Laser-scanning fotostimulatie van optogenetisch gerichte voorhersenencircuits
27 december 2013
We beschrijven een methode voor het karakteriseren van de functionele topografie en synaptische eigenschappen van voorhersenencircuits met behulp van een optogenetische aanpak om neuronale populaties in vitro te fotostimuleren.
Het algemene doel van deze procedure is om moderne optogenetische technieken toe te passen om gerichte neuronale paden in in vitro-snijdpreparaten te foto-stimuleren. Dit wordt bereikt door eerst het kanaalstaafje Dossin te gaan expresseren in de neuronale cellijnen van belang. De tweede stap van de procedure is om acute snijdpreparaten te maken van de relevante hersenstructuren die bestudeerd moeten worden.
De volgende stap is om reacties op te nemen van neuronen in de snijdvoorbereiding als reactie op foto-stimulatie van het kanaal, staafje Dossin expresserende vezels. De laatste stap is om de verdeling van kanaalopsine expresserende neuronen en vezels te beeldvormen. Uiteindelijk maakt deze aanpak een beoordeling mogelijk van de functionele topografie en synaptische eigenschappen van neurale circuits door middel van laser-scanning foto-stimulatie van optogenetisch getargeteerde neurale componenten.
De belangrijkste voordelen van deze techniek ten opzichte van traditionele elektrische stimulatiemethoden zijn de mogelijkheid om specifiek bepaalde neurontypen te targeten en te stimuleren en hun langeafstandsprojecties in vitro te onderzoeken. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van systeemneurowetenschappen, zoals de functionele organisatie van complexe oorwartel. Bereid een spuit en naald voor om de virale oplossing te injecteren, die vier microgram per milliliter poly bevat om de transfectie te verbeteren.
Injecteer vervolgens onder druk 200 nanoliters van de oplossing met behulp van de spuitpomp, twee tot drie weken later zal er een adequate expressie van kanaalstaafje Dossin in de snijdvoorbereiding zijn. De voorbereiding moet zo snel mogelijk worden uitgevoerd Na het verwijderen van de geïnjecteerde hersenen, maak een blok van de hersenen in de gewenste oriëntatie met behulp van een schone scheermesje. Bevestig vervolgens het geblokkeerde oppervlak van de hersenen aan de snijfas met behulp van onmiddellijke kleeflijm.
Breng de snede vervolgens over naar een gekoelde vibram-snijkamer en giet ijskou A CSF in de snijkamer. Snijd de hersensecties met behulp van een viome in vier tot 500 micrometer dikke secties. Breng de hersensneden over naar een geoxideerde houdkamer en laat ze minstens een uur incuberen op 30 graden Celsius voordat u doorgaat met het experiment.
Wanneer u klaar bent om met het experiment te beginnen, brengt u de hersensnede over naar de elektrofysiologische opname-installatie. Neem een neuron op met behulp van standaard whole cell patch clamp-technieken. Plaats kort de opnamepipet bij het neuron terwijl u positieve druk op de pipet uitoefent.
Nadat er contact met de cel is gemaakt, laat u de druk los en brengt u zuiging aan om de giga-seal te vormen. Breng vervolgens kort zuiging aan om het membraan te breken voor whole cell-configuratie en neem opnames in voltage- of stroomklemmodi. Gebruik de laserscanner met behulp van Tidal Wave of EFA's data-acquisitiesoftware.
De software moet worden gekalibreerd aan de fotodiode voor gebruik om het vermogen van de laser te regelen. Een variabele neutraal dichtheidswiel wordt in het pad geplaatst. Door het wiel te draaien, wordt het vermogen van de laser aangepast door te meten in het achtere focaal vlak.
Het vermogen wordt meestal ingesteld op tussen de 25 en D milliwatt. De sluiterparameter van de sluiter regelt de lengte en timing van de stimulatie in de software. Een afbeelding van het te stimuleren gebied kan worden gemaakt met de grab-videofunctie.
Stel vervolgens het stimulatieraster in, zoals een 16 bij 16 raster met een afstand van 80 micrometer. Plaats vervolgens het raster op de verworven afbeelding en pas de XY-coördinaten en de mate van offset aan om de oriëntatie te optimaliseren om de stimulatie te starten. Activeer de kaartfunctie.
