Ontluikende Gist Protein extractie en zuivering voor de Studie van de functie, interacties, en post-translationele modificaties

Het algemene doel van deze procedure is om gisteiwitten te extraheren terwijl de interacties van de natuurlijke structuurfunctie en posttranslationele modificaties behouden blijven. Dit wordt bereikt door eerst cellen te kweken om de expressie van het eiwit van belang te induceren. Vervolgens worden de geoogste gistcellen gehomogeniseerd in een geschikte buffer om de eiwitten te extraheren.

Vervolgens worden de eiwitten van belang gezuiverd uit het geklaarde ruwe celextract met behulp van een affiniteithars. De laatste stap van de procedure is het elueren van de gezuiverde eiwitten uit de affiniteithars voor verdere analyse of downstream-toepassingen. Uiteindelijk kunnen resultaten worden behaald die eiwitzuiveringsmodificaties en interacties aantonen op basis van western blot-analyse.

De procedure wordt gedemonstreerd door Eva's Ky, een afgestudeerde van William and Mary die de afgelopen couple jaar als onderzoeker in mijn laboratorium heeft gewerkt. Het belangrijkste voordeel van bead beading ten opzichte van andere bestaande methoden is de snelle verwerking en lysis van meerdere monsters onder omstandigheden die de eiwitfunctie, interacties en post-translationele modificaties behouden. Om te beginnen, transformeer cellen van een gal-positieve giststam met een plasmide dat codeert voor een galactose-induceerbaar, six-his-getagd eiwit naar keuze. Inoculeer de transformanten in 5 mL van een geschikt selectief medium, zoals SD uracil, bevattend 2% sucrose en incubeer dit gedurende één nacht bij 30 °C met rotatie. Verdun de volgende dag de overnight-cultuur in selectief medium met 2% sucrose tot een eindvolume van 33 mL, zodat de optische dichtheid bij 600 nm 0,3 bedraagt. Laat dit groeien in een schudincubator bij 30 °C en 150 RPM.

Wanneer de cultuur een OD 600 van 0,8 tot 1,5 heeft bereikt, wordt de expressie van het gewenste eiwit geïnduceerd door 17 ml 3x XYEP met 6% galactose toe te voegen voor een eindconcentratie van 1x XYEP met 2% galactose, waarna de cultuur gedurende nog vijf tot zes uur in een schudincubator bij 30 °C wordt geplaatst. Na het meten van de OD 600 van de geïnduceerde cultuur worden ongeveer 150 tot 200 OD 600 units cellen gedurende vijf minuten gecentrifugeerd bij 5.000 RPM bij 4 °C. Gebruik vervolgens 1 ml ijskoude 1x XPBS met 1x protease-inhibitorcocktail om de celpellet opnieuw te suspenderen en breng deze over naar een centrifugebuis van 2 ml met schroefdop. Centrifugeer de cellen gedurende één minuut bij 15.000 RPM bij 4 °C. Na het afgieten van het supernatant wordt de celpellet direct ingevroren in vloeibare stikstof.

Voeg 200 µL zuurgezuiverde glazen kralen en 500 µL ijskoud lysisbuffer toe. Houd de buisjes te allen tijde op ijs. Gebruik een pipetpunt waarvan het uiteinde is afgeknipt om kortstondig op en neer te pipetteren bij 4 °C.

Plaats de buisjes met cellen in de vergrendeling van de kogelmolen-weegschaal en laat de machine volgens de instructies van de fabrikant 20 seconden draaien bij 5,5 meters per second. Plaats de buisjes vervolgens gedurende één minuut op slush-ijs. Herhaal dit in totaal zes keer. Centrifugeer de geëxtraheerde eiwitten vervolgens 15 minuten bij 15.000 RPM bij vier degrees Celsius.

Bereid vervolgens een monster van het hele cel-extract of WCE voor western blot door WCE dat correspondeert met twee OD 600 eenheden cellen toe te voegen aan 800 µL 20% trichloorazijnzuur of TCA en meng dit door te vortexen. Om een monster van helder WCE te zuiveren, wordt 50 tot 100 µL affiniteithars in een nieuwe microcentrifugebuis gedaan; was en equilibreer de hars door één mL wasbuffer toe te voegen en de buis om te keren tot de hars is geresuspendeerd. Centrifugeer gedurende één minuut bij 5.000 RPM en 4 °C en aspireer vervolgens het supernatant. Om eiwitten te binden voor affiniteitzuivering, wordt 100 tot 200 µL van het geklaarde lysaat aan de gewassen beads toegevoegd en wordt lysisbuffer gebruikt om het totale volume aan te vullen tot één mL.

