Name: Kwantitatieve beoordeling van Human migratie van neutrofielen door een Gekweekte blaas epitheel (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-07T19:40:00.000+00:00
Duration: 11 min 20 s
Description: Leer hoe je de transuroepitheliale neutrofielenmigratie-assay gebruikt om menselijke neutrofielenmigratie over blaasepitheel te kwantificeren tijdens bacteriële infectie. Deze methode helpt onderzoekers het immuunrespons te bestuderen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door de National Institutes of Health (NIH) verleent R01-DK080752 en P50-DK064540. Wij danken J. Loughman voor haar inspanningen bij de vaststelling van deze test.

1. Het kweken van 5637 Blaas epitheelcellen Voer de volgende stappen in een laminaire stroming weefselkweek kap bereid met UV-bestraling en afgeveegd met 70% ethanol. <ol><li> Bereid RPMI-1640 medium dat 10% foetaal runderserum (FBS) [genoemd RPMI +], filter gesteriliseerd met een 0,22 urn poriegrootte en opwarmen tot 37 ° C in een waterbad. </li><li> Ontdooi een Cryovial van 5637 cellen (American Type Culture Collection HTB-9, afgeleid van blaascarcinoom) in een 37 ° C waterbad. Snel overbrengen van de ontdooide cellen om een 75 cm 2 weefselkweek kolf met 20 ml RPMI +. </li><li> Incubeer de kolf bij 37 ° C in een vochtige atmosfeer met 5% CO2 totdat de cellen ongeveer 95% confluent (~ 6 x 10 6 cellen per kolf), ongeveer 4 dagen. </li><li> Om de 5637 cellen subcultuur: <ol><li> Verwijder het medium uit de kolf. Was de cellen met 10 ml Dulbecco&#39;s fosfaat-gebufferde Saline (DPBS) bij kamertemperatuur. </li><li> Voeg 6 ml warm (37 ° C) 0,05% trypsine, 0,02% EDTA-oplossing aan de kolf en incubeer bij 37 ° C met 5% CO2 gedurende 15 minuten. </li><li> Breng de cellen om een ​​15 ml conische buis en pellet door centrifugeren bij 300 g gedurende 5 minuten. Verwijder de trypsine / EDTA-oplossing. </li><li> Resuspendeer de cellen in 6 ml RPMI + (10 6 cellen / ml) en breng 1 ml (10 6 cellen) in nieuw 75 cm2 kolf met 20 ml RPMI +. </li></ol></li><li> Herhaal stap 1.4 tot cellen subcultuur om de 4 dagen of wanneer de cellen te bereiken 95% samenvloeiing. </li></ol> 2. Zaaien en Growing 5637 Cellen op Permeable Supports Voer de volgende stappen in een weefselkweek kap onder aseptische omstandigheden. Voor optimale resultaten gebruikt u 5.637 cellen die minder dan 10 subculturen hebben ondergaan. <ol><li> Met behulp van een steriel pincet, keren de doorlaatbare dragers in een steriele 25 mm diep weefselkweek schotel. </li><li&gt; Trypsinize een 75 cm 2 kolf van 5.637 cellen bij 95% samenvloeiing volgens stappen 1.4.1-1.4.3. </li><li> Met een 1.000 III pipet voorzichtig resuspendeer de cellen in ~ 2 ml RPMI + tot een concentratie van 3 x 10 6 cellen / ml, bepaald met celtelling behulp van een hemocytometer. </li><li> Breng 50 pl van de celsuspensie (1,5 x 10 5 cellen) aan elke doorlaatbare ondersteunen zonder het membraan. Plaats de deksel op de schaal en zorgvuldig plaats de schaal bij 37 ° C met 5% CO2 gedurende ten hoogste 16 uur. </li><li> Met behulp van een steriel pincet, rechts de doorlaatbare dragers in een 24-wells plaat met 0,6 ml RPMI + per putje. Voeg 0,1 ml RPMI + het bovenste reservoir van elke doorlaatbare drager. Incubeer bij 37 ° C met 5% CO2. </li><li> Vervang het medium om de 2 dagen. Eerste, aspireren medium uit het bovenste reservoir gevolgd door de onderste reservoir, en breng verse RPMI + in omgekeerde volgorde, naar het onderste reservoir (0,6 ml) en vervolgens de bovenste reservoir (0,1 ml). </li><li> Zeven dagen na zaaien het permeabele steunen met 5637 cellen beoordelen samenvloeiing van de cellen. Vul het bovenste reservoir met RPMI + (~ 0,35 ml). De cellen voldoende confluent wanneer het medium niet in evenwicht tussen de bovenste en onderste reservoirs. </li></ol> 3. Bereiding van het bacterieel inoculum <ol><li> Met behulp van aseptische techniek, voeg 20 ml van de juiste cultuur bouillon in een 250 ml kolf met een dop. Gebruik Luria-Bertani (LB) bouillon voor E. coli culturen en antibiotica aan de bouillon waar nodig. </li><li> Met behulp van een steriele inenting lus, te enten de bouillon met bacteriën uit een glycerol voorraad of een streep plaat. Voor UPEC stammen, incubeer de bacteriële kweek bij 37 ° C gedurende ongeveer 16 uur zonder schudden (productie van type 1 pili bevorderen). </li><li> Breng de bacteriecultuur een centrifugebuis. Pellet de bacteriën door centrifugeren bij 8000 xg gedurende 10 minuten. </li><li> Schenk de bovenstaande vloeistofEn resuspendeer de bacteriën in PBS bij OD 600 = 1,000, equivalent aan ~ 10 9 CFU / ml. <ol><li> Een verhitting gedode bacteriële stimulus genereren incubeer een hoeveelheid (bijv. ~ 1,5 x 10 8 CFU in 150 pl) van de geresuspendeerde bacteriën bij 55 ° C gedurende 30 minuten. Plaat een hoeveelheid van de door hitte gedode suspensie om bacteriële dood te bevestigen. </li></ol></li><li> Vlak voor het gebruik, verdunnen de geresuspendeerd bacteriën (live of hitte gedode) 10-voudig tot 10 8 CFU / ml in warme serum-vrij RPMI [genoemd RPMI-] in een microfugebuis. </li></ol> 4. Isolatie van humane neutrofielen uit perifeer bloed De collectie van het bloed van volwassen vrijwilligers nodig vooraf beoordeling en goedkeuring van een Institutional Review Board. Draag geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen en op de juiste verwijdering van gevaarlijke materialen om blootstelling aan menselijk bloed voorkomen. <ol><li> Ongeveer 25 ml veneus bloed van gezonde volwassenen volunteer moeten in 3 steriele