De gegevens worden bewaard en kunnen worden geanalyseerd met behulp van het offline analyseprogramma in Tidal Wave, of ze kunnen worden geanalyseerd met behulp van het kaartanalyseprogramma in de EFA's-software. Na het voltooien van de fysiologische opnamen op de snede, kan het expressiepatroon van YFP-gelabelde kanaalopsine worden gedocumenteerd. Fixeer eerst de snede een nacht in 4% PFA in 0,01 molair PBS bij vier graden Celsius.
De volgende dag brengt u de snede over in 30% sucrose 4% PFA-oplossing voor overnacht cryo-bescherming. Snijd de volgende dag 50 micrometersecties van de snede op een cryostaat. Spoel de sneden af in PBS en monteer ze voor beeldvorming met een anti-fade medium op de confocale microscoop.
Na het vinden van het gebied van belang in wit licht, gebruikt u een 514 nanometer opwindende golflengte en een 527 nanometer emissiegolflengte. Om YFPA-viraal construct te beeldvormen dat de expressie van kanaalstaafje Dobson, EYFP, in opwindende glutamaterge neuronen werd geïnjecteerd in de primaire visuele cortex van een BSY-muis.
Virale expressie werd gevonden in sporen tussen de primaire en secundaire visuele cortices, en in de cortico-thalamische vezels van de LGN. Hele cel patch clamp-opname van een neuron in de secundaire visuele cortex gemarkeerd door de ster onthulde e PSC's. Na laser-scanning foto-stimulatie van het kanaal, staafje Dossin expresserende vezels in de lagere lagen van V twee cortico-thalamische projecties uit laag zes van de primaire somatosensorische cortex. De ventrale achterste nucleus werd bestudeerd met behulp van een CRE LAX-benadering om kanaalstaafje dossin in laag zes cortico-thalamische neuronen te laten expresseren, en in hun projecties zoals verwacht. Transfectie door een flocked a a V-construct in een CRE-transgene muis resulteerde in kanaalstaafje dosin-expressie in de gerichte laag zes neuronen en hun vezels die zich uitstrekken tot laag vier.
Kanaalstaafje Dobson, EYFP-expressie werd ook opgemerkt in vezels die projecteren naar VP. Fysiologische opnamen van een VP-neuron onthulden dat e PSC's konden worden uitgelokt na foto-stimulatie in de buurt van het opgenomen neuron, dat is gemarkeerd door de ster. Offline analyse toont de gemiddelde responsamplitude op foto-stimulatie in VP. Resectie van 50 micrometer sneden van laag zes cortico-thalamische neuronen die kanaal Rodin EYFP tot expressie brengen, onthulde een fijn patroon van
Overzicht
Dit artikel presenteert een methode voor het karakteriseren van circuits in de voorhersenen met behulp van optogenetica om neuronale populaties in vitro fotostimuleren. De techniek maakt het mogelijk om de functionele topografie en synaptische eigenschappen van neurale circuits te beoordelen.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschappelijk vakgebied
- Neurowetenschappen
- Optogenetica
- Elektrofysiologie
Achtergrond
- Optogenetica maakt nauwkeurige controle van neuronale activiteit mogelijk.
- In vitro slice-preparaten worden gebruikt om hersencircuits te bestuderen.
- Channelrhodopsine is een essentieel hulpmiddel voor fotostimulatie.
- Deze methode biedt inzicht in de organisatie van neurale circuits.
Doel van de studie
- Om optogenetische technieken toe te passen voor gerichte neuronale stimulatie.
- Om synaptische eigenschappen van specifieke neuronale paden te onderzoeken.
- Om het begrip van de functionele organisatie in de hersenen te vergroten.
Gebruikte methoden
- Expressie van channelrhodopsine in neuronale cellijnen.
- Bereiding van acute hersensneden voor experimenten.
- Elektrofysiologische opnames met behulp van whole-cell patch-clamp technieken.
- Laser-scanning fotostimulatie om specifieke neuronale populaties te activeren.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle fotostimulatie van vezels die channelrhodopsine tot expressie brengen.
- Gedocumenteerde synaptische responsen in doelneuronen.
- Visualisatie van neuronale paden en hun projecties.
- Inzichten in de functionele connectiviteit van circuits in de voorhersenen.
