Name: Observeren en kwantificeren van fibroblast-gemedieerde Fibrin Gel Compaction (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-01-16T13:45:00.000+00:00
Duration: 10 min 37 s
Description: Leer fibroblast-gemedieerde fibrinegelcompactie analyseren met tijdopnamemicroscopie en digitale beeldcorrelatie. Deze methode onderzoekt cel-matrixinteracties en matrixhermodellering gedurende 48 uur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We danken George Giudice en Steven Eliason voor het doneren van menselijke huidfibroblasten en Ramesh Raghupathy voor hulp bij het algoritme voor het volgen van de stam. Ondersteuning voor dit werk werd verleend door een U.S. Department of Education Graduate Assistance in Areas of National Need Fellowship (GAANN P200A120071).

1. Stencil voorbereiding
Bereid een stencil op Parafilm voor om de locatie van elke explant in te delen, volgens de gewenste geometrie (figuren 1A en 1B). Ruimte elke explant ongeveer 1-2 mm uit elkaar. Deze afstand komt overeen met een ideale afstand voor het genereren van vezeluitlijning tussen explants. Bevestig het stencil onder het gebied van de afdekglas waar het monster met tape wordt bereid.
2. Sterilisatie
Reinig alle componenten van de bioreactor grondig met 70% ethanol en steriliseer gedurende 2-3 uur onder UV-licht voorafgaand aan het experimenteren. Als een alternatief vat wordt gebruikt in plaats van een bioreactor, moeten de juiste sterilisatietechnieken worden gebruikt. Zie stap 4.12 voor opmerkingen over het gebruik van een petrischaal met glazen bodem.
3. Fibrin Gel Voorbereiding
Nadat de componenten van de bioreactor zijn gesteriliseerd, giet u een dunne laag fibrinegel op het oppervlak van de afdekglas. Details voor het bereiden van fibrinogeen en trombine voorraadoplossingen voor het maken van 6,6 mg/ml fibrinegels worden beschreven in Sander et al. 13 Een soortgelijk protocol van Ye et al. 19 voor het maken van 3,3 mg/ml fibrinegels kan ook worden bekeken op de JoVE-website.
<ol><li>Bereid een oplossing van fluorescerende microbeads in DMEM met een concentratie van 10 miljoen kralen/ml. De kralen worden gebruikt om gelverplaatsingen te volgen. Om deze concentratie te bereiken, combineert u 0,017 ml microbeadbouillonoplossing en 0,149 ml DMEM in een microcentrifugebuis.</li>
	<li>Soniceer deze suspensie gedurende 10 minuten om de kralen te verspreiden en de oplossing te homogeniseren.</li>
	<li>Fibrineoplossing — Meng in een c-tube van 15 ml 0,22 ml fibrinogeenbouillonoplossing met 0,44 ml HEPES-buffer van 20 mM. Voeg de 0,1667 ml DMEM toe met microbeads gemaakt in stap 3.1.</li>
	<li>Trombineoplossing — Meng in een afzonderlijke c-tube van 15 ml 0,0328 ml trombinebouillonoplossing, 0,131 ml 20 mM HEPES-buffer en 0,00246 ml 2 M CaCl2.</li>
	<li>Meng de trombineoplossing (stap 3.4) voorzichtig met de fibrinogeenoplossing (stap 3.3) door 5-10x op en neer te gaan totdat de oplossing gelijkmatig is verdeeld. Vermijd zoveel mogelijk bubbels te introduceren. Om de hoeveelheid geproduceerde bubbels te verminderen, moet u ervoor letten dat u de pipet niet volledig ontlaadt tijdens het mengen.</li>
	<li>De toevoeging van trombine zorgt ervoor dat de oplossing snel gel (~ 30 sec). Pipetteer de gemengde oplossing zo snel mogelijk op de afdekglas. Laat de gel polymeriseren bij RT.</li>
	<li>Sluit de bioreactor af, plaats de verwarmingsblokken en sluit de thermokoppels aan op de temperatuurregelaar. Incubeer de gel bij 37 °C gedurende 15-30 min.</li>
</ol>4. Cel Explant Voorbereiding
<ol><li>Verwijder het medium uit de T-75 kolf met de menselijke huidfibrosecellen.</li>
	<li>Spoel het oppervlak voorzichtig af met ongeveer 5 ml fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) om serumeiwitten te verwijderen. Voeg 1 ml trypsine-EDTA toe en incubeer gedurende 3 minuten, of totdat de cellen zijn opgetild.</li>
	<li>Nadat de cellen zijn opgetild, draait u de suspensie gedurende 5 minuten in een centrifuge van 200 x g naar beneden. Verwijder het supernatant en resuspend de pellet in een volume DMEM dat een uiteindelijke concentratie van 20 miljoen cellen/ml mogelijk maakt.</li>
	<li>Terwijl de cellen in de centrifuge naar beneden draaien, koppelt u de bioreactor los van de verwarmingsblokken en de thermokoppels. Breng de bioreactor over in een bioveiligheidskast en verwijder het deksel voorzichtig volgens de asceptische technieken.</li>
	<li>Maak explants door 0,3 μl van de celsuspensie op de gepolymeriseerde fibrinegel te pipetten, volgens het patroon op het stencil. Elke explant moet ongeveer 6.000 cellen bevatten. Zorg ervoor dat micropipettips met een laag volume worden gebruikt (0,1-10 μl).</li>
	<li>Laat cellen bezinken en hechten aan de fibrinematrix gedurende 1 uur bij 37 °C.</li>
