dobson, EYFP, in opwindende glutamaterge neuronen werd geïnjecteerd in de primaire visuele cortex van een BSY-muis.
Virale expressie werd gevonden in sporen tussen de primaire en secundaire visuele cortices, en in de cortico-thalamische vezels van de LGN. Hele cel patch clamp-opname van een neuron in de secundaire visuele cortex gemarkeerd door de ster onthulde e PSC's. Na laser-scanning foto-stimulatie van het kanaal, staafje Dossin expresserende vezels in de lagere lagen van V twee cortico-thalamische projecties uit laag zes van de primaire somatosensorische cortex. De ventrale achterste nucleus werd bestudeerd met behulp van een CRE LAX-benadering om kanaalstaafje dossin in laag zes cortico-thalamische neuronen te laten expresseren, en in hun projecties zoals verwacht. Transfectie door een flocked a a V-construct in een CRE-transgene muis resulteerde in kanaalstaafje dosin-expressie in de gerichte laag zes neuronen en hun vezels die zich uitstrekken tot laag vier.
Kanaalstaafje Dobson, EYFP-expressie werd ook opgemerkt in vezels die projecteren naar VP. Fysiologische opnamen van een VP-neuron onthulden dat e PSC's konden worden uitgelokt na foto-stimulatie in de buurt van het opgenomen neuron, dat is gemarkeerd door de ster. Offline analyse toont de gemiddelde responsamplitude op foto-stimulatie in VP. Resectie van 50 micrometer sneden van laag zes cortico-thalamische neuronen die kanaal Rodin EYFP tot expressie brengen, onthulde een fijn patroon van
Overzicht
Dit artikel presenteert een methode voor het karakteriseren van voorhersencircuits door middel van optogenetiek om neuronale populaties in vitro te fotostimuleren. De techniek maakt de beoordeling van functionele topografie en synaptische eigenschappen van neurale circuits mogelijk.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschap
- Optogenetiek
- Elektrofysiologie
Achtergrond
- Optogenetiek maakt nauwkeurige controle van neuronale activiteit mogelijk.
- In vitro plakpreparaten worden gebruikt om hersencircuits te bestuderen.
- Channelrhodopsine is een belangrijk hulpmiddel voor fotostimulatie.
- Deze methode geeft inzicht in de organisatie van neurale circuits.
Doel van het onderzoek
- Om optogenetische technieken toe te passen voor gerichte neuronale stimulatie.
- Om synaptische eigenschappen van specifieke neuronale paden te onderzoeken.
- Om het begrip van functionele organisatie in de hersenen te verbeteren.
Gebruikte methoden
- Expressie van channelrhodopsine in neuronale cellijnen.
- Bereiding van acute hersensneden voor experimenten.
- Elektrofysiologische opnames met behulp van whole cell patch clamp technieken.
- Laser scanning fotostimulatie om specifieke neuronale populaties te activeren.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle fotostimulatie van channelrhodopsine-expresserende vezels.
- Gedocumenteerde synaptische reacties in doelgerichte neuronen.
- Visualisatie van neuronale paden en hun projecties.
- Inzichten in de functionele connectiviteit van voorhersencircuits.
Conclusies
- De methode biedt een krachtig hulpmiddel voor het bestuderen van neurale circuits.
- Optogenetiek maakt specifiek targeten van neuronale typen mogelijk.
- Deze aanpak kan kritieke vragen in de systeemneurowetenschap beantwoorden.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Laser-scanning photostimulation of optogenetically targeted forebrain circuits enables precise interrogation of neuronal connectivity and synaptic function in complex brain regions. This approach enhances predictive confidence in early discovery by allowing targeted hypothesis testing of circuit-level mechanisms. The method supports portfolio decisions by clarifying functional organization and de-risking biological targets in neuropsychiatric and neurodegenerative research.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables targeted interrogation of neuronal pathways to clarify circuit-level mechanisms.
- Supports functional target validation by isolating specific cell types and projections.
- Facilitates predictive confidence in mechanistic hypotheses for CNS disorders.
- Provides data to triage targets based on synaptic and connectivity profiles.
Screening & Assay Development
- Prepares validated brain slice systems for downstream electrophysiological assays.
- Standardizes stimulation and recording conditions for reproducible quantitative outputs.
- Enables scalable mapping of synaptic responses across defined neuronal populations.
- Supports reliable evaluation of compound effects on circuit function.
Translational & Preclinical Research
- Aligns functional circuit mapping with disease-relevant brain regions and pathways.
- Provides continuity from discovery through preclinical validation of neural targets.
- De-risks translational advancement by linking synaptic properties to in vivo function.
- Supports biomarker development through quantifiable electrophysiological readouts.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling hypothesis-driven mapping of neuronal circuits, supporting both target validation and assay development for CNS portfolios.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling selective stimulation and recording from defined neuronal populations.
- Screening: Provides reproducible, quantitative electrophysiological outputs for compound screening in validated slice systems.
- Analytics: Delivers quantitative measurements of synaptic responses and connectivity for comparative analysis.
- Translational Research: Links in vitro circuit function to disease-relevant models and potential biomarkers.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable platform for mapping diverse brain circuits and evaluating multiple targets.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in CNS target validation.
- Operational Value: Standardizes optogenetic stimulation and electrophysiological recording for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by clarifying circuit-level mechanisms early.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of CNS targets and pathways for advancement.
Implementation Considerations
- Requires expertise in optogenetics, viral transfection, and electrophysiology.
- Needs specialized instrumentation for laser-scanning, patch clamp, and confocal imaging.
- Demands cross-team standardization of stimulation and analysis protocols.
- Adaptation may be needed for different brain regions or transgenic models.
- Safety protocols for laser use and viral handling are essential.