natrium-heparine bevattende bloedafnamebuisjes worden getrokken door personeel dat is opgeleid in aderlaten. <ol><li> Wikkel een rubber tourniquet rond de bovenarm, boven de elleboog. </li><li> Ontsmet de ingangsplaats, de antecubitale fossa, met behulp van een steriele 70% alcohol schoon te vegen. </li><li> Bevestig een plastic buis houder op een gevleugelde vlinder naald systeem. </li><li> Steek de naald in een ader antecubitale bij een hoek van 30 ° of minder, schuine naar boven. De naald de ader doorboord wanneer een spurt van bloed in de plastic buis. </li><li> Plaats een bloedafname in de plastic buis houder. Wanneer de eerste collectie buis vol is, te vervangen door de tweede collectie buis. Herhaal dit met de derde buis. </li><li> Wanneer de derde collectie buis is ongeveer half vol, verwijder de tourniquet. </li><li> Bedek de prikplaats met een steriele katoenen bal en langzaam trek de naald uit de ader. Schuif het beschermend schild over de naald en plaats ina biohazard naaldcontainer. </li><li> Oefen druk uit op de prikplaats. Bedek de prikplaats en katoenen bal met een pleister. </li><li> Keer de bloedafnamebuisjes aan de heparine verspreiden. </li></ol></li></ol> Voer de volgende stappen in een weefselkweek kap onder aseptische omstandigheden. <ol start="2"><li> Met behulp van een pipet 10 ml, zachtjes het bloed over te dragen aan een nieuwe, steriele 50 ml conische buis. Voeg een gelijkwaardige hoeveelheid 3% (w / v) dextraan in 0,9% NaCl en meng door omkeren. Incubeer de buis wordt bij kamertemperatuur gedurende 20 minuten. </li><li> Zonder verstoring van de onderlaag voorzichtig zuigen de bovenlaag en overbrengen naar een nieuwe 50 ml conische buis. Pellet de cellen door centrifugatie bij 300 xg gedurende 10 minuten. Verwijder het supernatant. </li><li> Resuspendeer de celpellet in een hoeveelheid 0,9% NaCl gelijk aan het uitgangsvolume bloed. </li><li> Laag 10 ml-centrifugatie oplossing onder de celsuspensie, preserveren van het grensvlak tussen de twee fasen. Centrifugeer bij 400 xg gedurende 30 min zonder remmen. Verwijder het supernatant. </li><li> Achtergebleven rode bloedcellen lyseren, resuspendeer de celpellet in 10 ml koude 0,2% NaCl. Incubeer gedurende 30 sec, en vervolgens onmiddellijk voeg 10 ml koud 1,6% NaCl tot isotoniciteit herstellen. </li><li> Pellet de cellen door centrifugatie bij 300 xg gedurende 6 minuten. Verwijder het supernatant. </li><li> Herhaal stap 4,6-4,7 totdat de celpellet duidelijk vrij van rode bloedcellen, typisch 3 rondes van lysis te zijn. </li><li> Met behulp van een pipet 1.000 III, resuspendeer de celpellet, voornamelijk PMN in warm (37 ° C) RPMI-een concentratie van 10 7 cellen / ml, bepaald met celtelling behulp van een hemocytometer. Laat de cellen bij 37 ° C tot gebruik. Kenmerkend PMN levensvatbaarheid en zuiverheid&gt; 99% zoals bepaald door trypan blauw exclusie en visualisatie van nucleaire morfologie na kleuren respectievelijk. </li></ol> 5. Transuroepithelial neutrofielen migratiezeggen Voer de volgende stappen in een weefselkweek kap onder aseptische omstandigheden. Gebruik alleen doorlaatbaar steunen dragende samenvloeiing 5637 cellagen, zoals bepaald in stap 2.7. De 24-well platen met RPMI-kan worden voorbereid en bij 37 ° C gehouden met 5% CO 2 tot gebruik. <ol><li> Aliquot 1 ml warm RPMI per putje in een 24-well plaat; bereiden 3 putten per doorlaatbare ondersteuning. </li><li> Zuig het medium van de bovenste en onderste reservoirs van de permeabele steunen. </li><li> Met behulp van een steriel pincet, overdracht van de doorlatende steunen aan de 24-well plaat bereid in stap 5.1. Was de doorlaatbare dragers driemaal in door de steunen uit goed goed. </li><li> Als een bacterieel inoculum wordt gebruikt, keren de doorlaatbare dragers in een steriele 25 mm diep weefselkweekplaat. Als een chemoattractant (bijv. N-Formyl-Met-Leu-Phe (fMLF) of IL-8) wordt gebruikt, ga dan naar stap 5.6. </li><li> Voor experimenten met levende of gedode bacterial stimuli, te enten de apicale zijde van elke doorlaatbare steun met 60 ul RPMI-(pseudo-infectie) of met de bacteriële inoculum (6 x 10 6 CFU) bereid in stap 3.5. Plaats de deksel op de schaal en incubeer bij 37 ° C met 5% CO2 gedurende 1 uur. </li><li> Voeg 0,6 ml RPMI per-goed op een 24-well laag-bevestigingsplaat, goed voor te bereiden 1 per doorlaatbare ondersteuning. Bereid 3 putjes die 0,5 ml RPMI-PMN ingang sommen. <ol><li> Als een chemoattractant wordt gebruikt in plaats van bacteriën, voeg de chemoattractant tot 0,6 ml RPMI-in 24-well plaat bereid in stap 5.6. </li></ol></li><li> Rechts de doorlaatbare dragers in de 24-well laag-bevestigingsplaat. </li><li> Voeg 0,1 ml PMN (10 6 PMN), bereid in stap 4.9, naar de bovenste reservoir (basolaterale zijde) van elke doorlaatbare ondersteuning. Voeg 100 ul PMN direct aan putjes die 500 ul RPMI-. Incubeer bij 37 ° C met 5% CO2 gedurende 1 uur. </li><li> Met behulp van een steriel pincet voorzichtig schrapen dedoorlaatbare membraan van de steun tegen de rand van de put om extra PMN van de apicale kant verwijderen en afvoeren van de drager. </li><li> Verzamel PMN door voorzichtig schrapen de bodem van elk putje met 1000 ul pipetpunt en dragen PMN suspensies microfuge buizen. </li><li> Opsommen PMN behulp van een hemocytometer. </li><li> Om het totale aantal PMN in het onderste reservoir berekenen, vermenigvuldigt het aantal PMN in 1 mm 2 (100 nl) van 6000. Gegevens worden gerapporteerd als een percentage van de input PMN, of PMN getallen genormaliseerd tot 10 6 ingang PMN. </li></ol>