	<li>Voeg met de bioreactor nog open ongeveer 5 ml DMEM aangevuld met 10% foetale runderserum (FBS), 1% penicilline-streptomycine, 0,1% amfotericine B en 10 mg/ml aprotinine rechtstreeks in de bioreactorkamer toe. DMEM is bicarbonaat gebufferd en vereist 5% CO2 om een neutrale pH te behouden. Aangezien de bioreactor niet wordt geleverd met CO2,conditioneer het medium in een incubator met 5% CO2 gedurende 2-3 uur voor gebruik. Aprotinine is een serine proteaseremmer die veel wordt gebruikt om de snelheid van fibrinedegradatie te verminderen20.</li>
	<li>Reseal de bioreactor. Gebruik een spuit om nog eens 5 ml CO2 geconditioneerd medium af te leveren via de prikkeldraadfitting op de inlaatpoort. Doseer het medium langzaam en zorg ervoor dat het hele volume van de bioreactorkamer gevuld is. Verwijder voorzichtig bellen die zich in de bioreactor vormen.</li>
	<li>Lever gedurende het hele experiment vers, 5% CO2-geconditioneerd medium aan de bioreactor om de pH te behouden, voedingsstoffen te leveren en afvalproducten te verwijderen. Stel een spuitpomp in met een spuit van 10 ml of 30 ml gevuld met 5% CO 2-geconditioneerd medium. Sluit de spuit rechtstreeks aan op de inlaatpoort op het deksel van de bioreactor met steriele slang met Luer-lock. Verwijder de mannelijke fitting en bevestig de slang aan de prikkeldraadfitting op de bioreactor (zie figuur 1C).</li>
	<li>Stel de perfusiesnelheid in op 0,01 ml/min. Sluit aangepaste stukken slang aan op beide uitlaatpoorten en plaats de uiteinden in een bekerglas van 100 ml om afval op te halen.</li>
	<li>Gebruik een labaansluiting om de hoogten van de inlaat- en uitlaatvoedingen zo in te stellen dat er geen drukverschil ontstaat in de bioreactor (zie ter referentie figuur 1D).</li>
	<li>Als er geen bioreactor beschikbaar is, bereid dan monsters in petrischalen met glazen bodem van 35 mm. Gebruik er een met een coverslipgrootte die is geoptimaliseerd voor de specifieke set doelstellingen die moet worden gebruikt. Monsters die in petrischalen worden bereid , moeten in een incubator bij 37 °C en 5% CO2worden bewaard . Opmerking: Polystyreen depolariseert licht en interfereert met DIC-beeldvorming, dus glazen bovenkanten moeten worden gebruikt als DIC-beeldvorming wordt uitgevoerd. Fasecontrast is een geschikte alternatieve beeldvormingsmodaliteit. Het overbrengen van gerechten tussen de incubator en de microscoop zal de registratie van afbeeldingen moeilijk maken. Als afbeeldingen niet correct zijn geregistreerd, is de stam berekend in sectie 6 niet nauwkeurig.</li>
</ol>5. Time-lapse Beeldvorming
<ol><li>Zodra het monster is voorbereid, moet u de bioreactor opnieuw insealeren, de verwarmingsblokken en de thermokoppels opnieuw aansluiten en de temperatuur van de bioreactor op 37 °C instellen.</li>
	<li>Plaats de bioreactor op het op de microscoop gemonteerde gemotoriseerde podium. Plaats de 20X DIC-doelstelling onder de weergavepoort. Een lagere vergrotingsdoelstelling is aanvaardbaar, vooral als er geen precisiemotorische fase beschikbaar is. Zorg ervoor dat de polarisator, analysator en prisma allemaal op hun plaats zitten. Als alternatief kunnen monsters ook worden afgebeeld met fasecontrast.</li>
	<li>Open de beeldvormingssoftware.</li>
	<li>Richt de doelstelling op het gebied tussen de drie explants.</li>
	<li>Sla de coördinaten (x, y en z) van deze locatie op in de imaging-software.</li>
	<li>Als u het hele gebied tussen en rond de explants wilt afbeelden, selecteert u de optie om een grote afbeelding te verkrijgen en de grootte van het gebied op te geven. Hierdoor kunnen meerdere afbeeldingen rond het opgegeven gebied worden veroverd en kan een betegelde afbeelding worden gemaakt die een groter gebied van het voor beeld vertegenwoordigt.</li>
	<li>Stel de belichtingstijd en lichtintensiteit in op de laagst mogelijke waarden om celdood veroorzaakt door fototoxiciteit te voorkomen, terwijl het nog steeds voldoende resolutie biedt om onderscheid te maken tussen cellen, microbeads en fibrinevezels.</li>
</ol>6. Strain Volgen
Voor meer informatie en instructies over de gebruikte strain tracking software (Figuur 2) zie Raghupathy et al. 21 Het algoritme is een aangepaste MATLAB-code die kan worden gedownload van <a href="http://www.license.umn.edu/default.aspx">http://www.license.umn.edu/default.aspx</a>. Merk op dat DIC-afbeeldingen vaak voldoende textuur hebben voor het volgen van de spanning. De microbeads zijn inbegrepen om te dienen als een controle op de berekende stamvelden. Als strain tracking wordt gedaan, is het van cruciaal belang dat de verkregen beelden op exact dezelfde locatie worden gemaakt, zodat de beelden worden geregistreerd. Niet-geregistreerde afbeeldingen produceren valse soorten.