Incubeer met agitatie of op een schudplaat bij 4 °C gedurende twee tot vijf uur. Gebruik vloeibare stikstof om aliquoten van het resterende heldere WCE snel te bevriezen en bewaar deze bij -80 °C tot verder gebruik, terwijl de lysaat-beetoplossing op ijs incubeert voor het WCE Western blot-monster. Na het centrifugeren gedurende twee en een half minuut bij 15.000 RPM bij 4 °C, schenk het supernatant voorzichtig af terwijl het pellet behouden blijft, voeg 800 µL 2% TCA toe aan het pellet en vortex de buis voordat de centrifugatiestap van twee en een half minuut wordt herhaald.

Nadat het supernatant zorgvuldig is afgeschenkt, voegt u 100 µL TCA-monsterbuffer toe en vortexeert u om het pellet op te lossen vóór incubatie van het monster. Plaats het monster in een warmteblok van 100 °C gedurende twee tot vijf minuten en vortexeer vervolgens nogmaals om eventuele resten van het pellet volledig op te lossen, aangezien deze moeilijk oplosbaar kunnen zijn; bewaar het monster bij -80 °C tot gebruik. Zodra het lysaat-beadmonster is geïncubeerd, centrifugeert u dit gedurende één minuut bij 5.000 RPM en 4 °C, waarna de hars vijf keer met wasbuffer wordt gewassen om de eiwitten te elueren.

Voeg 150 µL elutiebuffer toe aan de hars en incubeer bij 4 °C gedurende vijf minuten. Centrifugeer één minuut bij 5.000 RPM en 4 °C en bewaar het supernatant in een nieuwe buis. Bereid ten slotte een monster voor western blot door 25 µL tweevoudige lithium-dodecylsulfaat monsterbuffer met 2 µL BME toe te voegen aan 25 µL UD-eiwitmonster.

Zoals in deze figuur wordt getoond, kan een breed scala aan eiwitten reproduceerbaar uit gistcellen worden geëxtraheerd. Discrete banden over een reeks molecuulgewichten zijn indicatief voor eiwitextracten van hoge kwaliteit. De kwaliteit van de extracten kan worden bevestigd via western blotting voor specifieke epitop-getagde eiwitten.

Hier is een representatief resultaat voor de galactose-overgeëxpresseerde V five-getagde Sumo Ligase, die migreert bij ongeveer 120 kilodaltons. Over het algemeen zouden gedeeltelijk gedegradeerde eiwitten verschijnen als meerdere fragmenten onder het verwachte gewicht, maar hier wordt alleen het eiwit van volledige lengte waargenomen. Daarnaast kunnen adducten met een hoog molecuulgewicht van een bepaald eiwit duiden op post-translationele modificaties.

Hier ziet u bijvoorbeeld lactose-overexpressie van sumo-gerelateerd S1 delta 4 40 en full-length SIS1. Zoals aangetoond in deze Western blot kunnen modificaties ook behouden blijven op endogeen tot expressie gebrachte S1. Deze figuur laat zien dat twee kernverrijkte eiwitten, SLX5 en CS1 delta 4 40, succesvol zijn gezuiverd uit onze ws.

Opmerkelijk is dat een eiwit met een six-his-tag affiniteitsgezuiverd kan worden uit W'S, zowel onder natieve als denaturerende omstandigheden. In tegenstelling hiermee missen SLX 5G ST en CS one delta four 40 ha een six-his-epitoop, maar ze interageren onder natieve omstandigheden nog steeds op een ole-gevoelige manier met de metaalaffiniteithars. Wij stellen voor dat CIS one en in mindere mate SLX five in staat zijn om aan de metaalaffiniteithars te binden via hun metaalcoördinerende ringdomein.

Hoewel naar ons weten dit specifieke fenomeen nog niet is gerapporteerd, is een vergelijkbare situatie beschreven waarbij het choletoxine B-subeenheid bindt aan Nicola-affiniteithars op een manier die wordt gemedieerd door zijn natuurlijke histidine-residuen. Deze observatie suggereert dat eiwitten in het WCER, ten minste gedeeltelijk, in hun natuurlijke gevouwen staat aanwezig zijn voor de studie van de eiwitfunctie. Het is belangrijk om aan te tonen dat eiwitcomplexen intact blijven in whole cell extracts.

Representatieve data onthulden dat CS one delta four 40 SLX five, en P GK one, een cytosolisch eiwit dat dient als loading control, aanwezig waren in WS cis one. Delta four 40 werd uit deze extracten gezuiverd op basis van het inherente vermogen om te binden aan metaalaffiniteitharsen. Daarnaast was bij co-expressie van SLX five en SIS one in gistcellen de concentratie SLX five in de EITs verhoogd, wat de mogelijkheid suggereert dat SLX five kan interageren met SIS one.

Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe gistcellen gekweekt en verwerkt moeten worden om gistproteïnen onder natuurlijke omstandigheden te extraheren, te zuiveren en te visualiseren.