Conclusies
- De methode biedt een krachtig instrument voor het bestuderen van neurale circuits.
- Optogenetica maakt specifieke targeting van neuronale typen mogelijk.
- Deze aanpak kan kritische vragen in de systeemneurowetenschap beantwoorden.
Veelgestelde vragen
Industriële relevantie voor directie
Laser-scanning fotostimulatie van optogenetisch getargete voorherscircuits maakt precieze ondervraging van neuronale connectiviteit en synaptische functie in complexe hersengebieden mogelijk. Deze aanpak vergroot het voorspellend vertrouwen in vroege ontdekkingen door gerichte hypothesetesten van mechanismen op circuitniveau mogelijk te maken. De methode ondersteunt portfoliobeslissingen door de functionele organisatie te verduidelijken en biologische targets in neuropsychiatrisch en neurodegeneratief onderzoek te ontrisken.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Maakt gerichte analyse van neuronale paden mogelijk om mechanismen op circuitniveau te verduidelijken.
- Ondersteunt functionele validatie van targets door specifieke celtypen en projecties te isoleren.
- Vergemakkelijkt de voorspellende betrouwbaarheid van mechanistische hypothesen voor CNS-aandoeningen.
- Levert gegevens om targets te prioriteren op basis van synaptische en connectiviteitsprofielen.
Screening & Assay-ontwikkeling
- Bereidt gevalideerde hersensnijsystems voor voor daaropvolgende elektrofysiologische assays.
- Standaardiseert stimulatie- en registratiecondities voor reproduceerbare kwantitatieve resultaten.
- Maakt schaalbare mapping van synaptische responsen over gedefinieerde neuronale populaties mogelijk.
- Ondersteunt een betrouwbare evaluatie van de effecten van verbindingen op de circuitfunctie.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Rijgt functionele circuitmapping aan hersengebieden en pathways die relevant zijn voor de ziekte.
- Zorgt voor continuïteit van ontdekking tot preklinische validatie van neurale targets.
- Vermindert de risico's bij translationele vooruitgang door synaptische eigenschappen te koppelen aan in vivo functie.
- Ondersteunt de ontwikkeling van biomarkers via kwantificeerbare elektrofysiologische read-outs.
Integratie van pijplijn & workflow
Deze methode is geïntegreerd in het continuüm van ontdekking naar preklinisch onderzoek door hypothese-gestuurde mapping van neuronale circuits mogelijk te maken, wat zowel de validatie van targets als de ontwikkeling van assays voor CNS-portefeuilles ondersteunt.
- Ontdekkingsbiologie: Ondersteunt hypothesetoetsing en pathway-verduidelijking door selectieve stimulatie en registratie van gedefinieerde neuronale populaties mogelijk te maken.
- Screening: Biedt reproduceerbare, kwantitatieve elektrofysiologische resultaten voor compound-screening in gevalideerde slice-systemen.
- Analytica: Levert kwantitatieve metingen van synaptische responsen en connectiviteit voor comparatieve analyse.
- Translationaal onderzoek: Koppelt in vitro circuitfuncties aan ziekterelevante modellen en potentiële biomarkers.
- Bedrijfsmatig hergebruik: Biedt een herbruikbaar platform voor het in kaart brengen van diverse hersencircuits en het evalueren van meerdere targets.
Operationele en bedrijfsmatige impact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen en vermindert mechanistische ambiguïteit bij de validatie van CNS-targets.
- Operationele waarde: Standaardiseert optogenetische stimulatie en elektrofysiologische registratie voor reproduceerbaarheid en schaalbaarheid.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen en kapitaalefficiëntie door mechanismen op circuitniveau in een vroeg stadium te verduidelijken.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering van CNS-targets en pathways voor verdere ontwikkeling mogelijk.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in optogenetica, virale transfectie en elektrofysiologie.
- Specialistische instrumentatie nodig voor laser-scanning, patchclamp en confocale beeldvorming.
- Vereist standaardisatie van stimulatie- en analyseprotocollen tussen verschillende teams.
- Aanpassing kan nodig zijn voor verschillende hersenregio's of transgene modellen.
- Veiligheidsprotocollen voor lasergebruik en de omgang met virussen zijn essentieel.