<ol><li>Boyden, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chemotactic+effect+of+mixtures+of+antibody+and+antigen+on+polymorphonuclear+leucocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes.</a> J. Exp. Med. 115, 453-466 (1962).</li>
<li>Zigmond, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orientation+chamber+in+chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Orientation chamber in chemotaxis.</a> Methods Enzymol. 162, 65-72 (1988).</li>
<li>Zicha, D., Dunn, G. A., Brown, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+direct-viewing+chemotaxis+chamber%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">A new direct-viewing chemotaxis chamber.</a> J. Cell Sci. 99 (Pt. 4), 769-775 (1991).</li>
<li>Chin, A. C., Parkos, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathobiology+of+neutrophil+transepithelial+migration%3A+implications+in+mediating+epithelial+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Pathobiology of neutrophil transepithelial migration: implications in mediating epithelial injury.</a> Annu. Rev. Pathol. 2, 111-143 (2007).</li>
<li>Zemans, R. L., Colgan, S. P., Downey, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transepithelial+migration+of+neutrophils%3A+mechanisms+and+implications+for+acute+lung+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Respir.+Cell+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Transepithelial migration of neutrophils: mechanisms and implications for acute lung injury.</a> Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 40, 519-535 (2009).</li>
<li>Loughman, J. A., Hunstad, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Attenuation+of+human+neutrophil+migration+and+function+by+uropathogenic+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Microbes+Infect%22%5BJournal%5D)">Attenuation of human neutrophil migration and function by uropathogenic bacteria.</a> Microbes Infect. 13, 555-565 (2011).</li>
<li>Lau, M. E., Loughman, J. A., Hunstad, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((YbcL+of+uropathogenic+Escherichia+coli+suppresses+transepithelial+neutrophil+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">YbcL of uropathogenic Escherichia coli suppresses transepithelial neutrophil migration.</a> Infect. Immun. 80, 4123-4132 (2012).</li>
<li>Loughman, J. A., Hunstad, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+indoleamine+2%2C3-dioxygenase+by+uropathogenic+bacteria+attenuates+innate+responses+to+epithelial+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Induction of indoleamine 2,3-dioxygenase by uropathogenic bacteria attenuates innate responses to epithelial infection.</a> J. Infect. Dis. 205, 1830-1839 (2012).</li>
<li>Foxman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+epidemiology+of+urinary+tract+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Urol%22%5BJournal%5D)">The epidemiology of urinary tract infection.</a> Nat. Rev. Urol. 7, 653-660 (1038).</li>
<li>Haraoka, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+recruitment+and+resistance+to+urinary+tract+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Neutrophil recruitment and resistance to urinary tract infection.</a> J. Infect. Dis. 180, 1220-1229 (1999).</li>
<li>Billips, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+host+innate+immune+response+in+the+bladder+by+uropathogenic+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Modulation of host innate immune response in the bladder by uropathogenic Escherichia coli.</a> Infect. Immun. 75, 5353-5360 (2007).</li>
<li>Bozeman, P. M., Learn, D. B., Thomas, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assay+of+the+human+leukocyte+enzymes+myeloperoxidase+and+eosinophil+peroxidase%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Assay of the human leukocyte enzymes myeloperoxidase and eosinophil peroxidase.</a> J. Immunol. Methods. 126, 125-133 (1990).</li>
<li>Lee, W. Y., Chin, A. C., Voss, S., Parkos, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+neutrophil+transepithelial+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">In vitro neutrophil transepithelial migration.</a> Methods Mol. Biol. 341, 205-215 (2006).</li>
<li>Säve, S., Mohlin, C., Vumma, R., Persson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+adenosine+A2A+receptors+inhibits+neutrophil+transuroepithelial+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Activation of adenosine A2A receptors inhibits neutrophil transuroepithelial migration.</a> Infect. Immun. 79, 3431-3437 (2011).</li>
<li>Agace, W. W., Patarroyo, M., Svensson, M., Carlemalm, E., Svanborg, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Escherichia+coli+induces+transuroepithelial+neutrophil+migration+by+an+intercellular+adhesion+molecule-1-dependent+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Escherichia coli induces transuroepithelial neutrophil migration by an intercellular adhesion molecule-1-dependent mechanism.</a> Infect. Immun. 63, 4054-4062 (1995).</li>
<li>Hung, C. S., Dodson, K. W., Hultgren, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+murine+model+of+urinary+tract+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">A murine model of urinary tract infection.</a> Nat. Protoc. 4, 1230-1243 (2009).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Met behulp van een gekweekte blaas epitheelcellijn en vers geïsoleerde humane PMN, hebben we een in vitro model van transuroepithelial neutrofielmigratie. Dit model is behulpzaam geweest bij het ​​begin tot de complexiteit van de aangeboren immuunrespons tijdens infectie van de urinewegen (UTI), een zeer veel voorkomende bacteriële infectie meestal veroorzaakt door UPEC 9 ontleden geweest. Tijdens blaasontsteking of cystitis, werving van PMN aan de blaas lumen is essentieel voor bacteriële verwijderi...