<ol><li>Grinnell, F., Petroll WM, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+motility+and+mechanics+in+three-dimensional+collagen+matrices%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Cell.+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell motility and mechanics in three-dimensional collagen matrices.</a> Annu. Rev. Cell. Dev. Biol. 26, 335-361 (2001).</li>
<li>Sander, E. A., Barocas, V. H. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSander%2C+EA+%22Biomimetic+collagen+tissues%3A+collagenous+tissue+engineering+and+other+applications.+In%3A+Collagen%3A+Structure+and+Mechanics%22">Biomimetic collagen tissues: collagenous tissue engineering and other applications. In: Collagen: Structure and Mechanics</a>. , Springer. New York. (2008).</li>
<li>Pedersen JA,, Swartz MA, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanobiology+in+the+third+dimension%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Biomed.+Eng%22%5BJournal%5D)">Mechanobiology in the third dimension.</a> Ann. Biomed. Eng. 33 (11), 1469-1490 (2005).</li>
<li>Bell, E., Ivarsson, B., Merrill, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+a+tissue-like+structure+by+contraction+of+collagen+lattices+by+human+fibroblasts+of+different+proliferative+potential+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Production of a tissue-like structure by contraction of collagen lattices by human fibroblasts of different proliferative potential in vitro.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 76 (3), 1274 (1979).</li>
<li>Guidry, C., Grinnell, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+on+the+mechanism+of+hydrated+collagen+gel+reorganization+by+human+skin+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Sci%22%5BJournal%5D)">Studies on the mechanism of hydrated collagen gel reorganization by human skin fibroblasts.</a> J. Cell. Sci. 79 (1), 67-81 (1985).</li>
<li>Fluck, J., Querfeld, C., Cremer, A., Niland, S., Krieg, T., Sollberg, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normal+human+primary+fibroblasts+undergo+apoptosis+in+three-dimensional+contractile+collagen+gels%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Invest.+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Normal human primary fibroblasts undergo apoptosis in three-dimensional contractile collagen gels.</a> J. Invest. Dermatol. 110 (2), 153-157 (1998).</li>
<li>Rosenfeldt, H., Grinnell, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblast+quiescence+and+the+disruption+of+ERK+signaling+in+mechanically+unloaded+collagen+matrices%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Fibroblast quiescence and the disruption of ERK signaling in mechanically unloaded collagen matrices.</a> J. Biol. Chem. 275 (5), 3088-3092 (2000).</li>
<li>Nakagawa, S., Pawelek, P., Grinnell, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+culture+of+fibroblasts+in+contracted+collagen+gels%3A+Effects+on+cell+growth+and+biosynthetic+activity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Invest.+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Long-term culture of fibroblasts in contracted collagen gels: Effects on cell growth and biosynthetic activity.</a> J. Invest. Dermatol. 93 (6), 792-798 (1989).</li>
<li>Harris, A. K., Stopak, D., Wild, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblast+traction+as+a+mechanism+for+collagen+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Fibroblast traction as a mechanism for collagen morphogenesis.</a> Nature. 290, 249-251 (1981).</li>
<li>Stopak, D., Harris AK, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Connective+tissue+morphogenesis+by+fibroblast+traction%3A+I.+tissue+culture+observations%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Connective tissue morphogenesis by fibroblast traction: I. tissue culture observations.</a> Dev. Biol. 90 (2), 383-398 (1982).</li>
<li>Sawhney, R. K., Howard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Slow+local+movements+of+collagen+fibers+by+fibroblasts+drive+the+rapid+global+self-organization+of+collagen+gels%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Slow local movements of collagen fibers by fibroblasts drive the rapid global self-organization of collagen gels.</a> J. Cell. Biol. 157 (6), 1083-1092 (2002).</li>
<li>Provenzano, P. P., Inman, D. R., Eliceiri, K. W., Trier, S. M., Keely, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contact+guidance+mediated+three-dimensional+cell+migration+is+regulated+by+rho%2FROCK-dependent+matrix+reorganization%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Contact guidance mediated three-dimensional cell migration is regulated by rho/ROCK-dependent matrix reorganization.</a> Biophys. J. 95 (11), 5374 (2008).</li>
<li>Sander, E., Barocas, V., Tranquillo, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initial+fiber+alignment+pattern+alters+extracellular+matrix+synthesis+in+fibroblast-populated+fibrin+gel+cruciforms+and+correlates+with+predicted+tension%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Biomed.+Eng%22%5BJournal%5D)">Initial fiber alignment pattern alters extracellular matrix synthesis in fibroblast-populated fibrin gel cruciforms and correlates with predicted tension.</a> Ann. Biomed. Eng. 39 (2), 714-729 (2011).</li>
<li>Barocas, V. H., Tranquillo, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+anisotropic+biphasic+theory+of+tissue-equivalent+mechanics%3A+the+interplay+among+cell+traction%2C+fibrillar+network+deformation%2C+fibril+alignment%2C+and+cell+contact+guidance%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomech.+Eng%22%5BJournal%5D)">An anisotropic biphasic theory of tissue-equivalent mechanics: the interplay among cell traction, fibrillar network deformation, fibril alignment, and cell contact guidance.</a> J. Biomech. Eng. 119, 137-146 (1997).</li>
