Observeren en kwantificeren van fibroblast-gemedieerde Fibrin Gel Compaction

Het algemene doel van deze procedure is het observeren en analyseren van het effect van cel-matrixinteracties op de heroriëntatie van vezels en matrix-remodelleringactiviteiten in een fibrinegelsysteem. Dit wordt bereikt door eerst een driedimensionale fibrinegel met microbeads te polymeriseren op dekglas in een bioreactor met gecontroleerde omgevingsfactoren. De tweede stap is het bereiden van een sterk geconcentreerde celsuspensie die wordt gebruikt om clusters fibroblasten of X-explantaten in geometrische patronen op het oppervlak van de gel te positioneren.

Vervolgens wordt het monster gedurende 48 uur elke 15 minuten gefotografeerd met behulp van differentieel-interferentiecontrastmicroscopie. De laatste stap is het meten van de mate van fibrinereorganisatie en -remodellering in de vorm van rek in verschillende regio's van de gel met behulp van digitale beeldcorrelatie. Uiteindelijk maakt dit explantaatsysteem het mogelijk om de cellen in eenvoudige geometrische patronen te rangschikken, waardoor het gemakkelijker is om de mechanismen die ten grondslag liggen aan celgestuurde matrixremodellering en vezelheroriëntatie te visualiseren en te onderzoeken.

Deze methode kan kernvragen binnen het veld van de mechanische biologie beantwoorden, zoals wat de effecten zijn van zeer specifieke spatiale en temporele mechanische signalen op het celgedrag en de resulterende veranderingen die deze teweegbrengen in de omringende weefselmatrix. In deze procedure zal Arabic de Jesus, een promovendus uit mijn laboratorium, de demonstratie verzorgen. Los fibrinogeen gedurende de nacht voorzichtig op in voorverwarmde saline bij 37 °C om een voorraadoplossing van 33,3 mg/mL te maken. Bereid een sjabloon voor op het profiel om de locatie van elk x-explantaat uit te zetten volgens de gewenste geometrische indeling.

Elk stip ongeveer één tot twee millimeter uit elkaar. Deze afstand komt overeen met een ideale spatiëring voor het genereren van vezeluitlijning tussen explantaten. Reinig vervolgens alle componenten van de bioreactor grondig met 70% ethanol en plaats de gereinigde componenten gedurende twee tot drie uur onder de UV-lamp van een weefselkweekkast voorafgaand aan de incubatie.

Nadat de componenten van de bioreactor zijn gesteriliseerd, bevestigt u met tape de sjabloon onder het gebied van het dekglas met een diameter van 60 millimeter waar het monster zal worden geprepareerd. Bereid vervolgens de microbead-suspensie voor, gevolgd door het fibrinogeen en de trombine. Voor de voorraadoplossingen voegt u 0,017 milliliter van de Microbead-voorraadoplossing en 0,149 milliliter DMEM samen in een microcentrifugebuis om een concentratie van 10 miljoen beads per milliliter te bereiken.

Sonicate de suspensie vervolgens 10 minuten om de kraaltjes te dispergeren en de oplossing te homogeniseren. Voeg 0,22 milliliter van de fibrinogeen-stamoplossing toe aan 0,44 milliliter 20 millimolair HEPES-buffer en 0,1667 milliliter van de microbead-oplossing in een 15 milliliter centrifugebuis. Meng de componenten voorzichtig en plaats de buis vervolgens op ijs in een aparte 15 milliliter centrifugebuis.

Samen mengen: 32,8 µL trombine opgelost in zoutoplossing tegen 25 units per milliliter, 131 µL 20 millimolaire HEPES-buffer en 2,46 µL twee molar calciumchloride.

Meng vervolgens de bereide trombine- en fibrinogeenoplossingen zorgvuldig door vijf tot 10 keer op en neer te pipetteren totdat de oplossing gelijkmatig is verdeeld. Probeer het ontstaan van bellen in het mengsel te minimaliseren door de pipet tijdens het mengen niet volledig leeg te maken. Pipetteer de gemengde oplossing zo snel mogelijk in PDMS-vormpjes van acht millimeter vierkant op dekglas en laat de gel polymeriseren bij kamertemperatuur.

De toevoeging van trombine zal ervoor zorgen dat de oplossing na polymerisatie in ongeveer 30 seconden snel gelt; sluit de bioreactor af en bereid de celexplantaten voor om te beginnen. Oogst 70 tot 90% confluente humane dermale fibroblastcellen uit een T 75-fles met trypsine en centrifugeer deze bij 200 ×g gedurende vijf minuten. Plaats de bioreactor in een veiligheidskast en verwijder voorzichtig het deksel onder aseptische omstandigheden. Aspireer vervolgens het medium en resuspendeer de celpellet tot een uiteindelijke concentratie van 20 miljoen cellen per milliliter in DMEM met 10% FBS.