De beweging van cellen in het lichaam, vaak over grote afstanden, is nodig voor de groei en ontwikkeling, wondgenezing en immuunrespons. Celmigratie is complex en vereist de coördinatie van verschillende processen, waaronder signaal transductie en herschikking van cytoskelet componenten. Cellen kunnen willekeurig evenals bewegen (chemokinesis) richting gedefinieerde chemische gradiënten (chemotaxis). Vele technieken zijn ontwikkeld om celmigratie in vitro bestuderen. De oudste en meest gebruikte techniek, de Boyden-kamer, bestaande uit een verticaal tweekamersysteem waarbij een chemoattractant stof wordt in de onderste kamer en cellen van belang worden geplaatst in de bovenste kamer 1. De beweging van cellen in de permeabele filter met poriën van gedefinieerde grootte, die de twee kamers wordt bewaakt. Aanvullende technieken ontwikkeld om celmigratie te onderzoeken, waaronder Zigmond kamer 2 en kamer Dunn3. Deze collectieve benaderingen hebben aanzienlijke inzicht in de beweging van vele verschillende celtypes opgeleverd. Naast ondervragen de basisprincipes van chemokinesis en chemotaxis, zijn twee kamers assays onderzoek van celmigratie door extracellulaire matrixcomponenten en zowel endotheliale en epitheliale lagen vergemakkelijkt. Een voordeel van twee-kamer systemen via andere technieken is dat het poreuze membraan kan worden bekleed met eiwitten zoals collageen of fibrinogeen, en celmigratie in een extracellulaire matrix-achtige barrière kan worden beoordeeld. Daarnaast kunnen gekweekte cellijnen worden gekweekt en gedifferentieerd op permeabele steunen. Om de beweging van cellen in de endotheliale barrière te onderzoeken, worden gekweekte endotheelcellen gezaaid en gekweekt in het bovenste reservoir van de permeabele steunen. Beweeglijke cellen, zoals immuuncellen, toegevoegd aan het bovenste reservoir en migratie in het onderste reservoir en in dedothelial barrière in de fysiologische apicale-to-basolaterale richting wordt waargenomen. Dit model is van onschatbare waarde geweest bij het begrijpen van extravasatie van immuuncellen uit het bloed. In tegenstelling tot transendotheliale migratie, de beweging van cellen in een epitheliale barrière treedt meestal in de basolaterale naar apicale richting. Om modelleren deze gebeurtenissen in vitro onderzoekers zaad en groeien gekweekte epitheelcellen aan de onderzijde van de permeabele steunen. Beweeglijke cellen worden toegevoegd aan het bovenste reservoir en migratie over de epitheliale barrière, die de basolaterale naar apicale richting bewaakt. Dergelijke modellen van transepitheliaal migratie hebben aanzienlijk bijgedragen aan ons begrip van ontstekingsreacties op mucosale oppervlakken, in het bijzonder die van de long en darm 4,5. In tegenstelling, is immuun cel mensenhandel door het epitheel van de urinewegen veel minder aandacht gekregen. Om onze understandi verderng aangeboren immuunrespons bij de urinewegen tijdens infectie met uropathogene Escherichia coli (UPEC), ontwikkelden we een in vitro test, de transuroepithelial neutrofielen migratie assay, dat onderzoek van polymorfonucleaire leukocyten maakt (PMN; neutrofielen) beweging over een blaas epitheelbarrière 6 -8. Zoals bij andere twee kamers modellen transepitheliale migratie worden gekweekte menselijke blaas epitheelcellen gegroeid op de onderzijde van een doorlaatbare steun en vormen confluente epitheliale lagen. Menselijke neutrofielen, geïsoleerd uit veneus bloed, worden aangebracht op de basolaterale zijde van de epitheliale laag en migratie over het epitheel van de fysiologisch relevante basolaterale naar apicale richting wordt gekwantificeerd in reactie op infectie door verschillende stammen van E. coli of de aanwezigheid van chemoattractant moleculen. Veel onderzoek was gericht op neutrofielen beweging, zowel chemokinesis en chemotaxis, bij het ontbreken van extra celtypes. De transuroepithelial neutrofielen migratie test is voordelig omdat het rekening houdt met de complexe interacties tussen de blaas epitheel cellen en immuuncellen tijdens infectie. Deze soepele in vitro model heeft het potentieel om de gedetailleerde onderzoek immuunrespons uroepithelial oppervlakken mogelijk.