<li>Neidert, M. R., Tranquillo, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-engineered+valves+with+commissural+alignment%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng%22%5BJournal%5D)">Tissue-engineered valves with commissural alignment.</a> Tissue Eng. 12 (4), 891-903 (2006).</li>
<li>Robinson PS,, Robinson PS, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Planar+biaxial+behavior+of+fibrin-based+tissue-engineered+heart+valve+leaflets%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+Part+A%22%5BJournal%5D)">Planar biaxial behavior of fibrin-based tissue-engineered heart valve leaflets.</a> Tissue Eng. Part A. 15 (10), 2763-2772 (2009).</li>
<li>Grassl, E., Oegema, T., Tranquillo, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibrin+as+an+alternative+biopolymer+to+type+I+collagen+for+the+fabrication+of+a+media+equivalent%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Mater.+Res%22%5BJournal%5D)">Fibrin as an alternative biopolymer to type I collagen for the fabrication of a media equivalent.</a> J. Biomed. Mater. Res. 60 (4), 607-612 (2002).</li>
<li>Paten, J. A., Zareian, R., Saeidi, N., Melotti, S. A., Ruberti, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+performance+of+an+optically+accessible%2C+low-volume%2C+mechanobioreactor+for+long-term+study+of+living+constructs%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+Part+C+Methods%22%5BJournal%5D)">Design and performance of an optically accessible, low-volume, mechanobioreactor for long-term study of living constructs.</a> Tissue Eng. Part C Methods. 17 (7), 775-788 (2001).</li>
<li>Ye KY,, Sulli van KE,, Black LD, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Encapsulation+of+cardiomyocytes+in+a+fibrin+hydrogel+for+cardiac+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Encapsulation of cardiomyocytes in a fibrin hydrogel for cardiac tissue engineering.</a> J. Vis. Exp. (55), (2011).</li>
<li>Ahmann, K. A., Weinbaum, J. S., Johnson, S. L., Tranquillo, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibrin+degradation+enhances+vascular+smooth+muscle+cell+proliferation+and+matrix+deposition+in+fibrin-based+tissue+constructs+fabricated+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+Part+A%22%5BJournal%5D)">Fibrin degradation enhances vascular smooth muscle cell proliferation and matrix deposition in fibrin-based tissue constructs fabricated in vitro.</a> Tissue Eng. Part A. 16 (10), 3261-3270 (2010).</li>
<li>Raghupathy, R., Witzenburg, C., Lake, S. P., Sander, E. A., Barocas, V. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+regional+mechanical+anisotropy+in+soft+tissue+analogs%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomech.+Eng%22%5BJournal%5D)">Identification of regional mechanical anisotropy in soft tissue analogs.</a> J. Biomech. Eng. 133, (2011).</li>
<li>Robinson, P. S., Johnson, S. L., Evans, M. C., Barocas, V. H., Tranquillo, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+tissue-engineered+valves+from+cell-remodeled+fibrin+with+commissural+alignment+of+cell-produced+collagen%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+Part+A%22%5BJournal%5D)">Functional tissue-engineered valves from cell-remodeled fibrin with commissural alignment of cell-produced collagen.</a> Tissue Eng. Part A. 14 (1), 83-95 (2008).</li>
<li>Gabbiani, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+myofibroblast+in+wound+healing+and+fibrocontractive+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">The myofibroblast in wound healing and fibrocontractive diseases.</a> J. Pathol. 200 (4), 500-503 (2003).</li>
<li>PaszeK, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tensional+homeostasis+and+the+malignant+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Tensional homeostasis and the malignant phenotype.</a> Cancer Cell. 8 (3), 241-254 (2005).</li>
<li>Grinnell, F., Rocha L, B., Iucu, C., Rhee, S., Jiang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nested+collagen+matrices%3A+A+new+model+to+study+migration+of+human+fibroblast+populations+in+three+dimensions%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Cell.+Res%22%5BJournal%5D)">Nested collagen matrices: A new model to study migration of human fibroblast populations in three dimensions.</a> Exp. Cell. Res. 312 (1), 86-94 (2006).</li>
<li>Miron-Mendoza, M., Seemann, J., Grinnell, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+differential+regulation+of+cell+motile+activity+through+matrix+stiffness+and+porosity+in+three+dimensional+collagen+matrices%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The differential regulation of cell motile activity through matrix stiffness and porosity in three dimensional collagen matrices.</a> Biomaterials. 31 (25), 6425-6435 (2010).</li>
<li>Wakatsuki, T., Kolodney MS,, Zahalak GI,, Elson EL, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+mechanics+studied+by+a+reconstituted+model+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Cell mechanics studied by a reconstituted model tissue.</a> Biophys. J. 79 (5), 2353-2368 (2000).</li>
<li>De Jesus, A., Aghvami, M., Sander, E. Fibroblast-mediated fiber realignment in fibrin gels. ASME Summer Bioengineering Conference, 2013 Jun 26-29, Sunriver, OR, , (2013).</li>
<li>Aghvami, M., Barocas, V. H., Sander, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiscale+mechanical+simulations+of+cell+compacted+collagen+gels%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomech.+Eng%22%5BJournal%5D)">Multiscale mechanical simulations of cell compacted collagen gels.</a> J. Biomech. Eng. 135, (2013).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten aangegeven.

