Ontluikende Gist Protein extractie en zuivering voor de Studie van de functie, interacties, en post-translationele modificaties

Het algemene doel van deze procedure is om gist-eiwitten te extraheren met behoud van natuurlijke structuurfunctie-interacties en post-translationele modificaties. Dit wordt bereikt door cellen eerst te laten groeien om expressie van het eiwit van belang te induceren. Vervolgens worden de geoogste gistcellen gehomogeniseerd in een geschikte buffer om de eiwitten te extraheren.

Vervolgens worden de eiwitten van belang gezuiverd uit het opgehelderde volledige cel-extract met behulp van een affiniteitshars. De laatste stap van de procedure is het elueren van de gezuiverde eiwitten van de affiniteitshars voor verdere analyse of downstream-toepassingen. Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die eiwitzuiveringsmodificaties en -interacties laten zien op basis van western blot-analyse.

De procedure wordt gedemonstreerd door Eva's Ky, een afgestudeerde van William and Mary die de afgelopen paar jaar als onderzoeker in mijn lab werkte. Het belangrijkste voordeel van bead beading ten opzichte van andere bestaande methoden is de snelle verwerking en lysis van meerdere monsters onder omstandigheden die eiwitfunctie-interacties en post-translationele modificaties behouden. Om te beginnen transformeer cellen van een gal-positieve giststam met een plasmide dat codeert voor een galactose-induceerbare zes, zijn getagged eiwit van keuze, inoculeer transformanten in vijf milliliters van een geschikt selectiemedium zoals SD uracil, bevattend 2% sucrose en incubeer bij 30 graden Celsius overnacht met rotatie. De volgende dag verdunt u de overnachtcultuur in selectiemedium met 2% sucrose tot een eindvolume van 33 milliliters, zodat de optische dichtheid bij 600 nanometer 0,3 meet, groeit in een schuddende incubator bij 30 graden Celsius en 150 RPM.

Wanneer de cultuur een OD 600 van 0,8 tot 1,5 heeft bereikt, induceert u de expressie van het gewenste eiwit door 17 milliliters van drie XYEP met 6% galactose toe te voegen voor een eindconcentratie van één XYEP met 2% galactose, geplaatst in een schuddende incubator bij 30 graden Celsius gedurende een extra vijf tot zes uur. Na het meten van de OD 600 van de geïnduceerde cultuur centrifugeert u ongeveer 150 tot 200 OD 600-eenheden cellen gedurende vijf minuten bij 5.000 RPM bij vier graden Celsius, gebruikt u vervolgens één milliliter ijskoud één XPBS met één x proteaseremmercocktail om de celpellet te resuspenderen en brengt u deze over naar een twee milliliters schroefdopbuis. Centrifugeer de cellen gedurende één minuut bij 15.000 RPM en vier graden Celsius. Na het decanteren van het supernatant snelvries de celpellet in vloeibare stikstof tot de bevroren celpellet.

Voeg 200 microliters zuurgewassen glaskralen en 500 microliters ijskoud lysebuffer toe. Houd de buisjes altijd op ijs. Gebruik een pipettentip met het uiteinde afgesneden om kort op en neer te pipetten bij vier graden Celsius.

Plaats de buisjes met cellen in de bead mill-balansvergrendeling en laat de machine draaien volgens de instructies van de fabrikant gedurende 20 seconden bij 5,5 meter per seconde. Plaats vervolgens de buisjes gedurende één minuut op sneeuwijs. Herhaal dit in totaal zes keer om de geëxtraheerde eiwitten te verwijderen, centrifugeer gedurende 15 minuten bij 15.000 RPM en vier graden Celsius.

Vervolgens om een monster van het volledige cel-extract of WCE voor western blot en WCE overeenkomend met twee OD 600-eenheden cellen te bereiden tot 800 microliters van 20% trichloroazijnzuur of TCA, vortex om te mengen. Om een monster van helder WCE te zuiveren, gebruikt u 50 tot 100 microliters affiniteitshars in een nieuwe microcentrifugebuis, wast en brengt u de hars in evenwicht door één milliliter wasbuffer toe te voegen en bovenkant boven kant te keren tot de hars gesuspendeerd is. Na één minuut centrifugeren bij 5.000 RPM en vier graden Celsius, aspireert u de supernatant om eiwit te binden voor affiniteitszuivering bij 100 tot 200 microliters van geklaard lysaat naar de gewassen kralen en gebruikt u lysebuffer om het totale volume tot één milliliter te brengen.

Incubeer met mutatie of schudden bij vier graden Celsius gedurende twee tot vijf uur. Gebruik vloeibare stikstof om aliquots van de resterende heldere WCE snel te bevriezen en bewaar deze bij minuus 80 graden Celsius tot verder gebruik, terwijl de lysate-bietenoplossing voor de WCE Western blot-monster op ijs incubeert. Na twee en een half minuten centrifugeren bij 15.000 RPM en vier graden Celsius, decanteer u het supernatant, zorg ervoor dat u de pellet behoudt, voegt u 800 microliters 2% TCA toe aan de pellet en vortex de buis voordat u de twee en een half minuut durende centrifugering herhaalt.

Na het zorgvuldig decanteren van het supernatant, voegt u 100 microliters TCA-monsterbuffer toe en vortex om de pellet op te lossen voordat u het monster incubeert. In een 100 graden Celsius warmteblok gedurende twee tot vijf minuten, neemt u een tweede keer de tijd om alle resten van de pellet volledig op te lossen, wat moeilijk op te lossen kan zijn, en bewaar het bij minuus 80 graden Celsius tot het klaar is om te gebruiken. Nadat het lysatekralenmonster is geïncubeerd, gebruikt u wasbuffer om de hars vijf keer te wassen na centrifugeren bij 5.000 RPM en vier graden Celsius gedurende één minuut om de eiwitten te elueren.

Voeg 150 microliters elutiebuffer toe aan de hars en muteer bij vier graden Celsius gedurende vijf minuten. Centrifugeer gedurende één minuut bij 5.000 RPM en vier graden Celsius en bewaar het supernatant in een nieuwe buis. Ten slotte, om een monster voor western blot te bereiden, gebruikt u 25 microliters van twee x lithiumdodecylsulfaatmonsterbuffer met twee microliters BME tot 25 microliters UD-eiwitmonster.

Zoals getoond in deze figuur, kan een breed scala aan eiwitten reproduceerbaar worden geëxtraheerd uit gistcellen. Discrete banden over een reeks molecuulgewichten zijn indicatief voor eiwitextracten van hoge kwaliteit. De kwaliteit van extracten kan worden bevestigd door middel van western blotting voor spec