<table><tbody><tr><td>Transwell Inserts (d.w.z.&nbsp;doorlaatbare dragers)</td><td>Corning</td><td>3472</td><td>6.5 mm, 3 &mu;m porie, polyester membraaninsert</td></tr><tr><td>BD Vacutainer Bloedopnamebuizen</td><td>Becton, Dickinson and Company (BD)</td><td>366480</td><td>16 mm x 100 mm x 10 ml groene dop buizen met natriumheparine</td></tr><tr><td>BD Safety-Lok Bloedopname en Infusie Set</td><td>Becton, Dickinson and Company (BD)</td><td>367281</td><td>21 G x 0.75 inch naald x 12 inch slang</td></tr><tr><td>BD Vacutainer eenmalig, niet-stapelbaar houder</td><td>Becton, Dickinson and Company (BD)</td><td>364815</td><td></td></tr><tr><td>Dextraan</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4876</td><td>Van Leuconostoc mesenteroides</td></tr><tr><td>Ficoll-Paque PLUS dichtheidscentrifugeeroplossing</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1440-02</td><td></td></tr><tr><td>Ultra-Low Attachment Platen</td><td>Corning</td><td>3473</td><td>24-well, heldere platte bodem</td></tr><tr><td>N-Formyl-Met-Leu-Phe (fMLF)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F3506</td><td>Gereconstrueerd in DMSO tot 10 mM</td></tr><tr><td>Recombinant Human CXCL8/IL-8</td><td>R&amp;D Systems</td><td>208-IL</td><td>Gereconstrueerd in PBS tot 100 &mu;g/ml</td></tr></tbody></table>

kwantitatieve beoordeling van human migratie van neutrofielen door een gekweekte blaas epitheel

Quantitative Assessment of Human Neutrophil Migration Across a Cultured Bladder Epithelium

De rekrutering van immuuncellen van de periferie naar de plaats van ontsteking is een essentiële stap in de aangeboren immuunrespons op elk slijmvliesoppervlak. Tijdens infectie van de urineblaas, polymorfonucleaire leukocyten (PMN, neutrofielen) migreren van de bloedsomloop en beweeg de blaas epitheel. Het niet-infectie op te lossen in de afwezigheid van een neutrofiele respons toont het belang van PMN in blaas verdediging. Kolonisatie van de blaas epitheel, uropathogene Escherichia coli (UPEC) te vergemakkelijken, de verwekker van de meerderheid van urineweginfecties (UWI), temperen de acute ontstekingsreactie behulp van een verscheidenheid van gedeeltelijk gedefinieerd mechanismen. Om de wisselwerking tussen gastheer en bacteriële pathogenen te onderzoeken, een in vitro model van dit aspect van de aangeboren immuunrespons op UPEC ontwikkeld. In de transuroepithelial neutrofielen migratie assay, een variatie op de Boyden-kamer, gekweekte blaas epithElial cellen worden gekweekt tot confluentie op de onderzijde van een doorlaatbare drager. PMN worden geïsoleerd uit menselijk veneus bloed en worden toegepast op de basolaterale zijde van de blaas epitheel cellagen. PMN migratie die de fysiologisch relevante basolaterale naar apicale richting in reactie op bacteriële infectie of chemo-aantrekkende moleculen opgesomd met behulp van een hemocytometer. Dit model kan worden gebruikt om de interacties tussen UPEC en eukaryotische cellen te onderzoeken alsook de moleculaire vereisten voor traversal van blaas epitheel ondervragen door PMN. De transuroepithelial neutrofiel migratiemodel ons begrip van de initiële ontstekingsreactie op UPEC in de blaas bevorderen.