Dit protocol is ontwikkeld met het oog op het observeren en kwantificeren van de mechanica die betrokken is bij celgemedieerde ECM-remodellering. Dergelijke processen liggen ten grondslag aan een aantal biologische verschijnselen en hebben belangrijke implicaties voor technische weefsels2,22, waardoor litteken1,23wordt verminderd , en inzicht in pathologische weefselremodellering12,24. Het gebruik van time-lapse DIC-microscopie stelt iemand in staat om de verplaatsing en uitlijning van fi...

Een belangrijk hulpmiddel voor het bestuderen van cel-matrix interacties is de cel bevolkte collageen gel1,2. De gel biedt een 3D-omgeving die dichter bij het in vivo karakter van het weefsel ligt en beter geschikt is voor het begrijpen van celgedrag dan wordt aangeboden door traditionele 2D-culturen3. Vroege studies waarin fibroblasten homogeen werden verdeeld in een collageengel, ontdekten dat de cellen de collageenvezels snel consolideren en de gelverdichten 4,5. De contractiele fibroblasten in vrij zwevende gels gaan dan over in een rustgevende toestand kort nadat de gel volledig verdichting1,6,7heeft bereikt. De fibroblasten in gels die aan de grenzen zijn beperkt, blijven in een actieve, synthetische toestand8 en ze genereren vezeluitlijning op een manier die afhankelijk is van gelgeometrie en externe beperkingen5,9. Verschillen in celactiviteit lijken het gevolg te zijn van de interne spanning (of het ontbreken daarvan) die zich ontwikkelt naarmate de cellen tractiekrachten uitoefenen via integrinen op de collageenvezels in de gel.
Een variant van deze techniek omvat het plaatsen van fibroblast explants(d.w.z. klonten cellen) op een afstand van elkaar binnen een collageengel en het observeren van celmatrixinteracties en de geleidelijke ontwikkeling van vezeluitlijning tussen de explants (soms ligamentachtige banden genoemd)10-12. Het belangrijkste voordeel van het explantsysteem is dat het iemand in staat stelt om de cellen in eenvoudige geometrische patronen te rangschikken, waardoor het gemakkelijker wordt om de mechanismen die ten grondslag liggen aan celgestuurde vezelherschikking te visualiseren en te onderzoeken. Deze uitlijningspatronen - die voornamelijk afhankelijk zijn van het samenspel tussen celtractiekrachten, cel ruimtelijke verdeling, gelgeometrie en de mechanische beperkingen op de gel - zijn belangrijk om te begrijpen omdat ze een centrale rol spelen in de wereldwijde weefselorganisatie, mechanische functie en lokale mechanische omgeving13.
Op het gebied van weefseltechniek omvat één strategie voor het produceren van mechanisch functionele, gemanipuleerde weefsels het controleren van het vezeluitlijningspatroon dat zich ontwikkelt uit celverdichting, zodat het gemanipuleerde weefsel vezeluitlijning bezit die die van het inheemse weefselnabootst 14,15. Een dergelijke uitlijning wordt verondersteld noodzakelijk voor gemanipuleerde weefsels om het complexe mechanische gedrag van inheemse weefsels te repliceren. Een wijziging van deze strategie is om de collageengel te vervangen door een fibrinegel16. De fibrinegel ontwikkelt een vergelijkbaar uitlijningspatroon als een collageengel tijdens verdichting. Na verloop van tijd wordt de fibrine afgebroken en vervangen door celgesynthetiseerde ECM die het initiële fibrinevezeluitlijningspatroon volgt. De resulterende ontworpen constructie heeft aanzienlijk verbeterde mechanische eigenschappen in vergelijking met collageengel afgeleide constructies17.
Het uitlijningsproces en de daaropvolgende renovatiegebeurtenissen in fibrinegels verlopen op een gecompliceerde en slecht begrepen manier. Om deze interacties en hun effect op celgedrag en ECM-remodellering beter te karakteriseren, hebben we een procedure ontwikkeld die is gebaseerd op de explantmethode. Bij deze methode worden fibroblast explants op een fibrinegel geplaatst in verschillende geometrische patronen. De gels worden onderhouden in een milieugecontroleerde, op een microscoop gemonteerde bioreactor18,en het proces van verdichting en vezelherschikking wordt bewaakt met time-lapse differentiële interferentiecontrast (DIC) microscopie. Verplaatsingsvelden worden gekwantificeerd met aangepaste algoritmen. De gegevens die uit deze experimenten worden verkregen, hebben uiteenlopende implicaties voor een aantal processen, waaronder het optimaliseren van weefselengineeringsstrategieën, het verbeteren van wondgenezing en het behandelen van pathologische weefselremodellering.

<table><tbody><tr><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8630</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4648</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gibco</td><td>11965-092</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2942</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sigma-Aldrich</td><td>H0887</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sigma-Aldrich</td><td>223506</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gibco</td><td>25200-056</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Invitrogen</td><td>3000</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lonza</td><td>DE14-701F</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Molecular Probes</td><td>F8858</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GIBCO</td><td>A10483-01</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GIBCO</td><td>11430-030</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fisher-Scientific</td><td>SS264-1</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3428-25MG</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Biotense Bioreactor</td><td>ADMET</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ti-Eclipe Microscope</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td># 0 35 mm Glass Bottom Petri Dish</td><td>MatTek</td><td>P35G-0-20-C</td><td></td></tr><tr><td># 0 35 mm Glass Top Petri Dish</td><td>MatTek</td><td>P35GTOP-0-20-C</td><td></td></tr><tr><td>Plastic Luer fittings, PVC tubing with Luer ends</td><td>Cole-Parmer</td><td>30600-65</td><td></td></tr></tbody></table>

observeren en kwantificeren van fibroblast-gemedieerde fibrin gel compaction

Observing and Quantifying Fibroblast-mediated Fibrin Gel Compaction

Cellen ingebed in collageen en fibrinegels hechten en oefenen tractiekrachten uit op de vezels van de gel. Deze krachten kunnen leiden tot lokale en wereldwijde reorganisatie en herschikking van de gelmicrostructuur. Dit proces verloopt op een complexe manier die deels afhankelijk is van het samenspel tussen de locatie van de cellen, de geometrie van de gel en de mechanische beperkingen op de gel. Om beter te begrijpen hoe deze variabelen globale vezeluitlijningspatronen produceren, gebruiken we time-lapse differentiële interferentiecontrast (DIC) microscopie in combinatie met een milieugestuurde bioreactor om het verdichtingsproces tussen geometrisch verdeelde explants (clusters van fibroblasten) te observeren. De afbeeldingen worden vervolgens geanalyseerd met een aangepast beeldverwerkingsalgoritme om kaarten van de stam te verkrijgen. De informatie verkregen uit deze techniek kan worden gebruikt om de mechanobiologie van verschillende celmatrixinteracties te onderzoeken, wat belangrijke implicaties heeft voor het begrijpen van processen in wondgenezing, ziekteontwikkeling en weefseltechnologietoepassingen.