Maak vervolgens explantaten door cellen in een micropipet te laden en 0,3 µL van de celsuspensie in de gepolymeriseerde fibrinegel te injecteren. Volg hierbij het patroon op de sjabloon, waarbij elk explantaat ongeveer 6.000 cellen moet bevatten. Zodra de explantaten op de gel zijn geplaatst, wordt de bioreactor afgesloten.

Plaats vervolgens de verwarmingsblokken en sluit de thermokoppels aan op de temperatuurregelaar. Stel de temperatuurregelaar in op 37 °C en incubeer de gels gedurende één uur zodat de cellen kunnen bezinken en zich kunnen hechten aan de fibrine-matrix. Voeg daarna ongeveer 5 mL DMEM, dat twee tot drie uur is geconditioneerd met 5% CO2 en is aangevuld met 10% foetaal runderserum, 1% penicilline-streptomycine, 0,1% amfotericine B en 10 µg/mL aprotinine, direct toe aan de bioreactorkamer.

Sluit de bioreactor vervolgens weer af. Gebruik een injectiespuit om de extra vijf milliliter met koolstofdioxide geconditioneerd medium via de gekartelde fitting op de inlaatpoort toe te dienen om de bioreactor volledig te vullen; verwijder voorzichtig alle bellen die ontstaan. Stel een spuitenpomp in met een injectiespuit van 10 milliliter of 30 milliliter gevuld met extra 5% koolstofdioxide geconditioneerd medium. Verbind de spuit direct met de inlaatpoort op het deksel van de bioreactor met steriele slangen voorzien van een luer-lock verbinding.

Stel de perfusiesnelheid op de spuitenpomp in op 0,01 milliliters per minuut. Sluit vervolgens aangepaste stukken slang aan op beide uitlaatpoorten en plaats de uiteinden in een bekerglas van 100 milliliter. Gebruik een laboratoriumkrik om de hoogte van de inlaat- en uitlaatvoedingen in te stellen, zodat er geen drukverschil ontstaat in de toevoer van de bioreactor, om het afval op te vangen.

Voeg gedurende het experiment vers medium geconditioneerd met 5% carbon dioxide toe aan de bioreactor. Om de pH te handhaven, voedingsstoffen toe te dienen en afvalproducten te verwijderen, is een spuit van 10 milliliter gevuld met medium ongeveer 16 uur lang voldoende. Plaats het 20 XDIC-objectief onder het kijkvenster van de microscoop en zorg ervoor dat de polarisator, analyzer en het prisma allemaal correct zijn geplaatst.

Open vervolgens de imagingsoftware. Stel de focus van het objectief in op het gebied tussen de drie x explan en sla de X-, Y- en Z-coördinaten van deze locatie op in de imagingsoftware. Om het gehele gebied tussen en rondom de x explan af te beelden, selecteert u de optie om een grote afbeelding te verkrijgen en specificeert u de grootte van het gebied.

Hiermee kunnen meerdere beelden rond het gespecificeerde gebied worden verkregen om een grote tegelafbeelding te creëren; stel de lichtintensiteit en de belichtingstijd in op de laagst mogelijke waarden. Dit helpt om celdood door fototoxiciteit te voorkomen, terwijl er toch voldoende resolutie behouden blijft om onderscheid te kunnen maken tussen cellen, microbeads en fibrinevezels. Let op dat in dit specifieke experiment de fibrinevezels niet zichtbaar zijn vanwege de hoge dichtheid van lichtverstrooiende beads in de gel; verminder de bead-dichtheid of de geldikte om fibrinevezels waar te kunnen nemen.

Begin vervolgens met het volgen van de rek. Maak eerst aangepaste MATLAB-code aan of download deze, en registreer vervolgens de beelden door microbeads in de gehele gel als referentiepunten te gebruiken. De registratie van het beeld zorgt ervoor dat de verkregen beelden telkens op exact dezelfde locatie worden genomen.

Vezelheroriëntatie werd tussen de explanen waargenomen door elke 15 minuten getegelde beelden vast te leggen. Over een periode van 48 uur werden individuele regio's uit de getegelde beelden geëxtraheerd en geanalyseerd met het strain-tracking-algoritme. Om lokale rek te meten op basis van de verplaatsing van microbeads, tonen contourplots de distributie van de maximale hoofdrekt in het gebied van vezelheroriëntatie dat overeenkomt met de strap.

Zodra deze techniek onder de knie is, kan deze bij een correcte uitvoering in ongeveer drie tot vier uur worden voltooid. Na deze procedure kunnen andere methoden, zoals fluorescentielabeling van collageen en cytoskeletale eiwitten alsook kwantificering van celmigratie, worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals welke mechanobiologische routes betrokken zijn bij weefselremodellering en hoe deze processen worden gemoduleerd door diverse biochemische stoffen.