De transuroepithelial neutrofiel migratie assay maakt de kwantitatieve beoordeling van menselijke PMN migratie over blaas gekweekte epitheelcellen lagen in reactie op verschillende stimuli (Figuur 1B). Terwijl het protocol is eenvoudig, er een aantal variabelen die PMN migratie beïnvloeden en bijgevolg invloed op de reproduceerbaarheid van deze test. Maatregelen moeten worden genomen, terwijl de voorbereiding van de doorlatende steunen en de PMN variabiliteit te verminderen tussen de technische en biolo...

We ontwikkelden een in vitro model dat een belangrijke component van de acute ontstekingsreactie tijdens infectie van de blaas uropathogene Escherichia coli nabootst. De transuroepithelial neutrofiel migratie assay maakt kwantitatieve beoordeling van menselijke neutrofiel migratie over blaas epitheel, gekweekt op permeabele dragers, in reactie op bacteriële infectie of chemoattractant stoffen.

Kwantitatieve beoordeling van Human migratie van neutrofielen door een Gekweekte blaas epitheel

The recruitment of immune cells from the periphery to the site of inflammation is an essential step in the innate immune response at any mucosal surface. ...

Het algemene doel van deze procedure is om de mate van neutrofielmigratie door een blaas-epitheelbarrière te kwantificeren tijdens een bacteriële infectie, of als reactie op chemo-attractantmoleculen. Dit wordt bereikt door eerst gekweekte blaas-epitheelcellen tot confluentie te laten groeien op permeabele dragers. De tweede stap is om de blaas-epitheelcellen te infecteren met diverse bacteriën of om chemo-attractantmoleculen toe te voegen aan het onderste reservoir van de permeabele dragers.Vervolgens worden neutrofielen geïsoleerd uit veneus bloed en aangebracht op het bovenste reservoir van de permeabele dragers. De laatste stap is het tellen van het aantal neutrofielen in het onderste reservoir na één uur met behulp van een hemocytometer. Uiteindelijk wordt de trans-urothele neutrofielenmigratie-assay gebruikt om verschillen in neutrofielenmigratie op te wekken door verschillende stimuli te beoordelen.Hoewel deze methode inzicht kan bieden in aspecten van de aangeboren immuunrespons tijdens een urineweginfectie, kan deze ook worden gebruikt om andere ziekten te onderzoeken, waaronder bacteriële infecties die optreden op andere slijmvliesoppervlakken. Voer deze procedure uit in een weefselkweekkast met een aseptische techniek onder gebruik van steriele pincetten. Plaats de permeabele dragers omgekeerd in een steriele weefselkweekschaal van 25 millimeter diep.Voor optimale resultaten worden 5 6 3 7 blaasepitheelcellen gebruikt die minder dan 10 subculturen met trypsine hebben ondergaan. Een fles van 75 vierkante centimeter met 5 6 3 7 cellen bij 95% confluentie conform de beschreven tekst. Gebruik een 1000 microliter pipette om de cellen voorzichtig te resuspenderen in ongeveer twee milliliter RPMI plus tot een concentratie van 3 miljoen cellen per milliliter, bepaald via celtelling.Breng met behulp van een hemocytometer 50 µL van de celsuspensie aan op elke permeabele drager zonder het membraan aan te raken. Plaats het deksel op de schaal en zet de schaal zorgvuldig bij 37 °C met 5%CO2 voor maximaal 16 uur. Gebruik hiervoor steriele pincetten.Plaats de permeabele dragers in een 24-wellplaat die 0,6 milliliters RPMI plus per well bevat. Voeg 0,1 milliliters RPMI plus toe aan het bovenste reservoir van elke permeabele drager voordat de plaat wordt geïncubeerd bij 37 graden Celsius met 5%CO2. Vervang het medium elke twee dagen door het medium uit het bovenste reservoir af te zuigen, gevolgd door het onderste reservoir.Breng vervolgens vers RPMI plus aan in omgekeerde volgorde, waarbij 0,6 milliliters aan het onderste reservoir en daarna 0,1 milliliters aan het bovenste reservoir wordt toegevoegd. Zeven dagen nadat de permeabele dragers met 5 6 3 7 cellen zijn gezaaid, wordt de confluentie van de cellen beoordeeld door het bovenste reservoir te vullen met 0,35 milliliters RPMI.Bovendien zijn de cellen voldoende confluent wanneer het medium niet meer equilibreert tussen de bovenste en onderste reservoirs. Bereid het bacteriële inoculum voor en neem bloed af van volwassen vrijwilligers zoals beschreven in het tekstprotocol in een weefselkweekkast. Gebruik een pipet van 10 milliliter om het bloed voorzichtig over te brengen naar een nieuwe steriele conische buis van 50 milliliter.Voeg een gelijkwaardige hoeveelheid 3% dextran in 0,9% natriumchloride toe. Incubeer de buis rechtopstaand gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur zonder de onderste laag te verstoren. Aspireer voorzichtig de bovenste laag en breng deze over naar een nieuwe conische buis van 50 milliliter.Pellet de cellen door centrifugatie bij 300 ×g gedurende 10 minuten; gooi na de centrifugatie het supernatant weg. Resuspendeer de celpellet in een volume 0,9% natriumchloride dat gelijk is aan het startvolume bloed. Breng