Weefselremodellering is een complex proces dat deels wordt aangedreven door wederzijdse fysieke interacties tussen cellen en de omringende matrix. De cellen reorganiseren de omringende vezels en genereren spanning in het glasvezelnetwerk. De uitlijning van vezels en mechanische omgeving op zijn beurt controleert celgedrag, zodat zowel cellen als matrix wereldwijd reorganiseren om geremodelleerd weefsel te produceren. In dit experiment begonnen de cellen van de explants, aanvankelijk rond in de morfologie, zich uit te bre...

Time-lapse microscopie- en beeldverwerkingstechnieken werden gebruikt om fibroblastgemedieerde gelverdichting en fibrinevezelherschikking in een milieuvriendelijke bioreactor gedurende een periode van 48 uur te observeren en te analyseren.

Observeren en kwantificeren van fibroblast-gemedieerde Fibrin Gel Compaction

Cells embedded in collagen and fibrin gels attach and exert traction forces on the fibers of the gel. These forces can lead to local and global ...

Het algemene doel van deze procedure is het observeren en analyseren van het effect van cel-matrixinteracties op de heroriëntatie van vezels en matrix-remodelleringactiviteiten in een fibrinegelsysteem. Dit wordt bereikt door eerst een driedimensionale fibrinegel met microbeads te polymeriseren op dekglas in een bioreactor met gecontroleerde omgevingsfactoren. De tweede stap is het bereiden van een sterk geconcentreerde celsuspensie die wordt gebruikt om clusters fibroblasten of X-explantaten in geometrische patronen op het oppervlak van de gel te positioneren.Vervolgens wordt het monster gedurende 48 uur elke 15 minuten gefotografeerd met behulp van differentieel-interferentiecontrastmicroscopie. De laatste stap is het meten van de mate van fibrinereorganisatie en -remodellering in de vorm van rek in verschillende regio's van de gel met behulp van digitale beeldcorrelatie. Uiteindelijk maakt dit explantaatsysteem het mogelijk om de cellen in eenvoudige geometrische patronen te rangschikken, waardoor het gemakkelijker is om de mechanismen die ten grondslag liggen aan celgestuurde matrixremodellering en vezelheroriëntatie te visualiseren en te onderzoeken.Deze methode kan kernvragen binnen het veld van de mechanische biologie beantwoorden, zoals wat de effecten zijn van zeer specifieke spatiale en temporele mechanische signalen op het celgedrag en de resulterende veranderingen die deze teweegbrengen in de omringende weefselmatrix. In deze procedure zal Arabic de Jesus, een promovendus uit mijn laboratorium, de demonstratie verzorgen. Los fibrinogeen gedurende de nacht voorzichtig op in voorverwarmde saline bij 37 °C om een voorraadoplossing van 33,3 mg/mL te maken. Bereid een sjabloon voor op het profiel om de locatie van elk x-explantaat uit te zetten volgens de gewenste geometrische indeling.Elk stip ongeveer één tot twee millimeter uit elkaar. Deze afstand komt overeen met een ideale spatiëring voor het genereren van vezeluitlijning tussen explantaten. Reinig vervolgens alle componenten van de bioreactor grondig met 70% ethanol en plaats de gereinigde componenten gedurende twee tot drie uur onder de UV-lamp van een weefselkweekkast voorafgaand aan de incubatie.Nadat de componenten van de bioreactor zijn gesteriliseerd, bevestigt u met tape de sjabloon onder het gebied van het dekglas met een diameter van 60 millimeter waar het monster zal worden geprepareerd. Bereid vervolgens de microbead-suspensie voor, gevolgd door het fibrinogeen en de trombine. Voor de voorraadoplossingen voegt u 0,017 milliliter van de Microbead-voorraadoplossing en 0,149 milliliter DMEM samen in een microcentrifugebuis om een concentratie van 10 miljoen beads per milliliter te bereiken.Sonicate de suspensie vervolgens 10 minuten om de kraaltjes te dispergeren en de oplossing te homogeniseren. Voeg 0,22 milliliter van de fibrinogeen-stamoplossing toe aan 0,44 milliliter 20 millimolair HEPES-buffer en 0,1667 milliliter van de microbead-oplossing in een 15 milliliter centrifugebuis. Meng de componenten voorzichtig en plaats de buis vervolgens op ijs in een aparte 15 milliliter centrifugebuis.Samen mengen: 32,8 µL trombine opgelost in zoutoplossing tegen 25 units per milliliter, 131 µL 20 millimolaire HEPES-buffer en 2,46 µL twee molar calciumchloride.Meng vervolgens de bereide trombine- en fibrinogeenoplossingen zorgvuldig door vijf tot 10 keer op en neer te pipetteren totdat de oplossing gelijkmatig is verdeeld. Probeer het ontstaan van bellen in het mengsel te minimaliseren door de pipet tijdens het mengen niet volledig leeg te maken. Pipetteer de gemengde oplossing zo snel mogelijk in PDMS-vormpjes van acht millimeter vierkant op dekglas en laat de gel polymeriseren bij kamertemperatuur.De toevoeging van trombine zal ervoor zorgen dat de oplossing na polymerisatie in ongeveer 30 seconden snel gelt; sluit de bioreactor af en bereid de celexplantaten voor om te beginnen. Oogst 70 tot 90% confluente humane dermale fibroblastcellen uit een T 75-fles met trypsine en centrifugeer deze bij 200 ×g gedurende vijf minuten. Plaats de bioreactor in een veiligheidskast en verwijder voorzichtig het deksel onder aseptische omstandigheden. Aspireer vervolgens het medium en resuspendeer de celpellet tot een uiteindelijke concentratie van 20 miljoen cellen per milliliter in DMEM met 10% FBS.Maak vervolgens explantaten door cellen in een micropipet te laden en 0,3 µL van de celsuspensie in de gepolymeriseerde fibrinegel te injecteren. Volg hierbij het patroon op de sjabloon, waarbij elk explantaat ongeveer 6.000 cellen moet bevatten. Zodra de explantaten op de gel zijn geplaatst, wordt de bioreactor afgesloten.Plaats vervolgens de verwarmingsblokken en sluit de thermokoppels aan op de temperatuurregelaar. Stel de temperatuurregelaar in op 37 °C en incubeer de gels gedurende één uur zodat de cellen kunnen bezinken en zich kunnen hechten aan de fibrine-matrix. Voeg daarna ongeveer 5 mL DMEM, dat twee tot drie uur is geconditioneerd met 5% CO2 en is aangevuld met 10% foetaal runderserum, 1% penicilline-streptomycine, 0,1% amfotericine B en 10 µg/mL aprotinine, direct toe aan de bioreactorkamer.Sluit de bioreactor vervolgens weer af. Gebruik een injectiespuit om de extra vijf milliliter met koolstofdioxide geconditioneerd medium via de gekartelde fitting op de inlaatpoort toe te dienen om de bioreactor volledig te vullen; verwijder voorzichtig alle bellen die ontstaan. Stel een spuitenpomp in met een injectiespuit van 10 milliliter of 30 milliliter gevuld met extra 5% koolstofdioxide geconditioneerd medium. Verbind de spuit direct met de inlaatpoort op het deksel van de bioreactor met steriele slangen voorzien van een luer-lock verbinding.Stel de perfusiesnelheid op de spuitenpomp in op 0,01 milliliters per minuut. Sluit vervolgens aangepaste stukken slang aan op beide uitlaatpoorten en plaats de uiteinden in een bekerglas van 100 milliliter. Gebruik een laboratoriumkrik om de hoogte van de inlaat- en uitlaatvoedingen in te stellen, zodat er geen drukverschil ontstaat in de toevoer van de bioreactor, om het afval op te vangen.Voeg gedurende het experiment vers medium geconditioneerd met 5% carbon dioxide toe aan de bioreactor. Om de pH te handhaven, voedingsstoffen toe te dienen en afvalproducten te verwijderen, is een spuit van 10 milliliter gevuld met medium ongeveer 16 uur lang voldoende. Plaats het 20 XDIC-objectief onder het kijkvenster van de microscoop en zorg ervoor dat de polarisator, analyzer en het prisma allemaal correct zijn geplaatst.Open vervolgens de imagingsoftware. Stel de focus van het objectief in op het gebied tussen de drie x explan en sla de X-, Y- en Z-coördinaten van deze locatie op in de imagingsoftware. Om het gehele gebied tussen en rondom de x explan af te beelden, selecteert u de optie om een grote afbeelding te verkrijgen en specificeert u de grootte van het gebied.Hiermee kunnen meerdere beelden rond het gespecificeerde gebied worden verkregen om een grote tegelafbeelding te creëren; stel de lichtintensiteit en de belichtingstijd in op de laagst mogelijke waarden. Dit helpt om celdood door fototoxiciteit te voorkomen, terwijl er toch voldoende resolutie behouden blijft om onderscheid te kunnen maken tussen cellen, microbeads en fibrinevezels. Let op dat in dit specifieke experiment de fibrinevezels niet zichtbaar zijn vanwege de hoge dichtheid van lichtverstrooiende beads in de gel; verminder de bead-dichtheid of de geldikte om fibrinevezels waar te kunnen nemen.Begin vervolgens met het volgen van de rek. Maak eerst aangepaste MATLAB-code aan of download deze, en registreer vervolgens de beelden door microbeads in de gehele gel als referentiepunten te gebruiken. De registratie van het beeld zorgt ervoor dat de verkregen beelden telkens op exact dezelfde locatie worden genomen.Vezelheroriëntatie werd tussen de explanen waargenomen door elke 15 minuten getegelde beelden vast te leggen. Over een periode van 48 uur werden individuele regio's uit de getegelde beelden geëxtraheerd en geanalyseerd met het strain-tracking-algoritme. Om lokale rek te meten op basis van de verplaatsing van microbeads, tonen contourplots de distributie van de maximale hoofdrekt in het gebied van vezelheroriëntatie dat overeenkomt met de strap.Zodra deze techniek onder de knie is, kan deze bij een correcte uitvoering in ongeveer drie tot vier uur worden voltooid. Na deze procedure kunnen andere methoden, zoals fluorescentielabeling van collageen en cytoskeletale eiwitten alsook kwantificering van celmigratie, worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals welke mechanobiologische routes betrokken zijn bij weefselremodellering en hoe deze processen worden gemoduleerd door diverse biochemische stoffen.

observing-and-quantifying-fibroblast-mediated-fibrin-gel-compaction

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

Deze video toont het protocol van een in vitro angiogenese test die recapituleert verschillende stadia van angiogenese. Time-lapse beelden van kiemen, lumen vorming, vertakking en anastomose - belangrijkste kenmerken van angiogenese - worden weergegeven.