vervolgens 10 milliliter dichtheidscentrifugatie-oplossing aan als laag onder de celsuspensie.Centrifugeer 30 minuten bij 400 ×g zonder remactivering, terwijl de interface tussen de twee fasen behouden blijft, en verwijder vervolgens het supernatant om de overgebleven rode bloedcellen te lyseren. Resuspendeer de celpellet in 10 milliliters koude 0,2% natriumchloride. Voeg na een incubatie van 30 seconden direct 10 milliliters koude 1,6% natriumchloride toe om de isotoniciteit te herstellen. Pelleteer de cellen door centrifugatie bij 300 ×g gedurende zes minuten en verwijder het supernatant. Herhaal deze stappen totdat de celpellet vrij lijkt te zijn van rode bloedcellen.Voer gewoonlijk drie ronden lysis uit met een 1000 microliter pipette. Resuspendeer de celpellet, hoofdzakelijk polymorfonucleaire leukocyten of PMN, in warm RPMI minus tot een concentratie van 10 miljoen cellen per milliliter, bepaald via celtelling met een hemocytometer. Houd de cellen op 37 degrees Celsius tot gebruik.Typisch zijn de levensvatbaarheid en zuiverheid van pm n groter dan 99%, respectievelijk bepaald door trypaanblauw-uitsluiting en visualisatie van de nucleaire morfologie na kleuring. Gebruik voor de migratie-assay uitsluitend permeabele supports met confluente 5 6 3 7 cellagen.Voeg 1 mL warm RPMI-medium per well toe. Bereid in een 24-wells plaat drie wells per permeabele support voor en aspireer het medium uit de bovenste en onderste reservoirs van de permeabele supports met steriele pincetten. Verplaats de permeabele supports naar de 24-wells plaat en was de permeabele supports drie keer door de supports van well naar well te verplaatsen.Indien een bacterieel inoculum wordt gebruikt, keer de permeabele dragers om in een steriele weefkweekschaal van 25 millimeter diep. Voor experimenten met levende of gedode bacteriële stimuli wordt de apicale zijde van elke permeabele drager geïnoculeerd met 60 µL RPMI voor een mock-infectie of met het bereide bacteriële inoculum. Plaats het deksel op de schaal en incubeer gedurende één uur bij 37 °C met 5%CO2.Voeg vervolgens 0,6 milliliters RPMI minus per put toe aan een 24-wells low attachment plate. Bereid één put per permeabele drager voor. Bereid drie putten voor met 0,5 milliliters RPMI minus om de input van PMN te bepalen.Als alternatief, indien een chemoattractant wordt gebruikt in plaats van bacteriën, voeg dan de chemoattractant toe aan 0,6 milliliters RPMI minus in de voorbereide 24-wells plaat. De volgende stap voor beide experimenten is het plaatsen van de permeabele supports in de 24-wells low attachment plaat. Voeg vervolgens 0,1 milliliters van de voorbereide PMN toe aan het bovenste reservoir van elke permeabele support.Voeg 0,1 milliliters PMN direct toe aan de wells die 0,5 milliliters RPMI minus bevatten; incubeer gedurende één uur bij 37 degrees Celsius met 5%CO2. Gebruik hiervoor een 1000 microliter pipette. Spoel de onderzijde van het membraan van de permeabele drager met medium uit het onderste reservoir door met steriele pincetten het membraan voorzichtig tegen de rand van de well te schrapen.Om extra PMN van de apicale zijde te verwijderen, worden de PMN verzameld door de bodem van elke well voorzichtig af te schrapen met de 1000 microliter pipetpunt. Vervolgens worden de PMN-suspensies overgebracht naar microcentrifugebuisjes. Tel de PMN met een hemocytometer om het totaal aantal PMN in het onderste reservoir te berekenen.Vermenigvuldig het aantal PMN per vierkante millimeter met 6.000. Gegevens kunnen worden gerapporteerd als een percentage van de toegevoegde PMN of als PMN-aantallen genormaliseerd naar 10⁶. Nauwkeurige naleving van het in deze video beschreven protocol bij het toevoegen van PMN maakt het mogelijk om de migratie van PMN te tellen in reactie op stimuli, waaronder bacteriën en chemo-attractante stoffen, zoals infectie met de niet-pathogene e coli-stam MG 1655.Hitte-gedode MG 1655 of een PEC-mutant roept significant meer pm n migratie op dan een schijninfectie of infectie met de wildtype pec-stam UTI 89, een cystitis-isolaat. De toevoeging van chemo-attractanten, FMLF of IL eight aan het onderste reservoir resulteert in significant meer PM en migratie dan bij een schijnbehandeling. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u de migratie van neutrofielen over een epitheliale barrière kunt beoordelen in reactie op chemotactische stimuli.

quantitative-assessment-human-neutrophil-migration-across-cultured

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Beschrijven we een protocol van helderveld intravitale microscopie voor het meten van dynamische neutrofiel-endotheliale cel interacties tijdens neutrofielen werving in reactie op de bron van een neutrofiel chemoattractant in vivo. Neutrofiele intraluminale kruipen, transendotheliale migratie en chemotaxis in de muis cremaster spierweefsel worden gevisualiseerd met een time-vervallen video fotografie en gevolgd met ImageJ.