Geoptimaliseerde fibrinegel Bead Assay voor de Studie van Angiogenese

In deze video, tonen we de experimentele technieken die gebruikt worden om compliant, extracellulaire matrix (ECM) gecoate substraten geschikt voor celcultuur fabriceren, en die vatbaar zijn voor trekkracht microscopie en het observeren van de gevolgen van ECM stijfheid op cel gedrag.

Voorbereiding van de Klacht Matrices voor het kwantificeren van Cellular Contractie

This video showcases quantitative time-lapse microscopy for evaluating extracellular matrix stiffness-dependent Listeria monocytogenes dissemination through endothelial cells. A softer hydrogel facilitates faster bacterial dissemination through endothelial cells compared to stiffer counterparts, highlighting the influence of matrix stiffness on bacterial dissemination.

Quantitative Time-Lapse Microscopy for Assessing Extracellular Matrix Stiffness-Dependent Bacterial Dissemination

Dit model systeem gaat uit van een myofibroblast-bevolkte fibrine gel die kan worden gebruikt om endogene collageen (her) inrichting real-time op een niet-destructieve manier te bestuderen. Het modelsysteem is zeer instelbaar, als het kan worden gebruikt met verschillende bronnen van cellen, medium additieven, en kan gemakkelijk worden aangepast aan specifieke behoeften.

Techniek Fibrine-based Tissue constructen van myofibroblasten en Application of Constraints en Zeef to Cell en collageen (Re) organisatie Induce

In dit manuscript worden experimentele technieken gepresenteerd, inclusief bloedvoorbereiding, confocale microscopie en lyse-snelheidsanalyse, om de morfologische verschillen tussen normale en abnormale stolselstructuren als gevolg van ziektoestanden te onderzoeken.

Experimentele en Imaging technieken voor de behandeling fibrinestolsel Structuren in normale en zieke Staten

Hier presenteren we een protocol om te bestuderen van de pathofysiologie van proliferatieve diabetische retinopathie met behulp van patiënt-afgeleide, operatief verwijderd, fibrovascular weefsels voor driedimensionale inheemse karakterisering en ex vivo weefselkweek. Dit ex vivo cultuur model is ook vatbaar voor testen of ontwikkelen van nieuwe behandelingen.

Een Ex Vivo weefselkweek Model voor Fibrovascular complicaties in proliferatieve diabetische retinopathie

Het verkrijgen van een zuivere populatie van fibroblasten is cruciaal voor het bestuderen van hun rol in wondherstel en fibrose. Hier beschreven is een gedetailleerde methode om fibroblasten en myofibroblasten te isoleren van niet gewonde en gewonde muisharten, gevolgd door karakterisering van hun zuiverheid en functionaliteit door immunofluorescentie, RTPCR, fluorescentie-ondersteunde cel sorteren, en collageen gel contractie.

Isolatie en karakterisering van volwassen cardiale fibroblasten en myofibroblasten

De gepresenteerde methode omvat het uniaxiaal uitrekken van 3D zachte hydrogels ingebed in siliconenrubber terwijl live confocale microscopie mogelijk is. Karakterisering van de externe en interne hydrogelstammen en vezeluitlijning worden gedemonstreerd. Het ontwikkelde apparaat en protocol kunnen de reactie van cellen op verschillende stamregimes beoordelen.

Gecontroleerde stam van 3D-hydrogels onder live microscopiebeeldvorming

Hier wordt een protocol gepresenteerd om gemanipuleerde bindweefsels te genereren voor een parallelle kweek van 48 weefsels in een multi-well plaat met dubbele polen, geschikt voor mechanistische studies, ziektemodellering en screeningstoepassingen. Het protocol is compatibel met fibroblasten van verschillende organen en soorten en wordt hier geïllustreerd met menselijke primaire cardiale fibroblasten.

Fibroblast afgeleide human engineered bindweefsel voor screeningstoepassingen

Dit artikel beschrijft hoe je fototunable hydrogels in 3D bioprint om extracellulaire matrixverstijving en fibroblastactivering te bestuderen.

3D-bioprinting Phototunable Hydrogels om de activering van fibroblasten te bestuderen

Mechanisch geïsoleerde stromale vasculaire fractie (SVF) in combinatie met een fibrine-hydrogel biedt een gemakkelijke en efficiënte drager voor levensvatbare, van vet afgeleide stromale cellen voor verschillende indicaties, waaronder weefselmanipulatie en/of wondgenezingsdoeleinden. Hier presenteren we de bereiding van een mechanisch SVF (mSVF)-fibrine hydrogelconstruct voor translationeel onderzoek en klinische toepassing.

De combinatie van mechanisch geïsoleerde stromale vasculaire fractie en fibrinehydrogel: een verwerkingsprotocol

Leer fibroblast-gemedieerde fibrinegelcompactie analyseren met tijdopnamemicroscopie en digitale beeldcorrelatie. Deze methode onderzoekt cel-matrixinteracties en matrixhermodellering gedurende 48 uur.

Observeren en kwantificeren van fibroblast-gemedieerde Fibrin Gel Compaction

Meer video's verkennen