Tracking neutrofielen intraluminale Crawling, transendotheliale migratie en chemotaxis in weefsel door intravitale Video Microscopie

In dit artikel wordt eerst een procedure voor het isoleren van humane endotheelcellen van de navelstreng aderen en dan laat zien hoe deze cellen te gebruiken om neutrofielen transmigratie onderzoeken op stromingscondities. Door een laag volume stromingskamer gemaakt van een polymeer met de optische eigenschappen van glas levende cellen fluorescerende beeldvorming zeldzame celpopulaties is ook mogelijk.

Isolatie van humane navelstreng endotheel cellen en hun gebruik in de studie van de neutrofielen transmigratie onder stroomtoestanden

Neutrofielaanhechting aan de geactiveerde endotheel op plaatsen van infectie is een integraal onderdeel van de gastheer ontstekingsreactie. Beschreven in dit rapport is een neutrofiel binding assay die het mogelijk maakt voor...

Kwantitatief<em&gt; In vitro</em&gt; Assay om neutrofieladhesie Maatregel om Activated primaire humane microvasculaire endotheelcellen onder statische omstandigheden

We presenteren een ex vivo celmigratie analyse die exacte kwantificering van enterische neurale celmigratie potentieel in aanwezigheid van verschillende groeifactoren maakt.

Een kwantitatieve cel-migratie test voor Muriene Enterisch neurale voorlopercellen

Neutrofiele trans-epitheliale migratie als reactie op mucosale bacteriële infectie draagt bij aan epitheelletsel en klinische ziekte. Er is een in vitro model ontwikkeld dat pathogene, menselijke neutrofielen en gepolariseerde menselijke epitheelcellagen combineert die op transwellfilters zijn gekweekt om onderzoeken naar het ontrafelen van de moleculaire mechanismen die dit fenomeen orkestreren te vergemakkelijken.

In vitro Coculture Assay om pathogene geïnduceerde neutrofiele trans-epitheliale migratie te beoordelen

Dit protocol Gegevens een test ontwikkeld om menselijk neutrofielchemotaxis meet van een druppel bloed met robuuste reproduceerbaarheid. Deze benadering omzeilt de noodzaak van neutrofielen scheiding en vereist slechts een paar minuten assay voorbereidingstijd. De microfluïdische chip maakt het mogelijk de herhaalde meting van neutrofielchemotaxis loop van de tijd bij zuigelingen of kleine zoogdieren, waar monster volume beperkt is.

Microfluidic Platform voor het meten neutrofielchemotaxis van onverwerkte volbloed

Leukocyten steken de endotheelcellen monolaag met behulp van de paracellulaire of de transcellulaire route. We ontwikkelden een eenvoudige test om te volgen de verdeling van endogene junctionele VE-cadherine en PECAM-1 tijdens de migratie van leukocyten onder fysiologische stroom te maken tussen de twee transmigratie routes.

Real-time beeldvorming van endotheelcellen-cel Junctions Tijdens Neutrophil Transmigration onder fysiologische Flow

Dit artikel geeft de gedetailleerde methode om een ​​snelle neutrofiele chemotaxis-analyse te verrichten door de integratie van de on-chip neutrofiele isolatie uit volledig bloed en de chemotaxis-test op een enkele microfluïdische chip.

Een all-on-chip methode voor snelle neutrofiele chemotaxis analyse direct van een druppel bloed

Protocollen voor kwantitatieve beoordeling van lymfocyt chemotaxis en migratie zijn belangrijke hulpmiddelen voor onderzoek van de immunologie. Hier, wordt een in vitro -protocol beschreven dat vergunningen real-time, multiplexed evaluatie van cel migratie, alsmede een complementaire in vivo techniek waardoor tracking van inheemse cellen met milt.

Kwantificeren van menselijke monocyt Chemotaxis In Vitro en lymfkliertest lymfocyt handel In Vivo

Hier presenteren we drie methoden om neutrofiele migratie en infiltratie zowel in vivo als in vitro te beoordelen. Deze methoden kunnen worden gebruikt om veelbelovende therapieën te ontdekken die gericht zijn op neutrofiele migratie.

Detecteren van migratie en infiltratie van neutrofielen bij muizen

Dit protocol genereert biodeeltjesmicroarrays die ruimtelijk gecontroleerde neutrofiele zwermen bieden. Het biedt gemakkelijke toegang tot de bemiddelaars die neutrofielen vrijgeven tijdens de migratie en maakt kwantitatieve beeldvormingsanalyse mogelijk.

Bioparticle Microarrays voor Chemotactic en Moleculaire Analyse van menselijke Neutrofiele Zwermen in vitro

Leer hoe je de transuroepitheliale neutrofielenmigratie-assay gebruikt om menselijke neutrofielenmigratie over blaasepitheel te kwantificeren tijdens bacteriële infectie. Deze methode helpt onderzoekers het immuunrespons te bestuderen.

Kwantitatieve beoordeling van Human migratie van neutrofielen door een Gekweekte blaas epitheel

Meer video's verkennen